CN110049770A - 肌肉分化诱导剂 - Google Patents

Abstract

本发明开发并提供一种药剂，其无需运动而诱导肌肉分化，即使对于老年人也能够减轻或抑制肌肉萎缩和肌肉量减少。本发明提供一种伴有肌肉萎缩的障碍或疾病的治疗或预防用组合物或者肌肉再生促进用组合物，其有效成分为由miR‑199或DNA组成的肌肉分化诱导剂，所述DNA包含编码miR‑199的miR‑199基因。

Description

肌肉分化诱导剂

技术领域

本发明涉及一种肌肉分化诱导剂，以及有效成分为该肌肉分化诱导剂的伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病的治疗或预防用组合物或者肌肉再生促进用组合物。

背景技术

近年来，很多主要发达国家已快速步入超老龄化社会的时代，男女平均寿命均超过80岁。例如，日本2015年的平均寿命为男性80.50岁，女性86.83岁。据预测，今后老龄人口的增加在全世界将持续20年以上。

在多国迎来超老龄化社会时，老龄化所伴随的各种问题也浮出水面。例如可举出：年龄的增长导致行走等日常生活动作受到限制，由此导致生活质量明显下降，还有随之而来的家人的护理负担问题，以及医疗费增加等社会问题。因此，减缓老龄化所导致的运动能力下降和改善日常生活动作，日益成为超老龄化社会所面临的重要问题。

老龄化导致的运动能力下降的原因，是肌纤维减少和肌肉萎缩导致的骨骼肌量和肌力的下降。骨骼肌量一般是由蛋白质的合成量和分解量的平衡来控制的(非专利文献1)。例如，在骨折时的石膏固定和卧床休息等肌肉不活动状态下，蛋白质合成受到抑制，同时分解得到促进，因此肌肉蛋白质含量下降，结果导致骨骼肌量减少，肌肉发生萎缩。长期不使用肌肉所引发的废用性肌肉萎缩，其产生原因不仅限于老龄化，微重力下的宇宙飞行(非专利文献2)、悬尾(非专利文献3)等导致的肌肉不活动、恶病质(非专利文献4)、肌少症(非专利文献5)、类固醇给药(非专利文献6)等也会引发废用性肌肉萎缩。

老年人的肌纤维减少和肌肉萎缩的减轻或改善方法作为上述问题的解决方案非常重要，其开发已成为当务之急。此外，如果能控制肌肉分化诱导，则对于肌肉营养不良症等伴有肌肉萎缩和肌肉损伤的肌源性疾病，也有望成为有效的疗法。

作为肌肉萎缩的疗法，一般有通过运动疗法对肌细胞施加适度的阻力(resistance)，激活蛋白质合成，诱导肌肉肥大的方法。肌肉训练是良好的示例。但是，对于卧床不起的老年人和伴有重度肌肉萎缩的肌源性疾病患者，伴有运动的治疗方法实施起来很困难。此外，老年人的年龄增长会导致肌肉分化能力下降，因此无法指望仅靠运动疗法来抑制肌肉萎缩和增大骨骼肌量。因此，需要一种无需对肌细胞施加过度阻力，通过药物来诱导肌肉分化，即使对于老年人也能减轻或抑制肌肉萎缩的疗法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Sandri,M.,Physiology(Bethesda),2008,23:160-170

非专利文献2：Nikawa,T.et al.,2004,FASEB J,18:522-524

非专利文献3：Suzuki,N.et al.,2007,J Clin Invest,117:2468-2476

非专利文献4：Zhou,X.et al.,2010,Cell,142:531-543

非专利文献5：Altun,M.et al.,2010,J Biol Chem,285:39597-39608

非专利文献6：Shimizu,N.et al.,2011,Cell Metab,13:170-182

发明内容

发明所要解决的问题

本发明开发并提供一种药剂，其无需对肌细胞施加过度阻力而诱导肌肉分化，由此即使对于老年人和肌源性疾病患者也能够减轻或抑制肌肉萎缩和肌肉损伤引起的肌肉量或肌力减少。

解决问题的技术方案

本发明人在全面分析小鼠血液中的miRNA的过程中，作为在低龄小鼠中高表达、在老龄小鼠中低表达的miRNA，获得了miR-199a-3p。经过对其诱导肌肉分化的活性进行研究，发现其具有较强的肌肉分化活性。此外还明确了miR-199的表达会使已知会进行肌肉特异性表达的miR-1的表达也提高。并且，当向造成肌肉损伤的小鼠给予miR-199时，与对照相比，肌纤维横截面积明显增大，肌肉再生得到了促进。该效果在老龄小鼠中也同样。已知miR-199在产生初期会在端脑等瞬时表达，但关于其在肌细胞中的功能，至今却几乎没有报道。但是，根据本发明人的研究表明，miR-199是将LIN28B和Suz12作为靶标分子，在最上游控制肌肉分化诱导的主因子。另外确认到给予miR-199会使肌肉营养不良症模型小鼠恢复肌力，表现出肌细胞的改善。本发明是基于该新发现的发明而完成的，提供以下方案。

(1)一种肌肉分化诱导剂，其由miR-199或DNA组成，所述DNA包含编码miR-199的miR-199基因。

(2)根据(1)所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199为miR-199-3p。

(3)根据(1)或(2)所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199为miR-199a。

(4)根据(3)所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199由以下(a)～(c)所示的碱基序列组成：

(a)SEQ ID NO:1所示的碱基序列；

(b)在SEQ ID NO:1所示的碱基序列中缺失、替换或增添1～3个碱基而形成的碱基序列；

(c)相对于SEQ ID NO:1所示的碱基序列具有85％以上的碱基同一性的碱基序列。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199基因以能够表达的状态包含在表达载体中。

(6)一种伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病的治疗或预防用组合物，其含有的有效成分为(1)～(5)中任一项所述的肌肉分化诱导剂。

(7)根据(6)所述的治疗或预防用组合物，其中，所述伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的疾病为肌源性疾病。

(8)根据(7)所述的治疗或预防用组合物，其中，所述肌源性疾病为肌肉营养不良症。

(9)一种肌肉再生促进用组合物，其含有的有效成分为(1)～(5)中任一项所述的肌肉分化诱导剂。

本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-201786号的公开内容。

发明效果

本发明的以肌肉分化诱导剂为有效成分的伴有肌肉萎缩的障碍或疾病的治疗或预防用组合物或者肌肉再生促进用组合物，在伴有肌肉萎缩和肌力低下的障碍和疾病，以及肌肉损伤部位的肌肉再生促进中，能够无需对肌细胞施加阻力而抑制肌肉萎缩的发展，从而恢复肌力或增强肌力。此外，对于难以进行康复训练等运动疗法的老年人，本发明也能够成为肌肉萎缩和肌力低下的有用的治疗剂或预防剂。

附图说明

图1是表示各种miRNA(let-7e、miR-1、miR-26a、miR-125b、miR-133a、miR-133b、miR-214)以及组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199a-3p对小鼠成肌细胞株C2C12细胞的肌肉分化诱导活性的图。该图中，通过肌肉分化标记蛋白肌细胞生成素(A)和Myh1(B)的表达量来验证肌肉分化诱导活性。

图2-1是表示导入miR-199a-3p后的C2C12细胞中的肌肉分化相关miRNA(miR-1)的表达量的图。该图中，表示将未导入miR-199a-3p的阴性对照(Neg)中的表达量设为1时的相对值。199s表示市售的miR-199a-3p即MISSION miRNA mimic的HMI0338；199#4表示该实施例中制备的miR-199a-3p即miR-199a-3p#4。

图2-2是将导入了199s的C2C12细胞中各种miRNA(miR-1、miR-133a、miR-26a、let-7g、miR-214)的表达量与阴性对照进行比较时的相对值。

图3-1是表示miR-199a-3p和其目标候选基因Lin28b基因和Suz12基因的碱基序列比对的图。小鼠miR-199a-3p在Lin28b基因上具有两处候选目标位点，即A所示的第81位～第102位，以及B所示的第983位～第1004位；另外，在Suz12基因上还具有一处候选目标位点，即C所示的第973位～第994位。

