ES2350903T3 - Métodos para producir polipéptidos segregados. - Google Patents

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Howard Brody
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Abstract

Método para la producción de un polipéptido segregado, comprendiendo: (a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (i)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37; (ii)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado a partir del medio de cultivo.

Description

Métodos para producir polipéptidos segregados.
Escrito en cuanto a Derechos para Invenciones Hechas Bajo Investigación y Desarrollo Patrocinados Federalmente
Esta invención se hizo con el apoyo del Gobierno bajo el subcontrato NREL nº. ZCO-30017-02, Contrato Preferente DE-AC36-98GO10337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene derechos determinados sobre esta invención.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir polipéptidos segregados.
Descripción de las técnicas relacionadas
La producción recombinante de una proteína heteróloga en una célula huésped fúngica, particularmente una célula micótica filamentosa tal como Aspergillus o una célula de levadura tal Saccharomyces, puede proporcionar un vehículo más deseable para producir la proteína en cantidades comercialmente pertinentes.
La producción recombinante de una proteína heteróloga se realiza generalmente construyendo un cassette de expresión en el cual la codificación de ADN para la proteína se coloca bajo el control de la expresión de un promotor, extirpado de un gen regulado, adecuado para la célula huésped. El cassette de expresión se introduce en la célula huésped, normalmente por transformación mediada por plásmidos. La producción de la proteína heteróloga se consigue entonces por cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones inductoras necesarias para el funcionamiento apropiado del promotor contenido en el cassette de expresión.
La mejora de la producción recombinante de proteínas requiere generalmente la disponibilidad de secuencias reguladoras nuevas las cuales son adecuadas controlando la expresión de las proteínas en una célula huésped.
La patente estadounidense. Nº. 6.015.703 expone constructos genéticos comprendiendo un promotor, una señal de secreción de xilanasa, y una región de codificación de beta-glucosidasa madura. Los constructos descritos, expresados en microbios recombinantes, aumentan espectacularmente la cantidad de beta-glucosidasa producida en relación a los microbios no transformados.
WO 91/17243 expone una endoglucanasa V y su gen a partir de Humicola insolens DSM 1800.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos mejorados para producir un polipéptido en una célula huésped fúngica usando secuencias de péptido señal.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido segregado, comprendiendo:
(a)
cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está situado inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:
(i)
una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37;
(ii)
una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal teniendo una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y
(b)
aislar el polipéptido segregado del medio de cultivo.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1 muestra un mapa de restricción de pAlLo1.
Figura 2 muestra un mapa de restricción de pMJ04.
Figura 3 muestra un mapa de restricción de pCaHj527.
Figura 4 muestra un mapa de restricción de pMT2188.
Figura 5 muestra un mapa de restricción de pCaHj568.
Figura 6 muestra un mapa de restricción de pMJ05.
Figura 7 muestra un mapa de restricción de pSMai130.
Figura 8 muestra la secuencia de ADN (SEC ID nº: 34) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID nº: 35) de la secuencia señal de secreción de una beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae.
Figura 9 muestra la secuencia de ADN (SEC ID nº: 36) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID nº: 37) de la secuencia señal de secreción de una endoglucanasa V de Humicola insolens.
Figura 10 muestra un mapa de restricción de pSMai135.
Figura 11 muestra un mapa de restricción de pSATe101.
Figura 12 muestra un mapa de restricción de pSATe111.
Figura 13 muestra un mapa de restricción de pALFd1.
Figura 14 muestra un mapa de restricción de pAlLo2.
Figura 15 muestra un mapa de restricción de pEJG97.
Figura 16 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID Nos: 46 y 47, respectivamente). El péptido señal anteriormente citado está subrayado y los intrones anteriormente citado están en letra itálica.
Figura 17 muestra un mapa de restricción de pCR4BIunt-TOPOAfcDNA5'.
Figura 18 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3'.
Figura 19 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA.
Figura 20 muestra un mapa de restricción de pALFd7.
Figura 21 muestra un mapa de restricción de pALFd6.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido, comprendiendo: (a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos y el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está situada inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, donde la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 y (ii) una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado del medio de cultivo.
En los métodos de producción de la presente invención, las células huésped fúngicas se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, o fermentación a gran escala o a pequeña escala (incluyendo las fermentaciones continua, en lote, en flujo discontinuo, o en estado sólido) en laboratorio o en fermentadores industriales realizado en un medio adecuado y bajo condiciones permitiendo al polipéptido expresarse y/o aislarse. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles a través de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection).
Los polipéptidos se pueden detectar usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático.
En los métodos de la presente invención, la célula fúngica produce preferiblemente al menos aproximadamente un 25% más, más preferiblemente al menos aproximadamente un 50% más, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75% más, más preferiblemente al menos aproximadamente un 100% más, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 200% más, de la forma más preferible al menos aproximadamente un 300% más, e incluso de la forma más preferible al menos aproximadamente un 400% más de polipéptidos en relación a una célula fúngica conteniendo una secuencia de péptido señal nativa operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido cuando se cultiva bajo condiciones de producción idénticas.
El polipéptido segregado resultante se puede recuperar directamente del medio por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.
Los polipéptidos se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico cromatoenfoque, y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
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Secuencias de péptido señal
El término "secuencia de péptido señal" se define aquí como una región de codificación peptídica que codifica una secuencia de aminoácidos vinculada al amino terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado dentro de la vía secretora de la célula.
El término "operativamente enlazado" se define aquí como una configuración en la cual una secuencia de control, por ejemplo, una secuencia de péptido señal, está apropiadamente colocada en una posición en relación a una secuencia codificante de manera que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido codificado por la secuencia codificante.
El término "secuencia codificadora" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que está transcrita en ARNm la cual se traduce en un polipéptido colocado bajo el control de las secuencias de control apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están generalmente determinados por el codón de iniciación localizado en el comienzo del marco de lectura abierto del extremo 5' del ARNm y un codón de detención localizado en el extremo 3' del marco de lectura abierto del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no está limitada a, secuencias de nucleótidos de ADN genómico, de ADNc, semisintéticas, sintéticas, y recombinantes.
El extremo 5' de la secuencia codificante polipeptídica puede contener una región de codificación de péptido señal nativa naturalmente vinculada en marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido, donde la región de codificación de péptido señal de la presente invención puede simplemente reemplazar la región de codificación de péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Alternativamente, en el extremo 5' de la secuencia codificante polipeptídica puede faltar una región de codificación de péptido señal nativa.
En los métodos de la presente invención, la secuencia de péptido señal es ajena a la secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido de interés, pero la secuencia de péptido señal o secuencia de nucleótidos puede ser nativa a la célula huésped fúngica.
En un aspecto, las secuencias de nucleótido aisladas codificando un péptido señal tienen un grado de identidad con la SEC ID nº: 37 de al menos un 90%, de la forma más preferible al menos aproximadamente un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos aproximadamente un 97%, las cuales tienen la capacidad de dirigir un polipéptido dentro de una vía secretora de la célula (de ahora en adelante "péptidos señal homólogos"). En un aspecto preferido, los péptidos señal homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por cinco aminoácidos, preferiblemente por cuatro aminoácidos, más preferiblemente por tres aminoácidos, incluso más preferiblemente por dos aminoácidos, y de la forma más preferible por un aminoácido de la SEC ID nº: 37. Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: Penalización de espacio de 10 y penalización de longitud de espacio de 10. Parámetros de alineación por pares son Ktuple=1, gap penalty=3, windows=5, y diagonals=5.
Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos codifican péptidos señal que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37, o variantes alélicas de la misma; o fragmentos de la misma que tienen la capacidad de dirigir el polipéptido dentro de una vía secretora de la célula. En un aspecto más preferido, una secuencia de nucleótidos de la presente invención codifica una señal peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos codifica un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37, o un fragmento de la misma, donde el fragmento de péptido señal tiene la capacidad de dirigir un polipéptido dentro de una vía secretora de la célula. En otro aspecto más preferido, la secuencia de nucleótidos de la presente invención codifica un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37.
La presente invención también comprende secuencias de nucleótidos que codifican un péptido señal teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37, la cual difiere de la SEC ID nº: 36 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de la SEC ID nº: 36 las cuales codifican fragmentos de la SEC ID nº: 37 las cuales tienen la capacidad de dirigir un polipéptido dentro de una vía secretora de la célula.
Una subsecuencia de la SEC ID nº: 36 es una secuencia de ácidos nucléicos comprendida por la SEC ID nº: 36 excepto porque uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' se han delecionado. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 45 nucleótidos, más preferiblemente al menos 51 nucleótidos, y de la forma más preferible al menos 57 nucleótidos. Un fragmento de la SEC ID nº: 37 es un polipéptido teniendo uno o más aminoácidos delecionados del amino y/o carboxi terminal de esta secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 17 residuos de aminoácidos, y de la forma más preferible al menos 19 residuos de aminoácidos.
Una variante alélica denota cualquiera de dos o formas alternativas de un gen ocupando la misma localización cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en un polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el péptido señal codificado) o pueden codificar péptidos señal teniendo secuencias de aminoácidos alteradas. La variante alélica de un péptido señal es un péptido codificado por una variante alélica de un gen.
En un aspecto preferido, la primera secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de péptido señal del gen de endoglucanasa V contenida en Humicola insolens DSM 1800.
La secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº: 36 o una subsecuencia de la misma, al igual que la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 o un fragmento de la mismo, se puede utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico a identificar y para clonar péptidos señal de codificación de ADN a partir de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este caso. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente de al menos 25, y más preferiblemente de al menos 35 nucleótidos de longitud. Se pueden usar ambas sondas de ADN y ARN. Las sondas normalmente se marcan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S, biotina, o avidina). Tales sondas están comprendidas por la presente invención.
Así, un ADN genómico o genoteca de ADNc obtenida a partir de tales otros organismos se pueden examinar para obtener ADN que hibridice con las sondas anteriormente descritas y que codifique un péptido señal. El genómico u otro ADN de tales otros organismos se pueden separar mediante agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEC ID nº: 36 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una transferencia de Southern. Para objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácido nucleico hibridiza a un sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID nº: 36, su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo las condiciones de astringencia definidas aquí. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico hibridiza bajo estas condiciones se pueden detectar usando una película radiográfica.
En un aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de la SEC ID nº: 37, o una subsecuencia de la misma. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la SEC ID nº: 36. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante de péptido señal del gen de endoglucanasa V contenida en Humicola insolens DSM 1800.
En otro aspecto, las secuencias de ácido nucleico aisladas codifican variantes del péptido señal teniendo una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos señal variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, tal como las sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; o deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 5 aminoácidos.
Ejemplos de sustituciones conservadoras los encontramos en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los cambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly así como estos a la inversa.
La presente invención también se refiere a las secuencias de péptido señal aisladas descritas arriba.
