CN104053633B

CN104053633B - 新型耶罗维亚属微生物、以及使用其的油分解剂及油分解除去方法

Info

Publication number: CN104053633B
Application number: CN201380005842.XA
Authority: CN
Inventors: 堀克敏; 藤冈正刚
Original assignee: Nagoya University NUC
Current assignee: Nissan Chemical Corp
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2033-01-16
Also published as: KR102026750B1; WO2013108775A1; JP5685783B2; CN104053633A; JP2013146689A; US10065877B2; EP2816015A1; KR20140116207A; MY164111A; SG11201404183QA; EP2816015A4; EP2816015B1; US20150024470A1

Abstract

本发明的课题在于提供在将油高效分解方面有用的新型微生物及其用途。筛选的结果是成功获得游离脂肪酸同化能力高的新型解脂耶罗维亚酵母。在油脂的水解产物脂肪酸存在的条件下，或在油脂被分解为脂肪酸和甘油的条件下，使该解脂耶罗维亚酵母作用，实现高效的油的分解。

Description

新型耶罗维亚属微生物、以及使用其的油分解剂及油分解除去方法

技术领域

本发明涉及油的分解。具体而言，本发明涉及对废水中、隔油池内等的油的分解有用的新型耶罗维亚属微生物、使用该微生物的油分解剂及油分解除去方法等。本申请基于在2012年1月19日申请的日本国特许申请第2012-009451号主张优先权，通过参照引用该特许申请的全部内容。

背景技术

利用了微生物的油脂分解被用于废水处理等。特别是，利用固液分离将餐饮业的厨房废水含有的油成分除去的处理设备即隔油池，是恶臭、害虫的产生根源，考虑到分离的油的回收、运输、清扫等维护花费的辛劳、成本等，以餐饮业为中心的产业界迫切期望确立削灭隔油池内的油这样的划时代的技术，尝试了利用微生物的油脂分解技术的应用。但是，餐饮业的厨房废水不仅含有通常1g/L以上，较高时10g/L以上的高浓度的油脂，而且多个隔油池内的废水的滞留时间是10分钟左右，由于其极短，仅在隔油池内处理油变得困难，对经得住实际应用的油分解剂的需求依然较高。

这种状况下，本申请发明人之一，作为高效处理含有油脂的废水的微生物，报告了分泌属于油脂水解酶的脂肪酶的新型微生物(木本树伯克霍尔德菌(Burkholderia arboris))(专利文献1)。另一方面，也报告了通过并用甘油同化性优异的微生物，从而促进油脂的分解的方法(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2010-227858号公报

专利文献2:日本特愿2010-227849号公报

专利文献3:日本特开2011-160713号公报

专利文献4:日本特许2561441号公报

专利文献5:日本特开2006-42774号公报

非专利文献

非专利文献1:J.Mol.Catal.B.Enzym.vol.71No.3-4,p.166-170,2011

非专利文献2:Eur.J.Lipid.Sci.Technol.Vol.112,No.11,p.1200-1208,2010

发明内容

油脂的水解反应是可逆反应，油脂的分解进行时，其分解产物脂肪酸和甘油蓄积，油脂分解速度降低。上述的专利文献2示出的技术中，通过甘油同化性优异的微生物将分解产物之一的甘油除去，促进油脂的分解。但是，作为油脂分解产物，脂肪酸要比甘油多地多。这种游离的脂肪酸(游离脂肪酸)本身也是油成分，与油脂同样必须除去。特别是，使用专利文献1中报告的微生物这样油脂分解能力极高的微生物等时，微生物所致的脂肪酸的消耗赶不上脂肪酸的生成，处理槽内蓄积大量的游离脂肪酸，而且也引起油脂分解效率本身的降低。

因此，本发明目的在于，为了解决以上课题，提供在有效分解除去油方面有用的新型微生物及其用途。

基于上述目的，本申请发明人等想到与油脂分解能力优异的微生物、其它的油脂分解剂(脂肪酶制剂等)的并用，尝试获得脂肪酸同化能力优异的微生物。具体而言，从隔油池槽内的油、土壤、污泥、湖水等环境样品中以脂肪酸同化能力为指标筛选微生物，进行了特性的研究及菌种的确定。其结果是，作为脂肪酸同化能力极高的微生物，确定了多株解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。通常，解脂耶罗维亚酵母作为脂肪酶分泌微生物而被熟知，以往尝试应用于油脂的分解(例如，专利文献3～5和非专利文献1、2等)。令人吃惊的是，成功鉴定的解脂耶罗维亚酵母均是脂肪酸同化能力高，另一方面，不具有油脂分解能力(即，不分泌脂肪酶)。在过去没有报告具有这种特性的解脂耶罗维亚酵母。

