KR102236782B1 - 미생물에서 오일 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다가불포화 지방산을 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원, 저 pH 또는 둘 모두를 포함하는 배지를 제공하는 단계, 및 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하는데 충분한 조건 하에 상기 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 또한 1종 이상의 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 농도 수준의 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 양을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계, 탄소 공급원 농도가 제1 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계, 및 배지에 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양을 첨가하여 탄소 공급원 농도를 제2 농도 수준으로 증가시키는 단계를 포함한다.

Description

미생물에서 오일 생산 방법{METHODS OF OIL PRODUCTION IN MICROORGANISMS}
본 발명은 미생물에서 오일을 생산하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2014년 5월 22일 출원된, 미국 가출원 제62/001,912호의 우선권을 주장하고, 그 전체를 참고로 본 명세서에 인용한다.
진핵생물 미생물의 발효배양을 통한 오일 생산 분야에서, 일정 전략들이 확립되어 광범위하게 용인되었다. 영양 억제를 피하여 높은 세포 농도를 획득하기 위한 그러한 한 가지 전략은 주요 기질(주로 탄소 공급원)을 연속 공급을 유지하기 위해 증가량으로 첨가하면서 발효배양 배지 내 그 기질의 고농도는 피하는, 유가 발효 배양을 사용한다. 그러나, 유가 발효 배양은 일반적으로 기질 공급 체제의 신중한 계획 및 집약적인 실시간 발효배양 모니터링 및 제어를 필요로 하고, 이는 광대한 인력을 요구하여 발효 작업의 높은 실패율을 초래할 수 있다.
산업적 규모의 발효배양과 관련된 다른 상당한 비용은 멸균과 관련된 절차를 포함한다. 이들 비용은 값비싼 압력 용기 발효배양기 및 스팀-인-플레이스(steam-in-place) 시스템을 비롯하여 스팀 생성과 관련된 작업 비용을 포함한다.
본 명세서는 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 다가 불포화된 지방산을 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원, 저 pH 또는 둘 모두를 포함하는 배지를 제공하는 단계, 및 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하기에 충분한 조건 하에 상기 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서는 또한 1종 이상의 미생물의 비멸균 배양의 오염을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원 존재 하에서, (ii) 저 pH 조건 하에서, 또는 (iii) 이들의 조합에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 배양 단계는 미생물을 포함하는 비멸균 배양의 오염을 감소시킨다.
본 명세서는 1종 이상의 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 농도 수준의 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 양을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계, 탄소 농도가 제1 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계, 및 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양을 배지에 첨가하여 탄소 공급원 농도를 제2 농도 수준으로 증가시키는 단계를 포함한다.
도 1은 2 리터(ℓ) 발효배양 동안 ONC-T18 세포 농도(바이오매스("X")) 및 총 지방산 함량(TFA%)의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 2는 5ℓ 발효배양 동안 ONC-T18 세포 농도(바이오매스("X")) 및 총 지방산 함량(TFA%)의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 3은 30ℓ 발효배양 동안 ONC-T18 세포 농도(바이오매스("X")) 및 총 지방산 함량(TFA%)의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 4는 동일한 발효배양 배지 공식(ONC 공식)을 사용한 동시 고포도당 발효배양 동안 ONC-T18 및 ATCC20888 세포 농도의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 5는 ONC-T18에 대해 ONC 발효배양 배지 공식 및 ATCC20888에 대해 상이한 발효배양 배지 공식을 사용한 동시 고포도당 발효배양 동안 ONC-T18 및 ATCC20888 세포 농도의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 6은 30ℓ 고포도당 다중-회분식 발효배양 동안 ONC-T18 세포 농도(바이오매스("X")) 및 포도당 농도의 시간 프로파일을 도시한 그래프이다. 도 6 및 도 3은 동일한 30ℓ 발효배양에 대한 데이터를 도시한다.
도 7은 고포도당 다중-회분식 발효배양 조건 하에서 ONC-T18의 성장에 대한 pH의 효과를 도시한 그래프이다.
도 8은 고포도당 다중-회분식 발효배양을 사용하고 상이한 pH 조건 하에서 성장된 ONC-T18의 지방산 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 9는 저 pH 조건 하에서 ONC-T18 배양의 감소된 오염을 도시한 그래프이다.
본 명세서는 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다가불포화 지방산을 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원, 저 pH 또는 둘 모두를 포함하는 배지를 제공하는 단계, 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하기에 충분한 조건 하에 상기 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 경우에 따라 배지는 저 pH를 갖는다. 경우에 따라, 배지는 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원을 갖는다. 경우에 따라 배지는 저 pH 및 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원을 갖는다.
본 명세서에서는 또한 1종 이상의 미생물을 포함하는 비멸균 배양의 오염을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원 존재 하에서, (ii) 저 pH 조건 하에서, 또는 (iii) 이들의 조합에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양 단계는 미생물을 포함하는 비멸균 배양의 오염을 감소시킨다. 경우에 따라, 상기 방법은 개방 용기에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 배양 단계는 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원의 존재 하에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 배양 단계는 저 pH 조건 하에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 배양 단계는 고농도의 1종 이상의 탄소 공급원 존재 하에, 저 pH 조건 하에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "저 pH" 또는 "감소된 pH"는 중성 pH보다 낮은 pH 값을 의미한다. 용어 "저 pH"는 대체로 4.5보다 낮은 pH 값을 의미한다. 경우에 따라, 저 pH는 2부터 4.5까지의 값, 또는 2 내지 4.5 사이의 임의 값을 의미한다. 경우에 따라, pH는 3 내지 3.5이다. 배양의 pH는 시간 경과에 따라, 즉 발효배양 프로세스 과정 동안 변화될 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 저 pH 조건 하에서 미생물을 배양하는 단계는 배양물 또는 배지의 pH를 모니터링하여 배양물의 pH가 저 pH로 유지되도록 시간에 따라 적합화하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 어구 "고농도의 탄소 공급원"은 200 g/ℓ 이상의 탄소 공급원의 양을 의미한다. 예를 들어, 1종 이상의 탄소 공급원의 농도는 200 g/ℓ 이상이거나 200 g/ℓ 초과이다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 농도는 200 내지 300 g/ℓ이다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 농도는 200 내지 250 g/ℓ이다. 탄소 공급원의 농도는 시간 경과, 즉, 발효배양 프로세스 과정 동안 변할 수 있음을 이해한다. 본 명세서에서 사용시, 고농도의 탄소 공급원을 함유하는 배지는 배지가 200 g/ℓ 이상의 탄소 공급원을 함유하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용시 고농도의 탄소 공급원에서 미생물을 배양하는 것은 배양물 또는 배지에서 탄소 공급원의 초기 농도가 200 g/ℓ 이상인 것을 의미한다. 이하에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 탄소 공급원 농도는 시간 경과에 따라 1회 이상 모니터링될 수 있고, 일정 한계치에 도달하면 탄소 공급원의 추가량을 배양물 또는 배지에 첨가할 수 있다. 이러한 예에서, 탄소 공급원의 추가량은 탄소 공급원의 고농도, 즉 200 g/ℓ 이상의 탄소 공급원이다.