图3-2是表示在C2C12细胞中导入miR-199a-3p时的Lin28b基因和Suz12基因中的表达抑制的蛋白质印迹图。

图4-1是表示在针对Suz12的siRNA(siSuz12#1&siSuz12#2)存在下的Myh1基因和肌细胞生成素(Myog)基因的表达量的图。

图4-2是表示在针对Lin28b的siRNA(siLin28#3)存在下的肌肉肌酸激酶(Ckm)基因和Myh1基因的表达量的图。

图5-1是表示在来自小鼠趾长伸肌的初代培养细胞中导入miR-199a-3p时的肌肉分化诱导活性的图。A表示导入了miR-199a-3p(199s和199#4)的初代培养细胞(c5～c8)中的miR-1的表达量。B表示c5～c8中的Ckm、Myog、Mef2c和Myh4的表达量的平均值。

图5-2的C表示在siLin28b存在下的Ckm的表达量。

图6是表示miR-199a-3p引起的体内肌肉分化诱导的结果的图。A表示实施例6的实验日程。B表示各肌肉分化标记的表达量。图中，NC表示阴性对照。

图7-1是表示miR-199a-3p引起的体内肌肉再生促进活性的图。A表示实施例7的实验日程，B和C表示8周龄的C57/BL6J小鼠的肌肉再生结果。

图7-2是表示miR-199a-3p引起的体内肌肉再生促进活性的图。D和E表示2年龄的ICR小鼠中的肌肉再生结果。

图8是表示miR-199a-3p的导入所引起的人肌卫星细胞的肌肉分化诱导的图。

图9表示给予了miR-199a-3p或对照用siControl的正常小鼠(B10)和肌肉营养不良症模型小鼠(mdx)的握力测试的结果。图中，siC表示siControl，199#4表示miR-199a-3p。

图10表示给予了miR-199a-3p或对照用siControl的正常小鼠(B10)和肌肉营养不良症模型小鼠(mdx)的血浆中的肌肉特异性miRNA(miR-1和miR-133a)量。A是miR-1的血浆中的表达量，B是miR-133a的血浆中的表达量。图中，siC表示siControl，199#4表示miR-199a-3p。

图11表示给予了miR-199a-3p或对照用siControl的正常小鼠(B10)和肌肉营养不良症模型小鼠(mdx)的血浆中的肌酸激酶(CK)活性。图中，siC表示siControl，199#4表示miR-199a-3p。

具体实施方式

1.肌肉分化诱导剂

1-1.概要

本发明的第一实施方式为肌肉分化诱导剂。本发明的肌肉分化诱导剂由核酸分子组成，所述核酸分子由miR-199或DNA组成，所述miR-199是在生物体内表达的miRNA的一种，所述DNA包含编码miR-199的miR-199基因。作为肌肉分化诱导用组合物，本发明的肌肉分化诱导剂是后述的第二实施方式或第三实施方式记载的肌肉再生促进用组合物或伴有肌肉萎缩的障碍或疾病的治疗或预防用组合物的有效成分。

1-2.术语定义

下面对本说明书中频繁使用的下述术语进行定义。

本说明书中，“肌肉分化”是指成肌细胞分化为肌细胞。此外，“肌细胞”是指构成骨骼肌的细胞，即肌纤维。

本说明书中，“肌肉分化诱导剂”是指作用于成肌细胞并诱导其向肌细胞分化，且使肌细胞增加的药剂。“肌细胞增加”是指促进肌肉肥大、抑制肌肉萎缩、增加肌力或维持肌力中的任一项或它们的组合。

本说明书中，“肌肉肥大”是指随着内源蛋白量的增加，单根肌纤维重量或横截面积增加所引起的肌肉重量的增加；“促进肌肉肥大”是指通过促进单根肌纤维中的内源蛋白量增加，从而促进该肌纤维重量或横截面积的增加所引起的肌肉重量的增加。此外，“肌肉萎缩”是指伴有单根肌纤维重量或横截面积局部减少的肌力低下的状态；“肌肉萎缩的减轻”是指阻止单根肌纤维重量或横截面积减少或延缓减少的速度，或者使减少的单根肌纤维重量或横截面积增加。“肌力”是指使肌肉收缩的力(肌张力)；“肌力的增加或维持”是指该力增加或维持。

“miRNA(microRNA)”是指存在于细胞内的长度为21～23个碱基长度的单链非编码RNA。miRNA在称为pri-miRNA的前前体状态下从基因组转录后，在核内通过称为Drosha的核酸内切酶而被加工成称为pre-miRNA的前体。之后，在称为Dicer的核酸内切酶的作用下，在核外被切割加工，变成由miRNA和miRNA*(star miRNA)构成的中间体即双链miRNA(miRNA/miRNA*)。miRNA/miRNA*被引入到蛋白因子复合体RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导沉默复合体)中，最终，一条RNA链即miRNA作为成熟体的miRNA(成熟miRNA)发挥功能(Bartel DP,2004,Cell,116:281-297、Kawamata T.,et al.,2009,Nat Struct MolBiol.,16(9):953-960)。已知成熟miRNA会通过在RISC内与靶基因的mRNA结合并阻碍其翻译，从而抑制性地调节靶基因的表达。因此，在细胞内，通常可以存在作为前体的pri-miRNA和pre-miRNA，以及成熟miRNA。本说明书中，miRNA是包含miRNA前体和成熟miRNA中任一种的概念，但在没有特别说明的情况下，其是指成熟miRNA。

另外，目前已知star miRNA链容易被分解，miRNA链作为成熟miRNA发挥功能，但具有功能性的star miRNA链存在很多，因此，将其变成miRNA/miRNA*，用意为pre-miRNA的发夹结构中的5’侧和3’侧的位置的miRNA-5p/miRNA-3p来表述。因此，在本说明书中，也按照此方法来表述。

1-3.组成

本实施方式的肌肉分化诱导剂由核酸分子组成，所述核酸分子由miR-199或DNA组成，所述DNA包含编码miR-199的miR-199基因。

已知“miR-199”是脊椎动物特异性miRNA的一种，参与到各种癌症的发生和发展、心肌细胞保护，或骨骼形成等多种多样的细胞机制和发生机制(Park KM,et al.,2016,AmJ Physiol Heart Circ Physiol,311(2):H371-383；Pencheva N.,et al.,2012,Cell,151(5):1068-1082；Alemdehy M.F.,et al.,2015,Blood,25(25):3937-3948；Chen B.F.,etal.,2014,Sci Rep,4:6413)。关于肌肉中的miR-199，已知在发育初期miR-199的表达瞬时增加，然后迅速消失(Lee Y.B.,et al.,2009,Nucleic Acids Res.37(1):123-128)。但是，关于其与肌肉分化和肌源性疾病等疾病的关联性却没有报道，具体功能不明。

与其他很多miRNA相同，在miR-199中也存在上述那样的miR-199-5p和miR-199-3p。其中，已知miR-199-3p主要在后脑表达，而miR-199-5p主要在肢芽表达(Lee Y.B.,etal.,2009,Nucleic Acids Res.37(1):123-128)。组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199可以是miR-199-5p和miR-199-3p中任一种，但优选为主表达部位为肌肉组织的miR-199-3p。

另外，关于miR-199，在同一生物种中已知有miR-199a和miR-199b那样的旁系同源。组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199可以为任一种旁系同源。

组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199包括野生型miR-199，或具有与野生型miR-199同等以上的活性的突变型miR-199。

