CN113122545B

CN113122545B - 舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用

Info

Publication number: CN113122545B
Application number: CN202110393768.XA
Authority: CN
Inventors: 曹传旺; 孙丽丽; 闫丽琼; 李雪; 王建国
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN113122545A

Abstract

本发明公开一种舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用。所述的气味受体OR2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。所述的气味受体OR2dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述的气味受体OR2dsRNA沉默舞毒蛾蛹，在成虫期则表现为对丁香酚和顺‑3‑己烯‑1‑醇趋向性减弱。本发明提出可利用舞毒蛾OR2的沉默技术来影响舞毒蛾成虫对次生物质的行为具有趋避作用，继而可基于丁香酚类和顺‑3‑己烯‑1‑醇类物质开发趋避剂，最终达到防治林木害虫舞毒蛾的作用。

Description

舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用。

背景技术

舞毒蛾是一种世界性森林害虫，可取食500多种植物，对森林造成了严重危害。目前对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等化学杀虫剂为主，但这些化合物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在受气候环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点，且该技术已经在农林害虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的生存能力；基于RNAi技术具有对人畜安全，对防治靶标对象专一，对非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。

在昆虫对外界气味识别的过程中，气味受体(ORs)对气味分子的专一性识别，使其成为嗅觉系统的关键，但是，舞毒蛾气味受体基因及功能未见相关报道。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用，本发明鉴定出的舞毒蛾气味受体OR2基因，能够影响舞毒蛾成虫期行为功能，气味受体OR2 dsRNA在蛹期沉默舞毒蛾OR2，羽化的舞毒蛾成虫对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇的敏感性均表现为降低。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种舞毒蛾气味受体OR2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明的另一目的是提供一种舞毒蛾气味受体OR2基因dsRNA，核苷酸序列如SEQID No.3所示。

本发明的第三目的是提供一种气味受体OR2基因及对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋向性的应用。

该应用的特点是，所述舞毒蛾气味受体OR2基因dsRNA显微注射舞毒蛾蛹期，在成虫期表现为对挥发性物质丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋向性减弱。

该应用的特点是，所述舞毒蛾为亚洲型舞毒蛾。

该应用的特点是，所述气味受体OR2基因的注射剂量为1μg。

该应用的特点是，一种用于调控舞毒蛾对丁香酚或/和顺-3-己烯-1-醇趋向性，其活性成分为如上述的dsRNA。

上述dsRNA在舞毒蛾防治中的应用，主要表现为成虫期沉默舞毒蛾OR2则表现为对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋向性明显减弱。

本发明的优点及有益效果在于：本发明鉴定得到的OR2基因序列，并且根据该序列得到的OR2基因的dsRNA，可以应用于舞毒蛾OR2沉默技术，来影响舞毒蛾成虫对次生物质丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋避行为，可基于丁香酚和顺-3-己烯-1-醇开发趋避剂，通过实验证明，该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后，明显导致舞毒蛾雌雄虫对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋向性均减弱，继而驱赶舞毒蛾成虫，避免其在寄主植物叶背面或者枝干部位产卵，继而避免舞毒蛾幼虫危害寄主植物，因此在研发新型杀虫剂方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为舞毒蛾气味受体OR2基因电泳图；

图2为注射dsRNA舞毒蛾成虫OR2基因表达水平图；

图3为注射dsRNA舞毒蛾成虫对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇行为学反应图；注：A图为雌成虫对丁香酚行为学反应；B图为雄成虫对丁香酚行为学反应；C图为雌成虫对顺-3-己烯-1-醇行为学反应；D图为雄成虫对顺-3-己烯-1-醇行为学反应。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：舞毒蛾气味受体OR2基因全长克隆

如图1所示，舞毒蛾OR2基因开放阅读框(ORF)长为1203bp，其序列如SEQ ID No.1，编码400个氨基酸，其序列如SEQ ID No.2，ProtParam在线程序预测编码蛋白分子量为45.76kDa，理论等电点(PI)为8.22，为一碱性蛋白。

提取舞毒蛾总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA第一条链，再以cDNA第一链为模板，根据舞毒蛾幼虫转录组序列在基因编码区序列的两侧设计引物(正向引物：5’-ATGAAAAACTACCATATCTTAAAAGCT-3’；反向引物：5’-TTATTTTGTGCATAAAACAAAGCGAATACG-3’)。

反应体系：5×PrimeScript buffer 2μL、PrimeScript ^RT Enzyme Mix I0.5μL、Oligo d(T)primer(50μM)0.5μL、Random 6mers(100μM)0.5μL、Total RNA 0.5μg RNaseFree ddH₂O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收1203bp的条带，其电泳图如图1所示。将回收得到的条带与pMD18-T载体连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞。通过菌液PCR检测的阳性克隆菌液，送至北京华大生物技术有限公司测序以验证读码框。

实施例2：舞毒蛾气味受体OR2基因dsRNA的合成

根据实施例1中所克隆的舞毒蛾OR2基因cDNA全长，设计合成OR2基因dsRNA正向引物(5’-AGGCGATGATCGAAACTTGC-3’)和反向引物(5’-CGGACACAATCATAGTCACCA-3’)，扩增得到片段长度为534bp的序列，通过体外dsRNA合成试剂盒获得OR2基因的dsRNA，其序列如SEQID No.3。

