JPS63109773A - グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は反応性が高くグルコースに特異的な基質特異性
を有するグルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方
法に関する。

（従来の技術） グルコ−ステヒドロゲナーゼは β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＯ（Ｐ）＋→Ｄ−グルコノラ
クトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋　ｔ１＋の反応を触媒する酵
素である。近年、臨床検査分野において、上記酵素反応
を利用した生体液中のグルコースの定量測定が行なわれ
ており、グルコースデヒドロゲナーゼの需要が高まって
いる。

従来のグルコースデヒドロゲナーゼの製造法としては、
例えばバチルス・メガテリウム菌株から培養、採取する
方法（特開昭５８−２０１９８５号公報）、バチルス・
セレウス菌株から培養、採取する方法（特開昭５７−１
６６９３＠公報）、アセトバクター、アシネトバクタ−
、グルコノバクタ−またはシュードモナスの各層の菌株
から培養、採取する方法（特開昭５９−２５７００号公
報）等が知られている。

しかしながら、特にグルコノバクタ−属に属する生産菌
からのグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースに対
する反応性を１００とした場合、２−デオキシ−グルコ
ースに対して２２７の相対活性を示すもので、さらにマ
ンノサミンに対しても９５の相対活性を示し、その基質
特異性が広すぎる欠点を有していた（「酵素ハンドブッ
ク」第４３頁。

１９８３年３月１株式会社朝倉書店発行参照）。

また、上記した如く近年とくにグルコースデヒドロゲナ
ーゼの需要が高まっており、新たなグルコースデヒドロ
ゲナーゼ生産菌の発見により新規な製造法が開発される
ことが期待されている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、反応性が高くかつ
基質特異性がグルコースに特異的な新規なグルコースデ
ヒドロゲナーゼを提供することであり、かつグルコース
デヒドロゲナーゼの新規な製造方法を提供することであ
る。

［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 本発明は、下記の理化学的性質を有するグルコースデヒ
ドロゲナーゼに関し、 ■　酵素作用：グルコースおよびＮＡＤＰからグルコノ
−δ−ラクトンおよび還元型ＮＡＤＰを生成する反応を
触媒する。

■　基質特異性：グルコースに基質特異性を示し、２−
デオキシ−グルコースに対して実質的作用を示さない。

さらに、クリプトコツカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　）属。

カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）Ｌデバリオマイセス（Ｄｅ
ｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ）属またはビチア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属するグ
ルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、その
培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取する゛こ
とによるグルコーステじドロゲナーゼの製造方法に関す
る。

本発明に使用される各層のグルコースデヒドロゲナーゼ
生産菌としては、クリプトコツカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、デバ
リＪフイセス（Ｄｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセ
ヌラ（ＨａｎＳｅｎｕｌａ）属またはビチア（Ｐｉｃｈ
ｉａ）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌で
あればよく、例えばクリプトコツカス　ユニグトラータ
ス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａ
ｔｕｓ）　Ｙ００３３（微工研菌奇第８７０９号）、カ
ンジダ　サケ（Ｃａｎｄｉｄａ　５ａｋｅ）ＹＯ１９２
（微工研菌奇第８７１０号）、デバリオマイセス　ハン
セニイ＜Ｏｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ　　ｈａｎｓｅｎｉ
ｉ）間■７０１２　（徴工研菌寄第８７１１号）、ハン
セヌラ　アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ａｎｏｍａｌ
ａ　）　ＨＵＴ　７０８３　（微工研菌寄第８７１２号
）およびピチア　ボビス（ｐｔｃｈｔａ　ｂｏｖｉｓ）
　ＡＴＣＣ２４２０８が挙げられる。上記各国の性状を
次に示す。