进行研究之后，表明成功鉴定的解脂耶罗维亚酵母能够与油脂分解能力高的木本树伯克霍尔德菌共生，通过与该木本树伯克霍尔德菌的并用而促进油脂的分解。值得一提的是，并用这2种微生物之后，在难以分解油的低温环境下能够实现油分解除去效率的飞跃式的提高。此外，即使在油脂以高浓度存在的条件下，也能够有效地分解除去油。鉴于预想到苛刻处理条件的实际使用环境，可以说在实际应用上这些效果是极其有利的。实际上，对于实际废水的有效性也得到了证实，确认了成功获得的新型微生物(解脂耶罗维亚酵母)的有用性和实用性(后述的实施例栏)。另一方面，即使在使用预设的隔油池的验证试验中，也确认通过与成功获得的微生物并用，能够实现油分解除去效率的飞跃式的提高(后述的实施例栏)。

以下示出的本发明主要是基于上述成果。

[1]一种油分解除去方法，其特征在于，在油脂的水解产物脂肪酸存在的第1条件下、或在油脂被分解为脂肪酸和甘油的第2条件下，使同化游离脂肪酸的解脂耶罗维亚酵母作用。

[2]根据[1]记载的方法，其中，上述解脂耶罗维亚酵母是不分泌脂肪酶的解脂耶罗维亚酵母。

[3]根据[1]或[2]记载的方法，其中，上述解脂耶罗维亚酵母是能够与木本树伯克霍尔德菌共生的菌株。

[4]根据[1]记载的方法，其中，上述解脂耶罗维亚酵母是由保藏编号NITE BP-1167确定的菌株。

[5]根据[1]～[4]中任一项记载的方法，其中，上述第2是存在脂肪酶的条件。

[6]根据[1]～[4]中任一项记载的方法，其中，上述第2是存在具有脂肪酶分泌能力的微生物的条件。

[7]根据[6]记载的方法，其中，上述微生物是木本树伯克霍尔德菌。

[8]根据[7]记载的方法，其中，上述木本树伯克霍尔德菌是由保藏编号NITE P-724确定的菌株。

[9]根据[1]～[8]中任一项记载的方法，其特征在于，并用同化甘油的微生物。

[10]根据[9]记载的方法，其中，同化甘油的上述微生物是柱状假丝酵母(Candida cylindracea)。

[11]根据[10]记载的方法，其中，上述柱状假丝酵母是由保藏编号NITE P-714确定的菌株。

[12]根据[1]～[11]中任一项记载的方法，其中，上述油脂是废水中或隔油池内的油脂。

[13]一种废水处理方法，其特征在于，用[1]～[11]中任一项记载的方法将废水中的油分解除去。

[14]一种隔油池净化方法，其特征在于，用[1]～[11]中任一项记载的方法将隔油池内的油分解除去。

[15]一种解脂耶罗维亚酵母，其具有以下特性:

(1)同化游离脂肪酸；

(2)不分泌脂肪酶；

(3)能够与木本树伯克霍尔德菌共生。

[16]根据[15]记载的解脂耶罗维亚酵母，其是由保藏编号NITEBP-1167确定的菌株。

[17]一种油分解剂，以[15]或[16]记载的解脂耶罗维亚酵母为有效成分。

[18]一种油分解剂，是由[15]或[16]记载的解脂耶罗维亚酵母与将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分组合而成的。

[19]根据[18]记载的油分解剂，其特征在于，含有上述解脂耶罗维亚酵母和上述成分。

[20]根据[18]记载的油分解剂，其特征在于，是由含有上述解脂耶罗维亚酵母的第1构成要素和含有上述成分的第2构成要素组成的试剂盒。

[21]根据[18]记载的油分解剂，其特征在于，含有上述解脂耶罗维亚酵母，与将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分并用。

附图说明

图1.解脂耶罗维亚酵母(Y.lipolytica)1A1株的系统解析结果。

图2.筛选的12个菌株的油酸分解能力的比较。用TLC解析培养基中的残存油酸。

图3.Y.lipolytica1A1株的增殖能力。在将10g/L(1％)芥花油(上)和10g/L(1％)油酸(下)作为碳源进行添加的琼脂培养基上观察生长。作为比较菌使用木本树伯克霍尔德菌(B.arboris)SL1B1株。

图4.28℃(油脂量是10g/L)的油分解行为。比较纯培养B.arborisSL1B1株的情形(左)与混合培养B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的情形(右)。

图5.22℃(油脂量是10g/L)的油分解行为。比较纯培养B.arborisSL1B1株的情形(左)与混合培养B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的情形(右)。

图6.22℃(油脂量是30g/L)的油分解行为。比较纯培养B.arborisSL1B1株的情形(左)与混合培养B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的情形(右)。

图7.利用混合微生物制剂进行的真实废水中的油分解实验时的正己烷值的减少量。将混合B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的微生物制剂投入到真实废水中，进行反应。在12小时后(左)和18小时后(右)测定正己烷值的减少量。

图8.每一投入活菌数的12小时后和18小时后的活菌数的变化。将混合B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的微生物制剂投入到真实废水中，进行反应。比较12小时后和18小时后的活菌数。