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Secuencias de nucleótidos de codificación de polipéptidos
El polipéptido codificado por la segunda secuencia de nucleótidos puede ser heterólogo o nativo a la célula huésped fúngica de interés.
El término "polipéptido" no se refiere aquí a una longitud específica del producto codificado y, por lo tanto, comprende péptidos, oligopéptidos, y proteínas. El término "polipéptido heterólogo" se define aquí como un polipéptido que no es nativo a la célula fúngica, un polipéptido nativo en el cual se han hecho modificaciones para alterar la secuencia nativa, o un polipéptido nativo cuya expresión se altera de forma cuantitativa como resultado de una manipulación del gen que codifica el polipéptido por técnicas de ADN recombinantes. La célula fúngica puede contener una o más copias de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido.
Preferiblemente, el polipéptido es una hormona o variante de la misma, una enzima, un receptor o parte del mismo, un anticuerpo o parte del mismo, o un indicador. En un aspecto preferido, el polipéptido es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, o ligasa. En un aspecto más preferido, el polipéptido es una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, celobiohidrolasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa de ciclodextrina, desoxiribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, galactosidasa de beta, glucoamilasa, glucosidasa alfa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa, o beta-xilosidasa. En un aspecto más preferido, el polipéptido es una endoglucanasa, celobiohidrolasa, y/o beta-glucosidasa útil en la conversión de celulosa a glucosa incluyendo, pero no limitándose a, la endoglucanasa I, endoglucanasa II, endoglucansa III, endoglucanasa IV, endoglucanasa V, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, y beta-glucosidasa. Las enzimas de endoglucanasa y celobiohidrolasa se refieren colectivamente como "celulasas".
La secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido de interés se puede obtener a partir de cualquier procariota, eucariota, u otra fuente. Para objetivos de la presente invención, el término "obtenido a partir de" como se utilizan en este caso en relación a una fuente dada debe significar que el polipéptido se produce mediante la fuente o mediante una célula en la cual se ha insertado un gen de la fuente.
Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido de interés se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de la secuencia de nucleótidos a partir de tal ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de nucleótido deseado comprendiendo la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector, y la incorporación del vector recombinante en la célula fúngica mutante donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o de cualquier combinación de los mismos.
En los métodos de la presente invención, el polipéptido también puede incluir un polipéptido híbrido o fundido en el cual otro polipéptido se funde en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fundición de una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) codificando un polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) codificando otro polipéptido. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen, ligar las secuencias de codificación codificando los polipéptidos de modo que éstas estén estructuradas y la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador. El polipéptido híbrido puede comprender una combinación de secuencias polipéptidas completas o parciales obtenidas de al menos dos polipéptidos diferentes donde uno o más pueden ser heterólogas a la célula mutante fúngica.
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Constructos de ácido nucleico
Se describen aquí constructos de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido operativamente enlazado a una secuencia de péptido señal de la presente invención y una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La expresión se entenderá por incluir cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.
"Constructo de ácidos nucleicos" se define aquí como una molécula de nucleótido, o bien de cadena única o doble, la cual está aislada de un gen de origen natural o que se ha modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos combinados y superpuestos de tal manera que de no ser así no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo ácido nucleico contiene una secuencia codificante y todas las secuencias de control requeridas para la expresión de la secuencia codificante.
Una secuencia de nucleótidos aislada codificando un polipéptido puede manipularse en mayor medida de diferentes maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser necesaria o deseable dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinantes se conocen bien en la técnica.
En los métodos de la presente invención, la secuencia de nucleótidos puede comprender una o más secuencias de control nativas o una o más de las secuencias de control nativas se pueden sustituir por una o más secuencias de control ajenas a la secuencia de nucleótidos para mejorar la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped.
El término "secuencias de control" se define aquí por incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de interés. Cada secuencia de control puede ser ajena o nativa a la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, secuencia de péptido señal de la presente invención, y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen una secuencia de péptido señal de la presente invención, y señales de parada traduccionales y transcripcionales. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlaces con la intención de introducir sitios de restricción específicos facilitando la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, la cual es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se pueden obtener a partir de genes codificando polipéptidos intracelulares o extracelulares o bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable ácida de Aspergillus Niger, glucoamilasa de Aspergillus Niger o de Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, isomerasa de triosa fosfato de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutral de Aspergillus Niger y la isomerasa de triosa fosfato de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.
En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO- 1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), isomerasa de triosa fosfato de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control puede ser una secuencia del terminador de transcripción adecuada, la cual es reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
Los terminadores preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, sintasa de antranilato de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), y dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, supra.
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La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente enlazada al termino 5' de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido. Cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
Líderes preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae e isomerasa de triosa fosfato de Aspergillus nidulans.
Líderes adecuados para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol dehidrogenasa/dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, la cual está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos y la cual, estando transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, sintasa de antranilato de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región de codificación de propéptido que codifique una secuencia de aminoácidos situada en el amino término de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir a un polipéptido maduro activo por escisión autocatalítica o catalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región de codificación del propéptido se puede obtener de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Donde están presentes tanto el péptido señal como regiones de propéptido en el amino terminal de un polipéptido, la región de propéptido está situada junto al amino término de un polipéptido y la región de péptido señal está situada junto al amino término de la región del propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen a excitar o evitar en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden utilizar el promotor de alfa-amilasa TAKA, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten una amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa el cual se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína los cuales se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido estaría operativamente enlazada con la secuencia reguladora.
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Vectores de expresión
Se describen aquí vectores de expresión recombinantes comprendiendo una secuencia de péptido señal de la presente invención, una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido de interés, y señales de parada traduccionales y transcripcionales. Las diferentes secuencias de nucleótidos y de control anteriormente descritas se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante el cual pueda incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del promotor y/o la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo la secuencia de péptido señal y/o la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de tal manera que la secuencia codificante está operativamente enlazada a una secuencia de péptido señal de la presente invención y una o más secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y pueda provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector dependerá típicamente la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.
Los vectores contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LiS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Son preferido para el uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pirG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces higroscopicus.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, introducido en la célula huésped, se integra en el genoma y se replicado junto con el/los cromosoma(s) en el/los cual(es) se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos los cuales juntos contengan el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
Los vectores contienen preferiblemente un elemento(s) que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido o de cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de nucleótidos adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es)
precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferible un número suficiente de nucleótidos, tal como de 100 a 1.500 par de bases, preferiblemente de 400 a 1.500 par de bases, y de la forma más preferible de 800 a 1.500 par de bases, que sean altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. En cambio, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación permitiendo que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido mediando la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "replicador plásmido" u "origen de replicación" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que habilita a un plásmido o vector para replicarse in vivo.
Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno teniendo una mutación que hace su funcionamiento termosensible en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula micótica filamentosa son AMAI y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores comprendiendo el gen se pueden realizar según los métodos descritos en WO 00/24883.
Más de una copia de una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido se puede insertar en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Un aumento en el número de copias de la secuencia de nucleótidos se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de nucleótidos donde células conteniendo copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
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Células huéspedes
Se describen aquí células huésped recombinantes, comprendiendo una secuencia de péptido señal de la presente invención operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido, la cual se usa ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector comprendiendo una secuencia de péptido señal de la presente invención operativamente enlazado a una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal autorreplicante como se describe anteriormente. El término "célula huésped" comprende cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped depende en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula huésped puede ser cualquier célula fúngica útil en los métodos de la presente invención. "Fungi" como se utiliza en este caso incluye la fila Ascomicota, Basidiomicota, Chitridiomicota, y Zigomicota (como se define por Hawkswort et al., In, Ainsworth y el Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que la Oomicota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
En un aspecto preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomicetales), levadura basidiosporógena, y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomicetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosacaromyces, o Yarrowia.
En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.
En otro aspecto preferido, la célula huésped fúngica es una célula micótica filamentosa. "Hongos (Fungi) filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de una especie de, pero no limitándose a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolipocladium, o Trichoderma.
En un aspecto incluso más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto incluso más preferido, el huésped fúngico filamentoso célula es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto incluso más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
En un aspecto más preferido, la célula de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum A3/5, la cual fue depositada originalmente como Fusarium graminearum ATCC 20334 y recientemente reclasificada como Fusarium venenatum por Yoder y Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 y O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67; al igual que equivalentes taxonómicos de Fusarium venenatum a pesar del nombre de especie por el cual estos se conocen habitualmente. En otro aspecto preferido, la célula de Fusarium venenatum es un mutante morfo-
lógico de Fusarium venenatum A3/5 o ATCC de Fusarium venenatum 20334, como se describe en WO 97/26330.
En otro aspecto más preferido, la célula de Trichoderma es Trichoderma reesei ATCC 56765, Trichoderma reesei ATCC 13631, Trichoderma reesei CBS 526.94, Trichoderma reesei CBS 529.94, Trichoderma longibrachiatum CBS 528.94, Trichoderma longibrachiatum ATCC 2106, Trichoderma longibrachiatum CBS 592.94, Trichoderma viride NRRL 3652, Trichoderma viride CBS 517.94, y Trichoderma viride NIBH FERM/BP 447.
Las células micóticas se pueden transformar mediante un proceso implicando la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus se describen en EP 238 023 y por Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Trichoderma reesei se describen en Penttila et al., 1987, Gene 61: 155-164, and Gruber et al., 1990, Curr Genet. 18(1):71-6. Métodos adecuados para transformar la especies Fusarium se describen por Malardier et al., 1989Gene 78: 147-156 and WO 96/00787. La levadura se puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
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Ejemplos Cepas
Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765 Montenecourt y Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: de 289-301) fue derivada de Trichoderma reesei Qm6A (ATCC 13631 Mandels y Reese, 1957, J. Bacteriol. 73: 269-278).Trichoderma reesei RutC30 y Saccharomyces cerevisiae YNG318 (MAT\alpha, ura3-52, let-2\Delta2, pep4\Delta1; his4-539) (WO97/07205) se usaron como huéspedes para la expresión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae. Se usó Aspergillus fumigatus PaHa34 como la fuente de la Familia GH3A de beta-glucosidasa.
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Medios y soluciones de tampón
El medio YP estuvo compuesto por litro de 10 g de extracto de levadura y 20 g de bactopeptona.
El medio de selección de levadura estuvo compuesto por litro de 6,7 g de base nitrogenada de levadura; 0,8 g de mezcla de suplemento completa (CSM, Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA; carente de uracilo y conteniendo 40 mg/ml de adenina), 5 g de ácidos de casamino (sin aminoácidos), 100 ml de 0,5 m de succinato a pH 5.0, 40 ml de un 50% de glucosa, 1 ml de 100 mM de CuSO_{4}, 50 mg de ampicilina, y 25 mg de cloranfenicol.
El medio de placa de selección de levadura estaba compuesto por litro de medio de selección de levadura suplementado con 20 g de bacto agar y 150 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranosida (X-Glc, INALCO SPA, Milán, Italia) pero carente de ampicilina y cloranfenicol.
