CN110157712A - 一种增加鱼类繁殖力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于转基因技术领域，公开了一种增加鱼类繁殖力的方法，包括以下步骤：(1)鱼类leptin基因的克隆及其转基因载体构建；(2)在显微注射前，进行所述转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；(3)体外合成Tol2转座酶mRNA；(4)对斑马鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；(5)将显微注射后的斑马鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。本发明以达到增加斑马鱼繁殖力的目的。
Description
技术领域
本发明属于转基因技术领域，尤其涉及一种增加鱼类繁殖力的方法。
背景技术
我国是水产养殖大国，长期以来，我国养殖产量占世界总产量的三分之二，目前我国正在朝水产养殖强国快速迈进。我国水产养殖种类繁多，包括鱼、虾、贝、藻在内的养殖种类多达200多种，目前，我国的水产业良种开发主要以选育、杂交、染色体工程等传统育种技术为主，新品种开发速度缓慢，目前我国水产良种覆盖率仅为20％左右。以鱼类为主的水产种类繁殖力强和体外受精、体外孵化等生理特点都十分有利于转基因操作，使鱼类成为非常合适的转基因动物实验材料和遗传改良对象，转基因技术为我国众多水产对象的快速育种带来机遇，是提高我国水产良种覆盖率的重要出路。我国上世纪八十年代即开发出快速生长的转基因鲤和转基因大马哈鱼，转基因鱼研制的理论方法和取得的成果均具有世界领先水平。
作为另一种鱼类——斑马鱼，斑马鱼和人类基因有着87％的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，这意味着其实验结果大多数情况下适用于人体，并且常可用于水质环境的监测。斑马鱼也是比较好养的一种鱼，但目前却未提出如何增加斑马鱼繁殖力的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种增加鱼类繁殖力的方法，以达到增加斑马鱼繁殖力的目的。
本发明的基础方案：一种增加鱼类繁殖力的方法，包括以下步骤：
(1)鱼类leptin基因的克隆及其转基因载体构建，具体方法如下：
S100，参考来自美国国立生物技术信息中心NCBI的斑马鱼mRNA序列，克隆斑马鱼leptin基因，设计一对引入酶切位点的特异引物：
leptin-HindIII-F：5’-CTCAAGCTTATGCGTTTTCCAGCTCTCCG 3’；
leptin-BamHI-R：5’CGAGGATCCTCAGCAGATTTTCAGCTGGTC-3’；
S110，以性成熟斑马雌鱼性腺组织cDNA为模板，利用所述特异引物进行PCR反应，得到PCR产物；
S120，所述PCR产物经Hind III和BamH I消化后克隆到pSKDTol2载体，得到主要元件为Tol2-CMV-leptin-polyA-Tol2的转基因载体；
(2)在显微注射前，进行所述转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(3)体外合成Tol2转座酶mRNA，具体方法如下：
S300，首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
S310，其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
S320，最后，纯化；
(4)对斑马鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(5)将显微注射后的斑马鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
进一步，所述步骤(2)中，具体方法如下：
S200，首先，进行所述去毒性处理，其包括用脱内毒素试剂盒提取转基因所用载体质粒；
S210，然后进行所述防串联处理，其包括转基因载体的线性化处理，再对线性化处理后的载体进行去磷酸化处理。
进一步，所述S300中，所述体外转录的反应体系如下：
线性化的质粒载体>0.5ug；
2xNTP/CAP 10ul；
10x Buffer 2ul；
SP6转录酶MIX 2ul；
RNase-free Water 补足20ul；
反应条件：37℃，水浴2h。
进一步，所述S310中，具体步骤依次如下：
a)加入1ul DNA酶，混匀，在37℃的温度下孵育15min；
b)加入205ul RNase-free Water，混匀；
c)加入25ul醋酸铵溶液，混匀，终止反应。
进一步，所述S320中，采用酚-氯仿纯化，具体步骤依次如下：
a)加入250ul酚-氯仿等比例混合液，剧烈震荡15s，室温放置2min；
b)在4℃的温度下，进行12000g离心15min；
c)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul氯仿，混匀；然后在4℃的温度下，进行12000g离心10min；
d)取上层液相移到新的1.5ml EP管，再次离心；
e)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul预冷的异丙醇溶液，颠倒混匀；然后在-20℃的温度下放置1h；
f)在4℃的温度下，进行12000g离心30min；
g)弃上清，自然晾干，看不到白色的RNA即可；
h)加入20ul RNase-free Water溶解沉淀；取0.5ul稀释，分光光度计测浓度和纯度，并电泳检测；剩下的mRNA分装后保存在-80℃备用。
进一步，所述S320中，用试剂盒自带的LiCl进行纯化，具体步骤参考所述试剂盒自带的说明书。
进一步，所述步骤(4)中，显微注射的所述转基因载体处理后的质粒DNA的浓度为50ng/μl，显微注射的所述Tol2转座酶mRNA的浓度为100ng/μl，且每颗斑马鱼胚胎注射的量约2nl。
本发明的有益效果：本发明首先以性成熟斑马雌鱼性腺组织cDNA为模板，设计了一对引入酶切位点的特异引物，进行PCR反应。然后利用pSKDTol2载体，构建Tol2-CMV-leptin-polyA-Tol2的转基因载体。