クリプトコツカス　ユニグトラータス　Ｙ　００３３１
、各培地における生育状態 （１）ＹＭ液体培地 ２５℃３日間培養で、栄養細胞は球形〜楕円形。

２〜５×４〜５μｍ、多極出芽により増殖。白色、粉状
の沈澱物を形成。皮膜は培養５日日よりリング状に形成
。

（２）ＹＭ寒天培地 集落は円形１周縁は全円、隆起は半レンズ状。

表面は平滑、光沢は輝光、性状はバター状１色は白色。

（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸は形成されない。

２、子のう胞子の形成　　− ３、射出胞子の形成　　− ４、各生理的性質 （１）最適生育条件 ｐＨ５〜９．温度２４〜３０℃ （２）生育の範囲 ｐＨ４，５〜１１．５．温度１９〜３３℃（３）硝酸塩
の同化　　− （４）脂肪の分解　　− （５）尿素の分解　　士 （６）ゼラチンの液化　　− （７）好浸透圧性または耐浸透圧性　　−（８）カロチ
ノイドの生成　　− （９）顕著な有機酸の生成　　− （１０）デンプン様物質の生成　　＝ （１１）ビタミン欠乏培地での生育　　十Ｗ５、各炭素
源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース　　− Ｄ−ガラクトース　　− 麦芽糖　　− ショ糖　　− 乳糖　　− ラフィノース　　− 資化性 Ｄ−アラビノース　　＋Ｓ Ｌ−アラビノース　　＋ Ｄ−リボース　　＋ Ｄ−キシロース　　＋Ｗ Ｄ−グルコース　　十 〇−マンノース　　− Ｄ−ガラクトース　　− Ｌ−ラムノース　　＋ Ｄ−フラクトース　　− し−ソルボース　　− 麦芽糖　　十 ショ糖　　十 乳糖　　− メリビオース　　− セロビオース　　− トレハロース　　＋ ラフィノース　　＋ フラクトース　　士 α−メチル−Ｄ−グルコシド　　士 アルブチン　　士 デキストリン　　− 可溶性デンプン　　＋Ｗ イヌリン　　＋Ｗ エタノール　　± アトニット　　± エリトリット　　− イノシット　　士 Ｄ−マンニット　　士 Ｄ−ソルビット　　士 ズルシット　　− Ｄ−グルコン酸塩　　− グリセリン　　− ２−ケトーＤ−グルコン酸塩　　十 ＤＬ−礼酸塩　　− コハク酸塩　　− クエン酸塩　　− この菌は静岡県田方郡大仁町の豚舎から単離された酵母
に属する菌である。この菌は多極出芽で増殖し、子のう
胞子、射出胞子及び偽菌糸形成しない。イノシトールを
資化する等の特色からクリプトコツカス属に属する。炭
素源の資化性パターンの他、硝酸塩を資化しない、ビタ
ミンを要求する、３７℃で生育しない等の生理的特色か
ら、本国はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｎｉｇｕｔｔ
ｕｌａｔｕｓと同定され、ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓＹ００３３株と命名された
。

本株は微工研に微工研菌奇第８７０９号として寄託され
た。

カンジ　　サケ　Ｙ　０１９２ １、各培地における生育状態 （１）ＹＭ液体培地 ２５℃３日間培養で、栄養細胞は卵円形〜球形１〜３Ｘ
２〜５μｍ、多極出芽により増殖。白色、粉状の沈澱物
を形成。皮膜はリング状に形成。

（２）ＹＭ寒天培地 集落は円形２周縁は乱糸状、隆起は半レンズ状１表面は
平滑、光沢は輝光、性状はバター状。

色は白色〜クリーム。

（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸を形成。

２、子のう胞子の形成　　− ３、射出胞子の形成　　− ４、各生理的性質 （１）最適生育条件 ｐＨ６〜８．ｍ度１９〜２２℃ （２）生育の範囲 １）Ｈ２〜８．５．温度１６〜２７℃ （３）硝酸塩の同化　　− （４）脂肪の分解　　− （５）尿素の分解　　− （６）ゼラチンの液化　　− （７）好浸透圧性または耐浸透圧性　　士（８）カロチ
ノイドの生成　　− （９）顕著な有機酸の生成　　＋ （１０）デンプン様物質の生成　　− （１１）ビタミン欠乏培地での生育　　＋（１２）ＤＢ
Ｂテスト　　− ５、各炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース　　＋ Ｄ−ガラクトース　　＋Ｓ、Ｗ 麦芽糖　　＋ｓ、ｗ ショ糖　　＋Ｓ、Ｗ 乳糖　　− ラフィノース 資化性 Ｄ−７ラビノース　　− し−アラビノース　　− Ｄ−リボース　　＋Ｗ、Ｓ Ｄ−キシロース　　士 Ｄ−グルコース　　士 Ｄ−マンノース　　士 Ｄ−ガラクトース　　＋ Ｌ−ラムノース　　− Ｄ−フラクトース　　士 し−ソルボース　　＋ 麦芽糖　　士 ショ糖　　十 乳糖　　− メリげオース　　− セロビオース　　− トレハロース　　＋ ラフィノース　　− メレジトース　　＋ α−メチル−〇−グルコシド　　士 アルブチン　　− デキストリン　　＋ 可溶性デンプン　　− イヌリン　　− エタノール　　士 アトニット　　士 土すトット　　− イノシット　　− Ｄ−マンニット　　＋ Ｄ−ソルビット　　＋ ズルシット　　− Ｄ−グルコン酸塩　　− グリセリン　　− ２−ケトーＤ−グルコン酸塩　　士 ＤＬ−礼酸塩　　士 コハク酸塩　　士 クエン酸塩　　十 この菌株は長野県佐久市の土壌より単ｉ！！された酵母
に属する菌である。多極出芽で増殖し、子のう胞子及び
射出胞子を形成しない、偽菌糸を形成する。イノシトー
ルを資化しない等の特色からＣａｎｄｉｄａ属に属する
。ざらにＤＢＢテスト　−。