Las placas de selección COVE estaban compuestas por litro de 342,3 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acetamida, 15 mM de CsCl_{2}, y 25 g de agar Noble.
Las placas COVE2 estaban compuestas por litro de 30 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acetamida, y 25 g de agar Noble.
La solución salina COVE estaba compuesta por litro de 26 g de KCl, 26 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 76 g de KH_{2}PO_{4}, y 50 ml de metales traza COVE.
La solución de metales traza COVE estaba compuesta por litro de 0,04 g de NaB_{4}O7\cdot10H_{2}O, 0,4 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 1,2 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,7 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,8 g de Na_{2}MoO_{2}\cdot2H_{2}O, y 10 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O.
Los medios de inducción de celulasa estaban compuestos por litro de 20 g de fibras celulósicas naturales Arbocel B800 (J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft, Michigan), 10 g de sólidos de maíz solubles (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1,45 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2,08 g de KH_{2}PO_{4}, 0,28 g de CaCl_{2}, 0,42 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,42 ml de metales traza de Trichoderma reesei, y 2 gotas de ácido plurónico; a pH 6,0 con 10 N de NaOH.
La solución de metales traza de Trichoderma reesei estaba compuesta por litro de 216 g de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 58 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 27 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 10 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,4 g de H_{3}BO_{3}, y 336 g de ácido cítrico.
El tampón PEG estaba compuesto por litro de 500 g de clavija 4000 (BDH, Poole, Inglaterra), 10 mM de CaCl_{2}, y 10 mM de Tris-HCl a pH 7.5 (filtro esterilizado).
El STC estaba compuesto por litro de 1 m de sorbitol, 10 mM de CaCl_{2}, y 10 mM de Tris-HCl a pH 7.5 (filtro esterilizado).
El medio inóculo estaba compuesto por litro de 20 g de glucosa, 10 g de sólidos de maíz solubles (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1,45 g de (NH_{4})_{2} SO_{4}, 2,08 g de KH_{2}PO_{4}, 0,28 g de CaCl_{2}, 0,42 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,42 ml de solución de metales traza de Trichoderma reesei, y 2 gotas de ácido plurónico; a pH final 5.0.
El medio de fermentación estaba compuesto por litro de 4 g de glucosa, 10 g de sólidos de maíz solubles, 30 g de fibras celulósicas naturales Arbocel B800 (J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft, Míchigan), 3,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2,8 g de KH_{2}PO_{4}, 2,08 g de CaCl_{2}, 1,63 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,75 ml de solución de metales traza de Trichoderma reesei, y 1,8 ml de ácido plurónico.
El medio alimento estaba compuesto por litro de 600 g de glucosa, 20 g de celulosa B800, 35,5 g de H_{3}PO_{4}, y 5 ml de ácido plurónico.
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Ensayo de actividad de beta-glucosidasa
Para las muestras de Trichoderma reesei, la actividad de beta-glucosidasa se determinó a temperatura ambiente usando 25 \mul de partes alícuotas de sobrenadantes de cultivo, diluido 1:10 en 50 mM de succinato a pH 5.0, usando 200 \mul de 0,5 mg/ml de p-nitrofenilo-beta-D-glucopiranosida como sustrato en 50 mM de succinato a pH 5.0. Después de 15 minutos de incubación la reacción se detuvo añadiendo 100 \mul de 1 M de Tris-HCl a pH 8.0 y la absorbancia se leyó espectrofotométricamente a 405 nm.
Para muestras de Saccharomyces cerevisiae, muestras de sobrenadante del cultivo se diluyeron 0,6 veces con 0,1 M de succinato a pH 5.0 en placas de microtitulación de 96 pocillos. Veinte cinco \mul de las muestras diluidas fueron tomados de cada pocillo y añadidos a una nueva placa de 96 pocillos, conteniendo 200 \mul de 1 mg/ml de sustrato de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas y la reacción se detuvo añadiendo 2 M de Tris-HCl a pH 9. Las placas se leyeron luego espectrofotométricamente a 405 nm.
Una unidad de actividad beta-glucosidasa correspondió a la producción de 1 \mumol de p-nitrofenilo por minuto por litro a pH 5.0, a temperatura ambiente. Se usó beta-glucosidasa de Aspergillus niger (Novozyme 188, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) como un estándar enzimático.
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Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN se realizó en un ABI3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando química de terminador colorante (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60). Las secuencias se formularon usando phred/phrap/consed (University of Washington, Seattle WA) con cebadores específicos de secuencia.
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Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión pAILo1
El vector de expresión pAlLo1 se construyó modificando pBANe6 (patente estadounidense 6.461.837), el cual comprende el promotor NA2-tpi, la secuencia del terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus Niger (terminador AMG), y el gen de acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS). La modificación de pBANe6 se realizó en primer lugar eliminando tres sitios de restricción NcoI en las posiciones 2051, 2722, y 3397 par de bases del marcador de selección amdS por mutagénesis sitio-dirigida. Todos cambios se diseñaron para ser "silenciosos" dejando la secuencia de proteína real del producto genético de amdS invariado. La eliminación de estos tres sitios se realizó simultáneamente con un GeneEditor Site-Directed Mutagenesis Kit (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante usando los cebadores siguientes (el nucleótido subrayado representa la base cambiada):
AMDS3NcoMut (2050): 5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3'
(SEC ID nº: 1)
AMDS2NcoMut (2721): 5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3'
(SEC ID nº: 2)
AMDS1NcoMut (3396): 5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3'
(SEC ID nº: 3)
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Un plásmido comprendiendo los tres cambios de secuencia previstos se sometió luego a mutagénesis sitio-dirigida, usando un QuickChange Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA), para eliminar el sitio de restricción Nco I al final del terminador AMG en la posición 1643. Los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada) se usaron para la mutagénesis:
Cebador superior para mutagenizar la secuencia del terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (AMG):
5'-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3'
(SEC ID nº: 4)
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Cebador inferior para mutagenizar la secuencia del terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (AMG):
5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3'
(SEC ID nº: 5)
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La última fase en la modificación de pBANe6 fue la adición de un nuevo sitio de restricción Nco I en el principio del poliligador usando un QuickChange Mutagenesis Kit y los siguientes cebadores (los nucleótidos subrayados representan las bases cambiadas) para producir pAlLo1 (Figura 1).
Cebador superior para mutagenizar el promotor de amilasa de Aspergillus niger (NA2-tpi):
5'-CTATATACACAACTGGATTTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3'
(SEC ID nº: 6)
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Cebador inferior para mutagenizar el promotor de amilasa de Aspergillus niger (NA2-tpi):
5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3'
(SEC ID nº: 7)
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El gen amdS de pAlLo1 se cambió por el gen pyrG de Aspergillus nidulans. El plásmido pBANe10 (Figura 14) se usó como una fuente para el gen pyrG como marcador de selección. El análisis de la secuencia de pBANe10 mostró que el marcador pyrG estaba contenido dentro de un fragmento de restricción NsiI y no contiene ninguno de los sitios de restricción NcoI o PacI. Puesto que el amdS también está flanqueado por los sitios de restricción NsiI, la estrategia para cambiar el marcador de selección fue un simple cambio de fragmentos de restricción de NsiI. ADN plásmido a partir de pAILo1 y pBANe10 se digerió con la enzima de restricción NsiI y los productos se purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento NsiI de pBANe10 conteniendo el gen pyrG se ligó al esqueleto de pAILo1 para reemplazar el fragmento de ADN NsiI original conteniendo el gen amdS. Los clones recombinantes se analizaron por digestión de la restricción para determinar que éstas tienen el inserto correcto y también su orientación. Se seleccionó un clon con el gen pyrG transcrito en el sentido contrario a las agujas del reloj. El plásmido nuevo se ha designado como pAlLo2 (Figura 15).
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Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión pMJ04
El vector de expresión pMJ04 se construyó por PCR amplificando el terminador del gen exocellobiohidrolase 1 de Trichoderma reesei (cbh1) a partir de ADN genómico RutC30 de Trichoderma reesei usando los cebadores 993429 (antisentido) y 993428 (sentido) mostrados abajo. El cebador antisentido se creó genéticamente para tener un sitio PacI en el extremo 5' y un sitio SpeI en el extremo 3' del cebador sentido.
Cebador 993429 (antisentido):
5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3'
(SEC ID nº: 8)
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Cebador 993428 (sentido):
5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3'
(SEC ID nº: 9)
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Se aisló ADN genómico de RutC30 de Trichoderma reesei usando un DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Chatsworth, CA).
Las reacciones de amplificación (50 \mul) fueron compuestos de 1X ThermoPol Reaction Buffer (New England Biolabs, Beverly, MA), 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de ADN genómico de RutC30 de Trichoderma reesei, 0,3 \muM de cebador 993429, 0,3 \muM de cebador 993428, y 2 unidades de VENT polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA). Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY) programado de la siguiente manera: 5 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando 40 mM de base de Tris-20 mM de sodio acetato-1 mM de tampón EDTA de disodio (TAE) donde una banda de producto de 229 par de bases se cortó a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante.
El fragmento de PCR resultante se digerió con PacI y SpeI y se ligó en pAlLo01 digerido con las mismas enzimas de restricción usando un Rapid Ligation Kit (Roche, Indianapolis, IN), para generar pMJ04 (Figura 2).
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Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión pCaHj568
El plásmido de expresión pCaHj568 se construyó a partir de pCaHj170 (patente estadounidense 5.763.254) y pMT2188. El plásmido pCaHj170 comprende la región de codificación de la endoglucanasa V de Humicola insolens (EGV). El plásmido pMT2188 se construyó de la siguiente manera: El origen de replicación de pUC19 fue PCR amplificado a partir de pCaHj483 (WO 98/00529) con los cebadores 142779 y 142780 mostrados abajo. El cebador 142780 introduce un sitio BbuI en el fragmento de PCR.
142779: 5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3'
(SEC ID nº: 10)
142780: 5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3'
(SEC ID nº: 11)
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El sistema Expand PCR (Roche Molecular Biochemicals, Basilea, Suiza) se usó para la amplificación siguiendo las instrucciones del fabricante para ésta y las amplificaciones de PCR posteriores. Los productos de PCR se separaron en un 1% de gel de agarosa usando tampón TAE y un fragmento de 1160 par de bases se aisló y purificó usando un Jetquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Wielandstr, Alemania).
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El gen URA3 se amplificó a partir del vector de clonación piES2 de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los cebadores 140288 y 142778 de abajo. El cebador 140288 introduce un sitio Eco RI en el fragmento de PCR.
140288: 5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3'
(SEC ID nº: 12)
142778: 5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3'
(SEC ID nº: 13)
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Los productos de PCR se separaron en un 1% de gel de agarosa usando tampón TAE y un fragmento de 1126 par de bases se aisló y purificó usando un Jetquick Gel Extraction Spin Kit.
