CN105219515B - 一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将含油微藻的悬浮液调节pH值为7.5‑14，进行水热处理；(2)水热处理后，在酶存在下进行酶解反应；(3)调节pH值至碱性进行反应，再调节pH值至酸性进行反应；(4)加入有机溶剂进行萃取并分离出油脂。本发明方法的油脂提取率高、操作条件温和、能有效保持微藻的营养组分、有机溶剂用量少、环保、能耗低，且能适用于微拟球藻、小球藻、硅藻、栅藻和单针藻等多种微藻，适用范围广。

Description

一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法

技术领域

本发明涉及微藻生物工程技术领域，具体地，涉及一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

背景技术

微藻是指在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻类群体，是生物圈中最重要的初级生产力。藻类具有生物量大，生产周期短，种类繁多，含油量高，环境适应能力强等优点，是生物柴油的良好原料。此外微藻内还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的来源。

但微藻油脂都包裹在细胞内，此外微藻的生物活性物质如蛋白质，类胡萝卜素，微藻多糖等大多数都存在于生物细胞内。由于微藻细胞较小、且具细胞壁结构，大多数种类的微藻细胞具有纤维素性细胞壁，某些种类的微藻细胞壁还有大量难以消化分解的其它成分，细胞壁厚，质地坚硬，不利于油脂的提取，也大大降低了微藻产品的生物利用率。因此微藻的破壁和油脂的提取是利用微藻内的油脂和其它有用组分的关键。

含油微藻的油脂的提取一直是生物柴油炼制的关键技术。目前通常采用水热法。水热法通常是在碱性条件下通过高温高压进行细胞破壁、油脂溶出，一般温度为100-300℃，能耗高，所得含油微藻溶浆通过离心进行油水分离，如CN100460513C，但由于得到的产油微生物溶浆为含有微生物渣的乳状液，油相和水相混合均匀，难以分离，通过离心进行油水分离能耗较高、油脂提取率较低。

目前，破碎细胞壁的方法有研磨法、反复冻融法以及超声波处理法等。其中研磨法操作繁琐，且易间接破坏细胞内的原液成分，细胞破碎程度较低，不能实现规模化。反复冻融法存在不能实现规模化，运行成本高，能耗高等问题。超声波处理法会破坏细胞内的其它活性组分，运行成本偏高。

此外，微藻油脂的提取是微藻能源的关键技术。常见的微藻油脂提取方法有超临界二氧化碳萃取法，索氏抽提法，有机溶剂提取法等方法。超临界二氧化碳萃取法操作复杂，设备昂贵，反应条件苛刻，不易实现规模化。索氏抽提法和有机溶剂提取法存在有机溶剂使用量大，毒性大，污染大，提油率不高的缺点。

CN102517146B公开了一种表面活性剂辅助水相提取藻油的方法，在形成超低界面张力和临界微乳浓度的条件下，将超生破碎的裂壶藻细胞与含有新型双子表面活性剂C10H21-18PO-2EO-SO4Na的盐水溶液混合，在20-25℃的条件下，以一定转速反应一定的时间，反应结束后将得到的混合液进行离心分离，上层为游离脂质层，中层为表面活性剂层，下层为水层。该方法的缺点是利用超声破壁，破坏细胞内的其它活性组分，运行成本偏高，且该方法仅仅针对裂壶藻，不针对其他的藻类，适用范围窄。

因此，需要探索一种油脂提取率高、能有效保持微藻的营养组分、操作条件温和、有机溶剂用量少、环保、能耗低、适用范围广的含油微藻破壁及油脂提取的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有含油微藻破壁及油脂提取中油脂提取率低、易破坏细胞内原液成分、反应条件苛刻、有机溶剂用量大、环境污染严重、能耗高或适用范围窄等缺点，提供一种新的含油微藻的破壁及其油脂提取的方法。

本发明的发明人在研究中发现，将含油微藻在碱性条件及较低的温度条件下进行水热处理并结合酶解反应一起破壁，然后进行皂化反应生成表面活性剂，利用少量的有机溶剂即可实现微藻油脂的提取。该方法的油脂提取率高、操作条件温和、能有效保持微藻的营养组分、有机溶剂用量少、环保、能耗低，且能适用于微拟球藻、小球藻、硅藻、栅藻和单针藻等多种微藻，适用范围广。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将含油微藻的悬浮液调节pH值为7.5-14，进行水热处理；

