CN102199482A

CN102199482A - 一种从产油微生物中提取油脂的方法

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Publication number: CN102199482A
Application number: CN 201110095230
Authority: CN
Inventors: 张栩; 刘颖; 谭天伟
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: CN102199482B

Abstract

本发明涉及微生物工程领域，公开了一种从产油微生物中提取油脂的方法。本发明所述方法用纤维素酶与蛋白酶组成混合酶并对产油微生物湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.25-4，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶。此外，本发明还用蛋白酶对粘红酵母湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，所述蛋白酶与产油微生物菌体的质量比为0.01-0.15∶1-10。本发明所述方法直接采用湿菌体提取，降低了能耗，反应条件温和，具有高专一性，能够以较少量的酶获得较高的油脂得率，提取效率较高，利于工业生产。

Description

一种从产油微生物中提取油脂的方法

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体的说是涉及一种从产油微生物中提取油脂的方法。

背景技术

微生物油脂又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源，再辅以无机盐生产的油脂以及有商业价值的脂质。在适宜条件下，某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的20％以上，具有这样表型的菌株称为产油微生物。

目前研究较多的产油微生物是酵母、藻类和霉菌，产油酵母的细胞含有大量的甘三酯，其脂肪酸组成与植物来源的食用油脂相似；产油藻类含油量高，可生产r-亚麻酸、二十五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DNA)等高营养油脂；霉菌以葡萄糖为碳源，在细胞内合成大量以甘三酯为主的脂质，利用霉菌能生产一些特别的油脂，如富含棕桐酸、油酸及亚油酸的油脂和类可可脂等。

产油微生物生产的油脂不仅可以代替动、植物油脂作为食用油脂，特别是作为保健类功能性油脂，还可以作为生产生物柴油的油源。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般动、植物油相近，都是以C16和C18系脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主，因此微生物油脂可替代植物油脂生产生物柴油，缓解能源危机。

此外，与动、植物油脂的生产相比，微生物油脂的生产还有许多优点：(1)微生物细胞增殖快，油脂含量高，生产周期短；(2)微生物生长所需原料丰富；(3)所需劳动力少，不占用耕地，不受季节、气候变化的限制；(4)能够利用细胞融合、细胞诱变等技术，使微生物生产出比动、植物油脂更符合人体需要的高营养油脂或某些由特定脂肪酸组成的油脂，例如EPA、DHA、类可可脂。

现阶段微生物油脂的生产工艺一般分为：菌体培养(制备菌体发酵液)-油脂提取-精制三个步骤。虽然菌体培养步骤对微生物储存油脂有着重要的影响，但是油脂的提取也是整个油脂生产工艺中关键的工序，此步工艺决定着油脂得率的高低。

由于微生物油脂大都存在于微生物细胞内，只有采用适当的方法对微生物细胞进行初步破碎，才有利于油脂的提取。目前，常用的提取方法包括压榨法、超临界提取法和有机溶剂萃取法。

压榨法损失较大，提取率不高，提取前要对得到的菌体烘干方可破碎，能耗太大，也有专利如CN101323865A，无需干燥，直接将菌体发酵液浓缩，然后利用高压均质机破碎细胞，不过高压均质机一般不能一次性完全破碎细胞，而多次破碎势必造成能耗较高，同时高压均质机破碎后温度可能会升高，容易氧化微生物油脂，稳定性不高；超临界提取法设备投资大，成本高，不利于微生物提取的扩大化生产。

常规的有机溶剂萃取法有冻融法、超声波法、酸热法和酶水解法。冻融法是通过温度的突然变化，细胞在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎，以达到使细胞破碎的目的，但是在反复冻融过程中，由于耗时较长，部分微生物细胞产生了自溶使油脂含量减少，油脂得率较差；酸热法主要是利用盐酸对细胞中的糖和蛋白质等成分的作用，疏松细胞的结构，再经沸水、冷冻处理，使细胞达到破碎的效果，破碎细胞油脂得率较高，不过会产生大量酸性废水，污染较为严重；超声波法破碎细胞是利用超声波产生的独特的机械振动作用，是细胞结构发生变化，促使细胞破碎，其油脂得率略低于酸热法，且在较长时间超声波作用下产生热量，使部分油脂进行了分解反应，不利于油脂的提取，此外超声波法处理量小，不能进行扩大再生产；相对于上述方法，酶水解法具有多方面优势，现有酶水解法一般采用纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶等进行水解，由于细胞破碎是通过酶的水解作用进行，所以破碎条件温和、能耗低、处理量大，但是酶水解法的提取效率不高，这使得酶水解法的应用受到一定影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从产油微生物中提取油脂的方法，使得该方法能够采用酶水解法高效率的提取油脂。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明所述一种从产油微生物中提取油脂的方法，用纤维素酶与蛋白酶组成混合酶并对产油微生物湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.25-4，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，所述纤维素酶酶活为800-1200U/g，所述中性蛋白酶酶活为58000-62000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为1.98×10⁵-2.02×10⁵U/g。

纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，一般分为三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构；Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶；β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。

中性蛋白酶，又名沙雷肽酶，是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、pH值下能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物，可广泛应用于动植物、微生物蛋白的水解。

碱性蛋白酶属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，由经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。

本发明进行了大量试验摸索，在确保能够得到较高的油脂得率的情况下，调节混合酶中各成分比例，以较少量的酶最大限度的水解产油微生物细胞壁。适当比例的混合酶能够起到相互促进和互补的作用，使各种酶的活性得到最大化的发挥，从而起到较好的破碎效果，获得较高的油脂得率。此外，由于酶的使用量较少，故能保证较低的成本，利于扩大生产。其中，所述纤维素酶与蛋白酶的质量比优选为1∶0.75；所述混合酶与产油微生物湿菌体的质量比为0.01-0.15∶1-10，优选为0.1∶6。所述纤维素酶酶活优选为1000U/g，所述中性蛋白酶酶活优选为60000U/g，所述碱性蛋白酶酶活优选为2×10⁵U/g。

本发明所述产油微生物优选为小球藻、螺旋藻、栅藻或者粘红酵母，由于藻类微生物的细胞壁成分主要是纤维素，因此产油微生物更优选为藻类微生物。本发明所述纤维素酶与蛋白酶复配，以适当的比例组成具有水解肽聚糖、蛋白等物质能力的复合酶，因此能以较少酶量水解藻类微生物细胞壁中的纤维素及其次要组分，使细胞壁通透性大幅增加，油脂能够顺利溶出。其中，所述蛋白酶优选为中性蛋白酶。

此外，本发明还提供了一种从产油微生物中提取油脂的方法，用蛋白酶对粘红酵母湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，所述蛋白酶与粘红酵母湿菌体的质量比为0.01-0.15∶1-10，所述中性蛋白酶酶活为58000-62000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为1.98×10⁵-2.02×10⁵U/g。

其中，所述蛋白酶与粘红酵母湿菌体的质量比优选为0.1∶6，所述中性蛋白酶酶活优选为60000U/g，所述碱性蛋白酶酶活优选为2×10⁵U/g。

粘红酵母的细胞壁成分主要是蛋白质和多糖，中性蛋白酶和碱性蛋白酶具有较强的水解蛋白的能力，能够使粘红酵母细胞壁保持较高通透性，以利于油脂的溶出，保持一个较高的油脂得率。同时，在水解粘红酵母细胞壁并提取油脂时，本发明还加入表面活性剂。

在酶催化的反应体系中，表面活性剂可以促进酶催化反应体系微环境的稳定，同时表面活性剂对蛋白表面构象有一定的影响，有利于酶蛋白的活性基团嵌入反应位点，提高酶催化效率。蛋白酶水解酵母类微生物细胞后，膜蛋白及细胞壁蛋白遭到不同程度的水解，细胞结构疏松多孔，部分蛋白酶在表面活性剂的协同下，进入细胞内，水解部分胞内蛋白，包括部分与油脂结合的蛋白质，有利于油脂的溶出。本发明所述表面活性剂优选为吐温20。

本发明所述产油微生物湿菌体由菌体发酵液离心获得，藻类微生物菌体发酵液的制备方法为取种子液对数期进行接种，接种量为20％，初始pH值为7.5，温度27℃，光照4000lx，通无菌空气培养8天则达到稳定期；粘红酵母菌体发酵液是在220rpm/min、30℃下培养种子液18h，然后转入液体培养基中培养5天获得。

当用纤维素酶和中性蛋白酶的混合酶水解时，水解温度为37-42℃，水解时间为4-6h，缓冲液为pH值为4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