关于野生型miR-199，可举出由SEQ ID NO:1所示的碱基序列组成的人野生型成熟miR-199a-3p(hsa-miR-199a-3p)或人野生型成熟miR-199b-3p(hsa-miR-199b-3p)那样的人野生型miR-199，或者由SEQ IDNO:2所示的碱基序列组成的人野生型成熟miR-199a-5p(hsa-miR-199a-5p)。并且，也包括具有与人野生型miR-199相同活性的来自其他生物种的野生型miR-199直系同源。已知miR-199一般极为高度地保存在生物种间，尤其是哺乳动物的野生型miR-199直系同源几乎全部都与人野生型miR-199具有100％的碱基同一性，或者具有一个碱基的缺失或替换。例如，小鼠(Mus musclus)、马(Equus caballus)、野猪(Susscrofa)和牛(Bos taurus)的野生型成熟miR-199a-3p与人野生型成熟miR-199a-3p具有100％的碱基同一性。此外，绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra hircus)的野生型成熟miR-199a-3p如SEQ ID NO:3所示，具有人野生型成熟miR-199a-3p的3’末端缺失1个碱基而形成的碱基序列。此外，除哺乳动物以外的生物种也和人野生型miR-199具有极高的碱基同一性。例如，SEQ ID NO:4所示的原鸡(Gallusgallus)的野生型miR-199-3p与人野生型miR-199a-3p具有86％的碱基同一性；SEQ ID NO:5所示的非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)的野生型miR-199a-3p与人野生型miR-199a-3p具有95％的碱基同一性；此外，大西洋鲑(Salmosalar)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)与山羊和绵羊的野生型miR-199a-3p具有100％的碱基同一性；斑马鱼(Danio rerio)与蛙的野生型miR-199a-3p具有100％的碱基同一性。从以上例举的碱基序列也可以看出，SEQ ID NO:6所示的碱基序列为miR-199的活性区域，所有生物种均相同。根据种间的高度的序列同一性，可以认为各生物种的miR-199活性具有兼容性，无论使用什么生物种的miR-199，都会表现出相同的活性和相同的效果。

关于突变型miR-199，可举出：由野生型miR-199的碱基序列中缺失、替换或增添1～3个碱基而形成的碱基序列组成的RNA；由相对于野生型miR-199的碱基序列具有85％以上、90％以上或95％以上的序列同一性的碱基序列组成的RNA；以及由在高严格度条件下与核酸片段杂交的碱基序列组成的RNA，其中，所述核酸片段由与野生型miR-199的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列组成。本说明书中，“碱基同一性”是指将野生型miRNA-199和突变型miR-199的碱基序列进行比对(alignment)，根据需要，在任意的碱基序列中引入空缺，二者的碱基一致度达到最高时，相对于一个miRNA的总碱基数，另一个miRNA的相同碱基所占的比例(％)。％同一性可以利用同源性检索程序BLAST(Basic local alignmentsearch tool，局部序列比对基本检索工具；Altschul,S.F.et al，J.Mol.Biol.,215,403-410,1990)检索等公知的程序容易地确定。此外，本说明书中，“高严格度条件”是指不形成非特异性杂交体的高温且低盐浓度的条件。例如，在杂交后的洗涤中，是指60℃～68℃且1×SSC以下的条件，优选为65℃～70℃且0.1×SSC以下的条件。

“miR-199基因”为编码上述miR-199的基因。miR-199基因是包含在组成上述miR-199的碱基序列中将尿嘧啶(U)替换为胸腺嘧啶(T)的多聚核苷酸的DNA，例如，编码miR-199的pre-miRNA(pre-miR-199)那样的miR-199前体的基因。具体可举出由SEQ ID NO:7所示的碱基序列组成的人野生型pre-miR-199a。

上述miR-199基因优选以能够表达的状态包含在表达载体中。

“表达载体”是指能够控制内部所包含的目标基因和基因片段的表达的表达单位。“能够表达的状态”是指在规定条件下目标基因等能够在宿主细胞内转录的状态。具体是指将目标基因等配置在启动子的控制下的状态。当启动子激活时，被配置在其控制下的目标基因等的表达会被诱导。关于表达载体，可以使用能够在宿主细胞内复制和表达的各种表达载体。作为示例，可举出病毒载体、质粒载体等。病毒载体包括来自逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、仙台病毒等的各种载体。这些表达载体也可使用各厂商生产的市售品。然而，由于miR-199在肌肉分化中能够作为主因子发挥功能，因此持续性的过量表达不仅有可能给肌肉分化带来副作用，还可能会给生物体带来严重的副作用。因此，当对生物体给予由miR-199基因，或由以能够表达的状态包含miR-199基因的表达载体组成的肌肉分化诱导剂时，优选使miR-199基因瞬时表达。例如，可举出将表达载体所包含的启动子变成能够在细胞内控制表达时间的表达诱导型启动子的方法。

2.伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病的治疗或预防用组合物

2-1.概要

本发明的第二实施方式涉及伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病的治疗或预防用组合物(以下在本说明书中简略记为“治疗预防用组合物”)。上述第一实施方式记载的由核酸分子组成的肌肉分化诱导剂，可以用作包含该肌肉分化诱导剂的组合物。本发明的治疗预防用组合物，其含有的有效成分为第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂，是用于通过对患有伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病，或将来有可能患有该障碍或疾病的受试对象给药，从而治疗或预防这些障碍或疾病的组合物。

2-2.组成

本发明的治疗预防用组合物所含有的组成成分为有效成分和载体。下面对各组成成分进行说明。

2-2-1.有效成分

本实施方式的治疗预防用组合物含有的有效成分为上述第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂。本发明的治疗预防用组合物可以含有一种或两种以上的第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂。例如，所含有的有效成分可以为人野生型miR-199a-3p和人突变型miR-199a-3p这两种肌肉分化诱导剂。此外，还可以组合使用已知能够诱导肌肉分化的其他肌肉分化诱导剂，例如miR-1、miR-133a、miR-26a和miR-214等。

治疗预防用组合物所包含的第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂的量(含量)，由于因该治疗预防用组合物所包含的肌肉分化诱导剂的种类和/或其有效量(给药量或摄取量)、障碍或疾病的种类、治疗预防用组合物的剂型，以及后述的载体或添加物的种类而不同，因此可以考虑各条件而适当确定。本说明书中，“有效量”是指在治疗预防用组合物中，肌肉分化诱导剂发挥作为有效成分的功能所必需的量，且对适用的生物体几乎或完全不会赋予有害作用的量。该有效量可以根据受试对象的信息、给药途径以及给药次数等各种条件而变化。本说明书中，“受试对象”是指成为本发明的治疗预防用组合物、肌肉分化诱导剂或肌肉再生促进用组合物的应用对象的生物体。例如有：人、家畜(牛、马、绵羊、山羊、猪、鸡、鸵鸟等)、赛马、宠物(狗、猫、兔等)、实验动物(小鼠、大鼠、豚鼠、猴等)等。优选为人、家畜、赛马。此外，“受试对象的信息”是指应用治疗预防用组合物的生物体的各种个体信息。例如包括全身健康状态，当患有其他疾病和病害时，则包括其种类和重症度、年龄、体重、性别、饮食生活、药物敏感性、有无并用药物和对治疗的耐受性等。肌肉分化诱导剂的最终有效量以及据此计算出的应用量，根据各上述受试对象的信息等，最终由医生或兽医等的判断来确定。如此，本发明的治疗预防用组合物中的肌肉分化诱导剂的含量根据条件而不同。在获得肌肉分化诱导剂的药理效果的基础上，当需要大量给予治疗预防用组合物时，为了减轻对受试对象的负担，也可以分数次给药。例如，通常可以将成人每天的肌肉分化诱导剂的有效量分成一天一次或数次，给予几天至一周、一个月、数个月、半年或一年。

2-2-2.载体

本发明的治疗预防用组合物含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指制剂技术领域中通常使用的添加剂。例如可举出溶剂、赋形剂。

溶剂例如可以是水或除水以外的药学上可接受的水溶液，或药学上可接受的有机溶剂中的任一种。水溶液例如可举出含有缓冲液(缓冲剂)、生理盐水、葡萄糖或其他助剂的等渗液。缓冲液用于维持作为上述有效成分的含有骨骼肌前体细胞的溶液中的pH值。具体可举出PBS、HEPES、MOPS、Tricine等。关于缓冲液等溶剂，可参考Green,M.R.and Sambrook,J.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Fourth Ed.,Cold SpringHarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York的记载。