图9.隔油池中的验证实验的结果。将B.arboris SL1B1株、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)SL1B2、和Y.lipolytica1A1株的混合三种微生物的制剂投入隔油池中，经时测定正己烷值。作为比较，设置未投入微生物制剂(比较例1)、投入B.arboris SL1B1和Candidacylindracea SL1B2株的混合二种微生物的制剂(比较例2)的试验区。

具体实施方式

1.油分解除去方法

本发明的第1方面涉及一种油分解除去方法。本发明的油分解除去方法被用于含有油脂的废水的处理、隔油池的净化等。即，能够将本发明应用于餐馆、医院、旅店等的废水、家庭废水、食品加工工场或油脂加工工场等排出的工业废水等含有油脂的废水的处理，或者应用于设置在厨房等的隔油池所蓄积的油的分解除去。所谓“隔油池”，是用于分离、收集废水中的油的装置，典型地由3槽构成。第1槽具有篮子，捕捉食材片段、剩饭等。第2槽中油水被分离。与油分离的废水被运送至第3槽，除去沉淀性的垃圾等。餐馆、医院、旅店等业务用厨房中有义务设置隔油池。

作为处理对象的油，可举出植物性油脂(棉籽油、菜籽油、大豆油、玉米油、橄榄油、葵花籽油、大米油、芝麻油、棕榈油、椰子油、花生油等)、动物性油脂(猪油、牛油、乳脂等)以及鱼油。这些油脂的加工品(人造奶油、起酥油、黄油等)也可作为处理对象。

本发明的油分解除去方法的最大特征是，在油脂的水解产物脂肪酸存在的条件(本发明中称为“第1条件”)下、或者在油脂被分解为脂肪酸和甘油的条件(本发明中称为“第2条件”)下，使同化游离脂肪酸的解脂耶罗维亚酵母作用。其中“使···作用”是指，使其形成与油脂的水解产物游离脂肪酸接触的状态。具体而言，投入或添加同化游离脂肪酸的解脂耶罗维亚酵母或含有其的制剂等，或者将固定化有该解脂耶罗维亚酵母的载体等设置于废水通路、废水贮留槽、隔油池内等。除了隔油池外，也可以另外设置专用的分解处理槽。

本发明中通过使用游离脂肪酸的同化能力优异的解脂耶罗维亚酵母，从而除去由油脂的分解生成的游离脂肪酸。或者防止游离脂肪酸的蓄积，促进油脂的分解。采用上述第1条件时，典型地是预先将油脂水解，变得可以应用本发明。油脂的水解可利用脂肪酶或具有脂肪酶分泌能力的微生物(参照以下说明)。另一方面，采用第2条件时，通常以形成脂肪酶或具有脂肪酶分泌能力的微生物存在的状态为前提。

无论采用何种条件，均可使用各种脂肪酶，例如，可利用市售的脂肪酶制剂。作为脂肪酶制剂的例子，可举出脂肪酶A10FG(Yakult药品工业株式会社制)、脂肪酶AL、脂肪酶OF、脂肪酶MY(以上，名糖产业株式会社制)、Lipolase、Lipex、Resinase、Lipozyme、Patalase、Lipopan、卵磷脂酶(以上，Novozymes Japan株式会社制)、脂肪酶AS“Amano”、脂肪酶AYS“Amano”、脂肪酶PS“Amano”、脂肪酶AK“Amano”、脂肪酶PS“Amano”、脂肪酶A“Amano”、脂肪酶AY“Amano”、脂肪酶G“Amano”、脂肪酶R“Amano”、脂肪酶DF“Amano”、脂肪酶MER“Amano”(以上、天野酶株式会社制)。另一方面，作为具有脂肪酶分泌能力的微生物，可使用芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、红细菌属(Rhodobacter)、雷尔氏菌(Ralstonia)属、食酸菌属(Acidovorax)等。其中，优选伯克霍尔德氏菌属微生物。伯克霍尔德氏菌属微生物的具体例是木本树伯克霍尔德菌SL1B1株。该菌株以保藏编号NITE P-724保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，通过规定手续就能够获得分割转让。该菌株会高率分解油脂。而且，即使在弱酸性条件下，也能够增殖和油脂分解。

关于微生物的脂肪酶分泌能力，可通过测定经微生物培养液的离心分离而得到的培养上清的脂肪酶活性进行评价。脂肪酶活性如下确定:使用棕榈酸和4-硝基苯酚的酯即4-硝基苯基棕榈酸酯(4-NPP)作为底物进行酶反应，通过测定410nm的吸光度来确定因酯的水解而产生的4-硝基苯酚的量。首先，将4-NPP(18.9mg)添加到3％(v/v)Triton X-100(12ml)，70℃溶解作为底物溶液。将底物溶液1mL、离子交换水0.9mL和150mM GTA缓冲液(150mM3,3-二甲基戊二酸、150mM Tris、和150mM2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇中加入NaOH或HCl，调节为pH6)1mL加入样品池中，28℃保温5分钟。向其中添加培养上清0.1mL，一边搅拌一边测定410nm的值。对于脂肪酶活性，将生产1微摩尔4-硝基苯酚的酶量定义为1单位(U)，进行活性测定，计算出相当于1mL培养上清的单位数。

