CN103184159B

CN103184159B - 紧密枝顶孢霉菌株及其特异性脂肪酶

Info

Publication number: CN103184159B
Application number: CN201110446326.3A
Authority: CN
Inventors: 毛爱军; 钱丗均; 佟小雪; 寇秀芬; 张国青; 丁双
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS; Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: CN103184159A

Abstract

本发明涉及一种新的脂肪酶及其生产菌株，具体说，本发明脂肪酶是一种新的1，3‑特异性脂肪酶，本发明生产菌株是紧密枝顶孢霉菌株2823。

Description

紧密枝顶孢霉菌株及其特异性脂肪酶

技术领域

本发明涉及一种新的脂肪酶及其生产菌株。具体说，本发明脂肪酶是一种新的1，3-特异性脂肪酶，本发明生产菌株是紧密枝顶孢霉菌株2823。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解，还可以催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。脂肪酶被广泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域，是重要的工业酶制剂之一。脂肪酶催化反应位置特异性是指反应底物甘油三酯中的Sn-1(或Sn-3)和Sn-2位酯键的识别和水解的反应性。微生物脂肪酶作用于底物三脂酰甘油的方式因酶的类型而异，具有1，3位置特异性的脂肪酶包括例如米黑根毛霉(Mucor miehei)和戴尔根霉(R.delemar)等产生的脂肪酶。具有1，3-位置特异性的脂肪酶可用于结构油脂生产，特殊脂肪酸、单甘酯的合成以及立体选择性化学合成和拆分，在工业生产中具有巨大的应用潜力。因此，选育1，3-特异性脂肪酶的菌种及开发相应脂肪酶，具有重要的工业价值和意义。

发明内容

本发明提供一种紧密枝顶孢霉(Acremonium strictum)菌株，其于2010年12月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏登记号为CGMCC 4420。

本发明提供一种脂肪酶，其具有1，3-特异性。

在一个实施方式中，本发明提供一种脂肪酶，其具有下述一种或多种特征：

a.最适作用温度为30-50℃；

b.最适作用pH为6-10；

c.在pH 7.0-pH 11.0稳定；

d.在40℃以下稳定；和/或

e.1，3-特异性。

在一个优选实施方式中，所述最适作用温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或其间任何范围。在另一个优选实施方式中，所述最适作用pH为6、7、8、9、10或其间任何范围。在另一个优选实施方式中，本发明脂肪酶在pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或其间任何范围下稳定。在另一个优选实施方式中，本发明脂肪酶在40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、0℃或更低温度下稳定。

在一个实施方式中，本发明提供一种脂肪酶，其是本发明紧密枝顶孢霉菌株2823产生的。

另一方面，本发明提供一种产生脂肪酶的方法，所述方法包括发酵本发明紧密枝顶孢霉菌株和收集发酵上清液。在一个优选实施方式中，本发明所述方法还包括纯化步骤。在一个优选实施方式中，发酵步骤在20-50℃，例如，20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或其间任何温度范围下进行。在另一个优选实施方式中，发酵步骤在摇床中进行。在另一个优选实施方式中，发酵步骤进行10-100小时，例如10小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时或其间任何范围。在一个优选实施方式中，收集上清液的步骤通过离心或移液器吸取进行。在一个优选实施方式中，纯化步骤通过柱层析进行。在一个优选实施方式中，利用本发明方法得到的脂肪酶具有如上所述的任何本发明脂肪酶的特征。

附图说明

图1是紧密枝顶孢霉2823的菌种显微形态。

图2是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的酶活与温度的关系曲线。

图3是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的酶活与pH的关系曲线。

图4是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的稳定性与温度的关系曲线。

图5是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的稳定性与pH的关系曲线。

图6是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶水解三油酸甘油酯的产物的TLC结果，其中1是油酸；2是0.5h反应产物；3是3h反应产物；4是9h反应产物；5是24h反应产物；6是无脂肪酶对照(孵育0.5h)；7是脂肪酶对照(24h)(无活性脂肪酶，将该菌株产生的粗酶液煮沸10-15分钟，采用pNPP法检测确认酶失去活性，以无活性的酶液作为对照)；8是2-MAG(2-油酸单苷酯)；9是DAG(1，2(2，3)油酸苷二酯)。

菌种保藏

本发明提供的紧密枝顶孢霉菌株2823于2010年12月19日保藏在中国微生物所菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 4420。