并且，本发明在对斑马鱼胚胎进行显微注射前，还对构建的转基因载体采用脱内毒素试剂盒提取转基因所用载体质粒、线性化处理和去磷酸化处理，最终实现以减少质粒对斑马鱼的毒性，以及防止载体的串联。斑马鱼胚胎的显微注射物质还包括有体外合成Tol2转座酶mRNA，使得获得转基因斑马鱼的效率较高。
本发明通过实验对照，对本发明得到的斑马鱼进行Leptin基因的表达检测，结果显示，转基因鱼脑和肠中leptin表达量分别约为对照鱼的2.2倍和1.8倍。对本发明得到的斑马鱼进行转leptin基因雌鱼生殖力检测，结果显示，过表达leptin基因的雌鱼卵巢中卵的排列比较致密，因此，相同体积的卵巢含有较多的卵子，即本发明能够实现增加斑马鱼的繁殖力。
附图说明
图1是本发明提供的脑和肠组织中leptin基因相比对照组的表达水平；
图2是本发明提供的转基因leptin斑马鱼生殖力检测。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述：
一种增加鱼类繁殖力的方法，包括以下步骤：
(1)鱼类leptin基因的克隆及其转基因载体构建：
S100，参考来自美国国立生物技术信息中心NCBI的斑马鱼mRNA序列(NM_001128576.1)，克隆斑马鱼leptin基因，设计一对引入酶切位点的特异引物：
leptin-HindIII-F：5’-CTCAAGCTTATGCGTTTTCCAGCTCTCCG 3’；
leptin-BamHI-R：5’CGAGGATCCTCAGCAGATTTTCAGCTGGTC-3’。
S110，以性成熟斑马雌鱼性腺组织cDNA为模板，利用特异引物进行PCR反应，得到PCR产物。
S120，PCR产物经Hind III和BamH I消化后克隆到pSKDTol2载体，得到主要元件为Tol2-CMV-leptin-polyA-Tol2的转基因载体。
(2)在显微注射前，进行转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理，具体方法如下：
S200，首先，进行去毒性处理，其包括用脱内毒素试剂盒提取转基因所用载体质粒。提取的质粒进行后续的显微注射后，能够减少对斑马鱼的毒性。
S210，然后进行防串联处理，其包括转基因载体的线性化处理，再对线性化处理后的载体进行去磷酸化处理。通过线性化处理和去磷酸化处理能够防止转基因载体的串联。
(3)体外合成Tol2转座酶mRNA，具体方法如下：
S300，首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录(Ambion)，其反应体系如下：
线性化的质粒载体>0.5ug；
2xNTP/CAP 10ul；
10x Buffer 2ul；
SP6转录酶MIX 2ul；
RNase-free Water 补足20ul；
反应条件：37℃，水浴2h。
S310，其次，进行DNA模板的去除及反应终止，具体步骤依次如下：
a)加入1ul DNA酶，混匀，在37℃的温度下孵育15min；
b)加入205ul RNase-free Water，混匀；
c)加入25ul醋酸铵溶液，混匀，终止反应。
S320，最后，纯化：
采用酚-氯仿纯化，具体步骤依次如下：
a)加入250ul酚-氯仿等比例混合液，剧烈震荡15s，室温放置2min；
b)在4℃的温度下，进行12000g离心15min；
c)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul氯仿，混匀；然后在4℃的温度下，进行12000g离心10min；
d)取上层液相移到新的1.5ml EP管，再次离心；
e)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul预冷的异丙醇溶液，颠倒混匀；然后在-20℃的温度下放置1h；
f)在4℃的温度下，进行12000g离心30min；
g)弃上清，自然晾干，看不到白色的RNA即可；
h)加入20ul RNase-free Water溶解沉淀；取0.5ul稀释，分光光度计测浓度和纯度，并电泳检测；剩下的mRNA分装后保存在-80℃备用。
在另一实施例中，采用试剂盒自带的LiCl进行纯化，具体步骤参考试剂盒自带的说明书。
(4)对斑马鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA。
显微注射的所述转基因载体处理后的质粒DNA的浓度为50ng/μl，显微注射的所述Tol2转座酶mRNA的浓度为100ng/μl，且每颗斑马鱼胚胎注射的量约2nl。
(5)将显微注射后的斑马鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
获得斑马鱼纯合F2代即增加了繁殖力，其leptin基因的表达检测的方法如下：
1)、利用Trizol法提取F2代的肠和脑组织中的总RNA，反转录后获得cDNA，作为荧光定量PCR的模板。
2)、荧光定量的引物为：
leptin-F：AGCTCTCCGCTCAACCTGTA；
leptin-R：CAGCGGGAATCTCTGGATAA；
内参基因为：
β-actin；
引物序列为：
β-actin-F：GGTACCCATCTCCTGCTCCAA；
β-actin-R：GAGCGTGGCTACTCCTTCACC。
3)、反应体系及反应条件如下：
2xSYBR Green Supermix 10ul；
正向引物(10mM) 0.4ul；
反向引物(10mM) 0.4ul；
cDNA 1ul；
dd H2O 8.2ul；
反应条件：95℃，3min；94℃，15s；60℃，15s；72℃，45s；40个循环。
基于上述方法，如图1所示，结果显示，转基因鱼脑和肠中leptin表达量分别约为对照鱼的2.2倍和1.8倍。
获得斑马鱼纯合F 2代，进行转leptin基因雌鱼生殖力检测：
1)性腺指数的测定
性腺指数的测定公式：性腺重/总体重x100。如图2所示的A处，结果显示，过表达leptin基因个体的性腺指数显著高于对照鱼。
2)相对怀卵量测定
相对怀卵量的测定参考“Qin,C.,Xu,L.,Yang,Y.,et al.2014.Comparison offecundity and offspring immunity in zebrafish fed Lactobacillus rhamnosusCICC6141and Lactobacillus casei BL23.Reproduction,147(1):53-64.”。如图2所示的B处，结果显示，过表达leptin基因个体的相对怀卵量显著高于对照鱼。