上述助剂例如有D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，其他还有低浓度的非离子型表面活性剂、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。有机溶剂例如可举出乙醇。

赋形剂主要用于使剂型容易形成，并维持剂型和作为有效成分的肌肉分化诱导剂的药理效果，根据需要而使用。赋形剂可以适当含有：粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、安抚剂、稳定剂、吸收促进剂、增量剂、保湿剂、吸附剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、等渗剂、人血清白蛋白等。

作为具体例，粘合剂例如可举出：使用植物淀粉的淀粉糊、果胶、黄原胶、单糖浆、葡萄糖溶液、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、虫胶、石蜡、聚乙烯吡咯烷酮或它们的组合物。

崩解剂例如可举出：上述淀粉、乳糖、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻淀粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、海藻酸或海藻酸钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、单硬脂酸甘油酯或它们的盐。

填充剂例如可举出：凡士林、上述糖和/或磷酸钙。

乳化剂例如可举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。

2-3.剂型和给药法

关于本发明的治疗预防用组合物的剂型，虽然治疗预防用组合物的剂型根据给药法和/或处方条件而不同，但只要是作为有效成分的第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂或其他附加有效成分不会因分解等而失活，且能够在给予后在生物体内发挥药理效果的形式，就没有特别限制。

给药法一般可以大体分为口服给药和非口服给药。本发明的治疗预防用组合物可以使用任意给药方法，但由于作为有效成分的肌肉分化诱导剂由RNA或DNA的核酸组成，因此优选非口服给药。因此，治疗预防用组合物也可以采用适合于各给药方法的剂型。

非口服给药进一步细分为全身给药、组织内给药、经皮给药、经粘膜给药和经直肠给药，而在对成肌细胞和肌细胞产生作用的性质上，本发明的治疗预防用组合物优选采用向肌肉组织内局部给药，或者血管内给药或淋巴管内给药等经由循环系统的全身给药。优选为向肌肉组织的直接局部给药。作为适合于上述全身或组织内给药的剂型，优选注射剂等剂型。注射剂例如与乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、pH调节剂等赋形剂适当组合，按照一般认为的制药实施所要求的单位用量形式进行混合，由此进行制剂，以单位用量安瓿或多用量容器的状态来提供。

静脉注射等血管内给药在可经由血流而使本发明的治疗预防用组合物中作为有效成分的肌肉分化诱导剂输送至全身这点上十分方便。但优选设置成将核酸作为组成成分的肌肉分化诱导剂递送至作为靶细胞的成肌细胞和肌细胞所存在的肌肉组织，而且并不会被血液中的核酸酶分解。例如，通过将miR-199或包含miR-199基因的DNA引入到腺相关病毒(AAV)载体颗粒内，可以避免被血液中的核酸酶分解，从而递送到目标肌肉组织。

当通过经皮给药或经粘膜给予来将本发明的治疗预防用组合物导入肌肉组织内时，作为适合于这些给药法的剂型，可举出：液剂(包括涂布剂、滴眼剂、滴鼻剂、吸入剂)、悬浮剂(包括乳剂、霜剂)、粉剂(包括滴鼻剂、吸入剂)、糊剂、凝胶剂、软膏剂、硬膏剂等。

当通过口服给药来给予本发明的治疗预防用组合物时，可以采用固形剂(包括片剂、丸剂、舌下片剂、胶囊剂、滴剂、锭剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂(包括内用水剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂)等剂型。固体制剂可以根据需要采用实施该技术领域中公知的包衣的剂型，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、薄膜包衣片、双层片、多层片。

本实施方式的治疗预防用组合物用于治疗或预防伴有肌肉萎缩的障碍或疾病，以及促进肌肉损伤部位的肌肉再生，因此应用对象部位原则上为骨骼肌。

2-4.对象障碍或疾病

作为本实施方式的治疗预防用组合物的治疗或预防对象的障碍或疾病为伴有肌肉萎缩或肌肉损伤和肌力低下的障碍或疾病。本说明书中，“治疗”是指障碍或患有的疾病和/或伴有该障碍疾病的症状的缓解或治愈。此外，本说明书中，“预防”是指将防止障碍的发生或疾病的发病。

伴有肌肉萎缩的障碍例如可举出：因石膏固定和卧床休息等肌肉不活动状态而产生的废用性肌肉萎缩、恶性肿瘤、呼吸器官等慢性疾病所伴有的恶病质、老化(肌少症)、给予类固醇所引起的副作用，以及在宇宙空间的生活等微重力下的肌肉萎缩。

另外，伴有肌肉萎缩或肌肉损伤和肌力低下的疾病可举出：因骨骼肌发生异常而呈现肌力低下等肌肉症状的肌源性疾病。不包括肌肉断裂等物理原因造成的肌肉损伤。肌源性疾病根据病因，可以大体分为炎症性肌病和非炎症性肌病。

“炎症性肌病”是自身免疫性的炎症性肌病，主要导致四肢肌肉和躯干肌肉、颈肌、咽肌等肌力低下。作为炎症性肌病的具体例，可举出：多发性肌炎(polymyositis：PM)、皮肌炎(dermatomyositis：DM)、包涵体肌炎(inclusion body myositis：IBM)、抗合成酶综合症(anti-synthetase syndrome：ASS)，以及免疫介导的坏死性肌病(肌肉疾病)(Immune-mediated necrotizing myopathy：iNM)。

“非炎症性肌病”是非自身免疫性的炎症性肌病，基本都是遗传变异导致的先天性肌病(遗传性肌病(hMD)：hereditary/genetic muscle disease)。作为非炎症性肌病的具体例，包括：肌肉营养不良症(包括杜兴氏、贝克型、Emery-Dreifuss型、肢带型、面肩肱型、眼咽型、先天性各种肌肉营养不良症)、肌病(包括先天性、远端型、甲状腺功能低下性、类固醇肌病等)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、溶酶体贮积症、肌无力综合征、线粒体病、肌红蛋白尿症、糖原贮积病、周期性四肢麻痹等。

3.肌肉再生促进用组合物

3-1.概要

本发明的第三实施方式涉及肌肉再生促进用组合物。上述第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂，除了上述第二实施方式的治疗预防用组合物以外，还可以根据其用途作为各种组合物使用。本发明的肌肉再生促进用组合物所含的有效成分为第一实施方式记载的肌肉分化诱导剂，作为与第二实施方式的伴有肌肉萎缩的障碍或疾病的治疗或预防用不同的用途，作为用于促进因肌肉断裂等物理原因而损伤的骨骼肌的再生的组合物使用。

本说明书中，“骨骼肌的损伤”是指骨骼肌细胞的细胞膜脆弱化，该细胞坏死，或者骨骼肌细胞的物理缺损。细胞的坏死是在肌源性疾病的肌细胞等确认到的现象，而在这里则是指在受到受伤或运动负荷引起的物理刺激的肌细胞产生的现象。

3-2.组成、剂型和给药法

本发明的肌肉再生促进用组合物的基本组成，以第二实施方式记载的治疗预防用组合物为准。即，第二实施方式记载的治疗预防用组合物的应用对象为患有伴有肌肉萎缩的障碍或疾病的受试对象；而本发明的肌肉再生促进用组合物的应用对象则是因创伤而使骨骼肌出现损伤的受试对象，和老化或衰弱等引起骨骼肌减少的受试对象。也就是说，与第三实施方式的治疗预防用组合物相比，只是用途不同。因此，关于以第三实施方式为准的组成、剂型和给药法，省略具体说明。

3-3.应用对象

在过度运动引起的物理负荷或创伤导致骨骼肌的一部分损伤的情况，或老化引起肌细胞减少或肌肉萎缩增加的情况下，本发明的骨骼肌再生促进剂会促进从成肌细胞向肌细胞的肌肉分化，由此可以填补或填充损伤部位的骨骼肌，从而使肌肉量恢复到原先的水平。因此，应用对象是因事故或手术等引起骨骼肌的一部分受损的受试对象，以及老化引起骨骼肌减少的受试对象。

[实施例]