具体地合成过程是，在每条特异性引物的5’端加有一段20bp左右的T7启动子序列，用外源Red基因作为对照组(见表1)。通过PCR法扩增目的条带，反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min，扩增产物经电泳检测确认后作为模板合成dsRNA(参照MEGAscript RNAi Kit试剂盒说明书)，于紫外分光光度计检测dsRNA浓度，并取0.5μL dsRNA于1％琼脂糖凝胶电泳检测确认，-80℃保存备用。

表1本研究所用的引物

实施例3:注射OR2基因dsRNA舞毒蛾成虫沉默效率检测

将实施例2合成的OR2和Red基因的dsRNA(1μg)，微注射入舞毒蛾蛹期，分别取注射dsRed和dsOR2的舞毒蛾羽化成虫，采用RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA，采用PrimeScript^TM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一条链，以此为模板，运用荧光定量RT-PCR检测注射后OR2基因的表达量。利用RT-qPCR技术检测注射dsRed和dsOR2组的舞毒蛾OR2基因的转录水平。根据图2结果显示：注射dsOR2的处理组雌、雄成虫相对表达量比对照组dsRed分别下降了58％和67％，沉默效率均为差异极显著(P<0.01)。由上述结果可知注射dsOR2能够显著降低OR2基因的mRNA的转录水平，因此舞毒蛾OR2基因得到了有效的沉默。

克隆以上实施例中所述的舞毒蛾气味受体OR2的方法是本领域中所常采用的方法。以上实施例中所述的提取舞毒蛾幼虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定量RT-PCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒Qiagen、PrimeScript^TM RT、MEGAscriptRNAi Kit、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo)等都可以从生产商家购买。

实施例4:注射OR2基因dsRNA舞毒蛾成虫对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇敏感性

注射dsOR2后，舞毒蛾OR2基因在雌、雄成虫的表达水平均显著降低。行为学试验表明，注射dsOR2的舞毒蛾雌虫与对照组相比对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇的趋向性明显减弱；注射dsOR2的舞毒蛾雄虫，与对照组相比对丁香酚和顺-3-己烯-1-醇趋向性减弱(图3)；表明舞毒蛾OR2沉默影响舞毒蛾对于挥发物的选择判断，对挥发物的敏感性受到影响，说明舞毒蛾OR2基因参与丁香酚和顺-3-己烯-1-醇气味分子感知，改变舞毒蛾对气味分子的趋向行为，说明是识别丁香酚和顺-3-己烯-1-醇的趋向性气味分子的关键基因。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 舞毒蛾气味受体OR2基因及dsRNA和防治舞毒蛾中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaaact accatatctt aaaagcttac tgtaaaggaa ttttccttat cggcaatgga 60

aatttttggt atgaagataa tgaattaggc gatgatcgaa acttgctgta taaagcatgt 120

ggtggtcttt tattttttat gtacggtttt atgacagtaa tggaaattat ggcagccgta 180

atggcggact ttcccgagga cgaaaaacgt gactcagtga gtttcgccgt cagtcacagc 240

atagttatga taaaaatatt ctcgattatt acgaacaaat cgttaataaa aagcctgaat 300

cgtaaaatgg taaatgtttg ccagaattac gaagaacaac cgttgatggc ggaaaaatac 360

aagatcatga aaataaatgt cgtcgcttat tgtgcgaccg tttacggttc atgcgcgtgt 420

tttgtttttg aaggcctacg aaaggtgtac gcaggatcac atttcgtaac tgtagtaact 480

tattatccat catttgaaga cgattctacg ttggctatgt ttgtcagaat ttttaacact 540

ttcgttttgt ttataatgat ggtgactatg attgtgtccg ttgattcttt tacaatggtt 600

tacattataa tgtataagta caaatttata actcttagac attattttga gcatttaaaa 660

gatgagataa agatgttata tgatgagggt aaaacaaact tagcagcaga aaagttgacg 720

aacggattga tagaaggaat tgagatgcac agcagtattt taaaattgtc aaaagagata 780

gataaagcct tcggaacagt gatagcgctt caactttgcc aaagctctgg atctgccgta 840

tctatactac ttcaaattgc cttatctgat gatctgaaat ttgtcgcagc aggaaaactt 900

atattttttg tagtggcatt atttttttta ctaggtctat ttttatgcaa tgctggagaa 960

ataacccacc aggcttcttt ggtatctgat gcaatatttt attgtggttg gcaactttat 1020

ccaccgagac taaataatat gcctcaaagg aatataagac aacttgtatt gttaggaata 1080

atgcaggcgc agcagccact cgtcatgaaa gcctttaaaa tgttagaatt aacatatggt 1140

acatttttac tggtgttgcg tggaacgtac tccgtattcg ctttgtttta tgcacaaaaa 1200

taa 1203

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Asn Tyr His Ile Leu Lys Ala Tyr Cys Lys Gly Ile Phe Leu