따라서, 1종 이상의 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 농도 수준의 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 양을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계, 탄소 공급원 농도가 제1 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계, 및 탄소 공급원 농도가 제2 농도 수준으로 증가되도록 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양을 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 및/또는 제2 농도 수준은 200 g/ℓ 초과이다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양은 탄소 공급원 농도 수준이 0 내지 20 g/ℓ에 도달할 때 배지에 첨가된다. 제공된 방법은 기술된 바와 같이, 탄소 공급원의 모니터링 및 첨가의 반복 회차를 포함할 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원이 제2 양의 첨가 후에, (a) 1종 이상의 탄소 공급원의 탄소 공급원 농도가 제2 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 미생물을 배양하는 단계, 및 (b) 탄소 공급원 농도가 제3 농도 수준으로 증가되도록 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양을 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 농도 수준은 200 g/ℓ 초과이다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양은 탄소 공급원 농도가 0 내지 20 g/ℓ로 감소될 때 배지에 첨가된다. 경우에 따라, 상기 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양의 첨가 후에, (a) 1종 이상의 탄소 공급원의 탄소 공급원 농도가 제3 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 미생물을 배양하는 단계, 및 (b) 탄소 공급원 농도가 제4 농도 수준으로 증가되도록 1종 이상의 탄소 공급원의 제4 양을 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제4 농도 수준은 200 g/ℓ 초과이다. 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제4 양은 탄소 공급원 농도가 0 내지 20 g/ℓ로 감소될 때 배지에 첨가된다. 경우에 따라, 제1, 제2, 제3, 및 제4 양의 1종 이상의 탄소 공급원은 동일하다.
제공된 방법에서, 탄소 공급원 농도는 1회 이상 모니터링될 수 있다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도는 연속적으로(예를 들어, 배지 내 탄소 공급원(예를 들어, 포도당) 농도를 연속적으로 모니터링하는 장치를 사용) 또는 주기적으로(예를 들어, 배지 샘플을 분리제거하여 샘플 중 탄소 공급원 농도를 검사하여) 모니터링할 수 있다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도는 1종 이상의 탄소 공급원의 양의 첨가 전 및/또는 후에 모니터링하거나 측정된다. 따라서, 예를 들어, 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 양들의 첨가 사이에 1회 이상 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 양의 첨가 전, 1종 이상의 탄소 공급원의 양의 첨가 후에, 및 1종 이상의 탄소 공급원의 추가량의 첨가 전 1회 이상, 탄소 공급원 농도를 모니터링 또는 결정하는 단계를 포함한다. 예로서, 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 양의 첨가 후에, 경우에 따라, 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양의 첨가 전에 1회 이상 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계를 포함한다. 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양의 첨가 후에, 및 경우에 따라 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양의 첨가 전 1회 이상, 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 제공된 방법은 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양의 첨가 후에, 및 경우에 따라 1종 이상의 탄소 공급원의 제4 양의 첨가 전 1회 이상, 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 제공된 방법에서, 탄소 공급원 농도는 1종 이상의 탄소 공급원의 양의 각 첨가 사이에 1회 모니터링된다. 예로서, 탄소 공급원 농도는 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 양의 첨가 후 및 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양의 첨가 전, 1회 모니터링된다. 유사하게, 탄소 공급원 농도는 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양의 첨가 후 및 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양의 첨가 전에 1회 모니터링될 수 있다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도는 1종 이상의 탄소 공급원 양의 추가 첨가 횟수와 무관하게 1종 이상의 탄소 공급원의 제2 양 첨가 전에 1회 모니터링된다.
탄소 공급원 농도 또는 수준은 당업자에게 공지된 임의 방식에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 모니터링될 수 있다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도는 예를 들어, 배지 또는 배지 유래 샘플 내 용존 산소 수준을 측정하여 모니터링된다. 경우에 따라, 모니터링 단계는 배지 샘플을 얻는 단계, 및 샘플 중 탄소 공급원 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도를 결정하는 단계는 비색, 효소-기반, 또는 형광발광 검정법을 포함한다. 경우에 따라, 탄소 공급원 농도를 결정하는 단계는 고압 액상 크로마토그래피(HPLC)를 포함한다.
I. 미생물
본 명세서에 기술된 방법은 미생물 개체군에서 지질을 추출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기술된 미생물 개체군은 조류(예를 들어, 미세조류), 진균(효모 포함), 박테리아, 또는 원생생물일 수 있다. 경우에 따라, 미생물은 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 보다 구체적으로, 트라우스토키트륨 속의 트라우스토키트리알레스를 포함한다. 경우에 따라, 미생물 개체군은 미국 특허 제5,340,594호 및 제5,340,742호(이들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술된 바와 같은, 트라우스토키트리알레스를 포함한다. 미생물은 트라우스토키트륨 종, 예컨대 미국 특허 제8,163,515호(이의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술된 바와 같은, ATCC 수탁 번호 PTA-6245로 기탁된 트라우스토키트륨 종(즉, ONC-T18)일 수 있다. 따라서, 미생물은 서열번호 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 이상(예를 들어, 100% 포함) 동일한 18s rRNA 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법에서 사용하기 위한 방법은 다양한 지질 화합물을 생산할 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 용어 지질은 인지질, 유리 지방산, 지방산의 에스테르, 트라이아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필(예를 들어, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 및 당업자에게 알려진 다른 지질을 포함한다. 경우에 따라, 지질 화합물은 불포화 지질을 포함한다. 불포화 지질은 다가불포화 지질(즉, 2개 이상의 불포화 탄소-탄소 결합, 예를 들어 이중 결합을 함유하는 지질) 또는 고도의 불포화 지질(즉, 4개 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 함유하는 지질)을 포함할 수 있다. 불포화 지질의 예에는 오메가-3 및/또는 오메가-6 다가불포화 지방산, 예컨대 도코사헥사엔산(즉, DHA), 아이코사펜타엔산(즉, EPA), 및 다른 천연 유래 불포화, 다가불포화 및 고도의 불포화된 화합물이 포함된다.
II. 프로세스
발효배양
제공된 방법은 당분야에 공지된 방법에 따라 미생물을 배양하는 추가 단계와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 트라우스토키트리드, 예를 들어 트라우스토키트륨 종은 미국 공개 특허 출원 제2009/0117194호 또는 제2012/0244584호(이들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술된 방법에 따라 배양될 수 있다. 미생물은 성장 배지("배양 배지"라고도 알려짐)에서 성장된다. 임의의 다양한 배지가 본 명세서에 기술된 미생물을 배양하는데 적합할 수 있다. 경우에 따라, 배지는 미생물을 위한, 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함하는, 다양한 영양 성분을 공급한다.