下面举出具体例，对本发明进行说明。但是，以下实施例只是本发明的例示而已，本发明的各条件不限于实施例记载的条件等。各实施例中的基本实验方法按照Green,M.R.and Sambrook,J.,2012(上述)记载的方法进行。

<材料和方法>

下面对以下记载的各实施例中使用的实验材料和实验方法进行说明。

1.培养细胞株和细胞培养

培养细胞株使用小鼠成肌细胞株C2C12细胞、小鼠初代成肌细胞，以及人肌卫星细胞。

C2C12细胞(理研细胞库)使用含有10％胎牛血清(FBS；赛默飞世尔科技公司)和1％青霉素/链霉素(Wako公司)的Dulbecco’s modified Eagle’smedium(DMEM)培养基(Wako公司)，在5％CO₂、37℃进行培养。C2C12细胞向肌管细胞的分化诱导使用含有2％马血清的DMEM，在5％CO₂、30℃进行培养。

小鼠初代成肌细胞从小鼠趾长伸肌(Extensor digitorum longus muscle：EDL肌)建立。将从小鼠采集的EDL浸泡在含有0.2％胶原酶1型(Worthington biochemical公司)的DMEM GlutaMax培养基(赛默飞世尔科技公司)中，在37℃大约培养2小时。在放入有上述培养基的经5％BSA/PBS包被的培养皿(Sterilin公司)中，分开肌肉，由此分离单根纤维(single fiber)。单根纤维使用含有20％胎牛血清、1％鸡胚提取物(US biological公司)、1％青霉素/链霉素(Wako社)和5ng/mL bFGF(Cell Signaling Technology(CST)公司)的DMEM GlutaMax培养基，在5％CO₂、37℃进行培养，使细胞从单根纤维中游离。予以说明，培养使用用1mg/mL Matrigel(BDBiosciences公司)包被的塑料培养皿或多孔板(TPP公司)。此外，小鼠初代成肌细胞向肌管细胞的分化诱导使用含有2％马血清和1％青霉素/链霉素的DMEMGlutaMax培养基，在5％CO₂、37℃进行培养。

人肌卫星细胞(ScienCellTMResearch Laboratories公司)使用骨骼肌细胞培养基(ScienCellTMResearch Laboratories公司)，在5％CO₂、37℃进行培养。

予以说明，培养使用经多聚-L-赖氨酸(ScienCellTM公司)包被处理的塑料培养瓶(Greiner公司)或多孔板(TPP公司)。

2.miRNA和siRNA的制备

实施例中使用的miRNA或siRNA使用市售的MISSION miRNA mimic(Sigma公司)，或根据序列设计的碱基序列信息而在Sigma公司进行化学合成的合成miRNA或合成siRNA。

MISSION miRNA mimic使用阴性对照(HMC0002)、miR-1(HMI0046)、miR-133a(HMI0196)、miR-133b(HMI0198)、miR-26a(HMI0415)、miR-125b(HMI0112)、miR-199a-3p(HMI0338)、miR-214(HMI0379)、let-7e(HMI0013)。()内表示产品编号。

另外，合成miRNA和siRNA使用具有以下序列的合成miRNA和siRNA。

·miR-199a-3p#4s:5’-acaguagucugcacauugguua-3’:(SEQ ID NO:8)

·miR-199a-3p#4as:5’-accaaugugcagacuacucauu-3’:(SEQ ID NO:9)

·siControl s:5’-uucuccgaacgugucacguuu-3’:(SEQ ID NO:10)

·siControl as:5’-acgugacacguucggagaauu-3’:(SEQ ID NO:11)

·siSuz12P s:5’-acucguccaggaagaagagaauuu-3’:(SEQ ID NO:12)

·siSuz12P as:5’-uaaauucucuucuuccuggacgagu-3’:(SEQ ID NO:13)

·siSuz12M s:5’-gagaauuuaauggaaugauuuu-3’:(SEQ ID NO:14)

·siSuz12M as:5’-aaucauuccauuaaauucucuu-3’:(SEQ ID NO:15)

·siLin28b#1s:5’-ggauucaucuccaugauaauu-3’:(SEQ ID NO:16)

·siLin28b#1as:5’-uuaucauggagaugaauccuu-3’:(SEQ ID NO:17)

·siLin28b#2s:5’-aggauuuagaagcuugaaauu-3’:(SEQ ID NO:18)

·siLin28b#2as:5’-uuucaagcuucuaaauccuuu-3’:(SEQ ID NO:19)

·siLin28b#3s:5’-guggaauuuacauuuaaaauu-3’:(SEQ ID NO:20)

·siLin28b#3as:5’-uuuuaaauguaaauuccacuu-3’:(SEQ ID NO:21)

·siLin28b#4s:5’-gagccaguggaauuuacauuu-3’:(SEQ ID NO:22)

·siLin28b#4as:5’-auguaaauuccacuggcucuu-3’:(SEQ ID NO:23)

等量混合相同名称的有义链(s)和反义链(as)，进行退火后用于以下实验。

3.miRNA/siRNA向肌细胞的导入

使用电穿孔法，将miRNA或siRNA导入到上述“1.培养细胞株和细胞培养”中培养的各细胞。

将达到70％～80％汇合的C2C12细胞用D-PBS(-)(Wako公司)洗涤后，为了将细胞剥离、分散，滴加0.25％胰蛋白酶/EDTA(Sigma公司)，在37℃孵育3分钟。将得到的细胞悬浮液以1000G、室温离心分离3分钟，除去上清液后，使用Amaxa Cell Line Nucleofector KitV(Lonza公司)的Nucleaofector溶液V，制备1×10⁶细胞/100μL的细胞悬浮液。在100μL细胞悬浮液中加入90pmol的MISSION miRNA mimic(Sigma公司)或合成miRNA或合成siRNA后，将其混合液转移到上述试剂盒专用比色皿中，使用Nucleofector 2b(Lonza公司)(使用程序：B-032)进行电穿孔，将miRNA或siRNA导入到细胞内。电穿孔后，将细胞用500μL的C2C12细胞用的分化诱导培养基(含有2％马血清的DMEM)悬浮，以每孔0.2×10⁶细胞的量将细胞接种到24孔板，在5％CO₂、30℃进行培养，进行分化诱导。

将达到70％～80％汇合的小鼠初代成肌细胞用D-PBS(-)(Wako公司)洗涤后，为了将细胞剥离、分散，滴加0.05％胰蛋白酶/EDTA(赛默飞世尔科技公司)，在37℃孵育3分钟。将得到的细胞悬浮液以1800G、室温离心分离5分钟，除去上清液后，通过与C2C12细胞相同的方法进行电穿孔，将miRNA或siRNA导入到细胞内。电穿孔后，将细胞用500μL的小鼠初代成肌细胞用的增殖培养基(含有20％胎牛血清、1％鸡胚提取物、1％青霉素/链霉素和5ng/mL bFGF的DMEM GlutaMax培养基)悬浮，以每孔0.2×10⁶细胞的量将细胞接种到24孔板，在5％CO₂、30℃进行培养，进行分化诱导。

将汇合达到70％～80％的人肌卫星细胞用D-PBS(-)(Wako公司)洗涤后，为了将细胞剥离、分散，在培养瓶中滴加4mL的D-PBS(-)和1mL的胰蛋白酶/EDTA溶液(ScienCell公司)，在37℃孵育2分钟。将得到的细胞悬浮液转移到加入有2.5mL的FBS(赛默飞世尔科技公司)的15mL Falcon试管(赛默飞世尔科技公司)后，再次将瓶在37℃孵育2分钟，使剩余的细胞进一步分散。接着，滴加2.5mL的胰蛋白酶中和溶液(ScienCell公司)，将得到的细胞悬浮液转移到上述15mL Falcon试管中。以1000G、室温离心分离5分钟，除去上清液后，通过与C2C12细胞相同的方法进行电穿孔，将miRNA或siRNA导入到细胞内。电穿孔后，将细胞用500μL的人肌卫星细胞用增殖培养基(骨骼肌细胞培养基)悬浮，以每孔0.2×10⁶细胞的量接种到24孔板，在5％CO₂、37℃进行培养。