1 5 10 15

Ile Gly Asn Gly Asn Phe Trp Tyr Glu Asp Asn Glu Leu Gly Asp Asp

20 25 30

Arg Asn Leu Leu Tyr Lys Ala Cys Gly Gly Leu Leu Phe Phe Met Tyr

35 40 45

Gly Phe Met Thr Val Met Glu Ile Met Ala Ala Val Met Ala Asp Phe

50 55 60

Pro Glu Asp Glu Lys Arg Asp Ser Val Ser Phe Ala Val Ser His Ser

65 70 75 80

Ile Val Met Ile Lys Ile Phe Ser Ile Ile Thr Asn Lys Ser Leu Ile

85 90 95

Lys Ser Leu Asn Arg Lys Met Val Asn Val Cys Gln Asn Tyr Glu Glu

100 105 110

Gln Pro Leu Met Ala Glu Lys Tyr Lys Ile Met Lys Ile Asn Val Val

115 120 125

Ala Tyr Cys Ala Thr Val Tyr Gly Ser Cys Ala Cys Phe Val Phe Glu

130 135 140

Gly Leu Arg Lys Val Tyr Ala Gly Ser His Phe Val Thr Val Val Thr

145 150 155 160

Tyr Tyr Pro Ser Phe Glu Asp Asp Ser Thr Leu Ala Met Phe Val Arg

165 170 175

Ile Phe Asn Thr Phe Val Leu Phe Ile Met Met Val Thr Met Ile Val

180 185 190

Ser Val Asp Ser Phe Thr Met Val Tyr Ile Ile Met Tyr Lys Tyr Lys

195 200 205

Phe Ile Thr Leu Arg His Tyr Phe Glu His Leu Lys Asp Glu Ile Lys

210 215 220

Met Leu Tyr Asp Glu Gly Lys Thr Asn Leu Ala Ala Glu Lys Leu Thr

225 230 235 240

Asn Gly Leu Ile Glu Gly Ile Glu Met His Ser Ser Ile Leu Lys Leu

245 250 255

Ser Lys Glu Ile Asp Lys Ala Phe Gly Thr Val Ile Ala Leu Gln Leu

260 265 270

Cys Gln Ser Ser Gly Ser Ala Val Ser Ile Leu Leu Gln Ile Ala Leu

275 280 285

Ser Asp Asp Leu Lys Phe Val Ala Ala Gly Lys Leu Ile Phe Phe Val

290 295 300

Val Ala Leu Phe Phe Leu Leu Gly Leu Phe Leu Cys Asn Ala Gly Glu

305 310 315 320

Ile Thr His Gln Ala Ser Leu Val Ser Asp Ala Ile Phe Tyr Cys Gly

325 330 335

Trp Gln Leu Tyr Pro Pro Arg Leu Asn Asn Met Pro Gln Arg Asn Ile

340 345 350

Arg Gln Leu Val Leu Leu Gly Ile Met Gln Ala Gln Gln Pro Leu Val

355 360 365

Met Lys Ala Phe Lys Met Leu Glu Leu Thr Tyr Gly Thr Phe Leu Leu

370 375 380

Val Leu Arg Gly Thr Tyr Ser Val Phe Ala Leu Phe Tyr Ala Gln Lys

385 390 395 400

<210> 3

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggcgatgat cgaaacttgc tgtataaagc atgtggtggt cttttatttt ttatgtacgg 60

ttttatgaca gtaatggaaa ttatggcagc cgtaatggcg gactttcccg aggacgaaaa 120

acgtgactca gtgagtttcg ccgtcagtca cagcatagtt atgataaaaa tattctcgat 180

tattacgaac aaatcgttaa taaaaagcct gaatcgtaaa atggtaaatg tttgccagaa 240

ttacgaagaa caaccgttga tggcggaaaa atacaagatc atgaaaataa atgtcgtcgc 300

ttattgtgcg accgtttacg gttcatgcgc gtgttttgtt tttgaaggcc tacgaaaggt 360

gtacgcagga tcacatttcg taactgtagt aacttattat ccatcatttg aagacgattc 420

tacgttggct atgtttgtca gaatttttaa cactttcgtt ttgtttataa tgatggtgac 480

tatgattgtg tccg 494

Claims

1.一种舞毒蛾气味受体OR2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的一种舞毒蛾气味受体OR2基因的dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.权利要求2所述的一种舞毒蛾气味受体OR2基因的dsRNA在防治舞毒蛾或制备防治舞毒蛾的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为减弱舞毒蛾成虫对挥发性物质敏感性的产品。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述舞毒蛾为亚洲型舞毒蛾。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述OR2基因的dsRNA的注射剂量为1 μg。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述OR2基因的dsRNA施用后表现为舞毒蛾成虫对丁香酚或/和顺-3-己烯-1-醇趋向性降低。

8.一种用于调控舞毒蛾对次生物质的行为反应的产品中，其活性成分为权利要求2所述的dsRNA，所述的次生物质为丁香酚或/和顺-3-己烯-1-醇。