微生物的油脂和脂肪酸的分解·消耗能力，可用气相色谱将培养基中残存的油脂含有的脂肪酸和由水解产生的游离脂肪酸进行定量，由此进行评价。示出具体的定量步骤，首先，用盐酸将培养上清1mL调节为酸性，加入2mL氯仿。2分钟搅拌后离心，将氯仿层1mL转移至其它容器，将溶剂蒸发浓缩。加入甲醇分解溶液(甲醇:硫酸＝17:3)2mL，100℃加热2小时，将油脂和游离脂肪酸甲酯化。然后，加入氯仿2mL、纯水1mL并搅拌之后，用气相色谱分析氯仿层，将脂肪酸的甲基酯定量。

微生物水解油脂的能力和消耗脂肪酸的能力，可用薄层色谱(TLC)分析培养基中残存的油脂和作为其水解生成物的脂肪酸，由此进行评价。示出具体的步骤，向培养上清20mL添加乙酸乙酯40mL后，用盐酸调节为酸性，搅拌10分钟。然后，浓缩乙酸乙酯层20mL，溶解于氯仿4mL之后，对TLC点样2μL，用氯仿:丙酮(96:4)溶液展开。油脂和脂肪酸的标准物质中，可分别使用三油酸甘油酯和油酸。展开后，喷洒4％(w/v)12钼磷酸(IV)乙醇溶液，通过100℃加热30分钟，能够将油脂和游离脂肪酸可视化。

如后述的实施例所示，本发明人等的研究结果表明被鉴定为游离脂肪酸的同化能力优异的解脂耶罗维亚酵母不分泌脂肪酶。基于这一事实，本发明的一实施方式中，使用具有不分泌脂肪酶这一特性的解脂耶罗维亚酵母。另一方面，表明成功获得的解脂耶罗维亚酵母与木本树伯克霍尔德菌共生，且实现有效的油的分解除去。基于这一事实，优选使用能够与木本树伯克霍尔德菌共生的解脂耶罗维亚酵母。应予说明，这种情况下，木本树伯克霍尔德菌被并用。能够与木本树伯克霍尔德菌共生的解脂耶罗维亚酵母的具体例是后述的实施例示出的1A1株、8A1株、8D1株、24B2株。其中，优选与木本树伯克霍尔德菌SL1B1株的并用效果优异的1A1株。该菌株如下所示，保藏于规定的保藏机构。

保藏机构:独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(邮编292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)

保藏日:2011年11月25日

保藏编号:NITE BP-1167

本发明的另一实施方式中，也并用将油脂分解产物之一的甘油进行同化的微生物，防止因甘油的蓄积引起的油脂分解速度的降低。只要能够同化甘油，其中的微生物没有特别限制，例如，可使用真细菌、酵母、丝状真菌类。优选使用念珠菌属酵母。念珠菌属酵母的具体例是柱状假丝酵母SL1B2株(专利文献2)。该菌株以保藏编号NITE P-714保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，通过规定的手续就能够获得分割转让。该菌株除了甘油同化能力优异之外，具有能够与木本树伯克霍尔德菌共生这一特性。因此，与柱状假丝酵母SL1B2株组合使用，在使用木本树伯克霍尔德菌的实施方式(即，为了形成油脂被分解为脂肪酸和甘油的条件，使用分泌脂肪酶的木本树伯克霍尔德菌的实施方式)中特别优选。应予说明，其中的木本树伯克霍尔德菌的具体例是上述的木本树伯克霍尔德菌SL1B1株(保藏编号NITEP-724)。

微生物的甘油分解·消耗能力，通过利用酶法将培养上清的甘油浓度定量来进行评价。其中，可使用F试剂盒-甘油(Roche制)等市售的定量试剂盒。此外，微生物的油脂、脂肪酸、甘油的同化能力，可通过考察在以它们作为唯一碳源的培养基中的增殖能力进行评价。作为考察增殖能力的方法，包括测定菌体的光学密度的方法，但是以油脂、脂肪酸作为碳源时，由于底物的乳化会导致培养液白色浑浊，所以有时不适合。作为更通用的方法，有测定集落形成单位(CFU)的方法。琼脂培养基上，将培养液的原液和稀释液以一定量扩散涂开，计数通过静置培养而形成的集落。

应用本发明的油分解除去方法时的温度条件，只要使用的解脂耶罗维亚酵母能够生长且能够同化游离脂肪酸即可，没有特别限制。优选的温度范围是20℃～40℃。解脂耶罗维亚酵母1A1株即使在油的分解效率降低的低温条件下，也显示良好的活性。特别是，并用木本树伯克霍尔德菌SL1B1株时，也会促进木本树伯克霍尔德菌SL1B1株的生长，与单独使用木本树伯克霍尔德菌SL1B1株时相比，油的分解除去效率显著提高。