(2)水热处理后，在酶存在下进行酶解反应；

(3)调节pH值至碱性进行反应，再调节pH值至酸性进行反应；

(4)加入有机溶剂进行萃取并分离出油脂。

优选地，水热处理的条件包括：温度为50-120℃，时间为0.5-10h。

优选地，步骤(3)中，调节pH值至碱性进行反应的条件包括：pH值为8-14，温度为30-100℃，时间为0.5-6h。

优选地，步骤(3)中，调节pH值至酸性进行反应的条件包括：pH值为3-6，温度为20-60℃，时间为10-60min。

优选地，以所述含油微藻的干重计，相对于1g所述含油微藻，所述有机溶剂的用量为1-30mL。

本发明的含油微藻的破壁及表面活性剂辅助提取油脂的方法，由于采用水热处理和酶解反应联合破壁，可以在较温和的条件下进行水热处理，避免了高温高压，有利于微藻中各营养元的生物性能的保持，降低了成本，提高了破壁效果；由于利用碱和微藻细胞中的油脂进行皂化反应生成了表面活性剂，有助于微藻油脂的析出，大大减少了有机溶剂的用量，进一步降低了成本，且减少了对环境的污染；本发明方法的油脂提取率可高达90％以上，油脂提取率高；本发明方法操作简单，且能适用于微拟球藻、小球藻、硅藻、栅藻和单针藻等多种微藻，适用范围广，易于实现规模化。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将含油微藻的悬浮液调节pH值为7.5-14，进行水热处理；

(2)水热处理后，在酶存在下进行酶解反应；

(3)调节pH值至碱性进行反应，再调节pH值至酸性进行反应；

(4)加入有机溶剂进行萃取并分离出油脂。

本发明中，含油微藻指的是从含油微藻培养液中收集获得的含油微藻的浆液或其经过干燥的藻粉。本发明方法可适用于各种含油微藻，即对含油微藻的种类没有特别的限制，优选为具有较大的产业利用价值的产油工程微藻，例如，含油微藻可以选自微拟球藻、小球藻、硅藻、单针藻和栅藻中的至少一种。

本发明步骤(1)中，对于含油微藻的悬浮液的浓度，以含油微藻的干重计，含油微藻在悬浮液中的含量优选为2-30重量％，更优选为15-30重量％。

本发明步骤(1)中，调节含油微藻的悬浮液至pH值为7.5-14，优选为8.5-12，对于pH值条件，可以加碱进行调节，对于碱无特殊要求，可以采用本领域常用的碱，例如，碱可以选自氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐中的一种或多种。

本发明中，pH值通过pH测定仪测得。

本发明中，水热条件指的是在一定温度下保持液态的条件。本发明方法由于采用水热处理和酶解反应联合进行破壁，因此，水热处理可以在较温和的条件下进行，本发明步骤(1)中，水热处理的条件优选包括：温度为50-120℃，更优选为60-100℃，时间为0.5-10h，更优选为2-6h。本领域技术人员应该理解的是，水热处理优选在搅拌下进行。

本发明方法水热处理的温度较常规的水热处理的温度100-300℃可极大地降低能耗，且有利于微藻中各营养元的生物性能的保持。

本发明步骤(2)中，进行酶解反应所使用的酶可以为本领域常规使用的各种酶，例如可以选自纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、溶菌酶和蜗牛酶中的至少一种，优选为纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和溶菌酶。这些酶均可以通过商购获得。

本发明步骤(2)中，对于酶的用量，以含油微藻的干重计，酶的用量优选为50-5000IU/g，更优选为200-1200IU/g。当酶为几种酶的组合时，对于各种酶的用量无特殊要求，只要总量优选上述范围即可。

本发明步骤(2)中，酶解反应的条件优选包括：温度为30-70℃，更优选为40-60℃；pH值为3-7，更优选为4-5.5；时间以能满足完全破碎微藻细胞的条件为止，为2-10h，更优选为4-6h。对于pH值条件，可以加酸进行调节，对于酸无特殊要求，可以采用本领域常用的酸，可以为无机酸，也可以为有机酸，例如，酸可以为醋酸、柠檬酸。

本发明步骤(3)中，调节pH值至碱性进行反应的条件优选包括：pH值为8-14，温度为30-100℃，时间为0.5-6h；更优选包括：pH值为10-14，温度为50-70℃，时间为1-3h。步骤(3)中，调节pH值至碱性所用的碱优选为氢氧化钠、氢氧化钾。本领域技术人员应该理解的是，搅拌更有利于皂化反应的进行，因此，优选地，调节pH值至碱性在搅拌下进行反应，对于搅拌的速度无特殊要求，例如可以为10-2000rpm。

本发明步骤(3)中，调节pH值至酸性进行反应的条件优选包括：pH值为3-6，温度为20-60℃，时间为10-60min；更优选包括：pH值为3-5，温度为25-40℃，时间为20-40min。步骤(3)中，调节pH值至酸性所用的酸优选为柠檬酸、醋酸。本领域技术人员应该理解的是，调节pH值至酸性进行反应是为了使生成的表面活性剂重新转化为微藻油脂，搅拌更有利于反应的进行，因此，优选地，调节pH值至酸性在搅拌下进行反应，对于搅拌的速度无特殊要求，例如可以为10-2000rpm。