Los dos fragmentos de PCR se fundieron mediante mezcla y amplificación usando los cebadores 142780 y 140288 mostrados arriba mediante el método de unión por recubrimiento (Horton et al., 1989, Gene 77: 61-68). Los productos de PCR se separaron en un 1% de gel de agarosa usando tampón TAE y un fragmento de 2263 par de bases se aisló y purificó usando un Jetquick Gel Extraction Spin Kit.
El fragmento resultante se digerió con EcoRI y BbuI y se ligó al fragmento más grande de pCaHj483 digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligadura se usó para transformar la cepa DB6507 de E. coli pyrF negativa (ATCC 35673) hecha competente por el método de Mandel e Higa, 1970, J. Mol. Biol. 45: 154. Se seleccionaron transformantes en medio M9 sólido (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) suplementado por litro con 1 g de casaminoácidos, 500 \mug de tiamina, y 10 mg de canamicina. Un plásmido de un transformante se aisló y designó pCaHj527 (Figura 3).
El promotor NA2/tpi presente en pCaHj527 se sometió a mutagénesis sitio dirigida por un enfoque de PCR simple. Los nucleótidos 134-144 se convirtieron de GTACTAAAACC a CCGTTAAATTT usando el cebador mutagénico 141223:
Cebador 141223: 5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3' (SEC ID nº: 14)
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Los nucleótidos 423-436 se convirtieron de ATGCAATTTAAACT a CGGCAATTTAACGG usando el cebador mutagénico 141222:
Cebador 141222: 5'-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3' (SEC ID nº: 15)
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El plásmido resultante se designó pMT2188 (Figura 4).
La región de codificación de la endoglucanasa V de Humicola insolens se transfirió de pCaHj170 como un fragmento BamHI-SalI en pMT2188 digerido con BamHI y XhoI para generar pCaHj568 (Figura 5).
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Ejemplo 4 Construcción del vector de expresión pMJ05
El vector de expresión pMJ05 se construyó por PCR amplificando la región de codificación de la endoglucanasa V de 915 par de bases de Humicola insolens a partir de pCaHj568 usando los cebadores HiEGV-F y HiEGV-R mostrados abajo.
HiEGV-F (sentido): 5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3'
(SEC ID nº: 16)
HiEGV-R (antisentido): 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'
(SEC ID nº: 17)
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por 1X de tampón de reacción TermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 10 ng/\mul de plásmido pCaHj568, 0,3 \muM de cebador HiEGV-F, 0,3 \muM de cebador HiEGV-R, y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde un producto de banda de 937 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
\newpage
Este fragmento purificado de 937 par de bases se usó como patrón de ADN para amplificaciones posteriores usando los cebadores siguientes:
HiEGV-R (antisentido): 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' 
\hskip1.3cm
(SEC ID nº: 18)
HiEGV-F-recubrimiento (sentido): 5'-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3'
(SEC ID nº: 19) 
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Las secuencias de cebador en cursiva son homólogas por 17 par de bases del promotor cbh1 de Trichoderma reesei y las secuencias de cebador subrayadas son homólogas por 29 par de bases de la región de codificación de la endoglucanasa V de Humicola insolens. El recubrimiento de 36 par de bases entre el promotor y la secuencia codificante permitió la fusión precisa del fragmento de 994 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei al fragmento de 918 par de bases comprendiendo el marco de lectura abierto de la endoglucanasa V de Humicola insolens.
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por 1X de tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 1 ul de fragmento de PCR purificado de 937 par de bases, 0,3 \muM de cebador de HiEGV-F-recubrimiento, 0,3 \muM de cebador HiEGV-R, y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 945 par de bases se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
Un PCR separado se realizó para amplificar la secuencia promotora cbh1 de Trichoderma reesei que se extiende desde 994 par de bases corriente arriba del codón de iniciación ATG del gen a partir del ADN genómico RutC30 de Trichoderma reesei usando los cebadores siguientes (el cebador de sentido se creó genéticamente para tener un sitio de restricción Sal I en el extremo 5'):
TrCBHIpro-F (sentido): 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'
(SEC ID nº: 20)
TrCBHIpro-R (antisentido): 5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3'
(SEC ID nº: 21)
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestos por 1X de tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de ADN genómico RutC30 de Trichoderma reesei, 0,3 \muM de cebador TrCBHIpro-F, 0,3 \muM de cebador TrCBHIpro-R, y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 998 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
El fragmento de PCR purificado de 998 par de bases se usó para como patrón de ADN para amplificaciones posteriores usando los cebadores siguientes:
TrCBHIpro-F: 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' 
\hskip4cm
(SEC ID nº: 22)
TrCBHIpro-R-recubrimiento: 5'-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT 3' (SEC ID nº: 23)
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Las secuencias en cursiva son homólogas por 17 par de bases del promotor cbh1 de Trichoderma reesei y las secuencias subrayadas son homólogas por 29 par de bases de la región de codificación de la endoglucanasa V de Humicola insolens. El recubrimiento de 36 par de bases entre el promotor y la secuencia codificante permitió la fusión precisa del fragmento de 994 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei al fragmento de 918 par de bases comprendiendo el marco de lectura abierto de la endoglucanasa V de Humicola insolens.
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por 1X de tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 1 \mul de fragmento de PCR purificado de 998 par de bases, 0,3 \muM cebador TrCBH1pro-F, 0,3 \muM de cebador TrCBH1pro-R-recubrimiento, y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 1017 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
\newpage
El fragmento de PCR de promotor cbh1 de 1017 par de bases de Trichoderma reesei y los fragmentos de PCR de la endoglucanasa V 945 par de bases de Humicola insolens se usaron como patrón de ADN para la amplificación posterior usando los cebadores siguientes para fusionar de forma precisa el promotor cbh1 de 994 par de bases de Trichoderma reesei a la región de codificación de la endoglucanasa V de 918 par de bases de Humicola insolens usando de superposición de PCR.
TrCBHIpro-F: 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'
(SEC ID nº: 24)
HiEGV-R: 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'
(SEC ID nº: 25)
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestos por 1X de tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 0,3 \muM de cebador TrCBH1pro-F, 0,3 \muM de cebador HiEGV-R, y 2 U de Vent polimerasa. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 1926 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
El fragmento de 1926 par de bases resultante se clonó en el vector pCR-Blunt-II-TOPO usando un Zero Blunt^{TM} TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El plásmido resultante se digerió con NotI y SalI y el fragmento de 1926 par de bases purificado y ligado en el vector de expresión pMJ04 el cual también se digerió con las dos mismas enzimas de restricción, para generar pMJ05 (Figura 6).
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Ejemplo 5 Construcción del vector de expresión pSMai130
Un fragmento de ADN de 2586 par de bases abarcando desde el codón de iniciación ATG hasta el codón de detención TAA de la secuencia codificante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID nº: 42 para la secuencia de ADNc y la SEC ID nº: 43 para la secuencia de aminoácido deducida; E. coli DSM 14240) se amplificó por PCR a partir de pJaL660 (WO 2002/095014) como patrón con los cebadores 993467 (sentido) y 993456 (antisentido) mostrados abajo. Un sitio SpeI se creó genéticamente en el extremo 5' del cebador antisentido para facilitar la ligación. Las secuencias de cebador en cursiva son homólogas a 24 par de bases del promotor cbh1 de Trichoderma reesei y las secuencias subrayadas son homólogas a 22 par de bases de la región de codificación de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae.
Cebador 993467: 5'-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3'
(SEC ID nº: 26)
Cebador 993456: 5'-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' 
\hskip3.6cm
(SEC ID nº: 27) 
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por tampón de amplificación Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,25 mM de dNTPs, 10 ng de plásmido pJaL660, 6,4 \muM de cebador 993467, 3,2 \muM de cebador 993456, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa ofPfx (Invitrogen, Carlsbad, California). Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 55ºC, y 180 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 2586 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
Se realizó un PCR separado para amplificar la secuencia promotora cbh1 de Trichoderma reesei la cual se extiende desde 1000 par de bases corriente arriba del codón de iniciación ATG del gen, usando el cebador 993453 (sentido) y el cebador 993463 (antisentido) mostrado abajo para generar un fragmento de PCR de 1000 par de bases. Las secuencias de cebador en cursiva son homólogas al promotor cbh1 de 24 par de bases de Trichoderma reesei y secuencias de cebador subrayadas son homólogas al Región de codificación de la beta-glucosidasa de 22 par de bases de Aspergillus oryzae. El recubrimiento de 46 par de bases entre el promotor y la secuencia codificante permite la fusión precisa del fragmento de 1000 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei al fragmento de 2586 par de bases comprendiendo el marco de lectura abierto de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae.
Cebador 993453: 5'-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3' 
\hskip3.2cm
(SEC ID nº: 28)
Cebador 993463: 5'-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3'
(SEC ID nº: 29) 
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM dNTPs, 100 ng de ADN genómico RutC30 de Trichoderma reesei, 6,4 \muM de cebador 993453, 3,2 \muM de cebador 993463, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 55ºC, y 180 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 1000 par de bases se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos purificados se usaron como patrón de ADN para la amplificación posterior usando el cebador 993453 (sentido) y el cebador 993456 (antisentido) mostrado arriba para fusionar de forma precisa el fragmento de 1000 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei al fragmento de 2586 par de bases comprendiendo el marco de lectura abierto de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae por superposición de PCR.
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM de dNTPs, 6,4 \muM de cebador 99353, 3,2 \muM de cebador 993456, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 60ºC, y 240 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos).
El fragmento de 3586 par de bases resultante se digerió con SalI y SpeI y se ligó en pMJ04, digerido con las dos mismas enzimas de restricción, para generar pSMai130 (Figura 7).
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Ejemplo 6 Construcción de pSMai135
La región de codificación de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (menos la secuencia señal nativa, véase Figura 8) desde Lys-20 hasta el codón de detención TAA se amplificó por PCR a partir de pJaL660 como patrón con el cebador 993728 (sentido) y el cebador 993727 (antisentido) mostrado abajo. Las secuencias en cursiva son homólogas por 20 par de bases de la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens y las secuencias subrayadas son homólogas por 22 par de bases de la región de codificación de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae. Un sitio SpeI se creó genéticamente en el extremo 5' del cebador antisentido.
993728: 5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3' 
\hskip1cm
(SEC ID nº: 30)
Cebador 993727: 5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' 
\hskip3cm
(SEC ID nº: 31) 
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM de dNTPs, 10 ng/\mul de pJa1660, 6,4 \muM de cebador 993728, 3,2 \muM de cebador 993727, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 55ºC, y 180 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 2523 par de bases se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
Se realizó una amplificación por PCR separada para amplificar 1000 par de bases del promotor cbh1 de Trichoderma reesei y 63 par de bases de la secuencia señal putativa de la endoglucanasa V de Humicola insolens (codón de iniciación ATG a Ala-21, Figura 9, SEC ID nº: 36), usando el cebador 993724 (sentido) y el cebador 993729 (antisentido) mostrado abajo. Las secuencias de cebador en cursiva son homólogas por 20 par de bases de la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens y las secuencias de cebador subrayadas son homólogas a los 22 par de bases de la región de codificación de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae. El plásmido pMJ05, el cual comprende la región de codificación de la endoglucanasa V de Humicola insolens bajo el control del promotor cbh1, se usó como un patrón para generar un fragmento de 1063 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei/fragmento de secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens. Un recubrimiento de 42 par de bases se compartió entre el promotor cbh1 de Trichoderma reesei/secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens y la secuencia de codificación de Aspergillus oryzae para proporcionar un enlace perfecto entre el promotor y el codón de iniciación ATG de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de 2523 par de bases.