イノシトール、エリトリット、マルトース、ラフィノー
スの各炭素源の資化性　−２硝酸塩の資化性　−等の特
色から“Ｔｈｅ　ＹｅａＳｔＳ；ａ　ｔａＸＯｎｏｍｉ
ｃｓｔｕｄｙ　１９８４”のＣａｎｄｉｄａ　Ｇｒｏｕ
ｐ■に該当する。

ＧｒＯｕｌ）　ＶＩには２８種認められているが、ガラ
クトースの資化性　＋、可溶性デンプン、乳糖及びセロ
ビオースの資化性　−１３７℃での生育　−、グルコー
スの発酵性　＋、偽菌糸の形成　十等から、本国はＣａ
ｎｄｉｄａ　５ａｋｅと同定され、Ｃａｎｄｉｄａ　５
ａｋｅＹＯ１９２と命名された。本株は微工研に微工研
菌奇第８７１０号として寄託された。

一バリオマイセス　ハンセニイ　■υＴ　７０１２１、
各培地における生育状態 （１）麦芽汁培地 ２６℃７日間培養で細胞は球形〜楕円形、多極出芽、２
〜６Ｘ２〜８μｍ、数個連鎖する。沈澱物は粉状。皮膜
はリング状に形成。

（２）麦芽汁寒天培地 ２６℃７日間で生育良好。集落は白色、鈍光。

バター質、平滑。周縁は金縁。

（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸は形成されない。

２、子のう胞子の形成 ニンジン片培地及び野菜汁培地にて形成される。

接合法。球形で表面はやや粗面。２．５〜３μｍ０１子
のうに１個形成。

３、各生理的性質 硝酸塩の資化性　　− アルブチンの分解　　十 ビタミン欠乏培地での生育　　− ３７℃での生育　　− ４、炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース　　＋Ｗ Ｄ−ガラクトース　　± 麦芽汁　　士 ショ糖　　十Ｗ 乳糖　　− ラフィノース　　− 資化性 Ｄ−アラビノース　　− し−アラビノース　　＋ Ｄ−リボース　　士 Ｄ−キシロース　　＋ Ｄ−グルコース　　士 Ｄ−ガラクトース　　＋ 麦芽糖　　士 ショ糖　　十 乳糖　　− セロビオース　　＋ トレハロース　　＋ ラフィノース　　＋ し−ラムノース　　＋ 可溶性デンプン　　＋ イヌリン　　− この菌は広島大学工学部よりＤｅｂａｒｉＯｍｌ／Ｃｅ
Ｓ　ｋｌ。

ｅｃｋｅｒｉとして分与された菌株である。現在り、ｋ
ｌｏｅｃｋｅｒｉという種は認められておらず（Ｔｈｅ
　ｙｅａｓｔｓ。

ａ　ｔａＸＯｎｏｍｉｃ　５ｔｕａｙ、１ｓａ４）　、
すべてｏｅｂａｒｔｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎ　ｉ　ｉ
に編入されている。

８０１７０１２株の再確認を行なった結果、栄養細胞は
多極出芽により増殖、子のうは接合により形成。

子のう胞子は球形かつ粗面、硝酸塩を資化しない、グル
コースの発酵性微弱等の特色からＤｅｂａｒｉＯｍｙＣ
ｅｓＪｌに属することが、確認された。Ｄｅｂａｒｔｏ
ｍｙｃｅｓ居は現在９種類認められているが（Ｔｈｅ　
ｙｅａｓｔｓ、ａｔａＸＯｎｏｍｉｃ　５ｔｕｄｙ　１
９８４　）　、子のう胞子は球形〜細球形かつ粗面、１
子のうに１個形成、グルコース及びショ糖の発酵性ある
が微弱、シヨ糖、麦芽糖及びキシロースを資化する。ビ
タミンの要求性ある等の特色から、水筒はＤｅｂａｒｉ
ＯｍｙＣｅＳ　ｈａｎｓｅｎｉｉであることが確認され
た。水筒は微工研に徴工研菌寄第８７１１号として寄託
された。