具体实施方式

定义

紧密枝顶孢霉(Acremonium strictum)在分类学上，隶属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、枝顶孢霉属的菌种(参考《真菌词典》第九版)。菌落(MEA 2％)生长迅速，微湿到粘滑，粉红色到橙色；反面持久无色或粉红色到橙色。显微形态为分生孢子梗结构简单，偶尔有分支，瓶梗细长，生长于基质或稍微呈簇着生于气生菌丝，20-65x1.4-2.5μm。生于基质的孢子常常形成于简化的瓶梗。分生孢子粘滑的头部聚集在一起，圆柱形或椭圆形，3.3-5.5x0.9-1.8μm，透明(参考Hoog，G.S.de 2000，《临床真菌图册》(Atlas ofclinical fungi)，第2版：418)。本发明获得的紧密枝顶孢霉菌株，来源于中国青岛海岸长有海蛎子岩石上，经中科院微生物所鉴定，该菌株生长和形态与上述文献记载的特征略有区别，其特征还在于该菌株能够分泌产生1，3-特异性脂肪酶。

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可催化三酰甘油酯水解生成脂肪酸、甘油、单甘脂和苷二脂等产物，还可以催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成等反应。脂肪酶被广泛应用于油脂生产、食品加工、日用化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域，是重要的工业酶制剂之一。本发明脂肪酶，由青岛海岸长有海蛎子的岩石生境中筛选获得的菌株产生，和以前报道的该属菌产生的脂肪酶相比，属于碱性脂肪酶，此外，还具有酶促反应在40℃以下较稳定，在pH 7.0-pH11.0范围内较稳定等特征。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所有试剂都可来源于市售，例如，本发明所用的培养基成分均可购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1菌株选育

1.采样：

分别在烟台和青岛海岸采集83个样品，包括沙滩土样、沙滩沙、朽木、海洋动物尸体、海边腐朽的海草、海带、海菜、海岸岩石表层、海岸边的沟泥以及饭店前的沟泥等。

2.培养基配制：

平板分离培养基(％，以重量百分数计算)：豆粉0.5、蛋白胨0.5、KH₂PO₄0.1、Na₂HPO₄0.1、MgSO₄0.01，pH 6.5，蒸馏水配制)121℃灭菌30分钟后，在上述成分中再加0.4％的甘油丁酸三酯，制备成平板分离培养基。

脂肪酶筛选发酵培养基(％，以重量百分数计算)：豆粉2.0、鱼油2.0、KH₂PO₄0.2、Na₂HPO₄0.2、MgSO₄0.01、CaCl₂0.2，蒸馏水配制)。每100mL三角瓶中加发酵培养基20mL(pH 6.0)，121℃灭菌30分钟。

营养肉汁琼脂培养基(％，以重量百分数计算)：蛋白胨1.0、牛肉浸取物0.3、NaCl 0.5、琼脂1.5、pH7.0，蒸馏水配制。

PDA培养基(％，以重量百分数计算)：葡萄糖2.0、琼脂1.5、余量为马铃薯浸出液，自然pH。其中马铃薯浸出液配制：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1.0升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液用水补足至1.0升。

3.菌种平板初筛：

在10mL试管中，加入2mL液体分离培养基，0.2g采集的样品，28℃摇床震荡培养24-48小时。取发酵液少许，划线接种在平板分离培养基)上，28℃培养，随时观察，生长2-3天后，挑选产透明圈的菌落。接种到营养肉汁琼脂培养基或PDA培养基中，其中细菌接到营养肉汁琼脂培养基斜面，霉菌接到PDA培养基斜面。菌种再进行平板划线分离，挑选菌落小透明圈大的菌落，接种到斜面培养基。

4.菌种摇瓶发酵复筛：

对于细菌，从营养肉汁琼脂培养基斜面取半耳环菌体，对于霉菌，从PDA培养基斜面切3毫米左右大小的菌块，分别接种于250ml摇瓶中，摇瓶中含有20ml发酵培养基，28℃培养，在接种后24小时、48小时、72小时取样，常规氢氧化钠碱滴定法(QB/T1803-1993脂肪酶测定方法)测定脂肪酶活力，获得初筛活力达10-50U/mL菌种，并将菌种保存在试管斜面。

5.菌种初步编号：

依据上述方法，在青岛海岸曾长有海蛎子的岩石上的第28号样品中，分离出第23个菌落，经检测在平板上具有明显的水解透明圈，摇瓶发酵复筛检测，具有较强的脂肪酶水解活力，故编号2823，命名为紧密枝顶孢霉2823。

实施例2紧密枝顶孢霉2823的菌种鉴定

本发明人委托中国科学院微生物研究所菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路)对编号为2823菌种进行鉴定，鉴定结果，详述如下。

菌种生长特性鉴定：麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长局限，25℃避光条件下培养7天菌落直径为25-28mm，初期菌落白色，后期变为浅橙色，平铺，湿润，中部形成大量皱褶，气生菌丝稀少，产生由基部向顶变细的菌丝绳；背面无色素。

