JP2014507952A - スラウストキトリド微生物の操作 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2011年3月7日出願の米国仮特許出願第61/449,848号の利益、およびそれに対する優先権を主張するものであり、その全内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書は、出願時に国際出願において開示された配列表(2012年3月7日作成の表題「Sequence_Listing.txt」、108キロバイト)について言及する。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
改善されたPUFA供給源および他の有用な化合物の必要性が未だ存在する。
コンピテント:細胞に関して本明細書において使用される「コンピテント」という用語は、細胞外遺伝物質を取り込む細胞の能力を指す。細胞は、天然でコンピテントであり得、かつ/または人工的に(例えば、実験室内で)誘導されて、コンピテントになり得る。いくつかの実施形態において、コンピテント細胞は、細胞外遺伝物質が特定の方法、例えば、形質転換の特定の方法によって導入されるときに、細胞外遺伝物質を取り込むことができる。例えば、細胞は、形質転換の1つの方法に対してコンピテントであるが、別の方法に対してはコンピテントでない場合がある。あるいは、またはさらに、細胞は、2つ以上の形質転換方法に対してコンピテントであり得る。コンピテント細胞を、様々な供給源のうちのいずれかから得ることができる。例えば、それらを、自然界から単離し、実験室で調製し、かつ/または商業的に購入することができる。いくつかの実施形態において、細胞のコンピテンスは、一時的である。いくつかの実施形態において、細胞のコンピテンスは、永久的である。
本明細書に記載されるように、本発明は、PUFAの産生および/またはスラウストキトリドの修飾に関連する様々な試薬および方法を提供する。概して、本発明は、スラウストキトリド宿主細胞の修飾、具体的には、特に目的とする化合物(例えば、PUFA)の産生を増加させるためのスラウストキトリドの操作に関する。本発明は、ある特定のスラウストキトリウム種遺伝子調節要素の識別、ならびにスラウストキトリドまたはスラウストキトリウムの変異誘発についての方法論の開発を包含する。ある特定の実施形態において、本発明は、操作されたスラウストキトリウム種株、およびそれらから産生され、かつそれらとともに産生される生成物をさらに提供する。本発明のこれらおよび他の態様の特定の実施形態のある特定の詳細は、以下でより詳細に論じられる。
宿主細胞
微生物の操作
遺伝子発現
変異誘発
選択
形質転換
操作された株
発酵および産生
生成物
実施例
本実施例は、ONC−T18由来のある特定の例示の遺伝子発現プロモーターおよびターミネーター核酸配列の識別ならびに単離を説明する。
オリゴヌクレオチドプライマー52番(配列番号1)および53番(配列番号2)を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージKodon(Applied Maths)を用いたスラウストキトリウム種ONC−T18ゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Invitrogen(California,USA)によって合成され、そこから購入したものであった。
オリゴヌクレオチドプライマー54番(配列番号7)および55番(配列番号8)を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージKodon(Applied Maths)を用いてスラウストキトリウム種ONC−T18ゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Invitrogen(California,USA)によって合成され、そこから購入したものであった。
オリゴヌクレオチドプライマー58番(配列番号11)および59番(配列番号12)を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージKodon(Applied Maths)を用いたONC−T18のゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Invitrogen社(California,USA)によって合成され、そこから購入したものであった。
オリゴヌクレオチドプライマー60番(配列番号15)および61番(配列番号16)を、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージKodon(Applied Maths)を用いたONC−T18のゲノム配列データに基づいて設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Invitrogen(California,USA)によって合成され、そこから購入したものであった。
本実施例は、スラウストキトリド特異的遺伝子発現ベクターの構築を説明する。
本実施例は、抗生物質であって、その耐性をONC−T18の遺伝子操作のための選択可能なマーカーとして使用することができる抗生物質を識別する実験を説明する。
当技術分野において既知のように、ゼオシンは、高塩濃度では不安定である(Invitrogen,CA,USA)。ONC−T18の本来の生息環境のため、ONC−T18が比較的高い塩分の条件下で成長することを好むことも示されている(国際特許出願PCT/IB2006/003977号)。本実施例は、ゼオシン耐性遺伝子を選択可能なマーカーとして用いた、ONC−T18形質転換細胞の効率的な選択に最適なゼオシン濃度および塩分の決定を説明する。