ハンセヌラ　アノマラ　ＨＵＴ　７０８３１、各培地に
おける生育状態 （１）麦芽汁培地 ２６℃７日間培養で栄養細胞は球形〜長楕円形。

２〜４Ｘ２〜８μｍ、単生〜数個連鎖する。沈澱物は粉
状、皮膜は平滑に形成。

（２）麦芽汁寒天培地 ２６℃７日間で生育良好。集落は白色、鈍光。

バター質、平滑２周縁は波状。

（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 多数の偽菌糸が形成される。

２、子のう胞子の形成 ニンジン片培地及び野菜汁培地にて形成される。

山高帽型で表面は平滑。２．０〜３．ＯＸ　２．０〜２
．５μｍ０１子のうに１〜４ｇ形成。

３、各生理的性質 硝酸塩の資化性　　十 アルブチンの分解　　士 ビタミン欠乏培地での生育　　十 ３７℃での生育　　− ４、炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース　　士 Ｄ−ガラクトース　　＋ 麦芽汁　　十 ショ糖　　十 乳糖　　士 ラフィノース　　＋ 資化性 Ｄ−アラビノース　　− Ｌ−アラビノース　　− Ｄ−リボース　　− Ｄ−キシロース　　士 Ｄ−グルコース　　士 Ｄ−ガラクトース Ｌ−ラムノース 麦芽糖　　十 ショ糖　　十 乳糖　　− セロビオース　　士 トレハロース　　＋ ラフィノース　　＋ 可溶性デンプン　　＋ イヌリン　　− エリトリット　　＋ 水筒は広島大学工学部より分与を受けた株である。再確
認を行なった結果、栄養細胞は多極出芽により増殖、偽
菌糸を形成、山高帽型の子のう胞子を形成、子のうは長
い管状とはならない、硝酸塩を資化する等の特色からハ
ンセヌラ属に属することが確認された。ハンセヌラ属は
３０種認められているが（Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔｓ、ａ　
ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　５ｔｕｄｙ　１９８４）、麦芽糖
、エリトリット及び可溶性デンプンを資化する、ラムノ
ースを資化しない、ビタミン要求性はない。グルコース
、ショ糖及び麦芽糖の発酵性ある等の特色から、水筒は
微工研に微工研菌寄第８７１２号として寄託された。

ピチア　ボビス　ＡＴＣＣ２４２０８ ＾ＴＣＣ２４２０８寄託菌（ｖａｎ　ＩＪｄｅｎ、Ｎ、
ａｎｄ　ｄｅ　Ｃａｒｍｏ−ｓｏｕｓａ、　Ｌ、“Ｊｏ
ｕｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ”１６：３８５　　（１９５７）参照） 本発明における上記各酵母によるグルコースデヒドロゲ
ナーゼの製造は、通常の酵母培養による酵素の製造の方
法にしたがって行なう。すなわち酵母を培地に接種し、
通気攪拌による好気的培養条件下に培養する。

培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され、例えば窒素源とじてはコーンスチー
プリカー、大豆粉、カゼイン加水分解物、ペプトン、　
ｒＲａエキス、肉エキス等が好ましく、炭素源としては
資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース
またはマルトース。

シュクロース、ラクトースなどの二糖類、デキストリン
、ｌ！ｉ粉、糖蜜などが使用される。

培養温度は菌が発育しグルコースデヒドロゲナーゼを生
産する範囲内で適宜変更できるが好ましくは２５℃〜３
７℃特に３０℃付近である。培養時間は条件によって多
少異なるが、グルコースデヒドロゲナーゼが最高収量に
達する時期をみはからって適当な時期に培養を終了すれ
ばよく通常２０〜５０時間である。

このようにして得られた培養物からグルコースデヒドロ
ゲナーゼを採取する。採取方法は、例えばまず得られた
培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を分
離し、次いで分離した菌体を超音波処理、フレンチプレ
ス処理もしくはガラスピーズを用いる機械的破壊、また
は有機溶媒を用いた自己消化などで破壊し、次に遠心分
離によってグルコースデヒドロゲナーゼを含む粗酵素液
を得る。次いで、この粗酵素液を５０℃に１０〜３０分
間加温し直ちに遠心分離し上清を回収する。ざらにＤＥ
ＡＥ−セルロース、叶＾Ｅ−セファデックスＡ−２５゜
ＤＥＡＥ−セフ１０−ス、　ＣＨ−セルロース、　ＣＭ
セファデックスＣ−２５，ＣＭ−セファロースＣＬ−６
Ｂなどのイオン交換クロマトグラフィーを行った後、ハ
イドロキシル　アパタイト　クロマトグラフィーを行っ
て精製すればよい。必要に応じて凍結乾燥する。