트라우스토키트리드 배양용 배지는 임의의 다양한 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 탄소 공급원의 예에는 지방산, 지질, 글리세롤, 트라이글리세롤, 탄수화물, 폴리올, 아미노당, 및 임의 종류의 바이오매스 또는 폐기 스트림을 포함한다. 지방산은 예를 들어, 올레산을 포함한다. 탄수화물은 제한없이, 포도당, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 프룩토스, 덱스트로스, 자일로스, 락툴로스, 갈락토스, 말토트라이오스, 말토스, 락토스, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세테이트, m-이노시톨(예를 들어, 옥수수 침지액에서 유도), 갈락투론산(예를 들어, 펙틴에서 유도), L-푸코스(예를 들어, 갈락토스에서 유래), 젠티오바이오스, 글루코사민, 알파-D-포도당-1-포스페이트(예를 들어, 포도당에서 유도), 셀로바이오스, 덱스트린, 알파-사이클로덱스트린(예를 들어, 전분에서 유도), 및 수크로스(예를 들어, 당밀)를 포함한다. 폴리올은 제한없이, 말티톨, 에리쓰리톨, 및 아도니톨을 포함한다. 아미노당은 제한없이, N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민, 및 N-아세틸-베타-D-만노사민을 포함한다. 경우에 따라, 탄소 공급원은 포도당이다. 상기에 언급한 바와 같이, 제공되는 방법에서, 탄소 공급원은 고농도로, 예를 들어 200 g/ℓ 이상로 제공된다.
경우에 따라, 본 명세서에 제공된 미생물은 바이오매스 및/또는 관심 화합물(예를 들어, 오일 또는 총 지방산(TFA) 함량)의 생산을 증가시키는 조건 하에서 배양된다. 예를 들어, 트라우스토키트리드는 전형적으로 염수 배지에서 배양된다. 경우에 따라, 트라우스토키트리드는 약 2.0 g/ℓ 내지 약 50.0 g/ℓ의 염 농도를 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 경우에 따라, 트라우스토키트리드는 약 2 g/ℓ 내지 약 35 g/ℓ(예를 들어, 약 18 g/ℓ 내지 약 35 g/ℓ)의 염 농도를 갖는 배지에서 배양된다. 경우에 따라, 본 명세서에 기술된 트라우스토키트리드는 낮은 염 조건에서 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 트라우스토키트리드는 약 5 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ(예를 들어, 약 5 g/ℓ 내지 약 15 g/ℓ)의 염 농도를 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 경우에 따라, NaCl을 포함한다. 경우에 따라, 배지는 자연 또는 인공 바다 소금 및/또는 인공 해수를 포함한다.
배양 배지는 나트륨 공급원으로서, 클로라이드 무함유 나트륨 염(예를 들어, 황산나트륨)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 총 나트륨의 유의한 비율은 배양 배지 중 총 나트륨의 약 100%, 75%, 50%, 또는 25% 미만이 염화나트륨으로 공급되도록 비클로라이드 염으로 공급된다.
경우에 따라, 배양 배지는 클로라이드 농도가 약 3 g/ℓ, 500 mg/ℓ, 250 mg/ℓ, 또는 120 mg/ℓ 미만이다. 예를 들어, 제공된 방법에서 사용하기 위한 배양 배지는 클로라이드 농도가 약 60 mg/ℓ 내지 120 mg/ℓ이다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 적합한 염화나트륨 이외의 염의 예는 제한없이, 소다회(탄산나트륨 및 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨, 및 이의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,340,742호 및 제6,607,900호(이들 각각의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)를 참조한다.
트라우스토키트리드 배양을 위한 배지는 임의의 다양한 질소 공급원을 포함할 수 있다. 예시적인 질소 공급원은 암모늄 용액(예를 들어, H2O 중 NH4), 암모늄 또는 아민 염(예를 들어, (NH4)2SO4,(NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3(NH4Ac)), 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분, 나트륨 글루타메이트, 대두 추출물, 카사미노산 및 주모를 포함한다. 적합한 배지 내 질소 공급원의 농도는 전형적으로 약 1 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ의 범위이다.
배지는 경우에 따라 포스페이트, 예컨대 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함한다. 배지 내 무기 염 및 미량 영양분은 황산암모늄, 중탄산나트륨, 나트륨 오르소바나데이트, 칼륨 크로메이트, 나트륨 몰리브데이트, 셀레노우스 산, 황산니켈, 황산구리, 황산아연, 염화코발트, 염화철, 염화망간, 염화칼슘, 및 EDTA를 포함한다. 비타민 예컨대 피리독신 하이드로클로라이드, 티아민 하이드로클로라이드, 칼슘 판토테네이트, p-아미노벤조산, 리보플라빈, 니코틴산, 바이오틴, 폴산 및 비타민 B12가 포함될 수 있다.
배지의 pH는 적절한 경우에 산 또는 염기를 사용하고/하거나 질소 공급원을 사용하여 3.0 내지 10.0으로 조정할 수 있다. 경우에 따라, 배지는 상기 정의된 바와 같이 저 pH로 조정된다. 배지는 멸균될 수 있다.
대체로 미생물의 배양에 사용되는 배지는 액체 배지이다. 그러나, 미생물의 배양에 사용되는 배지는 고형 배지일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 탄소 및 질소 공급원 이외에도, 고형 배지는 구조적 지지체를 제공하고/하거나 배지를 고체 형태가 될 수 있게 하는 1 이상의 성분(예를 들어, 한천 또는 아가로스)를 함유할 수 있다.
세포는 1일 내지 60일 동안 어디든 배양할 수 있다. 경우에 따라, 배양은 14일 이하, 13일 이하, 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하, 5일 이하, 4일 이하, 3일 이하, 2일 이하, 또는 1일 이하 동안 수행된다. 배양은 경우에 따라 약 4℃ 내지 약 30℃, 예를 들어 약 18℃ 내지 약 28℃의 온도에서 수행된다. 배양은 통기-진탕 배양, 진탕 배양, 정치 배양, 회분식 배양, 반연속 배양, 연속 배양, 롤링 회분식 배양, 웨이브 배양 등을 포함할 수 있다. 배양은 통상의 교반-발효배양기, 기포탑형 발효배양기(회분식 또는 연속 배양), 웨이브 발효배양기 등을 사용해서 수행할 수 있다.
배양은 진탕을 포함하여, 1 이상의 다양한 방법으로 통기될 수 있다. 경우에 따라, 진탕은 약 100 rpm 내지 약 1000 rpm, 예를 들어, 약 350 rpm 내지 약 600 rpm 또는 약 100 내지 약 450 rpm 범위이다. 경우에 따라, 배양은 바이오매스 생산기 및 지질 생산기 동안 상이한 진탕 속도를 사용해서 통기된다. 대안적으로 또는 부가적으로 진탕 속도는 배양 용기의 유형(예를 들어, 플라크스의 형태 또는 크기)에 따라 다양할 수 있다.