Cebador 993724: 5'-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3' 
\hskip3cm
(SEC ID nº: 32)
Cebador 993729: 5'-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA-3' (SEC ID nº: 33)
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Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM de dNTPs, 10 ng/\mul de pMJ05, 6,4 \muM de cebador 993728, 3,2 \muM de cebador 993727, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 60ºC, y 240 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 1063 par de bases se extrajo a partir del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos de superposición purificados se usaron como un patrón para la amplificación usando el cebador 993724 (sentido) y el cebador 993727 (antisentido) anteriormente descritos para fusionar de forma precisa el fragmento de 1063 par de bases comprendiendo el promotor cbh1 de Trichoderma reesei/secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens al fragmento de 2523 par de bases comprendiendo el marco de lectura abierto de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae por superposición de PCR.
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestos por tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM de dNTPs, 6,4 \muM de cebador 993724, 3,2 \muM de cebador 993727, 1 mM de MgCl_{2}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos de 60 segundos cada uno a 94ºC, 60 segundos a 60ºC, y 240 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 3591 par de bases se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
El fragmento de 3591 par de bases resultante se digerió con SalI y SpeI y se ligó en pMJ04 digerido con las mismas enzimas de restricción para generar pSMai135 (Figura 10).
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Ejemplo 7 Expresión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae comparando la señal de secreción nativa y heteróloga endoglucanasa V de Humicola insolens en Trichoderma reesei
El plásmido pSMai130, en el cual la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae se expresa a partir del promotor cbh1 y la señal de secreción nativa (Figura 8, SEC ID Nos: 34 (secuencia de ADN) y 35 (secuencia de aminoácidos deducida), o pSMai135 codificando la enzima madura de Aspergillus oryzae enlazada a la señal de secreción de beta-glucosidasa vinculada a la endoglucanasa V de Humicola insolens (Figura 9, SEC ID Nos: 36 (secuencia de ADN) y 37 (secuencia de aminoácidos deducida), se introdujo en RutC30 de Trichoderma reesei por transformación mediada por PEG (Penttila et al., 1987, supra). Ambos plásmidos contienen el gen amdS de Aspergillus nidulans para permitir que los transformantes crezcan en acetamida como la única fuente de nitrógeno.
El RutC30 de Trichoderma reesei se cultivó a 27ºC y 90 r.p.m. En 25 ml de medio YP suplementado con un 2% (p/v) de glucosa y 10 mM de uridina durante 17 horas. Los micelios se recogieron por filtración usando el Millipore's Vacuum Driven Disposable Filtration System (Millipore, Bedford, MA) y se lavaron dos veces con agua desionizada y dos veces con 1,2 M de sorbitol. Los protoplastos se generaron suspendiendo los micelios lavados en 20 ml de 1,2 M de sorbitol conteniendo 15 mg de Glucanex (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) por ml y 0,36 unidades de quitinasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) por ml e incubándolos durante 15-25 minutos a 34ºC con agitación suave a 90 r.p.m. Los protoplastos se recogieron por centrifugado durante 7 minutos a 400 x g y se lavaron dos veces con 1,2 M de sorbitol frío. Los protoplastos se contaron usando un hemacitómetro y se resuspendieron en STC hasta llegar a una concentración final de 1 X 10^{8} protoplastos por ml. El exceso de protoplastos se almacenó en un contenedor criogénico Cryo 1ºC Freezing Container (Nalgene, Rochester, NY) a -80ºC.
Aproximadamente 7 \mug de plásmido de expresión PME I digerido (pSMai130 o pSMai135) se añadieron a 100 \mul de solución de protoplasto y se mezclaron suavemente, seguido de 260 \mul de tampón PEG, mezclado, e incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entonces se añadió STC (3 ml), se mezcló y la solución de transformación se colocó sobre placas COVE usando selección amdS de Aspergillus nidulans. Las placas se incubaron a 28ºC durante 5-7 días. Los transformantes se sub-cultivaron sobre placas COVE2 y se maduraron a 28ºC.
Ciento diez transformantes positivos de amdS se obtuvieron con pSMai130 y 65 transformantes con pSMai135. Veinte transformantes designaron el SMA130 obtenido con pSMai130 (señal de secreción nativa) y 67 transformantes designaron el SMA135 obtenido con pSMai135 (señal de secreción heteróloga) se subcultivaron sobre placas nuevas conteniendo acetamida y se dejaron esporular durante 7 días a 28ºC.
Los 20 transformantes de SMA130 y los 67 transformantes de SMA135 de Trichoderma reesei se cultivaron en frascos de agitación disipados de 125 ml conteniendo 25 ml de medio de inducción de celulasa a pH 6.0 inoculados con esporas de los transformantes e incubados a 28ºC y 200 r.p.m. durante 7 días. El RutC30 de Trichoderma reesei se utilizó como un control. Las muestras de caldo de cultivo se retiraron el día 7. Un ml de cada caldo de cultivo se centrifugó a 15.700 x g durante 5 minutos en un micro-centrifugador y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Se almacenaron muestras a 4ºC hasta el ensayo enzimático. Los sobrenadantes se sometieron a ensayo para observar la actividad beta-glucosidasa usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida como sustrato, como se ha descrito anteriormente.
Todos y cada uno de los 20 transformantes de SMA130 mostraron actividad beta-glucosidasa equivalente a la de la cepa huésped, RutC30 de Trichoderma reesei. En cambio, varios transformantes de SMA135 mostraron actividades beta-glucosidasa varias veces mayor que la de RutC30 de Trichoderma reesei. El transformante SMA135-04 produjo la mayor actividad beta-glucosidasa teniendo 7 veces más actividad beta-glucosidasa que la producida por RutC30 de Trichoderma reesei como control.
La SDS-PAGE se efectuó usando los geles (5% de resolución) Criterion Tris-HCl (BioRad, Hercules, CA) con The Criterion System (BioRad, Hercules, CA). Cinco \mul de sobrenadantes del día 7 (véase arriba) se suspendieron en una concentración de 2X de tampón Laemmli Sample Buffer (BioRad, Hercules, CA) y se hirvieron en presencia de un 5% de beta-mercaptoetanol durante 3 minutos. Las muestras de sobrenadantes se colocaron sobre un gel de poliacrilamida y se sometieron a electroforesis con 1X de Tris/Glicina/SDS como tampón de desplazamiento (BioRad, Hercules, CA). El gel resultante se manchó con Safe Coomassie Stain de BioRad.
No se hizo visible ninguna proteína de beta-glucosidasa mediante SDS-PAGE para los sobrenadantes del caldo de cultivo transformantes de SMA130 de Trichoderma reesei. En cambio, 26 de los 38 transformantes de SMA135 de Trichoderma reesei produjeron una proteína de aproximadamente 110 kDa que no fue visible en RutC30 de Trichoderma reesei como control. el transformante Trichoderma reesei SMA135-04 produjo el mayor nivel de beta-glucosidasa.
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Ejemplo 8 Fermentación de Aspergillus oryzae SMA135-04
La fermentación se realizó sobre Aspergillus oryzae SMA135-04 para determinar el nivel de producción de actividad beta-glucosidasa. La Trichoderma reesei RutC30 (cepa huésped) se utilizó como control. Esporas de Trichoderma reesei SMA135-04 se inocularon en matraces de agitación de 500 ml, conteniendo 100 ml de medio inóculo. Los matraces se colocaron en un agitador orbital a 28ºC durante aproximadamente 48 horas tras las cuales se inocularon 50 ml del cultivo en 1,8 litros de medio de fermentación (véase arriba) en un vaso de fermentación de 2 litros. Las fermentaciones se realizaron a pH 5.0, 28ºC, con oxígeno disuelto mínimo a un 25% a un 1,0 WM de flujo de aire y una agitación de 1100. El medio alimenticio se administró en el vaso de fermentación a las 18 horas con una velocidad de administración de 3,6 g/hora durante 33 horas y después de 7,2 g/hora. Las fermentaciones se realizaron durante 165 horas tras las cuales se centrifugaron los caldos de fermentación finales y se almacenaron los sobrenadantes a -20ºC hasta el ensayo de actividad beta-glucosidasa usando el procedimiento anteriormente descrito.
La actividad beta-glucosidasa en la muestra de fermentación de Trichoderma reesei SMA135-04 se determinó como aproximadamente 8 veces más activa que la de Trichoderma reesei RutC30.
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Ejemplo 9 Construcción de los vectores de expresión de Saccharomyces cerevisiae pSATe111 y pALFd1
Un fragmento de ADN de 2,605 par de bases comprendiendo la región que va desde el codón de iniciación ATG hasta el codón de detención TAA de la secuencia codificante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID nº: 42 para la secuencia de ADNc y SEC ID nº: 43 para la secuencia de aminoácidos deducida) se amplificó por PCR a partir de pJaL660 (WO 2002/095014) como patrón con los cebadores 992127 (sentido) y 992328 (antisentido) mostrados abajo:
992127: 5'-GCAGATCTACCATGAAGCTTGGTTGGATCGAG-3'
(SEC ID nº: 38)
992328: 5'-GCCTCAGATTACTGGGCCTTAGGCAGCGAG-3'
(SEC ID nº: 39)
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El cebador 992127 tiene un sitio BglII superior y el cebador 992328 tiene un sitio XhoI inferior.
Las reacciones de amplificación (50 \mul) estaban compuestas por 1X de tampón PCR conteniendo MgCl_{2} (Roche Applied Science, Manheim, Alemania), 0,25 mM de dNTPs, 50 \muM de cebador 992127, 50 \muM de cebador 992328, 80 ng de pJaL660, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pwo (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado para 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos seguidos de 25 ciclos cada uno a 94ºC durante 60 segundos, a 55ºC durante 60 segundos, y a 72ºC durante 120 segundos (extensión final de 10 minutos). El producto de PCR se subclonó entonces en el vector Blunt II-TOPO usando el TOPO PCR Cloning Kit TOPO ZeroBlunt^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante para generar el plásmido pSATe101 (Figura 11). El plásmido pSATe101 se digerió con BglII y XhoI para liberar el gen de beta-glucosidasa. Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 2,6 kb se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
\newpage
El producto de PCR de 2,6 kb se digerió y se clonó en los sitios BamHI y XhoI del vector de expresión pCu426 de 2 \muM de levadura inducible mediante cobre (Labbe y Thiele, 1999, Methods Enzymol. 306: 145-53), para generar pSATel11 (Figura 12).