（実施例） 実施例１ （ｉ）粉末酵母エキス０．５％、牛肉エキス１．０％。

グルコースｉ、ｏ％、　ＫＨ２ＰＯａ　０．１５％、Ｃ
ａＣ！１２　・２Ｈ２００，０３３％、　Ｈｇ５ｏ４　
・７８２０　０．０５％。

Ｎａｃｌｏ、２％からなる培地１００ｍ１（５００ｒｄ
容三角フラスコ）にクリプトコツカス　ユニグトラータ
スＹ　００３３を１白金耳移植後、３０℃で５０時間振
盪培養を行った。培養液を４５０Ｏｒ、　ｐ、ｍ、　１
０分間の遠心分離にかけ菌体を得た。菌体を１０−の１
０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁後ブラウン
のホモゲナイザーで菌体を破砕し１５０００ｒ、ｐ、　
ｍ、　１０分間の遠心分離で菌体残滓を除去し粗酵素液
１０ｍ＠得たく０．６単位／ｄ）。

に１）粉末酵母エキス０．５％、カザミノ酸１．０％。

スクロース２％、　ＫＨ２ＰＯ４０，１５％、ＣａＣＪ
２！２”２１１２０　０．０３３％、　Ｈｇ５Ｏａ　・
７Ｈ２００，０５％、Ｎａ（Ｆ！０．２％からなる培地
１００ＷＩ！にクリプトコツ力スユニグトラータスＹ　
００３３を１白金耳移植後３０℃で５０時間振盪培養を
行った。上記（ｉ＞と同様にして粗酵素液１０ｄを得た
（１４単位／ｍｌ）。

（ｉｉｉ　）ミースト０．５％、カッオニキス１．０％
、マルトース１％、　ＫＨ２ｐｏａ　０１１５％。

Ｃａ　Ｃｊ２２　　・２８２０　０．０３３％、　Ｈ（
］ＳＯａ　・７Ｈ２００，０５％、　Ｎａ　ｃｌ　０．
２％からなる培地１００Ｉｎｆ！にクリプトコツ力スユ
ニグトラータスＹ００３３を１白金耳移植後、３０℃で
５０時間振盪培養を行った。実施例１と同様にして粗酵
素１０ｍｆｔ′＠得たく６単位／ｍｌ）。

（ｉＶ）上記（ｉｉ＞に示した方法で培養液１０５０７
から得られた粗酵素液１５０ｍ１を５０℃で１５分間加
温し、４５００ｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分間の遠心分離
で上清を得、これを０ＥＡＥセファロースＣＬ−６８カ
ラム（４，８ｘ４ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、０．
ＩＭＫＣｊ　　１００ｒｄ１．　０．２ＭＫＣｊ　　１
００ｄ、　　０．３ＭＫＣｆｆｉ　　１００ｒｄｌを流
した。０．３ＭＫＣｌ５ｄでグルコースデヒドロゲナー
ゼは溶出した。酵素液をアミコン社のダイアフローメン
プランを用いて脱塩し、次いでこれをシグマ社のハイト
ロキシルアパタイトカラム（４，８ｘ　１ｃｍ）に通し
てＭ素を吸着させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ１１７．
０＞　５０ｄ　０．２Ｍリン酸緩衝液５０ｍ、　　０．
３Ｍリンｒ！ｉ緩衝液５０ｄを流した。０．３Ｍリン酸
緩衝液２０ｄでグルコースデヒドロゲナーゼは溶出し、
２３．６単位／ｄの活性を有する酵素液２０ｄが得られ
た。

（ｑられたグルコースデヒドロゲナーゼは次の理化学的
性質を有するものであった。

■酵素作用 下記式に示すように、グルコースおよびＮＡＤＰ７’）
１らグルコノ−δ−ラクトンおよび還元型ＮＡＤＰを生
成する反応を触媒する。

ｆ−Ｄ−ｆ’”ｊ’７”””　　　ｐ−＋−Ｊ”Ｊａｅ
ｊｏｙｃ■ｌ）Ｈ安定性 １単位／ｒｒｄｌ　（４０ｍＭの緩衝液）で５３℃１０
分間処理後の残存活性を測定した。第１図に示すように
９Ｈ６，０〜７．５で安定である。トーーはジメチルグ
ルタル酸、←→はリン酸、トー→はトリス塩酸緩衝液を
表わす（記号は第２図以下同じ）。