경우에 따라, 용존 산소(DO)의 수준은 지질 생산기 동안 보다 바이오매스 생산기 동안 더 높다. 따라서, DO 수준은 지질 생산기 동안 감소된다(즉, DO 수준은 바이오매스 생산기의 용존 산소 양보다 적다). 경우에 따라, 용존 산소의 수준은 포화 이하로 감소된다. 예를 들어, 용존 산소 수준은 매우 낮은 수준, 또는 심지어 검출불가능한 수준으로 감소될 수 있다.
바람직한 지질의 생산은 보다 높은 품질의 바람직한 화합물을 얻기 위해 1 이상의 배양 조건의 이동을 포함하는 본 발명에 따라서 세포를 배양하는 것에 의해 향상될 수 있다. 경우에 따라, 세포는 바이오매스를 최대화하는 조건 하에서 먼저 배양된 후 지질 생산성에 호의적인 1 이상의 배양 조건의 이동을 후속한다. 이동시킨 조건은 산소 농도, C:N 비율, 온도, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 제1 단계는 바이오매스 생산(예를 들어, 고산소(예를 들어, 대체로 또는 제2 단계에 비해), 저 C:N 비율, 및 대기 온도 사용)에 호의적이고, 이어서 지질 생산에 호의적인 제2 단계(예를 들어, 산소를 감소시키고, C:N 비율을 증가시키고, 온도를 감소시킴)를 후속하는 2단계 배양을 수행한다.
저온살균
경우에 따라, 최종 바이오매스는 저온살균하여 바이오매스에 존재하는 바람직하지 않은 물질을 비활성화시킨다. 예를 들어, 바이오매스는 화합물 분해 물질을 불활성화시키기 위해 저온살균될 수 있다. 바이오매스는 발효배양 배지에 존재하거나 저온살균 단계를 위한 발효배양 배지로부터 단리될 수 있다. 저온살균 단계는 바이오매스 및/또는 발효배양 배지를 고온으로 가열하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스 및/또는 발효배양 배지는 약 50℃에서 약 95℃(예를 들어, 약 55℃에서 약 90℃ 또는 약 65℃에서 약 80℃)의 온도로 가열시킬 수 있다. 경우에 따라, 바이오매스 및/또는 발효배양 배지는 약 30분에서 약 120분(예를 들어, 약 45분에서 약 90분, 또는 약 55분에서 약 75분) 동안 가열될 수 있다. 저온살균은 당업자에게 알려진 적합한 가열 수단, 예컨대 직접 스팀 주입법을 사용해서 수행될 수 있다.
경우에 따라, 저온살균 단계는 수행되지 않는다(즉, 이 방법은 저온살균 단계가 없음).
수확 및 세척
경우에 따라, 바이오매스는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수확될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 경우에 따라 다양한 통상의 방법, 예컨대 원심분리(예를 들어, 간헐식 원심분리) 또는 여과(예를 들어, 직교류 여과)를 사용해서 발효배양 배지로부터 회수될 수 있고 또한 세포 바이오매스의 가속화된 회수를 위한 침전제(예를 들어, 인산나트륨 또는 염화칼슘)의 사용을 포함할 수 있다.
경우에 따라, 바이오매스는 물로 세척된다. 경우에 따라, 바이오매스는 최대 약 20% 고체로 농축될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 약 5% 내지 약 20% 고체, 약 7.5% 내지 약 15% 고체, 또는 약 15% 고체 내지 약 20% 고체, 또는 언급된 범위 내 임의 비율로 농축될 수 있다. 경우에 따라, 바이오매스는 약 20% 고체 이하, 약 19% 고체 이하, 약 18% 고체 이하, 약 17% 고체 이하, 약 16% 고체 이하, 약 15% 고체 이하, 약 14% 고체 이하, 약 13% 고체 이하, 약 12% 고체 이하, 약 11% 고체 이하, 약 10% 고체 이하, 약 9% 고체 이하, 약 8% 고체 이하, 약 7% 고체 이하, 약 6% 고체 이하, 약 5% 고체 이하, 약 4% 고체 이하, 약 3% 고체 이하, 약 2% 고체 이하, 또는 약 1% 고체 이하로 농축될 수 있다.
단리 및 추출
제공된 방법은, 경우에 따라 당업자에게 공지된 방법을 사용해서 바이오매스 또는 미생물로부터 다가불포화 지방산을 단리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 다가불포화 지방산을 단리하는 방법은 미국 특허 제8,163,515호(이는 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기술되어 있다. 경우에 따라, 배지는 다가불포화 지방산의 단리 전에 멸균되지 않는다. 경우에 따라, 멸균은 온도 증가를 포함한다. 경우에 따라, 미생물에 의해 생산되어 제공된 방법으로 단리된 다가불포화 지방산은 중간 쇄 지방산이다. 경우에 따라, 1종 이상의 다가불포화 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 아이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된다.
III. 생성물
본 명세서에 기술된 방법에 따라 생산된 다가불포화 지방산(PUFA) 및 다른 지질은 그들의 생물학적 또는 영양적 특성을 이용하는, 임의의 다양한 분야에서 이용될 수 있다. 경우에 따라, 화합물은 약제, 식품 첨가물, 동물 사료 첨가물, 화장품 등에 사용될 수 있다. 경우에 따라, PUFA 및 다른 지질은 연료, 예를 들어 생물연료를 생산하는데 사용된다. 본 명세서에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 또한 다른 화합물의 생산에서 중간체로서 사용될 수 있다.
경우에 따라, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 최종 제품(예를 들어, 식품 또는 식품 보충제, 유아 유동식, 약제, 연료 등)에 혼입될 수 있다. 본 명세서에 기술된 지질을 혼입시키기 적합한 식품 또는 식품 보충제는 음료 예컨대 우유, 물, 스포츠 음료, 에너지 음료, 차, 및 주스; 당과제품 예컨대 젤리 및 비스켓; 지방 함유 식품 및 음료 예컨대 유제품; 가공 식품 예컨대 연질미(또는 포리지); 유아용 유동식; 아침 시리얼 등을 포함한다. 경우에 따라, 1종 이상의 생산된 지질은 식이 보충제, 예를 들어, 멀티비타민에 혼입될 수 있다. 경우에 따라, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 지질은 식이 보충제에 혼입될 수 있고, 경우에 따라 식품 또는 사료의 성분(예를 들어, 식품 보충제)에 직접 혼입될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법으로 생산된 지질이 도입될 수 있는 사료의 예는 애완동물 사료 예컨대 고양이 사료; 개 사료 등; 관상어류, 양식 어류 또는 갑각류용 사료; 농장 사육 동물용 사료(가축 및 수산양식되는 어류 또는 갑각류 포함)를 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법에 따라 생산된 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 물질은 바람직하게 의도하는 수용자 유기의 입맛에 맞다. 이 식품 또는 사료 물질은 식품 물질로 현재 알려진 임의의 물리적 특성(예를 들어, 고체, 액체, 연질)을 가질 수 있다.