形質転換の効率性を、様々な圧力条件で試験した。本実施例において、約1100psiの圧力条件が、試験した他の圧力条件よりも高い形質転換の効率性をもたらしたことが見出された。
この実施例は、ONC−T18の微粒子銃形質転換方法を説明する。
この実施例は、形質転換したONC−T18における導入遺伝子の存在の確認を説明する。PCRアッセイを用いて、ONC−T18を形質転換するために使用されたプラスミド構築物のそれぞれに存在するble導入遺伝子の存在を評価した。
この実施例は、形質転換した単一細胞由来の株の成長速度の決定を説明する。ゼオシンONC−T18−GM0寒天プレート上に3回移されたゼオシン耐性株の接種材料を、10μLのピペット先端を用いてそれぞれのコロニーから採取し、200μLPCR管内の50μLの滅菌水中に再懸濁した。その細胞懸濁液の1μLを、18g/Lまたは35g/Lのいずれかの海塩を含有するONC−T18−GM0寒天プレート(15g/Lの寒天)上にスポットした。スポットされたコロニーの直径を、接種後1日目、3日目、5日目、7日目、および8日目に測定した。
この実施例は、単一細胞由来の形質転換株のゼオシン感受性のアッセイを説明する。
本実施例は、形質転換細胞のバイオマス生産性と野生型株スラウストキトリウム種のバイオマス生産性との比較を説明し、とりわけ、ある特定の形質転換株が、上昇した(例えば、野生型と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、またはそれ以上上昇した)バイオマスレベルをもたらすことを実証する。
本実施例は、様々な形質転換株のDHA生産性を説明し、野生型と比較して上昇したレベルを実証する。本実施例は、とりわけ、野生型よりも少なくとも1%〜36%高い(例えば、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%等)レベルが達成されたことを実証する。これらの所見に基づいて、当業者であれば、さらなる上昇が達成可能であることを認識する(例えば、野生型よりも1%〜1000%高い、例えば、野生型よりも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、310%、320%、330%、340%、350%、360%、370%、380%、390%、400%、410%、420%、430%、440%、450%、460%、470%、480%、490%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950、1000%、またはそれ以上高い範囲まで)。本実施例は、約1:4〜約1:2のDHA:バイオマス比、野生型株で典型的に観察されるDHA:バイオマス比よりも少なくとも約40%高いDHA:バイオマス比の達成をさらに実証する(例えば、Raghukumar(2008)の表2を参照されたく、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。これらの所見に基づいて、当業者であれば、少なくとも約1:5の比率が達成可能であることを認識する。我々は、約1:8〜1:4のDHA:バイオマス比(DHA:バイオマス)を達成し、約1:3の比率を達成する見込みである。文献(Raghukumar,2008によって公開された総説等)内の実施例は、この比率を1:5未満には低下させていないという功績を示す。
高レベルのDHA産生形質転換株由来の総脂質に対するDHAの比率は、それらの親株の比率よりも高い(図17C)。DHA:総脂質の因子は、形質転換株の細胞から抽出されるDHAの下流処理に影響を与え得る。本発明の株および方法で達成されるDHA:総脂質比は、発酵条件によって異なり得る。例えば、フラスコ内で成長させた培養物の場合、総脂質の約15%〜約25%であるDHA割合(約0.15:1〜約0.25:1のDHA:総脂質比に相当する)が、典型的には、形質転換株で達成され得る。発酵器内で成長させた培養物の場合、総脂質の約30%〜約60%であるDHA割合(約0.3:1〜約0.6:1のDHA:総脂質に相当する)が、典型的には、形質転換株で達成され得る。野生型株で得ることができるDHA収量よりもはるかに多いDHA収量が、本明細書に開示の形質転換株から得られる。例えば、形質転換株からのDHA収量が、典型的には、約10〜約40g/L(培地1リットル当たりのグラム単位のDHA)である一方で、野生型株からのDHA収量は、典型的には、約0.5〜約1.6g/Lである(例えば、Raghukumar(2008)の表2を参照のこと)。高レベルのDHA産生形質転換株のDHA:バイオマスの比率も、それらの親株の比率よりも高い。このより高い比率のDHA:バイオマスは、形質転換株の細胞バイオマスからのDHAの下流抽出に役立つ(図17D)。
本明細書において十分に説明および実証されるように、ONC−T18は、薬剤生体分子産生物および薬剤によって栄養価を高めた生体分子産生物のPUFAならびにその誘導体だけでなく、バイオ燃料産生にも効率的なバイオファクトリーとしての使用に有望である。本発明に従ってバイオ燃料産生に用いるONC−T18の能力を評価および特性化するために、ONC−T18の形質転換株の総脂質生産性および脂肪酸プロフィールを、専門的な製品適用のために脂肪酸プロフィールを変化させる方法に使用できる可能性について分析した。
本実施例は、本明細書に記載の形質転換したスラウストキトリウム種株における導入遺伝子の安定性を確認する。