■至適ｐＨ 第２図に示すとおりであり、ｐＨ６〜８に至適ｐＨを有
する。岬−４は酢酸緩衝液を表わす。

■熱安定性 １単位／ｄの酵素溶液（４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，
０）を各温度で１０分間処理後、残存活性を測定した。

第３図に示すように５０℃まで安定である。

■至適温度 第４図に示すとありであり、５５℃付近に至適温度を有
する。

■分子量 １１Ｘ１０４±１１０００　　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　
　Ｓ−２００５ｕｐｅｒｆｉｎｅによる値） ■等電点 ｐＨ４，９±０，５ ■Ｋ１１ｌ値 約２．６Ｘ１０−３±２，６　Ｘ　１０−４　Ｍ　（グ
ルコース、トリス−塩酸緩衝液ｐｔ１７．５） 約４．２Ｘ１０−［ｉ±４．２Ｘ１叶７Ｍ　（ＮＡＤＰ
、　　トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５） ■金属イオン界面活性剤の影響 第１表に示すとおりである。

［株］基質特異性 第２表に示すとおりである。基質５０ｍＭ、酵素０、０
０５　Ｕの反応時間１０分間。

なお、上記において、酵素活性および残存活性は次の酵
素活性測定法により求めた。

醍！盾ユ還Ｚ基 ０．２Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７．５）　　
０．４１０　ｍＭ　　ＮＡＤＰ　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｏ，０５１０％　ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ−１０
００，０１０、５Ｍ　　グルコース　　　　　　　　　
　０．１精製水　　　　　　　　　　　　　　　　０．
４４１．０ 上記組成の反応液ｉ、ｏｙを３７℃で２〜３分間予備加
熱した後、２０／１ｆｆｌの酵素溶液を加えて反応を開
始し、３７℃で１０分間反応を行う。０．ＩＮ塩酸溶液
２ｄを添加して反応を止め、３４０ｎｍの吸光度を測定
した。酵素１単位は１分間に１μｍｏｂの還元型ＮＡＤ
Ｐを生成する活性とした。

（以下　余白） 策二Ｌ１ 第−ヱー人 実施例２ （ｉ）カンジダ　サケ　ＹＯ１９２を実施例１の（ｉ）
と同様に培養し粗酵素液１０威を得た（０．１−単位／
ｄ）。

（１１）カンジダ　サケを実施例１の（ｉｉ＞と同様に
培養し、粗酵素液１０ｒｎｉを得た（２．５単位／ｒｎ
ｌ）。

（ｉｉｉ）カンジダ　サケを実施例１の（ｉｉｉ　＞と
同様に培養し粗酵素液１０ｒｒ１１を得た（０．７単位
／ｍｅ）。

（ｉＶ）上記（ｉｉ）に示した方法で培養液２０００ｄ
から得られた粗酵素液２００ｄを４５００ｒ、　ｐ、　
ｍ、　１０分間の遠心分離により上清を得、これをＤＥ
ＡＥセファロースＣＬ−６８カラム（４，８ｘ５　ｃｍ
）に通して酵素を吸着させ、実施例１のにＶ）と同様の
方法により処理した。０．３ＭＫＣｆｆｉ　１００ｄで
グルコースデヒドロゲナーゼは溶出した。酵素液を実施
例１の（＋Ｖ）と同様にして脱塩し、ハイトロキシルア
パタイトカラム（４，８ｘｌ　ｃｍ）に通して酵素を吸
着させ、実施例１の（ｉｖ＞と同様にして３．１単位／
ｒ１１１の活性を有する酵素液２０ｄを得た。

得られたグルコースデヒドロゲナーゼは次の理化学的性
質を有するものであった。

■酵素作用 下記式に示すように、グルコースおよびＮＡＤＰからグ
ルクロン酸および還元型ＮＡＤＰを生成する反応を触媒
する。またＮＡＤＰの代りにＮＡＤを用いても、同一反
応を触媒する。