El plásmido pALFd1 se construyó para determinar si la producción mejorada de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae y la secreción podrían conseguirse también en Saccharomyces cerevisiae intercambiando la señal de secreción de beta-glucosidasa nativa de Aspergillus oryzae con el péptido señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens.
El plásmido pSATe111 se digerió con XhoI y SpeI para liberar los fragmentos de 2,6 kb (beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae) y 6 kb (resto del vector). El fragmento de 6 kb se aisló y ligó al fragmento de PCR de 2.6 kb, conteniendo la región de codificación de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (menos la secuencia señal de secreción) y la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens, la cual se amplificó a partir de pSMai135 usando los cebadores 993950 y 993951 mostrados abajo. Los cebadores contienen los sitios de restricción XhoI y SpeI en sus extremos para la subclonación posterior en los sitios de restricción XhoI y SpeI de pSATe111.
993950: 5'-AATCCGACTAGTGGATCTACCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' 
\hskip1.2cm
(SEC ID nº: 40)
Cebador 993951: 5'-GCGGGCCTCGAGTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' 
\hskip1.5cm
(SEC ID nº: 41) 
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Las reacciones de amplificación (100 \mul) estaban compuestas de tampón Thermo Pol Buffer de PCR, 0,20 mM de dNTPs, 0,14 \mug de ADN plásmido de pSMai135, 50 \muM de cebador 993950, 50 \muM de cebador 993951, y 2 unidades de Vent ADN polimerasa. Las reacciones se incubadas en un RoboCycler Gradient 40 Thermal Cycler (Stratagene, La Jolla, CA) programado de la siguiente manera: un ciclo de 1 minuto a 95ºC, 25 ciclos de 1 minuto cada uno a 95ºC, 1 minuto a 60ºC o 64ºC, y 3 minutos a 72ºC (extensión final de 10 minutos). Los productos reactivos se hicieron visibles en un 0,7% de gel de agarosa usando tampón TAE. Las bandas de fragmento de 2,6 kb resultantes se purificaron usando un MinElute PCR Purification de PCR (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos purificados se combinaron y digirieron con XhoI y SpeI y se ligaron en pSATe111 digerido con las dos mismas enzimas de restricción para generar pALFd1 (Figura 13).
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Ejemplo 10 Expresión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae comparando la señal de secreción nativa y heteróloga en Saccharomyces cerevisiae
El plásmido pALFd1 (aproximadamente 600 ng) se transformó en células competentes recién creadas de Saccharomyces cerevisiae YNG 318 según el protocolo YEASTMAKER Yeast Transformation Protocol, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. Las células transformadas se colocaron sobre placas de selección de levadura conteniendo 0,15 mg del sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranosida por ml, el cual produce colonias azules cuando la beta-glucosidasa está presente. Las placas se incubaron a 30ºC durante 4 días.
Las colonias conteniendo el vector de expresión con la señal de secreción de la endoglucanasa V de Humicola insolens eran generalmente de un color azul más oscuro que las colonias que el que tenía la secuencia señal de beta-glucosidasa nativo de Aspergillus oryzae, indicando que se segregó más beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae usando la señal de secreción de la endoglucanasa V de Humicola insolens. Aproximadamente, 242 colonias azules de ambos constructos se escogieron usando un recolector de colonias automatizado (QPix, Genetix USA, Inc., Boston, MA). Los 242 transformantes se inocularon en medio de selección de levadura (el cual contiene cobre) para inducir la expresión y la secreción de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae. Se tomó caldo del día 7 del cultivo de 96 pocillos de cada una de las 245 colonias y se sometió a ensayo para observar la actividad beta-glucosidasa usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida como sustrato como se ha descrito anteriormente. Los resultados mostraron que las colonias expresando beta-glucosidasa con la secuencia señal heteróloga eran 6,6 veces más activas que las colonias que se transformaron con la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae con la señal de secreción nativa.
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Ejemplo 11 Identificación de un gen de la familia GH3A de la glicosil hidrolasa en la secuencia genómica de Aspergillus fumigatus
Una búsqueda tblastn (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) de la secuencia genómica parcial de Aspergillus fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) se efectuó usando como criterio de búsqueda una secuencia de proteína de beta-glucosidasa a partir de Aspergillus aculeatus (Nº de Accesión P48825). Diferentes genes se identificaron como homólogos putativos de la familia GH3A en base a un alto grado de similitud con la secuencia del criterio de búsqueda en el nivel aminoácido. Una región genómica de aproximadamente 3000 par de bases con más de un 70% de identidad con la secuencia del criterio de búsqueda en el nivel aminoácido se seleccionó elegido para un posterior estudio.
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Ejemplo 12 Extracción de ADN genómico de Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus PaHa34 se cultivó en 250 ml de medio de dextrosa de patata en un matraz de agitación disipado a 37ºC y 240 r.p.m. Los micelios se cosecharon por filtración, se lavaron dos veces en tampón TE (10 mM de Tris-1 mM de EDTA), y se congelaron bajo nitrógeno líquido. Los micelios congelados se cultivaron por mortero y a mano de mortero hasta obtener un polvo fino, el cual se resuspendió en tampón a pH 8.0 conteniendo 10 mM de Tris, 100 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 0,5 M guanidina-HCl, y 200 mM de NaCl. Se añadió ribonucleasa A sin ADNsa en una concentración de 20 \mug/ml y el lisado se incubó a 37ºC durante 30 minutos. El detrito celular se eliminó por centrifugado, y el ADN se aisló usando una columna Qiagen Maxi 500 (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). Las columnas se equilibraron en 10 ml de QBT, se lavaron con 30 ml de QC, y se eluyeron con 15 ml de QF (todos los tampones de QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). El ADN se precipitó en isopropanol, se lavó en un etanol al 70%, y se recuperó por centrifugado. El ADN se resuspendió en tampón TE.
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Ejemplo 13 Clonación del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A y construcción de un vector de expresión de Aspergillus oryzae
Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados abajo se diseñaron para amplificar por PCR un gen de PaHa34 de Aspergillus fumigatus codificando una beta-glucosidasa de la familia GH3A a partir del ADN genómico preparado en el Ejemplo 14. Un InFusion Cloning Kit (BD Biosciences, Palo Alto, CA) se usó para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pAlLo2 (Figura 14), sin la necesidad de digestiones de restricción y ligación.
Cebador directo: 5'-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3'
(SEC ID nº: 44)
Cebador inverso: 5'-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3'
(SEC ID nº: 45)
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Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pAlLo2, descritos en el Ejemplo 7.
Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción de PCR conteniendo 100 ng de ADN genómico de Aspergillus fumigatus, 1X Pfx de tampón de amplificación, 1,5 \mul de 10 mM de mezcla de DATP, dTTP, DGTP, y DCTP, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx, 1 \mul de 50 mM de MgSO4 y 2,5 \mul de 10X de solución intensificadora pCRx (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un volumen final de 50 \mul. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: un ciclo a 94ºC durante 2 minutos; y 30 ciclos a 94ºC cada uno durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 68ºC durante 3 minutos. El bloque de calor pasó entonces a un ciclo de remojo a 4ºC.
Los productos reactivos se aislaron en un 1.0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de producto de 3 kb se extrajo del gel y se purificó usando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.
El fragmento se clonó entonces en el vector de expresión pAlLo2 usando un Infusion Cloning Kit. El vector se digerió con NcoI y PacI. El fragmento se purificó por electroforesis en gel y purificación en gel QIAquick. El fragmento de gen y el vector digerido se ligaron juntos en una reacción dando como resultado el plásmido de expresión pEJG97 (Figura 15) en el cual transcripción del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A estaba bajo el control del promotor NA2-tpi. La reacción de ligación (50 \mul) estaba compuesta por 1X de tampón InFusion Buffer (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1X de BSA (BD BiocienciasBiosciences, Palo Alto, CA), 1 \mul de enzima de infusión (diluido 1: 10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 150 ng de pAlLo2 digerido con NcoI y PacI, y 50 ng del producto de PCR purificado de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un \mul de la reacción se usó para transformar células XL10 Solopac Gold de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E. coli conteniendo el plásmido pEJG97 se detectó por digestión de restricción del ADN
plásmido.
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Ejemplo 14 Caracterización de la secuencia genómica de Aspergillus fumigatus codificando una beta-glucosidasa de la familia GH3A
La secuenciación del ADN del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a partir de pEJG97 se realizó como se describe previamente usando una estrategia de desplazamiento de cebador. Un modelo de gen para la secuencia de Aspergillus fumigatus se construyó en base a la similitud a genes homólogos de Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, y Aspergillus kawachii. La secuencia de nucleótidos (SEC ID nº: 46) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID nº: 47) se muestran en la Figura 16. El fragmento genómico codifica un polipéptido de 863 aminoácidos, interrumpido por 8 intrones de 62, 55, 58, 63, 58, 58, 63 y 51 par de bases. El contenido %G+C del gen es del 54.3%. Usando el programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predijo un péptido señal de 19 residuos. La proteína madura predicha contiene 844 aminoácidos con una masa molecular de 91,7 kDa.
Una alineación comparativa de secuencias de beta-glucosidasa se determinó usando el método Clustal W (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el Software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguiente parámetros de alineación múltiple: Gap penalty de 10 y gap length penalty de 10. Los parámetros de alineación por pares fueron Ktuple=1, gap penalty=3, window=5, y diagonals=5. La alineación mostró que la secuencia de aminoácidos deducida del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus comparte un 78%, 76%, y 76% de identidad a las secuencias de aminoácidos deducidas de las beta-glucosidasas del Aspergillus aculeatus (número de accesión P48825), Aspergillus niger (número de accesión 000089), y Aspergillus kawachii (número de accesión P87076).
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Ejemplo 15 Expresión del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A de Aspergillus fumigatus en Aspergillus oryzae JAL250
Se prepararon protoplastos de Aspergillus oryzae Jal250 según el método de Christensen et al., 1988, Bio/
Technology 6: 1419-1422. Cinco \mug de pEJG97 (así como pAILo2 como control de vector) se usaron para transformar Aspergillus oryzae JAL250.
La transformación de Aspergillus oryzae Jal250 con pEJG97 liberó aproximadamente 100 transformantes. Diez transformantes se aislaron a placas PDA individuales.
Placas PDA confluyentes de cinco de los diez transformantes se lavaron con 5 ml de 0,01% Tween 20 y se inocularon separadamente en 25 ml de medio MDU2BP en frascos de agitación de vidrio de 125 ml y se incubaron a 34ºC, 250 r.p.m. Cinco días tras la incubación, 0,5 \mul de sobrenadante de cada cultivo se analizaron usando un 8-16% de geles de SDS-PAGE de Tris-Glicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Los perfiles SDS-PAGE de los cultivos mostraron de los transformantes (designado transformante 1) tenía una banda mayor de aproximadamente 130 kDa.