3)性腺组织形态观察
通过性腺组织冰冻切片后进行HE染色进行性腺组织的形态观察，如图2所示的C处和D处，过表达leptin基因的雌鱼卵巢中卵的排列比较致密，因此，相同体积的卵巢含有较多的卵子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鱼类leptin基因的克隆及其转基因载体构建，具体方法如下：
S100，参考来自美国国立生物技术信息中心NCBI的斑马鱼mRNA序列，克隆斑马鱼leptin基因，设计一对引入酶切位点的特异引物：
leptin-HindIII-F：5’-CTCAAGCTTATGCGTTTTCCAGCTCTCCG3’；
leptin-BamHI-R：5’CGAGGATCCTCAGCAGATTTTCAGCTGGTC-3’；
S110，以性成熟斑马雌鱼性腺组织cDNA为模板，利用所述特异引物进行PCR反应，得到PCR产物；
S120，所述PCR产物经Hind III和BamH I消化后克隆到pSKDTol2载体，得到主要元件为Tol2-CMV-leptin-polyA-Tol2的转基因载体；
(2)在显微注射前，进行所述转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(3)体外合成Tol2转座酶mRNA，具体方法如下：
S300，首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
S310，其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
S320，最后，纯化；
(4)对斑马鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(5)将显微注射后的斑马鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
2.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，具体方法如下：
S200，首先，进行所述去毒性处理，其包括用脱内毒素试剂盒提取转基因所用载体质粒；
S210，然后进行所述防串联处理，其包括转基因载体的线性化处理，再对线性化处理后的载体进行去磷酸化处理。
3.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述S300中，所述体外转录的反应体系如下：
线性化的质粒载体>0.5ug；
2xNTP/CAP 10ul；
10x Buffer 2ul；
SP6转录酶MIX 2ul；
RNase-free Water补足20ul；
反应条件：37℃，水浴2h。
4.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述S310中，具体步骤依次如下：
a)加入1ul DNA酶，混匀，在37℃的温度下孵育15min；
b)加入205ul RNase-free Water，混匀；
c)加入25ul醋酸铵溶液，混匀，终止反应。
5.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述S320中，采用酚-氯仿纯化，具体步骤依次如下：
a)加入250ul酚-氯仿等比例混合液，剧烈震荡15s，室温放置2min；
b)在4℃的温度下，进行12000g离心15min；
c)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul氯仿，混匀；然后在4℃的温度下，进行12000g离心10min；
d)取上层液相移到新的1.5ml EP管，再次离心；
e)取上层液相移到新的1.5ml EP管，加入250ul预冷的异丙醇溶液，颠倒混匀；然后在-20℃的温度下放置1h；
f)在4℃的温度下，进行12000g离心30min；
g)弃上清，自然晾干，看不到白色的RNA即可；
h)加入20ul RNase-free Water溶解沉淀；取0.5ul稀释，分光光度计测浓度和纯度，并电泳检测；剩下的mRNA分装后保存在-80℃备用。
6.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述S320中，用试剂盒自带的LiCl进行纯化，具体步骤参考所述试剂盒自带的说明书。
7.根据权利要求1所述的增加鱼类繁殖力的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，显微注射的所述转基因载体处理后的质粒DNA的浓度为50ng/μl，显微注射的所述Tol2转座酶mRNA的浓度为100ng/μl，且每颗斑马鱼胚胎注射的量约2nl。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111218478A (zh) * | 2020-02-12 | 2020-06-02 | 湖南文理学院 | 一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014147378A (ja) * | 2013-02-04 | 2014-08-21 | Fisheries Research Agency | 飼料効率の高い魚類の養殖方法 |
| CN104450763A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-03-25 | 中山大学 | 斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白表达纯化的方法及其应用 |
| CN107058386A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-08-18 | 厦门大学 | 一种转基因斑马鱼的制备方法 |
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2019
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