MEA培养基，即麦芽提取物琼脂培养基(％，重量百分数)：麦芽浸出粉2.0、蛋白胨1.0、葡萄糖2.0、琼脂1.5，蒸馏水配制。

显微形态鉴定：在光学显微镜(蔡司(Zeiss)Axioplan2型成像显微镜)下观察分生孢子梗特化不明显，细长，不分枝，宽1.5-2.5μm，长20-70μm。分生孢子多数柱状，无色透明，聚集成团，孢子长度变异幅度大，2.3-7.0×1.5-2.0μm。无厚垣孢子。菌种显微图片如图1所示。

rRNA基因序列鉴定：

测序方法：提取紧密枝顶孢霉基因组DNA，利用鉴定引物进行PCR扩增，将扩增产物测序。具体如下：

紧密枝顶孢霉DNA提取方法：

(1)用解剖刀(挑针)从培养皿(试管斜面)中刮取少量菌丝(约0.2-0.5mg)，放入1.5ml离心管中；

(2)加少量灭菌石英砂(与菌丝体积基本相同)和200μl 65℃水浴预热的CTAB抽提液(2％CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris·HClpH8.0)，用研磨玻璃棒研磨至匀浆；

(3)加入400μl预热CTAB抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴0.5-1h；

(4)水浴完成后，将离心管在12000rpm室温条件下离心10min，取上清液至新离心管中；

(5)加入等体积的抽提溶液(Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，颠倒混匀50次；

(6)12000rpm室温条件下离心10min，取上清液至新离心管中；

(7)可重复5、6步1-2次，视两相界面处杂质的多少而定；

(8)加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀50次；

(9)12000rpm室温条件下离心10min，取上清液至新离心管中；

(10)向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4℃或-20℃沉淀20min；

(11)12000rpm室温条件下离心10min，弃去上清液，加500μl 70％乙醇溶液洗涤两次；

(12)倒出乙醇溶液后，短暂离心使管壁上的溶液汇集至管底，用移液器吸净，离心管敞口在室温干燥5min；

(13)加50-100μl无菌水或TE缓冲液(10mM Tris.HCl，1M EDTA，pH8.0)溶解沉淀，-20℃条件下贮存备用。

PCR方法：

以紧密枝顶孢霉基因组DNA为模板，以ITS5和ITS4为上下游引物进行扩增，引物序列为：上游引物：ITS5，5’-GGA AGT AAA AGT CGT AACAAG G-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物：ITS4，5’-TCC TCC GCT TAT TGATAT GC-3’(SEQ ID NO：3)。

PCR条件为：95℃变性3min，94℃解链1min，54℃复性40s，72℃延伸1min，扩增35个循环后72℃延伸10min，完成后产物在4℃下保存。

测序：

委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序采用ABI3730xl测序仪及配套的BigDye终止者(Terminator)试剂盒进行。

测序结果如下表1和SEQ ID NO：1所示，其包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片段，测序引物是ITS4。

GAGGTCAACC TTAAAAAATT GGGGGTTTCA CGGCGTGGCC GAGCCGCTCT 50

CCGGTGCGAG GTGTGCTACT ACGCAGGGGA GGCTGCGGCG CGACCGCCAC 100

TCAATTTGGG GGACAGGGGC CCGGAGGCCG CTGATCCCCA GCACCAGGTC 150

CCCCCCGAAA GGGGGTCCTG AGGGTTGAAA TGACGCTCGG ACAGGCATGC 200

CCGCCGGAGT GCCGGCGGGC GCAATGTGCG TTCAAAGATT CGATGATTCA 250

CTGAATTCTG CAATTCACAT TACTTATCGC ATTTCGCTGC GTTCTTCATC 300

GATGCCAGAG CCAAGAGATC CGTTGTTGAA AGTTTTGATT CATTTTGTTT 350

TCGGGCTTTC GCCCCTCAGA GATTCACAAT AAAATCAGAG TTTGGTTGTC 400

CCCGGCGGAC GCCCGGAGCC CGGAGGCACC GCGCGCTGAG CCCGCCGAGG 450

GAACGATAGG TATGTTCACA ATGGGTTGGA GAGCCTAGGG CACTCTGGTA 500

ATGATCCCTC CGCTGGTTCA CCAACGGAGA CCTTGTTAC 539

根据测序结果，进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。测序结果与紧密枝顶孢霉(Acremonium strictum)相应的rDNA序列同源性达到97％。综合菌种生长特性、显微形态以及rDNA基因测序结果，鉴定该菌株为紧密枝顶孢霉。该菌株的特性在于，能够分泌产生1，3-特异性脂肪酶。

实施例3紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶及催化性能测定

1.培养基优化：

发酵培养基优化配方为(％，重量百分数)：大豆粉2.0、蛋白胨1.0、玉米浆1.0、磷酸氢二钾0.2，硫酸铵0.1、七水合硫酸镁0.05，pH7.0，蒸馏水配制。

2.脂肪酶发酵：

将PDA培养基上的菌种接种含有50ml优化发酵培养基中，采用250毫升摇瓶进行发酵，摇瓶培养基装液量为50ml。在30℃、220rpm摇床中进行发酵。发酵72小时，取发酵液于8000rpm离心10min，上清液即脂肪酶粗酶液。