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Ejemplo 16 Extracción del ARN total de Aspergillus oryzae
El transformante de Aspergillus oryzae descrito en Ejemplo 13 se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. Posteriormente, el tejido congelado puso en un molinillo de café eléctrico con unos trozos pequeños de hielo seco adicionado para mantener los micelios en polvo congelados. Después, el material colocado se transfirió con una espátula a un tubo cónico estéril de 50 ml el cual se había rellenado previamente previamente con 20 ml de Fenozol (Active Motif, Inc., Carlsbad, CA). La mezcla se mezcló rápidamente para disolver el material congelado a una solución gruesa, y se colocó en un baño maría a 50ºC durante 15 minutos. Cinco ml de cloroformo sin ribonucleasa se añadieron a la mezcla y ésta se removió enérgicamente. Luego, la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después la mezcla se centrifugó a 1300 x g en un centrifugador Sorvall RT7 (Sorvall, Inc, Newtown, CT) a temperatura ambiente durante 20 minutos. La fase superior se transfirió a un tubo cónico nuevo y se añadió un mismo volumen de fenol-cloroformo-isoamilalcohol (25:24:1). La mezcla se removió y centrifugó durante 10 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces de modo que se hicieron tres extracciones de fenol-cloroformo-isoamilalcohol. Luego, la fase superior se transfirió a un tubo nuevo y se añadió un mismo volumen de cloroformo:isoamilalcohol (24:1). La mezcla se removió otra vez y se centrifugada durante 10 minutos. Después del centrifugado, la fase acuosa (aproximadamente 5 ml) se transfirió a un tubo nuevo Oak Ridge y se añadieron 0,5 ml de 3 m de acetato sódico a pH 5.2 y 6,25 ml de isopropanol. La mezcla se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos, a 4ºC en un Sorvall RC5B (Sorvall, Inc, Newtown, CT). Tras el centrifugado, el sobrenadante se eliminó y 18 ml de etanol al 70% se añadieron cuidadosamente al granulado. Otra etapa de centrifugado se realizó durante 10 minutos a 4ºC a 12.000 x g. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y el granulado se secó al aire. El granulado de ARN se resuspendió en 500 \mul de agua tratado con pirocarbonato dietilo (DEPC). Un calentamiento a 65ºC durante 10 minutos ayudó en la resuspensión. El ARN total se almacenó a -80ºC. La cuantificación y la evaluación de la calidad del ARN se hizo en un bioanalizador Agilent Bioanalyzer 2100 (Englewood, Co) usando trocitos de ARN. Todos los materiales y reactivos usados en este protocolo estaban libres de ribonucleasa.
\newpage
Ejemplo 17 Clonación de secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus
El ARN total descrito en el Ejemplo 16 se usó para clonar la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 48 para la secuencia de ADNc y SEC ID nº: 49 para la secuencia de aminoácidos deducida). El ARNM del ARN total se purificó usando un Poly(A)Purist Mag Kit (Ambion, Inc., Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, se amplificado después en dos fragmentos: un fragmento de ADN de 1,337 par de bases midiendo por palmos desde el codón de iniciación ATG hasta la posición 1,332 (marcado como fragmento 5') y un segundo fragmento de ADN de 1,300 par de bases (marcado como fragmento 3') midiendo por palmos desde la posición 1,303 hasta el codón de detención usando el sistema ProStar UltraHF RT- PCR System (Stratagene, La Jolla, CA), siguiendo el protocolo del fabricante para una reacción de 50 \mul usando 200 ng de poly-A ARNm con los cebadores Afuma (sentido) y Afumc (antisentido) para el fragmento 5' y los cebadores Afumd (sentido) y Afumb (antisentido) para el fragmento 3' como se muestra abajo:
Afuma: 5'-GGCTCATGAGATTCGGTTGGCTCGAGGTC-3'
(SEC ID nº: 50)
Afumc: 5'-GCCGTTATCACAGCCGCGGTCGGGGCAGCC-3'
(SEC ID nº: 51)
Afumd: 5'-GGCTGCCCCGACCGCGGCTGTGATAACGGC-3'
(SEC ID nº: 52)
Afumb: 5'-GCTTAATTAATCTAGTAGACACGGGGCAGAGGCGC-3'
(SEC ID nº: 53)
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El cebador Afuma tiene un sitio BspHI superior y el cebador Afumb tiene un sitio PacI inferior. Veinte nueve nucleótidos en el extremo 3' del fragmento 1,337 se solaparon con el extremo 5' del fragmento 1,303. En la región de recubrimiento sólo había un único sitio SacII.
Ambos fragmentos se subclonaron individualmente en el vector PCR-BluntII-TOPO usando un equipo Zero Blunt^{TM} TOPO PCR Cloning Kit para la secuenciación, siguiendo el protocolo del fabricante, la generación de los plásmidos pCR4BIunt-TOPOAfcDNA5' (Figura 17) y pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3' (Figura 18), conteniendo los fragmentos 5' y 3', respectivamente.
La región de codificación entera de ambos fragmentos de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus se confirmó mediante secuenciación usando 0,5 \mul de cada ADN plásmido y 3,2 pmol de los siguientes cebadores:
BGLU1.dir: 5'-ACACTGGCGGAGAAGG-3'
(SEC ID nº: 54)
BGLU2.dir: 5'-GCCCAGGGATATGGTTAC-3'
(SEC ID nº: 55)
BGLU3.dir: 5'-CGACTCTGGAGAGGGTTTC-3'
(SEC ID nº: 56)
BGLU4.inv: 5'-GGACTGGGTCATCACAAAG -3'
(SEC ID nº: 57)
BGLU5.inv: 5'-GCGAGAGGTCATCAGCA -3'
(SEC ID nº: 58)
M13 directo: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
(SEC ID nº: 59)
M13 inverso: 5'-CAGGAAACAGCTATGA-3'
(SEC ID nº: 60)
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Los resultados de la secuenciación indicaron la presencia de diferentes cambios de nucleótidos al comparar la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus obtenida con la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus deducida de los datos de genoma de The Institute for Genomic Research (Instituto para investigación genómica) (Rockville, MD). En la posición 500, T se sustituyó por C, de modo que la secuencia codificante GTT se cambió a GCT, de modo que la valina se sustituyó por alanina. En la posición 903, T se sustituyó por C, de modo que la secuencia codificante CCC se cambió a CCT, no obstante, este cambio fue silencioso. En la posición 2,191, G se sustituyó por C, de modo que la secuencia codificante CAG se cambió por GAG, de modo que el ácido glutámico se sustituyó por glutamina. Finalmente, en la posición 2.368, C se sustituyó por T, de modo que la secuencia codificante CTG se cambió a TTG, no obstante, este cambio también fue silencioso.
Una vez se habían secuenciado los dos fragmentos, ambos clones conteniendo cada fragmento se digirieron usando aproximadamente 9 \mug de cada ADN plásmido con SacII y PmeI. La digestión del vector pCR4Blunt-TOPOAfcDNA5' con las enzimas anteriores generó un fragmento de 3,956 par de bases (conteniendo la mayor parte del vector) y un segundo fragmento de y 1,339 par de bases (conteniendo el fragmento 5' del ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus). La digestión del vector pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3' con estas mismas enzimas generó un fragmento de 5.227 par de bases (conteniendo la mayor parte del Vector pCR4Blunt- TOPO y el fragmento 3' del ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus) y un segundo fragmento de 31 par de bases.
El vector pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3' digerido se trató con fosfatasa alcalina de gamba para la defosforilación de los productos de ADN digeridos añadiendo 1X de tampón SAP y 1 \mul de fosfatasa alcalina de gamba (Roche Applied Science, Manheim, Alemania) e incubando la reacción durante 10 minutos a 37ºC seguido de una incubación a 85ºC durante 10 minutos para la inactivación enzimática. Ambas digestiones se llevaron a cabo en un 0,7% gel de agarosa con tampón TAE y se purificaron usando un QIAGEN Gel Purification Kit según las instrucciones del fabricante. La banda de 1,339 par de bases generada a partir de la digestión de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA5' y el fragmento de 5,527 par de bases generado a partir de la digestión de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3' se ligaron usando el Rapid DNA Ligation Kit (Roche Applied Science, Manheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción de ligación se transformó en células competentes para la subclonación de E. coli XL1-Blue según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). Tras la transformación, ADN plásmido de una colonia aislada se secuenció para confirmar que tanto el fragmento 5' como el 3' del ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus se subclonaron en serie generando un vector pCR4Blunt-TOPOAfcDNA de 6,566 par de bases (Figura 19).
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Ejemplo 18 Construcción de los vectores de expresión de Sacharomices cerevisiae pALFd6 y pALFd7
El ADNc en su longitud total de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus se amplificó por PCR usando los cebadores siguientes los cuales tienen homología a pCu426 y a las secuencias 5' y 3' del ADNc de la beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus:
AfumigatusBGUpper:
1
ATGAGATTCGGTTGGCTCG tiene homología con el extremo 5' del ADNc de Aspergillus fumigatus
AfumigatusBGLower:
5'-GCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGACTCGAGCTAGTAGACACGGGGCAGAG-3' {}\hskip14cm (SEC ID nº: 62)
CTAGTAGACACGGGGCAGAG tiene homología al extremo 3' del ADNc de Aspergillus fumigatus 
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La reacción de amplificación (100 \mul) estaba compuesta por 0,5 \mul del plásmido pCR4Blunt-TOPOAfcDNA conteniendo la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus, 1X de tampón de amplificación Pfx, 50 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 50 pmole de cada uno de los cebadores de arriba, 1,5 mM de MgSO4, y 2,5 unidades de ADN polimerasa de Pfx Platinum. Las reacciones se incubaron en un RoboCycler Gradient 40programado para 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos; 25 ciclos cada uno a 95ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 3 minutos; y un ciclo de extensión final a 72ºC durante 10 minutos. La reacción de PCR se purificó usando un QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA). El ADN se eluyó en 30 \mul de tampón EB (QIAGEN Inc., Valencia, CA). El producto de PCR comprendía 37 par de bases de secuencia de ADN homóloga la cual se mezcló con 1 \mul de pCU426 adicionado con SpeI y XhoI para la cotransformación en células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318 como se describe en el Ejemplo 10. Estas colonias no se volvieron azules, sugiriendo algún error de secuenciación en la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. Otro secuenciación de la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus indicó una inserción de un nucleótido extra en la secuencia de ADNc, la cual interrumpido el marco de lectura abierto de la enzima. Por lo tanto, este constructo debía de fijarse.