进行皂化反应生成表面活性剂辅助提取油脂的原理是：油脂分子的酯基会通过氢键相互作用吸附在微藻破壁后的残余组织上(如多肽、糖脂等)，表面活性剂分子通过亲水头基与这些残余组织产生更强的静电相互作用，能够与油脂分子产生竞争性吸附，将油脂分子顶替下来；油脂分子因为其疏水性质，在水中有高的界面能而倾向于吸附在相对疏水的细胞组织上，表面活性剂分子能够在水溶液中形成聚集体而产生疏水微区，对油脂分子有强的增容、分散能力，降低油水界面张力，使油脂分子从细胞组织上转移进入水溶液中。

本发明中，有机溶剂可以为本领域常用的各种有机溶剂，优选为三氯甲烷、正己烷、石油醚。

本发明方法中，由于进行皂化反应生成了表面活性剂，油脂分子更容易被有机溶剂萃取，因此，大大降低了有机溶剂的用量，以含油微藻的干重计，相对于1g含油微藻，有机溶剂的用量优选为1-30mL，更优选为2-10mL。

而且，本发明的发明人在研究中发现，现有技术中提取微藻中的油脂，采用的是极性有机溶剂和非极性有机溶剂合用的方式，采用本发明方法，进行皂化反应生成表面活性剂，仅用非极性有机溶剂提取就可以达到比现有技术中极性有机溶剂和非极性有机溶剂合用提取更好的提取效果，因此，进一步说明本发明方法能够极大降低有机溶剂用量。

而且，本发明方法通过皂化反应生成表面活性剂，省去了购买表面活性剂的高昂费用，极大降低了提取油脂的成本。

本领域技术人员应该理解的是，为了使有机溶剂更好地萃取油脂分子，在加入有机溶剂进行萃取时，优选采用搅拌、振荡、超声波等方式使有机溶剂与藻液充分接触，接触的时间一般为25-35min。

本发明方法中，加入有机溶剂进行萃取后，油脂分子进入有机溶剂中，分离出含有油脂的有机溶剂，可以采用本领域常用的各种方法，例如离心、静置分层等，优选为离心。对于离心的具体条件无特殊要求，可以采用本领域的常规条件，例如，可以在4000-6000rpm下离心5-15min。

分离得到含有油脂的有机溶剂后，本领域技术人员应该理解的是，还需要将有机溶剂去除，以得到较纯净的微藻油脂。去除有机溶剂的方法可以为本领域技术人员所能想到的各种方法，例如自然挥发、蒸馏、减压蒸馏等，优选为减压蒸馏。

本领域技术人员应该理解的是，为了进一步减少有机溶剂的用量，实际生产中，可以将有机溶剂循环使用若干次后再去除含有油脂的有机溶剂中的有机溶剂。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在下述实施例及对比例中：

油脂提取率＝提取的油脂的重量/微藻干粉的重量。

pH值通过pH测定仪(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，SG23)测得。

搅拌速度均为30rpm。

实施例1

本实施例用于说明本发明的含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

(1)将5g微拟球藻干粉放入三角瓶中，加水配制成25重量％的悬浮液，并调节pH值到8.5，在80℃下搅拌4h；

(2)调节PH值到5，以微拟球藻干粉计，均按照100IU/g的量加入纤维素酶(北京鸿润宝顺科技有限公司，2000IU/g，下同)、果胶酶(北京鸿润宝顺科技有限公司，20000IU/g，下同)、酸性蛋白酶(北京鸿润宝顺科技有限公司，50000IU/g，下同)和溶菌酶(国药集团化学试剂有限公司，20000IU/g，下同)，在50℃下反应5h；

(3)加入氢氧化钠调节pH值至10，在70℃下搅拌1h，然后加入醋酸调节pH值至4，在35℃下搅拌40min；

(4)加入20ml正己烷，搅拌30min，在5000rpm下离心10min，取上面含有油脂的有机溶剂层，然后100-200Pa，68℃下减压蒸馏，恒重干燥，得到油脂，油脂的提取率见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明的含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

(1)将5g小球藻干粉放入三角瓶中，加水配制成15重量％的悬浮液，并调节pH值到10，在60℃下搅拌6h；

(2)调节PH值到4，以小球藻干粉计，均按照200IU/g的量加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和溶菌酶，在40℃下反应6h；