경우에 따라, 생산된 화합물(예를 들어, PUFA) 중 1 이상은 약제에 혼입될 수 있다. 그러한 약제의 예에는 다양한 유형의 정제, 캡슐, 음용제 등을 포함한다. 경우에 따라, 약제는 국소 도포에 적합하다. 제형은 예를 들어, 캡슐, 오일, 과립, 세립, 산제, 정제, 환제, 트로키 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 임의의 다양한 작용제와 조합하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 생성물에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 그러한 화합물은 1 이상의 결합제 또는 충전제와 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생성물은 1 이상의 킬레이트화제, 안료, 염, 계면활성제, 보습제, 점도 개질제, 증점제, 연화제, 향료, 보존제 등, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
본 명세서는 개시된 방법의 생성물 및 조성물이거나, 그의 제조를 위해 사용되거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그를 위해 사용될 수 있는 재료, 조성물, 및 성분을 개시한다. 이들 재료의 조합, 서브셋, 상호작용, 기 등이 개시되는 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 변경에 대한 특별한 언급이 명확하게 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 특별히 본 명세서에서 고려되고 기술됨을 이해한다. 예를 들어, 방법이 개시되고 설명되며, 방법을 포함한 수많은 분자에 가해질 수 있는 많은 변경이 설명되면, 가능한 각각의 모든 방법의 조합 및 변경, 및 변형이 반대로 특별히 언급되지 않으면 특별히 고려된다. 유사하게, 임의의 서브셋 또는 이들의 조합이 또한 특별히 고려되고 개시된다. 이러한 개념은 제한없이, 개시된 조성물을 사용하는 방법의 단계들을 포함하여 이러한 개시의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행할 수 있는 다양한 추가 단계가 존재한다면, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계들의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 그러한 조합 또는 조합의 서브셋은 특별히 생각되고 본 명세서에 고려되어야 함을 이해한다.
본 명세서에 인용된 출판물 및 본 명세서에 인용된 자료들은 그들의 전문이 참고로 구체적으로 본 명세서에 편입된다.
이하의 실시예는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물의 소정의 양상들을 더욱 예시하고자 하는 것이며, 청구항의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1. 오일 생산을 위한 미생물의 고포도당 다중-회분식 발효배양
ONC-T18을 기반으로 우리의 발효배양 프로세스 개발 동안, 배양물은 발효배양 배지(최대 250 g/ℓ) 내 극도로 높은 농도의 포도당에서 생존할 수 있었다. 이러한 관찰은 의도적으로 높은 초기 포도당 농도 및 발효배양 동안 높은 포도당 용량으로 발효배양 프로세스의 개발로 이루어졌다.
따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 미생물에 대한 고유한 오일 발효배양 프로세스가 개발되었다. 배지 내 포도당의 초기 고농도(최대 250 g/ℓ) 및 발효배양 동안 고용량 포도당 공급을 포함하는 전략을 적용하여 신속한 배양 성장 및 오일 생산을 달성하였다. 이러한 탄소 공급원 공급 전략은 전통적인 유가식 발효배양 프로세스에 의해 채택되는 연속 탄소 공급 전략에 비해 단순하지만 고도의 효율적인 대안을 제공한다. 외래 유기체 오염 가능성은 높은 탄소 기질 농도에 의해 생성되는 높은 삼투압 덕분에 상당히 감소하였다. 이러한 발효배양 전략은 또한 대표적인 조류 오일 생산 균주, 스키조키트륨(Schizochytrium) ATCC20888의 발효배양에 적용되었다. 그러나, 고포도당 조건 하에서 유의한 배양 성장을 달성할 수 없었다. 그러므로, 이러한 고농도의 탄소 공급원에 대처하는 ONC-T18을 비롯한 일부 다른 미생물의 고유한 형질일 수 있음을 입증하였다.
ONC-T18의 고포도당 발효배양을 동일한 배지 조성 및 포도당 공급 전략으로 상이한 발효배양기 규모에서 수행하였다. 사용된 발효배양기는 2 리터(ℓ), 5ℓ, 및 30ℓ로서, 작업 부피는 각각 약 1.7ℓ, 4ℓ, 및 25ℓ였다. 배지 조성 및 포도당 공급 전략은 하기 표 1에 상세히 나타내었다.
ONC-T18의 고포도당 다중-회분 발효배양 동안 배지 성분 및 포도당 공급 전략
2ℓ 발효배양기 5ℓ 발효배양기 30ℓ 발효배양기
초기 부피 1.3ℓ 3.5ℓ 25ℓ
최종 부피 1.7ℓ 4.5ℓ 25ℓ
초기 배지 포도당 242 g/ℓ 230 g/ℓ 204 g/ℓ
대두 펩톤 2 g/ℓ 2 g/ℓ 2 g/ℓ
MgSO4.7H2O 4 g/ℓ 4 g/ℓ 4 g/ℓ
FeCl3.6H2O 0.005 g/ℓ 0.005 g/ℓ 0.005 g/ℓ
미량 원소
용액(스톡)		 1.5 ㎖/ℓ 1.5 ㎖/ℓ 1.5 ㎖/ℓ
KH2PO4 2.2 g/ℓ 2.2 g/ℓ 2.2 g/ℓ
K2HPO4 2.4 g/ℓ 2.4 g/ℓ 2.4 g/ℓ
(NH4)2SO4 20 g/ℓ 20 g/ℓ 20 g/ℓ
비타민
용액(스톡)		 3 g/ℓ 3 g/ℓ 3 g/ℓ
CaCl2.2H2O 0.1 g/ℓ 0.1 g/ℓ 0.1 g/ℓ
염기 5M NaOH 용액 필요시
산 2M H2SO4 용액 필요시
발효배양
동안
포도당 공급 		발효배양 동안 배지 내 포도당이 거의 고갈되었을 때, 고용량의 포도당이 수성 포도당 농도가 150 g/ℓ 내지 250 g/ℓ가 되도록 첨가되었다; 각각의 고용량 포도당 사이에 연속적 포도당 첨가는 이루어지지 않았다.
도 1 내지 도 3은 상이한 규모의 발효배양기를 사용한, ONC-T18 세포 농도(바이오매스) 및 총 지방산 생산(TFA %)의 시간 프로파일을 나타내는 그래프이다. 고 탄소 농도 하에서 다양한 미생물에 대해 보고된 것들과 대조적으로, ONC-T18은 이러한 혹독한 성장 조건 하에서 매우 빠르게 성장할 수 있었고 그 바이오매스가 발효배양 4일 내지 5일 동안 230 g/ℓ까지 증가될 수 있었다. 최종적으로 총 지방 함량은 시험된 모든 규모의 발효배양에서 70%에 도달할 수 있었고, 단일 세포 오일 발효배양에 관한 문헌에서 보고된 것들을 충족하거나 초과하였다.