当用纤维素酶和碱性蛋白酶水解时，水解温度为37-42℃，水解时间为4-6h，缓冲液为pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

当用中性蛋白酶水解时，水解温度为37-42℃，水解时间为35-36h，缓冲液为pH值为7的磷酸缓冲液。

当用碱性蛋白酶水解时，水解温度为37-42℃，水解时间为24-28h，缓冲液为pH值为8的磷酸缓冲溶液。

本发明在浸提时优选采用六号溶剂萃取，六号溶剂是各种低级烷烃的混合物，具有工业己烷类似的性质，主要用于油脂的萃取溶剂。六号有机溶剂浸提次数一般为三次，第一次4ml溶剂浸提1.5h，第二次3ml溶剂浸提0.5h，第三次2ml溶剂浸提0.5h。浸提后离心得到油相层，利用旋转蒸发仪脱溶得到油脂。运用本发明所述方法提取微生物油脂，油脂得率在60％左右，具有较高水平。

本发明的对比试验结果显示，在相同试验条件下，采用本发明所述比例提取油脂的得率较高，并且耗费酶量较少。

由以上技术方案可知，本发明所述方法直接采用湿菌体提取，降低了能耗，反应条件温和，具有高专一性，能够以较少量的酶获得较高的油脂得率，提取效率较高，利于工业生产。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种从产油微生物中提取油脂的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种产油微生物中提取油脂的方法进行详细说明。

实施例1：从小球藻中提取油脂

将小球藻发酵液以7000rpm/min离心10min，去除上清获得小球藻湿菌体，称取小球藻湿菌体0.6g于100ml三角烧瓶中。称取0.057g纤维素酶，0.043g中性蛋白酶，纤维素酶酶活为1000U/g，中性蛋白酶酶活为60000U/g，加入pH＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成0.1％的酶液，取10ml酶液加入到小球藻湿菌体中，水解温度为40℃，搅拌4h。将水解后的悬浊液进行4800r/min下离心10min，去上清，然后向所得沉淀加入6号有机溶剂进行反复三次浸提得到油脂，油脂得率为60.12％。

实施例2：从螺旋藻中提取油脂

将螺旋藻发酵液以7000rpm/min离心10min，去除上清获得螺旋藻湿菌体，称取螺旋藻湿菌体1.0g于100ml三角烧瓶中。称取0.05g纤维素酶，0.05g碱性蛋白酶，纤维素酶酶活为1200U/g，碱性蛋白酶酶活为2.02×10⁵U/g，加入pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至100ml，配制成0.1％的酶液，取15ml酶液加入到螺旋藻湿菌体中，水解温度为40℃，搅拌5h。将水解后的悬浊液进行4800r/min下离心10min，去上清，然后向所得沉淀加入6号有机溶剂进行反复三次浸提得到油脂，油脂得率为61.3％。

实施例3：从粘红酵母中提取油脂

将粘红酵母发酵液以7000rpm/min离心10min，去除上清获得粘红酵母湿菌体，称取粘红酵母湿菌体0.6g于100ml三角烧瓶中。称取0.1g中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为60000U/g，加入pH＝7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至100ml，配制成0.1％的酶液，取10ml酶液、适量吐温20加入到粘红酵母湿菌体中，水解温度为42℃，60rpm/min水解36h。将水解后的悬浊液进行4800r/min下离心10min，去上清，然后向所得沉淀加入6号有机溶剂进行反复三次浸提得到油脂，油脂得率为60.3％。

实施例4：从粘红酵母中提取油脂

将粘红酵母发酵液以7000rpm/min离心10min，去除上清获得粘红酵母湿菌体，称取粘红酵母湿菌体0.6g于100ml三角烧瓶中。称取0.1g碱性蛋白酶，碱性蛋白酶酶活为2×10⁵U/g，加入pH＝8的磷酸缓冲溶液定容至100ml，配制成0.1％的酶液，取10ml酶液、适量吐温20加入到粘红酵母湿菌体中，水解温度为42℃，60rpm/min水解42h。将水解后的悬浊液进行4800r/min下离心10min，去上清，然后向所得沉淀加入6号有机溶剂进行反复三次浸提得到油脂，油脂得率为59.2％。