4.对小鼠胫骨前肌造成肌肉损伤和miRNA的肌肉注射

实验用动物使用8～9周龄的雄性C57BL/6J(日本Charles River公司)，或出生后培养2年以上的自然老化ICR小鼠(日本CLEA公司)。

使用附带粗细为26g的针的1mL注射器(泰尔茂公司)，对小鼠左后肢的胫骨前肌肌肉注射50μL的1.2％(w/v)氯化钡(BaCl₂)(Wako公司)溶液，由此对小鼠造成肌肉损伤。在造成肌肉损伤(给予氯化钡)的第二日，使用AteloGene(注册商标)局部使用(高研社)试剂盒，分别准备AtelloGene(注册商标)和混合有各等量10μM miR-199a-3p mimic或siControl(对照RNA)的混合液，将50μL该混合液肌肉注射到各小鼠的损伤部位，由此向损伤部位给予RNA。

5.肌肉组织的染色

从造成肌肉损伤后第10天的小鼠身上取出胫骨前肌，在用液氮冷却的异戊烷(Wako公司)中快速冷冻。使用低温恒温器CM1900(Leica公司)，制作厚度为10μm的胫骨前肌的横截冷冻切片，进行HE染色。染色的肌肉组织使用Axiovert 40CFL(Carl Zeiss公司)和Axiovision Rel 4.6software(Carl Zeiss公司)进行观察。使用ImageJ软件，测定具有作为从损伤再生的肌肉的指标的中心核的肌纤维横截面积。对于每只小鼠，测定至少700根(老龄小鼠至少100根)肌纤维横截面积。通过student t检验，检验siControl和miR-199a-3p mimic给药组之间有无统计学上的显著差异。

6.总RNA提取和RT-qPCR分析

使用TRI试剂(MRC公司)提取来自细胞和来自肌肉损伤第3天的胫骨前肌的总RNA。使用低聚dT15引物(Promega公司)作为cDNA合成用引物，使用SuperScript III(赛默飞世尔科技公司)作为反转录酶，按照附带的操作流程，从总RNA中的mRNA合成cDNA。使用合成的cDNA、Fast SYBR Green主混合液(罗氏公司)和针对各基因的Perfect Real Time引物(日本宝生物株式会社)，利用StepOne Plus实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)进行qPCR(定量PCR)分析。关于得到的数据，通过在培养细胞时将Gapdh基因作为内源性标准基因，在肌肉组织样品时将Actb基因作为内源性标准基因的比较CT法(ΔΔCT法)分析，从而测定相对表达量。

引物使用日本宝生物株式会社的引物对Myog(MA127738)、Myh1(MA149010)、MyoD(MA128901)、Gapdh(MA050371)、Myh4(MA116815)、Myf5(MA075089)、Mef2c(MA107825)、Ckm(MA112761)、Actb(MA050368)、MEF2C(HA103691)、MYH4(HA155834)、GAPDH(HA067812)。各引物组名称后的()内的符号表示日本宝生物株式会社的产品编号。

另外，为了研究肌肉分化相关的miRNA中成熟miRNA的表达水平，使用TaqMan(注册商标)MicroRNA Assays(赛默飞世尔科技公司)和TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，按照附带的操作流程，进行cDNA合成。对于合成的cDNA，使用TaqMan FastAdvanced主混合液(赛默飞世尔科技公司)和TaqMan MicroRNA Assays(赛默飞世尔科技公司)以及StepOne Plus实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)，按照附带的操作流程，进行qPCR分析。通过使用内标基因的ΔΔCt法分析，将数据规范化，测定表达量。

用于TaqMan MicroRNA assay的肌肉分化相关的miRNA是赛默飞世尔科技公司的miR-1a-3p(2222)、miR-133a-3p(2246)、miR-214-3p(2306)、miR-26a-5p(405)、let-7g(2282)以及miR-199a-3p(2304)，此外，，内标基因中使用U6snRNA(1973)。miRNA名称后的()内的符号表示赛默飞世尔科技公司的产品编号。

7.蛋白质印迹分析

来自各细胞的细胞提取液使用含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini；罗氏公司)的RIPA裂解提取缓冲液(赛默飞世尔科技公司)进行制备。通过使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳法(SDS-PAGE)根据分子量将得到的细胞提取液中的蛋白质分离后，将凝胶中的蛋白质以电泳转录到PVDF膜(Millipore公司)。接着，使用含有5％脱脂牛奶(Wako公司)和0.1％Tween20(nacalai tesque公司)的TBS(20mM Tris，500mM NaCl，pH7.5)，将转录后的膜封闭。将封闭后的膜浸泡在用含有5％BSA(sigma公司)(或1％脱脂牛奶)和0.1％Tween20的TBS稀释的一抗液中，在4℃下振荡过夜。一抗使用抗-Suz12(#3737、稀释1000倍、CST公司)、抗-Lin28b(#5422、稀释1000倍、CST公司)、肌球蛋白重链抗体(MF20)(#MAB4470、稀释200倍、R&D systems公司)以及抗-α-微管蛋白(#F2168、稀释5000倍、Sigma公司)。将膜洗涤，然后使用通过含有1％脱脂牛奶和0.1％Tween20的TBS稀释到5000倍的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(或HRP标记的山羊抗兔IgG)(Sigma公司)，在室温进行30分钟的二抗反应。再次将膜洗涤，然后使用ECL引物蛋白印迹检测试剂(GE healthcare公司)进行发光反应，使用LAS500(GE healthcare公司)进行曝光和条带检测。

<实施例1：miR-199a-3p对小鼠成肌细胞的肌肉分化诱导>

(目的)

验证组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199a-3p对成肌细胞的肌肉分化诱导活性。

(方法和结果)

通过电穿孔向小鼠成肌细胞株C2C12细胞导入miR-199a-3p、miR-1、miR-133a、miR-26a、miR-214、miR-125a、miR-133b和Let-7e的各miRNA后，将细胞接种到肌肉分化用培养基(2％HS/DMEM)并在30℃培养3天，然后使用该细胞的总RNA，利用RT-qPCR验证肌肉分化标记蛋白质肌细胞生成素(Myog)和Myh1的表达量。

结果示于图1。A是Myog的表达量，B是Myh1的表达量。在这两种标记中，导入了miR-199a-3p的C2C12细胞与导入了其他miRNA的C2C12细胞相比，肌肉分化标记的表达量明显较高。该结果表明，miR-199a-3p对成肌细胞具有较高的分化诱导活性。

<实施例2：miR-199a-3p引起的肌肉分化相关miRNA的表达量>

(目的)

验证导入组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199a-3p之后的C2C12细胞中的肌肉分化相关miRNA的表达量。

(方法和结果)

将U6snRNA用于内标基因，通过ΔΔCt法分析，从而测定导入miR-199a-3p之后的C2C12细胞中miR-1、miR-133a、miR-26a、let-7g和miR-214的表达量。导入的miR-199a-3p使用MISSION miRNA mimic的miR-199a-3p(HMI0338)(简称“199s”)和miR-199a-3p#4(简称“199#4”)。

结果示于图2。如图2-1所示，199s和199#4的miR-1的表达量相对于对照(neg)中的表达量，均明显较高。此外，如图2-2所示，导入了199s的C2C12细胞与对照(neg)相比，miR-1、miR-133a的表达明显增加。该结果表明，miR-199a-3p在肌肉分化中，比miR-1更好地发挥功能。

<实施例3：miR-199a-3p对目标候选基因的表达抑制>

(目的)

根据miR-199a-3p的碱基序列，可以推测出miR-199a-3p的目标候选基因是Lin28b基因和Suz12基因。如图3-1所示，小鼠miR-199a-3p在Lin28b基因上具有两处候选目标位点(A：第81位～第102位，以及B：第983位～第1004位)；另外，在Suz12基因上还具有一处候选目标位点(C：第973位～第994位)。因此，验证在向C2C12细胞导入了miR-199a-3p时，在细胞内作为目标候选基因的Lin28b基因和Suz12基因的表达是否受到了抑制。