像并用解脂耶罗维亚酵母和木本树伯克霍尔德菌，或进一步并用柱状假丝酵母的情况那样将2种以上的微生物组合使用时，例如，分别准备各微生物用于使用。或者预先调制混合的微生物(混合微生物剂)，也可以将其用于本发明。并用3种以上的微生物时，也可以不将全部的微生物以1个混合微生物剂的形式构成(例如，使用3种微生物时，可准备含有1种微生物的微生物剂和含有其余2种微生物的微生物剂，并将它们并用)。

本发明中使用的解脂耶罗维亚酵母的使用量，可考虑处理对象、处理条件等进行设定。如果举出使用量的例子，应用于工场废水(正己烷值是约300mg/L)时，将1×10⁴CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的解脂耶罗维亚酵母培养物以每1L处理槽的容积为1mL～100mL的方式进行添加。应用于隔油池时，将1×10⁴CFU/mL～1×10¹¹CFU/mL的解脂耶罗维亚酵母培养物以每1L隔油池的容积为1mL～100mL的方式进行添加。对于并用的成分的使用量也是同样，可考虑处理对象、处理条件等进行设定。并用木本树伯克霍尔德菌时的使用量，例如是每1L处理槽容积为1×10⁴CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的培养物1mL～100mL(废水处理的情形)，每1L隔油池的容积为1×10⁴CFU/mL～1×10¹¹CFU/mL的培养物1mL～100mL(隔油池的净化的情形)。同样地，并用柱状假丝酵母时的使用量，例如是每1L处理槽的容积为1×10⁴CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的培养物1mL～100mL(废水处理的情形)，每1L隔油池的容积为1×10⁴CFU/mL～1×10¹¹CFU/mL的培养物1mL～100mL(隔油池的净化的情形)。应予说明，为了维持效果，例如，优选以1小时～7天的间隔进行微生物的追加或交换。与微生物的使用量同样，追加或交换的频度可考虑处理对象、处理条件等进行设定。

2.游离脂肪酸的同化能力优异的微生物和油分解剂

本发明的第2方面，提供游离脂肪酸的同化能力优异的新型微生物及以其为有效成分的油分解剂。如上述所示，本发明者人等成功鉴定的解脂耶罗维亚酵母显示游离脂肪酸的同化能力优异、另一方面不分泌脂肪酶的这一特性。此外，确认与木本树伯克霍尔德菌共生，且实现有效的油的分解。基于这些见解，提供一种解脂耶罗维亚酵母，其特征在于，(1)同化游离脂肪酸，(2)不分泌脂肪酶，及(3)能够与木本树伯克霍尔德菌共生。本发明的解脂耶罗维亚酵母，由于具有(3)的特征，因此适合于与木本树伯克霍尔德菌的并用。具体而言，通过与木本树伯克霍尔德菌并用，在防止游离脂肪酸的蓄积、促进油脂的分解的同时，促进木本树伯克霍尔德菌的生长，进一步促进油的分解。本发明的解脂耶罗维亚酵母的具体例是由保藏编号NITE BP-1167确定的1A1株。

本发明的油分解剂中，将本发明的解脂耶罗维亚酵母应用于油脂的水解产物。即，将解脂耶罗维亚酵母作为有效成分使用。或者，组合解脂耶罗维亚酵母和将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分(以下，称为“分解油脂成分”)来使用。根据该实施方式的油分解剂，通过分解油脂成分进行油脂的分解，另一方面，通过解脂耶罗维亚酵母，防止油脂分解产物脂肪酸(游离脂肪酸)的蓄积。其结果是能够实现有效的油的分解除去。本说明书中“组合解脂耶罗维亚酵母和分解油脂成分来使用”或“组合解脂耶罗维亚酵母和分解油脂成分而成”是指，并用解脂耶罗维亚酵母和分解油脂成分。典型地，作为混合本发明的解脂耶罗维亚酵母和分解油脂成分的配合剂，提供本发明的油分解剂。例如，通过混合本发明的解脂耶罗维亚酵母的培养物和分解油脂成分得到油分解剂。作为分解油脂成分，使用脂肪酶或具有脂肪酶分泌能力的微生物。对于脂肪酶和具有脂肪酶分泌能力的微生物，如本发明的第1方面中说明的那样。应予说明，作为具有脂肪酶分泌能力的微生物，优选使用木本树伯克霍尔德菌，更优选使用由保藏编号NITE P-724确定的木本树伯克霍尔德菌SL1B1株。

另一方面，例如，也可以以由含有解脂耶罗维亚酵母的第1构成要素和含有分解油脂成分的第2构成要素组成的试剂盒的形式提供本发明的油分解剂。此时，同时或设置特定的时间的间隔使用两要素。优选，将两要素同时使用。此处的“同时”并不是要求严格的同时性。因此，如混合两要素之后进行添加·给予等的实施方式那样，两要素在没有时间差的条件下使用的情况当然可以，在添加·给予一种后快速添加·给予另一种等两要素实质上没有时间差的条件下而使用的情况也包含于此处的“同时”的概念。