높은 탄소 농도 하에서 성장하고 오일을 생산하는 능력이 ONC-T18 균주 및 고도로 관련된 균주의 고유한 형질인지에 대해 조사하기 위해, 대표적인 미세조류 오일 생산 균주 스키토키트륨 종 ATCC20888을 사용해서 ONC-T18과 동시에 발효배양을 실시하였다. 제1 동시 발효배양 실험에서, 양 균주는 표 1에 열거된 바와 동일한 배지 공식을 사용해서 2ℓ 발효배양기에서 성장시켰는데, 초기 포도당 농도가 ONC-T18 발효배양기는 188 g/ℓ였고 ATCC20888 발효배양기는 193 g/ℓ였다. 초기 포도당의 유의한 소비가 일어나지 않았기 때문에, 발효배양 동안 ATCC20888 발효배양기에 추가 포도당을 공급하지 않았다. 도 4에서 입증한 바와 같이, 균주 스키조키트륨 종 ATCC20888은 배지 내에서 포도당의 이와 같은 높은 초기 농도에 대처할 수 없었고, 따라서, 총 바이오매스 측면에서 거의 성장하지 않았다.
높은 포도당 조건 하에서 성장하는 ATCC20888의 불능성이 ONC의 조류 오일 발효배양 배지의 특별한 조성에 기인하지 않음을 확증하기 위해서, 다른 세트의 동시 발효배양을 2ℓ 발효배양기에서 실시하였다. 이 실험 동안, ONC-T18은 여전히 ONC의 배지 공식을 사용해서 배양하였고, 한편 ATCC20888은 베일리(Bailey) 등의 미국 특허 제6,607,900호(이의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 조정된 배지 공식을 사용해서 배양하였다. 시간 제약으로 인해, 오직 초기 포도당(ONC-T18 발효배양기의 경우 258 g/ℓ, ATCC20888 발효배양기의 경우 211 g/ℓ)만을 제공하였고, 양쪽 발효배양은 포도당이 고갈되기 전에 종료하였다(도 5). 균주 ATCC20888에 대해 특별히 개발된 배지 공식에서도, 높은 초기 포도당은 여전히 배양에는 너무 혹독한 조건이어서 유의하게 성장하지 않는 것으로 나타났다.
상기 발효배양으로 입증된 바와 같이, 전통적인 유가 발효배양과 새롭게 개발된 발효배양 프로세스 간 주요 차이는 시작 시점 및 또한 발효배양 과정 동안의 높은 포도당 농도였다. 새로운 프로세스는 약 200 g/ℓ 포도당(이전 프로세스의 60 g/ℓ 포도당과 비교) 및 충분한 양의 다른 영양분(예를 들어, 황산암모늄 형태의 질소, 인산칼륨 형태의 인)에서 출발한다. 오프 라인 샘플의 신속한 포도당 검정으로 검출시, 포도당이 고갈되거나 거의 고갈되면, 다른 고용량의 포도당을 한번에 첨가하여 발효배양 배지 내 포도당 농도를 다시 대략 200 g/ℓ로 상승시킨다. 따라서, 고용량 포도당 첨가의 각 시간 후, 발효배양은 고포도당 회분식 방식 하에서 작동되었다. 이러한 포도당 첨가 및 회분식 작동 주기는 오일 생산이 배양물의 생리적 한계에 도달하거나, 성장/생산이 다른 발효배양 조건, 예컨대 특정 발효배양 시스템의 디자인 요인들에 의해 결정된, 용존 산소 공급 등과 같은 다른 발효배양 조건에 의해 제한될 때까지 반복한다. 이러한 탄소 공급 전략은 조류 오일 발효배양 프로세스의 제어 및 모니터링을 매우 단순화시킨다. 이는 2ℓ 내지 10ℓ에서 이 프로세스의 타당성을 보여주는 표 2에 의해 입증되었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 4 내지 6일 주기에서 바이오매스는 200 내지 230 g/ℓ에 도달하였고 총 지방산 함량은 약 70%에 달하였다.
2ℓ 내지 10ℓ 배양시 고포도당 다중-회분식 전략 타당성.
회분 # 회분 시간 바이오매스 TFA MFA
2011-2L-1 102 시간 227 g/ℓ
2.22 g/ℓh		 69 %
156 g/ℓ
1.53 g/ℓh		 56 %
88 g/ℓ
0.86 g/ℓh
2011-5L-1 136 시간 237 g/ℓ
1.74 g/ℓh		 69 %
163 g/ℓ
1.20 g/ℓh		 68 %
110 g/ℓ
0.81 g/ℓh
2012-10L-3 135 시간 193 g/ℓ
1.43 g/ℓh		 77 %
149 g/ℓ
1.10 g/ℓh		 57 %
86 g/ℓ
0.63 g/ℓh
2012-10L-6 119 시간 191 g/ℓ
1.61 g/ℓh		 67 %
128 g/ℓ
1.08 g/ℓh		 66 %
84 g/ℓ
0.71 g/ℓh
2012-10L-4 162 시간 227 g/ℓ
1.41 g/ℓh		 70 %
159 g/ℓ
0.98 g/ℓh		 60 %
96 g/ℓ
0.59 g/ℓh
이러한 고포도당 발효배양의 다른 장점은 소수 미생물만 견딜 수 있어 오염이 덜 초래되는, 고 삼투압으로 부여되는 경쟁 우위이다. 2 발효배양 동안, 초기 200 g/ℓ 포도당 이외의 추가 포도당은 비멸균 형태로 첨가되었다. 오염이 관찰되지 않았다.
실시예 2. 오일 생산을 위해 미생물을 배양하기 위한 비멸균 발효배양 프로세스
산업 규모 발효배양의 상당한 비용은 멸균과 관련된 것들을 포함한다. 이 비용들에는 압력 용기 발효배양기 및 스팀-인-플레이스 시스템에 대한 비용뿐만 아니라 스팀 생성과 관련된 작동 비용도 포함된다. 이들 비용을 절감하기 위한 한 가지 방법은 비멸균 조건 하에서 배양물을 발효배양하는 것이다. 그러나, 비멸균 조건은 예를 들어, 박테리아에 의한 배양 오염으로 인해 대부분의 미생물에게는 문제가 된다.
ONC-T18 및 유사 미생물이 성장할 수 있는 비멸균 조건을 조사하기 위해, 효모 추출물 또는 대두 펩톤이 없는 배지를 제조하였다. 표 3에 배지 성분을 열거하였다. pH는 발효배양 전반에서 수산화나트륨(5N)을 사용해서 4.5로 제어하였다. 온도는 제어하지 않았고 발효배양 동안 75%의 포도당 공급을 사용하였다.