■ｐＨ安定性 １単位／ｄ　（４０ｍＭの緩衝液）で５０℃１５分間処
理後の残存活性を測定した。第５図に示すようにｐＨ６
，０〜６．５で安定である。

■至適ｐＨ 第６図に示すとおりである。ＯＨ６，０〜７．０に至適
ｐＨを有する。

■熱安定性 第７図に示すように４５℃まで安定である。

■至適温度 第８図に示す通りであり３５℃付近に至適温度を有する
。

■分子量 １１．５Ｘ１０４付近（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０５ｕｐｅｒ　ｆｉｎｅによる値） ■等電点 ｐＨ４，６付近 ■Ｋｍ値 約３２．５Ｘ　１０−３　Ｍ　（グルコース、トリス−
塩酸緩衝液ｐＨ７．５） 約３，７４ｘｌＯ−３Ｍ　（ＮＡＤ、　トリス−塩酸緩
衝液ｐＨ７．５＞ ■金属イオン、界面活性剤の影響 第３表に示すとおりである。

■基質特異性 第４表に示すとおりである。

なお上記において、酵素活性は次の酵素活性測定法によ
り求めた。

肚虱盾ユ里呈迭 ０．２Ｍ　　トＩＪスー塩ｒ！ＩＰＩ　街液（１）Ｈ７
．５）　　　０．４０１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｏ，０５１０％　Ｔｒｉｔｏｎ
　　Ｘ−１０００，０１０，５Ｍ　　グルコース　　　
　　　　　　　　０．１精製水　　　　　　　　　　　
　　　　　　０・４４１．０ 前記組成の反応液１．０ｒｒ１１を３７℃で２〜３分間
予備加温した後、２０成の酵素溶液を加えて反応を開始
し、３７℃で１０分間反応を行う。０．１Ｎ塩酸溶液２
７を添加して反応を止め、３４０ｎｍの吸光度を測定し
た。酵素１単位は１分間に１μｌｌ１Ｏ１の還元型ＮＡ
Ｄを生成する活性とした。

（以下　余白） Ｌｉ玉 ■−１−入 実施例３〜５ 以上、クリプトコツカス属およびカンジダ属に属するグ
ルコースデヒドロゲナーゼ生産菌による方法について詳
細に示したが、デバリオマイセス属、ハンセヌラ属また
はピチア属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌
を用いる場合も、上記実施例と同様である。これら３種
のグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌の場合について次
に示す。

ただし使用した酵母は 実施例３・・・デバリオマイセス　ハンセニイＨＵＴ　
７０１２ 実施例４・・・ハンセヌラ　アノマラ　ＨＵ丁７０８３
実施例５・・・ピチア　ボビス　ＡＴＣＣ２４２０Ｂで
あり、実施例１の（ｉＶ　）の方法で酵素を製造した。

１ｑられた酵素の理化学的性質および各酵素の培養力価
（実施例１の（１１）の培地を用いた）を次に示す。。

鼠員立」 実施例３．実施例４および実施例５のいずれの酵素も、
カンジダ　サケＹＯ１９２における酵素作用と同一反応
を触媒する。

Ｋｍ値 実施例３　　約７．　ＩＯＸ　１０−２　Ｍ実施例４　
　約３．０７Ｘ　１０−２　Ｍ実施例５　　約５．４８
Ｘ　１０−２　Ｍ楚且丘且塁 大塵■ユ　　ユ　　互 グルコース　　　　　　　　１００％　１００％　１０
０％グルコース−１−リン酸　　　０　　　００グルコ
ース−６−リン酸　　　３　　　００フルクトース　　
　　　　　　ＯＯＯ ガラクトース　　　　　　　　ＯＯＯ キシロース　　　　　　　　１４　　１Ｂ　　　２７ラ
クトース　　　　　　　　　ＯＯＯ マルトース　　　　　　　　　ＯＯＯ シュクロース　　　　　　　　０　　　００且簸方員 り、ｈａｎｓｅｎｉｉ　　　８１丁　７０１２　　　　
　　０．０１ｕ／ｄＨ，ａｎｏｍａｌａ　　ＨＵＴ７０
８３　　　０．０３ｕ／ｍｅＰ、ｂｏｖｉｓ　　ＨＵＴ
　７３１１　　　　０．０１ｕ／ｄ匝支足ユ 実施例３・・・第９図に示す。

実施例４・・・第１１図に示す。

実施例５・・・第１３図に示す。

工適朗 実施例３・・・第１０図に示す。

実施例４・・・第１２図に示す。

実施例５・・・第１４図に示す。

［発明の効果コ 本発明は新規なグルコースデヒドロゲナーゼおよびその
製造方法を提供するものである。

本発明の製造方法のうち、特にクリプトコツカス属に属
するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌により！ａ造し
たグルコースデヒドロゲナーゼはＫｍ値が低く　（２，
６ｘｌＯ−３Ｍ　）　、これは例えば従来の製造法によ
るグルコースデヒドロゲナーゼが２×１０−２Ｍ（バチ
ルス　セレウスによる場合、メソッド　イン　エンチモ
ロジー　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