也可以设定含有解脂耶罗维亚酵母的油分解剂，在其使用时并用分解油脂成分。此时的含有解脂耶罗维亚酵母的油分解剂和分解油脂成分的使用的时机与上述的试剂盒的实施方式的情形是同样的。即，优选为同时给予两者，也可以以规定的时间差使用两者。此外，与上述的实施方式相反，也可以设定含有分解油脂成分的油分解剂，在其使用时并用解脂耶罗维亚酵母。此时的使用的时机以上述的实施方式的情形为准。

作为第3成分，优选本发明的油分解剂中含有同化甘油的微生物。根据该实施方式，也能够防止油脂分解产物甘油的蓄积，成为能够实现更有效的油脂分解的油分解剂。对于同化甘油的微生物，如本发明的第1方面说明所示。应予说明，作为同化甘油的微生物，优选使用柱状假丝酵母，更优选使用由保藏编号NITE P-714确定的柱状假丝酵母SL1B2株。

可以进一步含有提高使用的微生物的活性的成分(例如，碳源、氮源)、干燥保护剂、用于长时间维持微生物的成分、防腐剂、赋形剂、强化剂、抗氧化剂等。

本发明的油分解剂以液体或固体或者以干燥体的状态提供。作为液体形状，可例示微生物的培养液(可以根据需要进行浓缩或稀释)、通过离心分离等从培养液将微生物收集后而再次分散于水、缓冲液或者培养液等而成的液体等。此外，关于固体，可以例示利用离心分离、挤压压缩等而脱水的固体、介于固体和液体中间的糊状状态·膏酱状态的固体、进一步干燥的干燥体等。关于干燥体，例如，可通过将培养菌体冻结干燥或者减压干燥而得到，作为其具体的形状可例示粉末、颗粒、片剂。

构成本发明的油分解剂的微生物也可以被固定化。即，可以使用固定于载体的微生物。作为用于固定化的载体的材质，可以例示碳纤维(PAN系、沥青系、酚醛树脂系等)、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、聚氨酯树脂、聚苯乙烯树脂、聚氯乙烯树脂、聚醋酸乙烯树脂、聚乙烯醇树脂、聚乙二醇树脂、丙烯酸树脂、明胶、精氨酸钠、卡拉胶、糊精及这些物质的复合物。为了提高微生物的固定化率，提高微生物的作用效率，优选使用多孔或纤维状的载体。载体的形状没有特别限制。载体的形状的例子是立方体状、直方体状、圆柱状、球状、圆板状、片状。对于微生物的固定化技术，例如，参考“利用微生物固定化法的废水处理(须藤隆一编著，产业用水调查会)”、“利用微生物固定化法的水处理-载体固定化法包括固定化法生物活性炭法(新型水处理系列(1))(望月和博，堀克敏，立本英机(著)，株式会社NTS)”等。

实施例

1.脂肪酸分解同化菌的筛选

为了选定专门用于脂肪酸分解的微生物，获取隔油池槽内的油、土壤、污泥、湖水等环境样品共计29种，将各样品涂布于以油酸作为唯一碳源的琼脂培养基上，采取形成的单个集落，接种于同培养基，重复进行这些操作，能够得到总计12个菌株的脂肪酸分解同化菌。将这12株的菌添加到以油酸作为唯一碳源的无机盐液体培养基，28℃、24小时振荡培养之后，比较微生物的增殖和油酸的分解能力。此外，使用以对脂肪酶分泌微生物的评价有效的油脂为唯一的碳源的无机盐琼脂培养基，评价脂肪酶分泌能力。脂肪酶分泌微生物，在产生于上述琼脂培养基上的集落周围形成清除区(环)。因此，未形成环的微生物不具有脂肪酶分泌能力。将脂肪酸分解微生物的候补菌株示于表1。对于增殖能力，利用目测对将培养液的白色浑浊的程度进行5阶段评价，对于油酸分解能力，利用目测对浮在培养液表面的油滴分散量的程度进行5阶段评价，作为比较对象使用脂肪酶分泌微生物木本树伯克霍尔德菌(Burkholderia arboris)。此外，候补菌株的鉴定中，由16S或者26S核糖体RNA的碱基序列评价记载了同源性。其结果是，作为候补菌株耶罗维亚菌(Yarrowia)属或伯克霍尔德菌属被选定多个。进而没有限制，其结果是，作为候补优选解脂耶罗维亚酵母(Y.lipolytica)。这些菌株不具有脂肪酶分泌能力、油脂分解能力，但是具有高的油酸分解能力和增殖能力。

[表1]

2.1A1株的分类

通过形态观察可知1A1株是酵母，通过基于26S rDNA的系统学解析将1A1株鉴定为解脂耶罗维亚酵母(Y.lipolytica)，其显示与标准株Y.lipolytica NRRL YB-423的100％的同源性(图1)。