Simultáneamente a la expresión del ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus en Saccharomyces cerevisiae, la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens se cambió por la secuencia señal nativa de la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus también para la expresión en Saccharomyces cerevisiae para comparar la expresión de las enzimas con ambas secuencias de señal. La secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus se amplificó por PCR con un cebador el cual tiene homología a la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens en pALFd1 así como homología al extremo 5' de la secuencia de ADNc madura de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. Los cebadores usados para la amplificación de la secuencia de ADNc de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus son el cebador AfumigatusBGLower descrito antes y el cebador HiEGVAfumigatus descrito abajo:
HiEGVAfumigatus:
5'-CCGCTCCGCCGTTGTGGCCGCCCTGCCGGTGTTGGCCCTTGCCGAATTGGCTTTCTCTCC-3' {}\hskip14cm (SEC ID nº: 63)
GAATTGGCTTTCTCTCC tiene homología al extremo 5' de la secuencia madura de Aspergillus fumigatus.
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La reacción de amplificación (100 \mul) estaba compuesta por 0,5 \mul del plásmido pCR4Blunt-TOPOAfcDNA conteniendo la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus, 1X de tampón de amplificación Pfx, 50 \muM de cada uno de DATP, DCTP, DGTP, y dTTP, 50 pmole de cada uno de los cebadores de arriba, 1,5 mM de MgSO4, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx Platino. Las reacciones se incubaron en un RoboCycler Gradient 40 programado para 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos; 25 ciclos cada uno a 95ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 3 minutos; y un ciclo de extensión final a 72ºC durante 10 minutos. La reacción de PCR se purificó usando un QIAquick PCR Purification Kit.
El ADN se eluyó en 10 \mul de tampón EB. Tres ul del producto de PCR limpio se mezclaron con 1,8 \mul de pALFd61 adicionados con ECO NI y XhoI para la cotransformación en células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318 como se describe en el Ejemplo 10. Estas colonias se volvieron de un color azul claro. No obstante, una colonia sobresalió siendo muy azul. La recogida de ADN de esta colonia se hizo según el protocolo descrito por Kaiser y Auer, 1993, BioTechniques 14: 552, excepto porque se usaron 20 \mul de tampón de lisis de levadura (1% de SDS, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA a pH 8), y el plásmido se transformó en células competentes para la electroporación SURE de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) para la secuenciación. La secuenciación en toda su longitud indicó que la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus era correcta. Este plásmido se designó como pALFd7 (Figura 20), el cual comprendía la secuencia de ADNc de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus con la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens para la expresión de la levadura.
Para producir un vector de expresión de levadura conteniendo la secuencia de ADNc correcta de Aspergillus fumigatus con su secuencia señal nativa, la región conteniendo la secuencia de nucleótidos correcta a partir del vector de expresión de levadura conteniendo la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus con la secuencia señal de la endoglucanasa V de Humicola insolens (pALFd7) se amplificó por PCR usando el cebador BGLU.5inv de arriba y el siguiente cebador:
BGL.7dir: 5'-CTGGCGTTGGCGCTGTC-3'
(SEC ID nº: 64)
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La reacción de amplificación (100 \mul) estaba compuesto por 0,5 \mul de pALFd7, 1X de tampón de amplificación Pfx, 50 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 50 pmole de cada uno de los cebadores de arriba, 1,5 mM de MgSO_{4}, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfx Platino. Las reacciones se incubaron en un RoboCycler Gradient 40 programado para 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos; 25 ciclos cada uno a 95ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto; y un ciclo de extensión final a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento de PCR de 701 par de bases se purificó usando un QIAquick PCR Purification Kit. El ADN se eluyó en 10 \mul de tampón EB. Tres ul del producto de PCR limpio se mezclaron con 3 \mul del vector de expresión de levadura conteniendo la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigatus con la secuencia señal nativa y el nucleótido extra adicionado con los vectores SacII y XmaI para la cotransformación en células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318 como se describe en el Ejemplo 10. Estas colonias se volvieron azules. La recogida de ADN de un colonia azul escogida de forma aleatoria se hizo como se dice arriba, el plásmido se transformó en células competentes para la electroporación SURE de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) para la secuenciación. La secuenciación en toda su longitud indicó que la secuencia de ADNc de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus era correcta. Este vector de expresión de levadura se designó pALFd6 (Figura 21), el cual comprendía la secuencia de ADNc de Aspergillus fumigarus con su secuencia señal nativa.
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Ejemplo 19 Expresión de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus comparando la señal de secreción nativa y heteróloga en Saccharomyces cerevisiae
Los plásmidos pALFd6 (conteniendo el Aspergillus fumigatus con su secuencia señal nativa) y pALFd7 (conteniendo el Aspergillus fumigatus con la secuencia señal heteróloga), aproximadamente 1 ug, se transformaron individualmente células competentes recién creadas de Saccharomyces cerevisiae YNG318, se colocaron en placas de selección de levaduras, y se incubaron a 30ºC durante 4 días como se describe en el Ejemplo 10.
Dos colonias azules de ambos constructos se escogieron manualmente y se inocularon en medio de selección de levadura (el cual contiene cobre) para inducir la expresión y la secreción de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae. El caldo de cultivo del día 5 se sometió después a ensayo por duplicado para observar la actividad beta-glucosidasa usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida como sustrato como se ha descrito anteriormente. Los cultivos expresando beta-glucosidasa con la secuencia señal heteróloga produjo 2,5 veces más beta-glucosidasa que los cultivos expresando beta-glucosidasa con su secuencia señal nativa.
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Depósito de material biológico
El siguiente material biológico se ha depositado según las condiciones del Tratado de Budapest con el Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, y se le dio el siguiente número de accesión:
100
La cepa se ha depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante el pendencia de esta solicitud de patente para alguien determinado por el Comisario de Patentes y Marcas Registradas para tener derecho a la misma bajo 37 C.F.R. \NAK1.14 and 35 U.S.C. \NAK122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera por leyes de patentes extranjeras en países donde están depositados duplicados de la solicitud sujeta, o sus descendientes. No obstante, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención sujeta en derogación de los derechos de patentes garantizados por la acción gubernamental.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet DE AC3698GO10337 [0001]
\bullet WO 9707205 A [0083]
\bullet WO 9117243 A [0007]
\bullet US 6461837 B [0102]
\bullet WO 9600787 A [0047] [0082]
\bullet US 5763254 A [0110]
\bullet WO 9533836 A [0058]
\bullet WO 9800529 A [0110]
\bullet WO 0024883 A [0069] [0069]
\bullet WO 2002095014 A [0131] [0155]
\bullet WO 9726330 A [0080]
\bullet WO 10375204 A [0193]
\bullet EP 238023 A [0082]
\bullet WO 60467766 A [0193]
Bibliografía fuera de la patente citada en la descripción
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\bulletGems et al. Gene, 1991, vol. 98, 61-67 [0069]
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> NOVOZYMES BIOTECH, INC.
\hskip1cm
Maiyiran, Suchindra 
\hskip1cm
Fidantsef, Ana 
\hskip1cm
Brody, Howard 
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<120> Métodos para producir polipéptidos segregados
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10375.204-WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/467,766
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-05-02
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<160> 64
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<170> Versión de patentIn 3.2
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<210> 1
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Aspergillus oryzae 
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<400> 1
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gtgccccatg atacgcctcc gg 
\hfill
22 
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<210> 2
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Aspergillus oryzae 
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<400> 2
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gagtcgtatt tccaaggctc ctgacc 
\hfill
26 
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<210> 3
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Aspergillus oryzae 
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<400> 3
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ggaggccatg aagtggacca acgg 
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24 
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<210> 4
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Aspergillus niger 
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<400> 4
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caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag 
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45 
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<210> 5
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Aspergillus niger 
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctatatacac aactggattt accatgggcc GATC de cgcggccgca 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgttaatt aaggaatcgt tttgtgttt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtactagta gctccgtggc gaaagcctg 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagattga de ttgaattgaa tttaaaactt C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgaattcat gggtaataac tgatat 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagcttaagc atgcgttcct cccccctcc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc Ag 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc Ag 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgcggact gcgcatcatg cgttcctccc ccctcc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgcgcagt ccgcggt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagggggga ggaacgcatg atgcgcagtc cgcggt 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc Ag 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atagtcaacc gcggactgcg catcatgaag cttggttgga tcgagg 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actagtttac tgggccttag gcagcg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcgactcga agcccgaatg taggat 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctcgatcca accaagcttc atgatgcgca gtccgcggtt gacta 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgccggtgtt ggcccttgcc aaggatgatc tcgcgtactc cc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactagtctt actgggcctt aggcagcg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgcgtcgac cgaatgtagg attgttatcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggagtacgc gagatcatcc ttggcaaggg ccaacaccgg aprox 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaagcttg ggtggccgca de gttggatcga ttggcggctg cctcagtagt cagtgcc 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagatctac catgaagctt ggttggatcg Ag 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcctcagatt actgggcctt aggcagcgag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatccgacta gtggatctac catgcgttcc tcccccctcc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgggcctcg agttactggg ccttaggcag coriogonadotropina 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2586
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2583)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
5
6
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12
13
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actggattta ccatgagatt cggttggctc g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtcacctct agttactagt agacacgggg C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3060
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
15
16
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
18
19
20
21 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
24
25
26
27
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctcatgag attcggttgg ctcgaggtc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgttatca cagccgcggt cggggcagcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctgccccg accgcggctg tgataacggc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> > ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttaattaa tctagtagac acggggcaga ggcgc 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acactggcgg agaagg 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccagggat atggttac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgactctgga gagggtttc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggactgggtc atcacaaag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgagaggtc atcagca 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaaaacgac ggccagt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatga 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt gccgaattgg ctttctctcc 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggcgttgg cgctgtc 
\hfill
17

Claims (13)

1. Método para la producción de un polipéptido segregado, comprendiendo:
(a)
cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:
(i)
una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37;
(ii)
una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y
(b)
aislar el polipéptido segregado a partir del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos codifica un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37, o un fragmento peptídico de la misma que retiene la capacidad para dirigir el polipéptido dentro de una vía secretora de la célula.
3. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos consiste en la SEC ID nº: 36, o una subsecuencia de la misma la cual codifica un péptido señal que retiene la capacidad para dirigir el polipéptido dentro de una vía secretora de la célula.
4. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos está contenida en un gen de endoglucanasa V el cual está contenido en la cepa DSM 1800 de Humicola insolens.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la segunda secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido heterólogo o nativo a la célula huésped fúngica.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la célula huésped fúngica contiene una o más copias de la segunda secuencia de nucleótidos.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el polipéptido es una hormona o variante de hormona, enzima, receptor o parte del mismo, anticuerpo o parte del mismo, o indicador.
8. Método según la reivindicación 7, donde la enzima es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, o ligasa.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la enzima es una endoglucanasa, celobiohidrolasa, o beta-glucosidasa.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el polipéptido es una beta-glucosidasa.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa o de levadura.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el constructo de ácidos nucleicos comprende además un promotor operativamente enlazado a las secuencias de nucleótidos primera y segunda.
13. Método según la reivindicación 12, donde el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en un promotor del gen de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, promotor del gen de celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, promotor del gen de xilanasa I de Trichoderma reesei, promotor del gen de xilanasa II de Trichoderma reesei, y promotor del gen de beta-xilosidasa de Trichoderma reesei.
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