ｇＶ　９１０６参照）かおるいはそれ以上であるのに対
し、約１０倍の活性を有するもので、特に良好な酵素で
ある。。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図および第４図はそれぞれクリプ
トコツカス　ユニグトラータス　Ｙ００３３により製造
したグルコースデヒドロゲナーゼのｐＨ安定性、至適ｐ
Ｈ，熱安定性および至適温度を表わすグラフ、第５図、
第６図、第７図および第８図はそれぞれカンジダ　サケ
　ＹＯ１９２により製造したグルコースデヒドロゲナー
ゼのｐｌ＋安定性、至適ｐＨ２熱安定性および至適温度
を表わすグラフ、第９図および第１０図はそれぞれデバ
リオマイセスハンセニイ　間Ｔ７０１２により製造した
グルコースデヒドロゲナーゼのｐＨ安定性および至適ｐ
Ｈを表わすグラフ、第１１図および第１２図はハンセヌ
ラ　アノマラ　ＨＵＴ７０８３により製造したグルコー
スデヒドロゲナーゼのｐＨ安定性および至適ｐＨを表わ
すグラフ、第１３図および第１４図はそれぞれピチア　
ボビス　ＡＴＣＣ２４２０８により製造したグルコース
デヒドロゲナーゼのｐｔｌ安定性および至適ｐＨを表わ
すグラフである。 （８７３３）代理人　弁理士　猪　股　祥　晃（ばか１
名） イ？紫厚（〆） 存７ｇ恢蓼（内 グｅ荒蓼（−） ＃、マ５峡１ド） 「ぐ紫躯ド） “　　揶糟蚊炉ｌ） ゴぐヤ碧（−） 兵、ｎ悸（ド） （ｅ禦ザ（ｊ） Ｊ！［九１ド） −領？恢−（ｊ）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するグルコースデヒドロ
   ゲナーゼ。 ［１］酵素作用：グルコースおよびＮＡＤＰからグルコ
   ノ−δ−ラクトンおよび還元型 ＮＡＤＰを生成する反応を触媒する。 ［２］基質特異性：グルコースに基質特異性を示し、２
   −デオキシ−グルコースに対して実質的作用を示さない
   。
2. （２）至適ｐＨが６〜８、至適温度が５５℃付近、ｐＨ
   安定性においてｐＨ６．０〜７．０で安定で、分子量１
   １×１０＾４±１１０００、グルコースに対するＫｍ値
   ２．６×１０＾−＾３±２．６×１０＾−＾４Ｍ、ＮＡ
   ＤＰに対するＫｍ値４．６×１０＾−＾６±４．６×１
   ０＾−＾７Ｍ、等電点４．９±０．５である特許請求の
   範囲第１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
3. （３）クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
   属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、デバリオマイセス
   （Ｄｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎ
   ｓｅｎｕｌａ）属またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属
   するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し
   、その培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取す
   ることを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造
   方法。
4. （４）クリプトコッカス属に属するグルコースデヒドロ
   ゲナーゼ生産菌がクリプトコッカス　ユニグトラータス
   （Ｃｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓ　ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕ
   ｓ）Ｙ００３３（微工研菌奇第８７０９号）である特許
   請求の範囲第３項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの
   製造方法。
5. （５）カンジダ属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ
   生産菌がカンジダ　サケ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓａｋｅ）
   Ｙ０１９２（微工研菌寄第８７１０号）である特許請求
   の範囲第３項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造
   方法。
6. （６）デバリオマイセス属に属するグルコースデヒドロ
   ゲナーゼ生産菌がデバリオマイセス　ハンセニイ（Ｄｅ
   ｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＨＵＴ　７
   ０１２（徴工研菌寄第８７１１号）である特許請求の範
   囲第３項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
   。
7. （７）ハンセヌラ属に属するグルコースデヒドロゲナー
   ゼ生産菌がハンセヌラ　アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
   　ａｎｏｍａｌａ）ＨＵＴ　７０８３（微工研菌寄第８
   ７１２号）である特許請求の範囲第３項記載のグルコー
   スデヒドロゲナーゼの製造方法。
8. （８）ピチア属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生
   産菌がピチア　ボビス（Ｐｉｃｈｉａ　ｂｏｖｉｓ）Ａ
   ＴＣＣ　２４２０８である特許請求の範囲第３項記載の
   グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。