(3)加入氢氧化钾调节pH值至12，在60℃下搅拌2h，然后加入柠檬酸调节pH值至3，在40℃下搅拌20min；

(4)加入10ml三氯甲烷，搅拌25min，在4000rpm下离心15min，取上面含有油脂的有机溶剂层，然后100-200Pa，60℃下减压蒸馏，恒重干燥，油脂的提取率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明的含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

(1)将5g栅藻干粉放入三角瓶中，加水配制成30重量％的悬浮液，并调节pH值到12，在100℃下搅拌2h；

(2)调节PH值到5.5，以栅藻干粉计，均按照300IU/g的量加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和溶菌酶，在60℃下反应4h；

(3)加入氢氧化钠调节pH值至14，在50℃下搅拌3h，然后加入醋酸调节pH值至5，在25℃下搅拌30min；

(4)加入50ml石油醚(北京化工厂，分析纯)，搅拌35min，在6000rpm下离心5min，取上面含有油脂的有机溶剂层，然后100-200Pa，50℃下减压蒸馏，恒重干燥，得到油脂，油脂的提取率见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明的含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

按照实施例1的方法进行含油微藻的破壁及油脂的提取，不同的是，步骤(3)中，加入氢氧化钠调节pH值至8，在30℃下搅拌0.5h。油脂的提取率见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明的含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法。

按照实施例1的方法进行含油微藻的破壁及油脂的提取，不同的是，步骤(3)中，加入氢氧化钠调节pH值至8，在100℃下搅拌6h。油脂的提取率见表1。

对比例1

按照实施例1的方法进行含油微藻的破壁及油脂的提取，不同的是，不进行步骤(3)，直接进行步骤(4)有机溶剂的提取。油脂的提取率见表1。

对比例2

按照实施例1的方法进行含油微藻的破壁及油脂的提取，不同的是，省去步骤(2)。油脂的提取率见表1。

表1。

序号	油脂的提取率
		实施例1	95.7
实施例2	96.3
		实施例3	96.9
实施例4	90.7
		实施例5	91.2
对比例1	63.2
		对比例2	38.2

将实施例1-5与对比例1-2进行比较可以看出，本发明方法采用水热处理和酶解反应一起破壁，然后进行皂化反应生成表面活性剂，利用有机溶剂提取含油微藻中的油脂，提取率高。

将实施例1分别与实施例4和实施例5进行比较可以看出，调节pH值至碱性进行反应的条件包括：pH值为10-14，温度为50-70℃，时间为1-3h，在上述优选条件下进行皂化反应，能够进一步提高含油微藻的油脂提取率。

本发明的含油微藻的破壁及表面活性剂辅助提取油脂的方法，由于采用水热处理和酶解反应联合破壁，可以在较温和的条件下进行水热处理，避免了高温高压，有利于微藻中各营养元的生物性能的保持，降低了成本，提高了破壁效果；由于利用碱和微藻细胞中的油脂进行皂化反应生成了表面活性剂，有助于微藻油脂的析出，大大减少了有机溶剂的用量，进一步降低了成本，且减少了对环境的污染；本发明方法的油脂提取率可高达90％以上，油脂提取率高；本发明方法操作简单，且能适用于微拟球藻、小球藻、硅藻、栅藻和单针藻等多种微藻，适用范围广，易于实现规模化。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种含油微藻的破壁及利用皂化反应辅助提取油脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将含油微藻的悬浮液调节pH值为7.5-14，进行水热处理；

(2)水热处理后，在酶存在下进行酶解反应；

(3)调节pH值至碱性进行反应，再调节pH值至酸性进行反应；

(4)加入有机溶剂进行萃取并分离出油脂；

其中，所述酶选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、溶菌酶和蜗牛酶中的至少一种，以所述含油微藻的干重计，每种酶的用量为50-5000IU/g；

其中，步骤(1)中，水热处理的条件包括：温度为50-120℃，时间为0.5-10h；

其中，步骤(2)中，所述酶解反应的条件包括：温度为30-70℃，pH值为3-7，时间为2-10h；

其中，步骤(3)中，调节pH值至碱性时pH值为8-14，调节pH值至酸性时pH值为3-6；以及调节pH值至碱性进行反应的条件包括：温度为30-100℃，时间为0.5-6h；调节pH值至酸性进行反应的条件包括：温度为20-60℃，时间为10-60min。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，以所述含油微藻的干重计，所述含油微藻在所述悬浮液中的含量为2-30重量％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以所述含油微藻的干重计，每种酶的用量为200-1200IU/g。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述酶解反应的条件包括：温度为40-60℃；pH值为4-5.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂选自三氯甲烷、正己烷、石油醚。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述含油微藻的干重计，相对于1g所述含油微藻，所述有机溶剂的用量为1-30mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含油微藻为微拟球藻、小球藻、硅藻、单针藻和栅藻中的至少一种。