この実施例は、とりわけ、有効な変異誘発剤の発見を説明する。この作用物質は、スラウストキトリドにおける変異誘発に特に有用である。
この実施例は、スラウストキトリド株において高いバイオマス、総脂質、およびPUFA産生を得るための2段階発酵方法を説明する。
この実施例は、スラウストキトリドの株改良のための変異誘発剤、ゼオシンの適用を説明する。
この実施例は、脂質およびDHAの高レベルの生産性を有するスラウストキトリウム種の新規の株の発見を説明する。
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等価物
Claims (50)
- スラウストキトリウム遺伝子プロモーターを含む、単離された核酸分子。
- 前記プロモーターは、チューブリンプロモーターである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号6と少なくとも80%同一である、請求項2に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号10と少なくとも80%同一である、請求項2に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターは、△5エロンガーゼプロモーターである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号19と少なくとも80%同一である、請求項5に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターは、△4デサチュラーゼプロモーターである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号24と少なくとも80%同一である、請求項7に記載の核酸分子。
- スラウストキトリウム遺伝子ターミネーターを含む、単離された核酸分子。
- 前記ターミネーターは、チューブリンターミネーターである、請求項9に記載の核酸分子。
- 前記ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号14と少なくとも80%同一である、請求項9に記載の核酸分子。
- 前記ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号16と少なくとも80%同一である、請求項9に記載の核酸分子。
- スラウストキトリウム遺伝子プロモーターおよびスラウストキトリウム遺伝子ターミネーターに動作可能に結合される異種配列を含む、単離された核酸分子。
- 前記異種配列は、ポリペプチドをコードする、請求項13に記載の単離された核酸分子。
- ゼオシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項13に記載の単離された核酸分子。
- 請求項13〜15のいずれかの核酸分子を含む、宿主細胞。
- 以下を含む微生物の細胞を変異誘発する方法:
前記微生物の細胞を、前記細胞の60〜80%を死滅させる濃度のゼオシンを含む培地上で培養することと、
培養に耐え抜く細胞の亜集団を単離し、それによって、微生物の細胞を変異誘発すること。 - スラウストキトリウムのPUFA生合成経路に関与する酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体の一部をコードする1つ以上の遺伝子に対して1つ以上の修飾を含有する、スラウストキトリウム細胞。
- 前記1つ以上の修飾は、参照スラウストキトリウム細胞と比較して前記修飾された細胞による1つ以上のPUFAの産生を、前記修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、増加させる、請求項18に記載の細胞。
- 前記酵素ポリペプチドまたは酵素ポリペプチド複合体は、脂肪酸シンターゼ(FAS)、△5エロンガーゼ、△12エロンガーゼ、△4デサチュラーゼ、およびポリケチドPUFAシンターゼ(PKS)からなる群から選択される、請求項19に記載の細胞。
- 前記1つ以上のPUFAは、アラキドン酸(ARA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、γ−リノレン酸(GLA)、リノール酸(LA)、およびリノレン酸からなる群から選択される、請求項19に記載の細胞。
- 前記酵素または酵素複合体は、ポリケチドPUFAシンターゼ(PKS)、△9デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびω−3デサチュラーゼからなる群から選択される、請求項18に記載の細胞。
- 以下のステップを含むスラウストキトリウム細胞を形質転換するための方法:
(a)コンピテントスラウストキトリウム細胞を提供するステップと、
(b)選択可能なマーカーを含む組換え核酸を、前記コンピテントスラウストキトリウム細胞内に送達するステップと、
(c)前記コンピテントスラウストキトリウム細胞を、前記選択可能なマーカーを用いることなく、細胞の増殖を減少させる選択剤を含有する培養培地中で培養するステップ。 - 選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である、請求項23に記載の方法。
- 選択剤は、抗生物質である、請求項24に記載の方法。
- 抗生物質は、ゼオシンである、請求項25に記載の方法。
- 前記ゼオシンは、50μg/mLを超える濃度で存在する、請求項26に記載の方法。
- 前記ゼオシンは、約100ug/mLの濃度で存在する、請求項27に記載の方法。