(方法和结果)

向C2C12细胞导入miR-199a-3p并进行培养后，按照常规方法制备细胞提取液。对该细胞提取液进行蛋白质印迹，使用分别针对Lin28b蛋白和Suz12蛋白的抗体，检测它们的表达量。

结果示于图3-2。确认到通过miR-199a-3p的导入(199s、199#4)，与对照(ng)相比，Lin28b和Suz12的蛋白量减少。该结果表明，miR-199a-3p的靶基因是Lin28b基因和Suz12基因。

<实施例4：miR-199a-3p的靶基因和肌肉分化相关基因的关系>

(目的)

验证miR-199a-3p的靶基因Lin28b和Suz12的表达抑制引起的肌肉分化相关基因的表达量。

(方法和结果)

Lin28b和Suz12的表达抑制使用针对Lin28b和Suz12的siRNA。此外，肌肉分化相关基因使用Myog、Myh1和Ckm。向C2C12细胞导入各siRNA后，接种到肌肉分化用培养基，在30℃培养3天后，使用从细胞中提取的总RNA，进行RT-qPCR。

结果示于图4。图4-1表示在针对Suz12的siRNA(siSuz12#1&siSuz12#2)存在下的Myh1和Myog的表达量，图4-2表示在针对Lin28b的siRNA(siLin28#3)存在下的Ckm和Myh1的表达量。

由图4-1可知，Myh1和Myog的表达量因siSuz12#1或siSuz12#2对Suz12的表达抑制而明显增加。此外，由图4-2可知，Ckm和Myh1的表达量因siLin28#3对Lin28b的表达抑制而明显增加。

以上结果表明：Lin28b和Suz12会抑制性地控制肌肉分化；以及通过抑制Lin28b和Suz12的表达，可以解除该抑制。也就是说，结果表明了miR-199a-3p通过作为靶基因的Lin28b和Suz12的表达抑制，可以诱导肌肉分化。

<实施例5：向小鼠初代成肌细胞导入miR-199a-3p所引起的肌肉分化诱导>

(目的)

验证在向来自小鼠趾长伸肌的初代培养细胞导入miR-199a-3p的情况下，是否也会得到与小鼠成肌细胞株C2C12细胞相同的效果。

(方法和结果)

从2只小鼠制备初代培养细胞，将其三等分为ng用、199s用和199#4用，作为第一次培养组，将其独立进行4次(c5～c8)。导入作为miR-199a-3p的199s或199#4后，在增殖培养基中培养2天，然后进行分化诱导。在分化诱导1天后，从细胞中回收RNA，利用RT-qPCR测定miR-1的表达量，以及肌肉分化标记Ckm、Myog、Mef2c和Myh4的表达量。

结果示于图5。图5-1的A表示利用RT-qPCR测定导入了miR-199a-3p(199s和199#4)的初代培养细胞各组中miR-1的表达量时的结果。由于初代培养细胞非常不稳定，因此即使在同一实验中，制备的各培养组的表达水平也不相同，但在所有培养组中确认到相同的表达模式。此外，图5-1的B用Ckm、Myog、Mef2c和Myh4的各组中的表达量的平均值表示。并且，图5-2的C表示利用RT-qPCR测定在siLin28b存在下的Ckm的表达量时的结果。

<实施例6：miR-199a-3p引起的体内的肌肉分化诱导>

(目的)

验证向造成肌肉损伤的小鼠导入组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199a-3p时的肌肉分化诱导。

(方法和结果)

通过对8周龄的C57/BL6J小鼠的胫骨前肌(TA muscle)给予BaCl₂，从而造成肌肉损伤。24小时后，对同一部位给予miR-199a-3p。48小时后，取出胫骨前肌，使用其总RNA进行RT-qPCR分析，由此研究肌肉分化标记Myog、Myod1和Myf5的表达。

结果示于图6。A表示本实施例的实验日程。B表示各肌肉分化标记的表达量。与对照(NC)相比，导入miR-199a-3p使得Myog的表达明显上升(n＝8)。该结果表明，miR-199a-3p在体内也具有肌肉分化诱导活性。Myf5和Myod1的表达未确认到明显差异，认为这是Myog的表达时期和Myf5、Myod1的表达时期不同造成的。一般已知在肌肉分化过程中，Myf5和Myod1的表达在处于休眠状态的肌卫星细胞因刺激而成为活化肌卫星细胞后被激活；而Myog的表达则是在从成肌细胞进入肌管细胞的分化阶段之后被激活。据推测，本实施方式中，由于是在Myog的表达时期进行实验，因此Myf5、Myod1的表达未被充分激活，从而没有确认到明显差异。但是，由图6B可知，导入了miR-199a-3p的细胞中，Myf5、Myod1的表达量趋于增加。

<实施例7：miR-199a-3p引起的体内的肌肉再生促进活性>

(目的)

验证miR-199a-3p对老龄小鼠也具有肌肉再生促进活性。

(方法和结果)

通过对8周龄的C57/BL6J小鼠和2年龄的ICR小鼠的胫骨前肌(TAmuscle)给予BaCl₂，从而造成肌肉损伤。24小时后，对同一部位给予miR-199a-3p。9天后，制作胫骨前肌的冷冻切片，通过HE染色来测定处于再生过程的肌纤维横截面积。处于再生过程的肌纤维在中央处有核，计数时以核为标记。每个个体测定的肌纤维数在8周龄为小于700根纤维，在2年龄小鼠为小于100根纤维。

结果示于图7。图7-1中，A表示本实施例的实验日程。B和C表示8周龄的C57/BL6J小鼠的结果，图7-2中的D和E表示2年龄的ICR小鼠的结果。

B和D表示处于再生过程的胫骨前肌的肌纤维横截面积的平均值(n＝3)。此外，C和E表示单位肌纤维横截面积的肌纤维数(n＝3)。通过在肌肉损伤后给予miR-199a-3p，8周龄小鼠和2年龄小鼠的肌纤维横截面积均明显扩大，表明肌肉再生得到了促进。此外，2年龄的老龄小鼠中也进行了与8周龄小鼠同等程度的肌肉再生，因此表明组成本发明的肌肉分化诱导剂的miR-199a-3p对老龄个体也有效。

<实施例8：向人肌卫星细胞导入miR-199a-3p所引起的肌肉分化诱导>

(目的)

验证在向人肌卫星细胞(Human Skeletal Muscle Satellite Cells)导入miR-199a-3p的情况下，也会得到与小鼠成肌细胞株相同的效果。

(方法和结果)

导入miR-199a-3p并在增殖培养基中培养3天后，从细胞中回收RNA，利用RT-qPCR研究肌肉分化标记MEF2C和MYH4的表达。

结果示于图8。经过证实，将miR-199a-3p导入到人肌卫星细胞的情况与小鼠成肌细胞株和初代成肌细胞相同，miR-199a-3p(199s和199#4)能够诱导肌肉分化。

<实施例9：给予miR-199a-3p所引起的mdx小鼠的肌力改善>

(目的)

通过握力测试，验证给予了miR-199a-3p的肌肉营养不良症模型小鼠(mdx小鼠)的肌力改善。

(方法和结果)

使用AteloGene(注册商标)系统使用(高研社)试剂盒，将199#4作为miR-199a-3p，将siControl作为对照用，分别以每只1.6μg/Kg B.W.的给药量，对7周龄的雄性mdx小鼠和同胞雄性正常小鼠(B10)的尾静脉给予199#4和siControl。

导入1周后，使用小动物握力测定装置(MELQUEST公司：GPM-100B)，通过握力测试来测定小鼠的握力。具体而言，让小鼠的前足抓住测定棒后，拉动尾巴使小鼠处在水平方向，从而得到小鼠的前足即将离开测定棒之前的数值作为握力值。测试中所使用的各试验组的数量为：对正常小鼠B10给予siControl的组(B10-siC)11只；对正常小鼠B10给予199#4的组(B10-199#4)11只；对mdx小鼠给予siControl的组(mdx-siC)9只；对mdx小鼠给予199#4的组(mdx-199#4)10只。