3.发酵产脂肪酶活力测定：

脂肪酶活力测定采用pNPP比色法，其原理是：脂肪酶在一定温度和pH条件下，水解底物棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)，生成黄颜色的对硝基苯酚。在一定的浓度范围内，生成对硝基苯酚的量和反应液的410nm处吸光值呈线性关系。据此可以通过测定反应液的410nm吸光值计算脂肪酶活力。

测定方法具体如下：

溶液A：0.03g pNPP溶于10ml异丙醇，4℃备用。

溶液B：pH8.0，50mM磷酸钠缓冲液。

使用时将溶液A与溶液B按1∶9的体积比混合，配成2.4ml底物反应液，加入100μl粗酶液，37℃反应15min，在410nm测吸光值。以硝基苯酚系列浓度测定的吸光度，制定标准曲线。

脂肪酶1个酶活单位的定义：每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

经测定，按照步骤2发酵72h时获得的脂肪酶的酶活达到22.3U/ml。

实施例4紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的最适温度

将PDA培养基上的菌种接种于发酵培养基，在30℃、220rpm发酵72h后，于8000rpm离心10min，上清液即脂肪酶粗酶液。

分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下按PNPP方法测定粗酶液脂肪酶活力，以最高酶活为相对酶活，计算其他温度下酶的相对活力。测得其粗酶液酶反应的最适作用温度为40℃。结果如图2所示。

实施例5紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的最适pH

分别在pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液中按PNPP法测定按照实施例4制备的粗酶液的脂肪酶活力，以最高酶活为相对酶活，计算其他pH下酶的相对活力(pH5.0-9.0为磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲液；pH9.0-11.0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，测得其粗酶液酶反应的最适作用pH为8.0。结果如图3所示。

实施例6紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的温度稳定性

将按照实施例4制备的粗酶液分装于不同的反应管中，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃保温一小时后按PNPP方法测定粗酶液脂肪酶活力，以不经保温处理所测的脂肪酶酶活为相对酶活，测得其粗酶液在40℃以下较稳定。结果如图4所示。

实施例7紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的pH稳定性

将按照实施例4制备的脂肪酶液分别在不同pH(pH6.0～11.0)的缓冲液体系中4℃保温24h后按PNPP方法测定粗酶液脂肪酶活力，以不经保温处理所测的脂肪酶酶活为相对酶活，测得其粗酶液在pH7.0-pH11.0范围内较稳定。结果如图5所示。

实施例8紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的催化反应特异性

用按照实施例4制备的脂肪酶液进行甘油三酯的水解反应以验证该脂肪酶的水解特异性，实验结果表明紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶具有1，3-位置特异性。

具体说，于具塞试管中加入0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)1ml、2.2％氯化钙水溶液0.1ml、0.05％胆酸盐水溶液0.25ml、甘油三酯10mg、混合均匀，在37℃下水浴1分钟，再加入按照实施例4制备的脂肪粗酶液8mg，混合均匀后继续水浴0.5h、3h、9h、24h。将粗酶液煮沸10分钟，采用pNPP法检测确认酶失去活性，以无活性的酶液作为空白对照[1，2-3]。

当反应结束后用乙醚提取其中的脂类物质，乙醚吹干后，用薄层色谱分离出其中的甘油一酯，甘油二酯，游离脂肪酸[4-5]。

薄层层析(TLC)分离条件为：硅胶G板，展开剂为正己烷-乙醚-甲酸(75∶25∶1，V/V/V)。展开完毕，置于一密闭容器中碘蒸气显色(图6)。证明水解产物中2-单甘酯与1，2-甘二酯产物明显，故该脂肪酶为1，3-特异性脂肪酶(如图6所示)。

通过上述实验结果可以看出，利用本发明所述的菌株所制备的1，3-特异性脂肪酶具有良好的特异性和稳定性，其最适温度和最适pH也易于实现，因此可广泛应用于食品、粮油、医药、日化、油脂化学、农业化学、饲料、造纸、洗涤剂、纺织印染、药物合成、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域的生产工艺中。

Claims

1.一种紧密枝顶孢霉菌株，其特征在于，保藏登记号为CGMCC 4420。

2.一种产生脂肪酶的方法，所述方法包括：

发酵权利要求1所述的紧密枝顶孢霉菌株，和

收集发酵上清液，

其中，所述脂肪酶具有如下特征：

a.最适作用温度为30-50℃；

b.最适作用pH为6-10；

c.在pH 7.0-pH 11.0稳定；

d.在40℃以下稳定；和

e.1,3-特异性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括纯化所述脂肪酶的步骤。