实施例5：本发明利用小球藻提取油脂的对比试验

采用相同的试验条件，对比采用本发明所述的纤维素酶、蛋白酶的质量比以及其他比例的油脂得率，具体结果参见表1。同时，采用相同的试验条件，对比采用本发明所述的混合酶、小球藻湿菌体的质量比以及其他比例的油脂得率，具体结果参见表2。

表1采用不同纤维素酶和蛋白酶比例提取的油脂得率

表2采用不同混合酶和湿菌体比例提取的油脂得率

注：表中比例均为质量比，纤维素酶酶活为1000U/g，中性蛋白酶酶活为60000U/g，碱性蛋白酶酶活为2×10⁵U/g。

表1结果显示，在混合酶与湿菌体质量比以及其他试验条件相同的前提下，用本发明所述纤维素酶和蛋白酶比例(1∶0.5、1∶0.75、1∶2、1∶3、1∶4)提取油脂的得率较高，1∶5、1∶6两个比例的油脂得率与本发明所述比例的油脂得率无明显差异，但是在消耗的酶量上大于本发明所消耗的酶量，表明本发明所述方法提取效率较高。

表2结果显示，在纤维素酶和蛋白酶比例以及其他试验条件相同的前提下，用本发明所述混合酶与湿菌体质量比(0.01∶8、0.01∶5、0.01∶3、0.01∶1.5、0.1∶6)提取油脂的得率较高，1∶5、1∶3两个比例的油脂得率与本发明所述比例的油脂得率无明显差异，但是转换成相同质量的湿菌体后，这两个比例所消耗的酶量大于本发明所消耗的酶量，表明本发明所述方法提取效率较高。

实施例6：本发明利用粘红红酵母提取油脂的对比试验

采用相同的试验条件，对比采用本发明所述的蛋白酶、粘红酵母湿菌体的质量比以及其他比例的油脂得率，具体结果参见表3。

表3采用不同混合酶和湿菌体比例提取的油脂得率

中性蛋白酶∶湿菌体	油脂得率	碱性蛋白酶∶湿菌体	油脂得率
				0.01∶15	43.67％	0.01∶15	45.78％
0.01∶12	50.41％	0.01∶12	52.54％
				0.01∶8	58.57％	0.01∶8	57.92％
0.01∶5	59.31％	0.01∶5	59.35％
				0.01∶3	60.08％	0.01∶3	60.11％
0.01∶1.5	60.26％	0.01∶1.5	59.46％
				0.1∶6	60.37％	0.1∶6	61.03％
1∶5	61.56％	1∶5	61.05％
				1∶3	60.47％	1∶3	60.38％

注：表中比例均为质量比，中性蛋白酶酶活为60000U/g，碱性蛋白酶酶活为2×10⁵U/g。

表3结果显示，在试验条件相同的前提下，用本发明所述蛋白酶与湿菌体质量比(0.01∶8、0.01∶5、0.01∶3、0.01∶1.5、0.1∶6)提取油脂的得率较高，1∶5、1∶3两个比例的油脂得率与本发明所述比例的油脂得率无明显差异，但是转换成相同质量的湿菌体后，这两个比例所消耗的酶量大于本发明所消耗的酶量，表明本发明所述方法提取效率较高。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种从产油微生物中提取油脂的方法，其特征在于，用纤维素酶与蛋白酶组成混合酶并对产油微生物湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.25-4，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，所述纤维素酶酶活为800-1200U/g，所述中性蛋白酶酶活为58000-62000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为1.98×10⁵-2.02×10⁵U/g。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.75。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述混合酶与产油微生物湿菌体的质量比为0.01-0.15∶1-10。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纤维素酶酶活为1000U/g。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述中性蛋白酶酶活为60000U/g。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶酶活为2×105U/g。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述产油微生物为小球藻、螺旋藻、栅藻或粘红酵母。

8.一种从产油微生物中提取油脂的方法，其特征在于，用蛋白酶对粘红酵母湿菌体水解，然后离心，所得沉淀浸提、脱溶得到油脂，所述蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，所述蛋白酶与粘红酵母湿菌体的质量比为0.01-0.15∶1-10，所述中性蛋白酶酶活为58000-62000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为1.98×10⁵-2.02×10⁵U/g。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述中性蛋白酶酶活为60000U/g。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶酶活为2×10⁵U/g。