3.油酸分解能力的详细比较

首先将筛选的12个菌株在添加了10g/L油酸的无机盐培养基进行24小时预培养，清洗集菌，调整菌体光学密度OD600变为0.01，接种于添加有2g/L油酸的无机盐液体培养基。使用100mL容量的烧瓶，28℃培养48小时后，将培养基中的残留脂肪酸浓度利用薄层色谱(TLC)进行评价。为了比较，也将具有高的油分解能力的B.arboris SL1B1株用于试验。其结果表明Y.lipolytica1A1株与包括B.arboris SL1B1株的其它菌株相比，油酸分解能力非常地高(图2)。

4.游离脂肪酸和油脂的同化能力

验证Y.lipolytica1A1株将油脂和油酸同化进行增殖的能力。在将10g/L(1％)芥花油和10g/L(1％)油酸作为碳源进行添加的琼脂培养基上观察生长(图3)。作为比较菌使用B.arboris SL1B1株。B.arboris在两培养基上增殖。与此相对，Y.lipolytica1A1株，在油酸培养基上能够增殖，而在芥花油培养基上没有增殖。因此Y.lipolytica1A1株具有将油脂的分解产物油酸进行同化的能力，但由于不能分泌脂肪酶，所以不能水解油脂，在油脂上不能生长。

5.油分解实验1

向3L的无机盐培养基添加10g/L芥花油，以pH6.0、温度28℃使用发酵罐进行B.arboris SL1B1株的纯培养或与Y.lipolytica1A1株的混合培养，解析油的分解行为。每6小时取样，考察脂肪酸浓度和微生物浓度。微生物浓度通过LB培养基上的集落计数来确定，对于脂肪酸而言用利用气相色谱的定量分析和利用薄层色谱的定性分析进行解析。其结果是，纯培养、混合培养均是30小时以内10g/L油脂及脂肪酸完全分解消失(图4)。纯培养中，B.arboris的菌体浓度达到10¹⁰细胞/mL。混合培养中B.arboris和Y.lipolytica1A1株均达到10⁷-10⁸细胞/mL。通过本实验，表明这二种微生物能够进行混合培养。但是，在该油脂浓度、温度中，B.arboris的油分解能力充分被发挥，无法看到Y.lipolytica1A1株的混合效果。

6.油分解实验2

向3L无机盐培养基添加10g/L芥花油，以pH6.0、温度22℃使用发酵罐进行B.arboris SL1B1株的纯培养或与Y.lipolytica1A1株的混合培养，解析油的分解行为。每6小时取样，考察脂肪酸浓度和微生物浓度。分析方法与实验5是同样的。其结果是B.arboris的纯培养中油脂和脂肪酸完全分解消失花费42小时以上，与此相对，混合培养中油脂的水解速度、脂肪酸的消耗速度加速，用30小时10g/L油脂和脂肪酸基本分解消失(图5)。此外，纯培养中B.arboris的菌密度达到10⁸细胞/mL，混合培养中B.arboris和Y.lipolytica1A1株分别达到10⁹细胞/mL和10⁶细胞/mL。在22℃这样低的温度下，B.arboris的游离脂肪酸同化速度变慢，在42小时仍有残存。通过添加油酸同化菌Y.lipolytica1A1株，发现了游离脂肪酸的分解·同化促进效果，即使用TLC在36小时也完全没有检测出脂肪酸。

7.油分解实验3

向3L无机盐培养基添加30g/L芥花油，以pH6.0、温度22℃使用发酵罐进行B.arboris SL1B1株的纯培养或与Y.lipolytica1A1株的混合培养，解析油的分解行为。每约12小时取样，考察脂肪酸浓度和微生物浓度。分析方法与实验5是同样的。其结果是B.arboris SL1B1株的纯培养中脂肪酸完全消失需要144小时，与此相对，与Y.lipolytica1A1株的混合培养中油脂和脂肪酸分解速度急剧加速，48小时以内脂肪酸完全消失(图6)。此外，纯培养中B.arboris达到10⁸细胞/mL，与此相对，混合培养中B.arboris和Y.lipolytica1A1株均增殖到超过10⁸细胞/mL。低温条件下且大量的油脂存在下，游离脂肪酸的蓄积量多，通过Y.lipolytica1A1株的共存而促进游离脂肪酸的分解·同化变得显著。

8.使用实际废水的实施例

向某食品工场的含有油的废水(正己烷值是约300mg/L)投入混合B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株而成的微生物制剂，控制在30℃、pH7，利用通气搅拌培养实施油分解试验。测定12小时后和18小时后的正己烷值。投入的活菌数(CFU)作为横轴、12小时后和18小时后的正己烷值的减少值作为纵轴示出于图中(图7)。投入的活菌数越多正己烷值的减少值越大，投入活菌数在10⁶cell/mL以上时，18小时后废水中的正己烷提取物基本没有(正己烷值减少值是约300mg/L)。此外，关于每一投入活菌数的12小时后和18小时后的活菌数的变化，示出于图8。可确认伴随时间经过活菌数增加。这样，B.arboris SL1B1株和Y.lipolytica1A1株的混合微生物制剂对于实际废水中的油的分解也是有效的得到验证。