초기 배지 성분. pH 제어를 위한 NaOH 및 인산을 제외하고 발효배양에 다른 것을 첨가하지 않았다.
성분 양(리터 기준)
하이메디아 효모 추출물 0 g/ℓ
하이메디아 대두 펩톤 0 g/ℓ
초기 포도당 60 g/ℓ
NaCl 9 g/ℓ
황산암모늄 20 g/ℓ
인산모노칼륨 2 g/ℓ
황산마그네슘 4 g/ℓ
염화칼슘(용액) 0.5 ㎖/ℓ
FeCl3 6H2O(용액) 0.5 ㎖/ℓ
TES(용액) 1.5 ㎖/ℓ
비타민(용액) 3 ㎖/ℓ
공기는 살포기없이 실리콘관을 통해 공급하였다. 추진기는 라이트닌(Lightnin) A310 스타일 수중익선(축류)이었다. 상부 개방형 용기는 상부를 제거한 병이었다. pH는 바이오스타트 비(Biostat B) 상의 사토리우스(Sartorius) PH 제어 시스템(사토리아사(Sartorius Corporation), 미국 뉴욕주 보히미아시에 소재)으로 제어하였다. 온도 제어는 없었다. 발효배양 기간 동안 지방 축적 속도는 0.5 g/ℓ/h였고 DHA 축적 속도는 0.23 g/ℓ/h였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
상부 개방식 발효배양의 최종 결과.
시간(h) 바이오매스(g/ℓ) 총 지방산(g/ℓ) DHA(g/ℓ)
161.4 139 79 38
500ℓ 파일럿 규모 운용 동안, 박테리아 오염은 로그 시간 8에 검출되었다. 오염은 PCR에 의해 바실러스(Bacillus) 속인 것으로 확인되었다. 배지 성분은 하기 표 5에 나타내었다.
배지 성분
성분 양(1 리터 기준)
하이메디아 대두 펩톤 10 g/ℓ
초기 포도당 60 g/ℓ
NaCl 9 g/ℓ
황산암모늄 10 g/ℓ
인산칼륨 2.2 g/ℓ
인산칼륨 2.4 g/ℓ
황산마그네슘 4 g/ℓ
염화칼슘(용액) 0.5 ㎖/ℓ
FeCl3 6H2O(용액) 0.5 ㎖/ℓ
TES(용액) 1.5 ㎖/ℓ
비타민(용액) 3 ㎖/ℓ
박테리아를 혈구계산기를 사용해서 계수하고, 그 농도는 배지 1㎖ 당 세포 계수 단위로 계산하였다. 박테리아 개체군은 pH를 3.3으로 강하시켰을 때 증가가 중단되었다. 그러나, 이렇게 낮은 pH에서도, ONC-T18의 배양은 도 9에 도시한 바와 같이 성장이 이루어졌다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 이 실험을 pH 6.5 대신 pH 3.3에서 시작하면, 박테리아 오염이 관찰되지 않았음을 주목한다.
발효배양 검정에 의한 최종 결과
시간(h) 바이오매스(g/ℓ) 총 지방산(g/ℓ) DHA(g/ℓ)
198 148 103 34
다음으로, 상이한 pH 값, 특히 6.5, 4.5, 및 3.2의 pH 값에서, 미생물에 대한 그들 효과를 시험하였다. ONC-T18은 매우 산성인 조건 하에도 매우 잘 성취되었다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 도시하였다. 도 7 및 도 8의 발효배양은 실시예 1에 기술한 바와 같은 고포도당 다중-회분식 공급 전략을 사용해서 수행하였다.
따라서, ONC-T18 및 유사 미생물은 오일 생산 비용을 절감하고 오염을 감소시키기 위한 고 스트레스 조건, 예를 들어 고포도당(그에 따라 고삼투압) 및/또는 저 pH 하에서 발효배양되거나 성장될 수 있음을 본 명세서에서 입증하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Mara Renewables Corporation <120> METHODS OF OIL PRODUCTION IN MICROORGANISMS <130> 95523-943400-003WO1 <140> PCT/IB2015/001407 <141> 2015-05-21 <150> 62/001,912 <151> 2014-05-22 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1723 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 1 gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60 gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120 atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180 gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240 gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300 actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360 gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420 cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480 caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540 aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600 tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660 ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720 caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780 gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840 gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900 atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960 tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020 agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080 taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140 acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200 attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260 ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320 acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380 gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440 catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500 cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560 agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620 cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680 tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723

Claims (54)

  1. (a) 다가불포화 지방산을 생산할 수 있는 트라우스토키트륨(Thraustochytrium) 미생물을 제공하는 단계;
    (b) 1종 이상의 탄소 공급원을 200 g/L 초과의 제1 농도 수준으로 포함하는 배지를 제공하는 단계;
    (c) 제1 탄소 공급원 농도 수준이 0 내지 20 g/L로 감소할 때까지 상기 배지에서 트라우스토키트륨 미생물을 배양하는 단계;
    (d) 상기 배지에, 200 g/L 초과의 제2 농도의 1종 이상의 탄소 공급원을 첨가하는 단계; 및
    (e) 상기 배지에서 상기 트라우스토키트륨 미생물을 배양하여 1종 이상의 다가불포화 지방산을 생산하는 단계
    를 포함하는, 1종 이상의 다가불포화 지방산의 생산 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 트라우스토키트륨 미생물이 ATCC 수탁번호 PTA-6245를 갖는, 생산 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 농도는 200 g/L 초과 250 g/L 이하인, 생산 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 농도는 200 g/L 초과 300 g/L 이하인, 생산 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 지방산, 지질, 글리세롤, 트라이글리세롤, 탄수화물, 폴리올 및 아미노당으로 이루어진 군에서 선택되는, 생산 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 포도당인, 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 배지의 pH는 2 내지 4.5인, 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 배지의 pH는 3 내지 3.5인, 생산 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 다가불포화 지방산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 배지는 상기 다가불포화 지방산의 단리 전에 멸균되지 않는, 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    멸균은 온도 승온을 포함하는, 생산 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 다가불포화 지방산은 중간 쇄 지방산인, 생산 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 1종 이상의 다가불포화 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 아이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는, 생산 방법.