结果示于图9。该图表示将正常小鼠组(B10-siC和B10-199#4)的测定值设为1时的mdx小鼠组(mdx-siC和mdx-199#4)的各相对值。使用呈现类似肌肉营养不良症的症状的mdx小鼠的mdx-siC组和mdx-199#4组，与正常小鼠的B10组相比，基础握力只有6～7成左右。但是，对相同的mdx小鼠给予199#4的mdx-199#4组，与对照用的mdx-siC组相比，握力明显提高。该结果证实了给予miR-199a-3p会使肌力增强，此外，还表明miR-199a-3p可以作为肌肉营养不良症的治疗剂的有效成分。

<实施例10：给予miR-199a-3p后的mdx小鼠的肌肉特异性miRNA在血液中的水平的验证>

(目的)

已知肌肉营养不良症患者和mdx小鼠，与健康人和正常小鼠相比，肌肉特异性的三种miRNA(miR-1、miR-133a、miR-206)的量在血清中在统计学上明显增加(Matsuzaka Y,etal.,PLoS One.2016Dec 15；11(12):e0167811.)。因此，要在给予miR-199a-3p使肌力恢复的mdx小鼠的血液中，对它们的miRNA的改善进行验证。

(方法和结果)

在测定完肌力后，使用抗凝剂EDTA，对实施例9中给予了miR-199a-3p的各小鼠进行心脏采血，再通过常规方法从采集的全血中得到血浆。接着，使用血浆/血清循环和体外RNA纯化微型试剂盒(NORGEN公司)，按照附带的操作流程，从各小鼠的200μL血浆中提取RNA。此外，在提取RNA时，加入cel-miR-39作为外标基因。

使用针对肌肉特异性的两种miRNA(miR-1和miR-133a)的TaqManassay(赛默飞世尔科技公司)和FastStart通用探针主控器(Rox)(罗氏公司)，进行RT-qPCR。接着，在内标基因中使用cel-miR-39和B10-siC，利用ΔΔCt法分析来分析数据后，利用Welch’s t检验进行统计监测。

结果示于图10。血浆中的miR-1(A)和miR-133a(B)的量，在正常小鼠组(B10-siC和B10-199#4)中为低值，而在导入了对照用siControl的mdx小鼠组(mdx-siC)中，则以与常规血清中所发现的相同的方式表现出较高值。但是，导入199#4作为miR-199a-3p的mdx小鼠组(mdx-199#4)中，与mdx-siC相比，miR-1和miR-133a在血浆中的量在统计学上均明显下降。这个结果在生物化学上支持了miR-199a-3p会使mdx小鼠的肌力恢复的观点，表明miR-199a-3p在肌肉营养不良症患者的肌力恢复和血液中的肌肉特异性的miRNA量的抑制也有效果。

<实施例11：给予miR-199a-3p后的mdx小鼠的血液中CK活性的验证>

(目的)

肌肉营养不良症患者的骨骼肌的肌纤维发生变性或坏死，会使肌细胞中含有的肌酸激酶泄漏到血液中。因此，已知肌肉营养不良症患者与健康人相比，血液中肌酸激酶活性(CK活性)的值在统计学上明显较高(AllenD.G.,et al.,2016,Physiol Rev.Jan；96(1):253-305)。于是，对mdx小鼠给予miR-199a-3p的情况下，对其血液中的CK活性进行验证。

(方法和结果)

使用在实施例10中采集的血浆，利用肌酸激酶活性测定试剂盒(比色)(Abcam公司)，按照附带的操作流程来测定血浆CK活性。所使用的测定装置为SYNERGY H1微孔板读数仪(BioTek公司)，分析软件则使用Gen52.07，分析数据之后，利用Welch’s t检验进行统计检测。

结果示于图11。血浆中的CK活性，在正常小鼠组(B10-siC和B10-199#4)中为低值，而在导入了对照用siControl的mdx小鼠组(mdx-siC)中，则表现出较高值。这表明，在mdx-siC中，也与肌肉营养不良症患者相同，骨骼肌损伤导致肌细胞中的肌酸激酶泄漏到血液中。另一方面，给予199#4作为miR-199a-3p的mdx小鼠组(mdx-199#4)中，与mdx-siC相比，血浆中的CK活性在统计学上均明显下降。该结果表明，miR-199a-3p在肌肉营养不良症患者的血液中的CK活性的抑制也有效果。此外，同时也表明miR-199a-3p可以作为抑制肌肉营养不良症患者的肌细胞变性和坏死的有效成分。

本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请均通过直接引用而并入本说明书。

序列表

<110> 国立研究开发法人国立精神·神经医疗研究中心

<120> 肌肉分化诱导剂

<130> PH-7138-PCT

<150> JP 2016-201786

<151> 2016-10-13

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<220>

<223> WT hsa-miR-199a-3p

<400> 1

acaguagucu gcacauuggu ua 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<220>

<223> WT hsa-miR-199a-5p

<400> 2

cccaguguuc agacuaccug uuc 23

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 绵羊(Ovis aries)

<220>

<223> WT oar-miR-199a-3p

<400> 3

acaguagucu gcacauuggu u 21

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 原鸡(Gallus gallus)

<220>

<223> WT gga-miR-199a-3p

<400> 4

uacaguaguc ugcacauugg 20

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 热带爪蟾(Xenopus tropicalis)

<220>

<223> WT xtr-miR-199a-3p

<400> 5

uacaguaguc ugcacauugg uu 22

<210> 6

<211> 18

<212> RNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 6

caguagucug cacauugg 18

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 7

gtacttgggc agtagtgtag agattggttt gcctgttaat gaattcaaac taatctctac 60

actgctgccc aagagc 76

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miRNA

<400> 8

acaguagucu gcacauuggu ua 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miRNA

<400> 9

accaaugugc agacuacuca uu 22

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 10

uucuccgaac gugucacguu u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 11

acgugacacg uucggagaau u 21

<210> 12

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 12

acucguccag gaagaagaga auuu 24

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 13

uaaauucucu ucuuccugga cgagu 25

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 14

gagaauuuaa uggaaugauu uu 22

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 15

aaucauucca uuaaauucuc uu 22

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 16

ggauucaucu ccaugauaau u 21

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 17

uuaucaugga gaugaauccu u 21

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 18

aggauuuaga agcuugaaau u 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 19

uuucaagcuu cuaaauccuu u 21

<210> 20

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 20

guggaauuua cauuuaaaau u 21

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 21

uuuuaaaugu aaauuccacu u 21

<210> 22

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 22

gagccagugg aauuuacauu u 21

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 23

auguaaauuc cacuggcucu u 21

Claims (9)

1.一种肌肉分化诱导剂，其由miR-199或DNA组成，所述DNA包含编码miR-199的miR-199基因。

2.根据权利要求1所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199为miR-199-3p。

3.根据权利要求1或2所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199为miR-199a。

4.根据权利要求3所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199由以下(a)～(c)所示的碱基序列组成：

(a)SEQ ID NO:1所示的碱基序列；

(b)在SEQ ID NO:1所示的碱基序列中缺失、替换或增添1～3个碱基而形成的碱基序列；

(c)相对于SEQ ID NO:1所示的碱基序列具有85％以上的碱基同一性的碱基序列。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的肌肉分化诱导剂，其中，所述miR-199基因以能够表达的状态包含在表达载体中。

6.一种伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的障碍或疾病的治疗或预防用组合物，其含有的有效成分为权利要求1～5中任一项所述的肌肉分化诱导剂。

7.根据权利要求6所述的治疗或预防用组合物，其中，所述伴有肌肉萎缩或肌肉损伤的疾病为肌源性疾病。

8.根据权利要求7所述的治疗或预防用组合物，其中，所述肌源性疾病为肌肉营养不良症。

9.一种肌肉再生促进用组合物，其含有的有效成分为权利要求1～5中任一项所述的肌肉分化诱导剂。