- 前記組換え核酸は、前記選択可能なマーカーとは異なる遺伝子発現カセットをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- (d)前記選択可能なマーカーを含有するコンピテントスラウストキトリウム細胞を単離するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記送達するステップは、前記組換え核酸でコーティングされた粒子の微粒子銃送達を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記粒子は、金粒子を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記培養培地は、約10g/L〜約40g/Lの塩(例えば、約15g/L〜約35g/Lの塩、または約18g/L〜約35g/Lの塩)を含有する、請求項23に記載の方法。
- 遺伝子形質転換にコンピテントなスラウストキトリウム細胞。
- 組換え核酸で形質転換されるスラウストキトリウム細胞。
- 以下を含むスラウストキトリウム細胞を培養する方法:
バイオマスが増加する第1の組の条件下で、スラウストキトリウム細胞を含む培養物を成長させることと、
前記第1の組の培養条件を、脂質生産性が増加する第2の組の条件に移行することと、を含み、前記移行することは、
(a)酸素濃度を第1の酸素濃度から第2の酸素濃度まで低減させることと、
(b)C:N比を第1のC:N比から第2のC:N比まで増加させることと、
(c)温度を第1の温度から第2の温度まで低減させることと、それらの組み合わせと、のうちの1つ以上を含む。 - 以下を含むPUFAを提供する方法:
参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞であって、前記修飾された細胞および参照細胞が同等の条件下で培養されるときに、前記修飾された細胞が、前記参照細胞と比較して前記修飾された細胞による1つ以上のPUFAの産生を増加させる1つ以上の遺伝子修飾を含有するという点において、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞を提供することと、
前記1つ以上のPUFAの産生を達成するのに十分な条件下で、それを達成するのに十分な時間、前記修飾されたスラウストキトリウム細胞を培養すること。 - 前記提供するステップは、少なくとも1つの操作されたスラウストキトリウムプロモーターを含有するスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記提供するステップは、少なくとも1つの操作されたスラウストキトリウムターミネーターを含有するスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項37または請求項38に記載の方法。
- 前記提供するステップは、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞であって、前記修飾されたスラウストキトリウム細胞が少なくとも1つの発現異種ポリペプチドを含有するという点において、参照スラウストキトリウム細胞と比較して修飾されるスラウストキトリウム細胞を提供することを含む、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種タンパク質は、操作されたスラウストキトリウム遺伝子プロモーター、操作されたスラウストキトリウムターミネーター、またはそれらの両方に動作可能に結合される遺伝子から発現される、請求項40に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ポリペプチドは、少なくとも1つの異種PUFA生合成ポリペプチドを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記遺伝子修飾は、PUFA生合成ポリペプチドの発現または活性を増加させる少なくとも1つのヌクレオチド変異を含む、請求項37に記載の方法。
- 発現または活性が増加する前記PUFA生合成ポリペプチドは、内在性PUFA生合成ポリペプチドである、請求項43に記載の方法。
- 発現または活性が増加する前記PUFA生合成ポリペプチドは、異種PUFA生合成ポリペプチドである、請求項43に記載の方法。
- 異種PUFA生合成ポリペプチドを発現する操作されたスラウストキトリウム細胞。
- 操作された細胞および操作されていない細胞が同等の条件下で培養されるときに、前記操作されていないスラウストキトリウム細胞よりも少なくとも36%高いレベルで少なくとも1つのPUFAを産生する、前記操作されたスラウストキトリウム細胞。
- 以下を含む組成物:
少なくとも1つのPUFAと、
抗生物質耐性遺伝子を含有するか、または抗生物質耐性遺伝子を含有するスラウストキトリウム細胞の子孫であるスラウストキトリウム細胞の1つ以上の構成成分。 - 前記抗生物質耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子である、請求項48に記載の組成物。
- 以下を含む組成物:
少なくとも1つのPUFAと、
以下のうちの1つ以上の構成成分:
(a)スラウストキトリウム細胞であって、ゼオシンが前記細胞の60〜80%を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリウム細胞、または
(b)スラウストキトリウム細胞の子孫であって、ゼオシンが前記細胞の60〜80%を死滅させる濃度でゼオシンを含む培地中もしくは上で培養されたスラウストキトリウム細胞の子孫。
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