9.隔油池中的验证试验

对某食堂隔油池投入B.arboris SL1B1株和柱状假丝酵母(Candida cylindracea)SL1B2株的混合二种微生物制剂，或B.arborisSL1B1株、C.cylindracea SL1B2株、Y.lipolytica1A1株的混合三种微生物制剂，进行实验。关于隔油池的构成，与以往公知的隔油池是同样的，因此省略详细说明，但描述其概况，由用板分隔成的3个槽构成，各槽间在底部相连接。废水流入第1槽，通过底部的开放部流入第2槽、进而流入第3槽，最终从第3槽流出。内容量是200L，废水的平均滞留时间是12分种。为了促进微生物的固定，在隔油池的底部投入木炭作为微生物固定化载体。微生物制剂的给予是在来自食堂厨房的废水的流入·流出在夜间停止之后立刻实施，用于正己烷值测定的采水，在白天的运转作业时进行。每晚将400mL的微生物制剂投入第1槽。其结果是通过混合二种微生物的制剂的添加确认了油分解效果，但是通过含有Y.lipolytica1A1株的混合三种微生物的制剂的添加能够飞跃性提高油分解效果，微生物制剂添加开始3周时间后，低于多个团体的正己烷值的标准值30mg/L，之后也维持在低值(图9)。

结论

(1)成功获得游离脂肪酸同化能力高的Y.lipolytica1A1株。1A1株与已知的解脂耶罗维亚酵母不同，不分泌脂肪酶。Y.lipolytica8A1株、8D1株、24B2株也显示同样的特性。

(2)Y.lipolytica1A1株能够与B.arboris SL1B1株共生。

(3)Y.lipolytica1A1株和B.arboris SL1B1株的并用显示极高的油分解能力，也适用于实际废水的处理。并用的效果，尤其是在低温下、大量的油脂存在下变得显著。

(4)除了Y.lipolytica1A1株和B.arboris SL1B1株之外，并用C.cylindracea SL1B2株会更进一步提高油分解能力，也适用于隔油池的净化。

产业上的可利用性

根据本发明的油分解除去方法，通过同化游离脂肪酸的解脂耶罗维亚酵母的作用，能够防止因油脂分解产物的蓄积引起的油脂分解速度的降低，能够实现有效的油的分解除去。例如，本发明能够适用于含有油脂废水的处理、隔油池的净化。此外根据本发明，也能够将含于油脂水解产物的游离脂肪酸分解除去，本发明也能够适用于油脂水解产物的处理。

本发明不局限于上述发明的实施方式和实施例的说明。在不脱离要求保护的范围的记载的情况下，本发明也包含在本领域技术人员容易想到的范围内的各种变形方式。本说明书中明示的论文、公开专利公报、以及专利公报等内容，通过援引而引用其全部内容。

Claims

1.一种油分解除去方法，其特征在于，在油脂的水解产物即脂肪酸存在的第1条件下、或在存在脂肪酶或存在具有脂肪酶分泌能力的微生物而油脂被分解为脂肪酸和甘油的第2条件下，使同化游离脂肪酸的不分泌脂肪酶的解脂耶罗维亚酵母作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解脂耶罗维亚酵母是能够与木本树伯克霍尔德菌共生的菌株。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解脂耶罗维亚酵母是由保藏编号NITE BP-1167确定的菌株。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微生物是木本树伯克霍尔德菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述木本树伯克霍尔德菌是由保藏编号NITE P-724确定的菌株。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，并用同化甘油的微生物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，同化甘油的所述微生物是柱状假丝酵母。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述柱状假丝酵母是由保藏编号NITE P-714确定的菌株。

9.根据权利要求1～5、7、8中任一项所述的方法，其中，所述油脂是废水中或隔油池内的油脂。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述油脂是废水中或隔油池内的油脂。

11.一种废水处理方法，其特征在于，用权利要求1～9中任一项所述的方法分解除去废水中的油。

12.一种隔油池净化方法，其特征在于，用权利要求1～9中任一项所述的方法分解除去隔油池内的油。

13.一种解脂耶罗维亚酵母，其具有以下特性:

(1)同化游离脂肪酸；

(2)不分泌脂肪酶；

(3)能够与木本树伯克霍尔德菌共生。

14.根据权利要求13所述的解脂耶罗维亚酵母，其是由保藏编号NITE BP-1167确定的菌株。

15.一种油分解剂，其特征在于，以权利要求13或14所述的解脂耶罗维亚酵母作为有效成分。

16.一种油分解剂，其特征在于，是组合权利要求13或14所述的解脂耶罗维亚酵母与将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分而成的。

17.根据权利要求16所述的油分解剂，其特征在于，含有所述解脂耶罗维亚酵母和所述成分。

18.根据权利要求16所述的油分解剂，其特征在于，是由含有所述解脂耶罗维亚酵母的第1构成要素和含有所述成分的第2构成要素组成的试剂盒。

19.根据权利要求16所述的油分解剂，其特征在于，含有所述解脂耶罗维亚酵母，与将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分并用。