  19. 1종 이상의 트라우스토키트륨 미생물을 포함하는 비멸균 배양의 오염을 감소시키는 방법으로서, 상기 트라우스토키트륨 미생물을 (i) 200 g/L 초과의 제1 농도 수준의 1종 이상의 탄소 공급원, (ii) pH 2 내지 4.5의 저 pH, 또는 (iii) 이들의 조합을 갖는 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 배양하는 단계는 상기 트라우스토키트륨 미생물을 포함하는 비멸균 배양의 오염을 감소시키는, 비멸균 배양의 오염 감소 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 미생물을 개방형 용기에서 배양하는 단계를 포함하는, 비멸균 배양의 오염 감소 방법,
  21. 삭제
  22. 제19항에 있어서,
    상기 배양하는 단계는 3 내지 4.5의 저 pH 조건 하에서 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 비멸균 배양의 오염 감소 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제19항에 있어서,
    상기 트라우스토키트륨 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-6245를 갖는, 비멸균 배양의 오염 감소 방법,
  26. 삭제
  27. 제19항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 농도는 200 g/L 초과 250 g/L 이하인, 비멸균 배양의 오염 감소 방법,
  28. 제19항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 제1 농도는 200 g/L 초과 300 g/L 이하인, 비멸균 배양의 오염 감소 방법,
  29. 제19항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 지방산, 지질, 글리세롤, 트라이글리세롤, 탄수화물, 폴리올 및 아미노당으로 이루어진 군에서 선택되는, 비멸균 배양의 오염 감소 방법.
  30. 제19항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 포도당인, 비멸균 배양의 오염 감소 방법.
  31. 삭제
  32. 제19항에 있어서,
    상기 배지의 pH는 3 내지 3.5인, 비멸균 배양의 오염 감소 방법.
  33. 제1항에 있어서,
    단계 (c)가, 제1 탄소 공급원 농도가 0 내지 20 g/L로 감소될 때까지 탄소 공급원 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  34. 삭제
  35. 제33항에 있어서,
    제2 농도의 1종 이상의 탄소 공급원의 첨가 후에, (a) 상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 탄소 공급원 농도가 상기 제2 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 상기 미생물을 배양하는 단계, 및 (b) 1종 이상의 탄소 공급원의 제3 양을 상기 배지에 첨가하여 상기 탄소 공급원 농도를 제3 농도 수준으로 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 제3 농도 수준은 200 g/L 초과인, 생산 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 제3 양을 상기 탄소 공급원 농도가 0 내지 20 g/L로 감소될 때 상기 배지에 첨가하는, 생산 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 제3 양의 첨가 후에, (a) 상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 탄소 공급원 농도가 상기 제3 농도 수준 미만으로 감소될 때까지 상기 미생물을 배양하는 단계, 및 (b) 1종 이상의 탄소 공급원의 제4 양을 상기 배지에 첨가하여 상기 탄소 공급원 농도를 제4 농도 수준으로 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 제4 농도 수준은 200 g/L 초과인, 생산 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 상기 제4 양을 상기 탄소 공급원 농도가 0 내지 20 g/L로 감소될 때 상기 배지에 첨가하는, 생산 방법.
  41. 제33항에 있어서,
    상기 탄소 공급원 농도를 1회 이상 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  42. 제33항 또는 제38항에 있어서,
    상기 1종 이상의 탄소 공급원의 첨가 사이에 상기 탄소 공급원 농도를 1회 이상으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  43. 제33항에 있어서,
    상기 모니터링하는 단계는 용존 산소 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  44. 제33항에 있어서,
    상기 모니터링하는 단계는 상기 배지의 샘플을 얻는 단계, 및 상기 샘플 중 상기 탄소 공급원 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 생산 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 결정하는 단계는 비색 또는 형광발광 검정법을 포함하는, 생산 방법.
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 제38항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3 및 제4 농도 수준을 달성하도록 첨가되는 상기 1종 이상의 탄소 공급원은 동일한 것인, 생산 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3159974A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 MARA Renewables Corporation Methods of oil production in microorganisms
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
MX2021004051A (es) * 2018-11-02 2021-06-04 Mara Renewables Corp Aceite de algas con valor nutricional mejorado.
CN112391292A (zh) * 2020-11-23 2021-02-23 江南大学 一种中链脂肪酸碳链延长功能微生物及其富集方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005021735A1 (en) 2003-09-01 2005-03-10 Novozymes A/S Method for increasing yield of biomass of and/or components of biomass from marine microorganisms
WO2005045050A1 (de) 2003-11-10 2005-05-19 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Prozess zur kultivierung von mikroorganismen der gattung thraustochytrieales
US20120244584A1 (en) * 2011-03-07 2012-09-27 Ocean Nutrition Canada Limited Engineering microorganisms

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340594A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Food product having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
DE60130737T3 (de) 2000-01-28 2016-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Verstärkte Produktion von Lipiden enthaltend mehrfachungesättigte Fettsäuren durch hochdichte Kulturen von eukariotischen Mikroben in Gärvorrichtungen
EP1359224A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-05 Ato B.V. A process for production of polyunsaturated fatty acids by marine microorganisms
CA2801065C (en) 2003-10-02 2020-04-28 Dsm Ip Assets B.V. Production of high levels of dha in microalgae using modified amounts of chloride and potassium
DE10352838A1 (de) 2003-11-10 2005-07-07 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Thraustochytriales unter Verwendung eines optimierten Niedrigsalzmediums
CN101389749A (zh) * 2005-06-07 2009-03-18 加拿大海洋营养食品有限公司 生产脂质和抗氧化剂的真核微生物
ES2576986T3 (es) 2005-06-07 2016-07-12 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes
EP2194138A1 (en) * 2008-12-08 2010-06-09 Marenutrica GmbH Compositions containing docosahexaenoic acid and method for its production
US20120202242A1 (en) 2011-02-09 2012-08-09 Hazlebeck David A System and Method for Non-Sterile Heterotrophic Algae Growth
CN105189740B (zh) * 2013-03-13 2019-01-15 帝斯曼营养品股份公司 工程化微生物
CA3159974A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 MARA Renewables Corporation Methods of oil production in microorganisms

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005021735A1 (en) 2003-09-01 2005-03-10 Novozymes A/S Method for increasing yield of biomass of and/or components of biomass from marine microorganisms
WO2005045050A1 (de) 2003-11-10 2005-05-19 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Prozess zur kultivierung von mikroorganismen der gattung thraustochytrieales
US20120244584A1 (en) * 2011-03-07 2012-09-27 Ocean Nutrition Canada Limited Engineering microorganisms

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 72, pp. 1161-1169 (2006.04.20.)
Bioprocess Biosyst. Eng., Vol. 36, pp. 1905-1912 (2013.05.15.)

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Publication number Publication date
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ES2774452T3 (es) 2020-07-21
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US11466297B2 (en) 2022-10-11
CA2953060A1 (en) 2015-11-26
US20150337345A1 (en) 2015-11-26
CN106795539B (zh) 2021-06-22
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IL249638A0 (en) 2017-03-30
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CA3159974A1 (en) 2015-11-26
CN106795539A (zh) 2017-05-31
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WO2015177641A3 (en) 2016-01-21
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EP3146060A2 (en) 2017-03-29
AU2015263044A1 (en) 2017-01-12

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