CN103849625A

CN103849625A - 一种棉铃虫COPI β基因cDNA及其应用

Info

Publication number: CN103849625A
Application number: CN201210520051.8A
Authority: CN
Inventors: 毛建军; 曾凡荣
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CN103849625B

Abstract

本发明公开了一种棉铃虫COPI β基因的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫COPI βsiRNA，棉铃虫取食COPI βsiRNA后，COPI β基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。

Description

一种棉铃虫COPI β基因cDNA及其应用

技术领域

本发明属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及棉铃虫衣被蛋白I(coatomerprotein I)β亚基(COPI β)cDNA的克隆，棉铃虫COPI β基因小RNA(siRNA)的设计，合成与对棉铃虫幼虫的饲喂。

背景技术

棉铃虫(Helicoverpa armigera)，夜蛾科昆虫的一种，是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。棉铃虫是一种世界性分布的害虫，国内各棉区均有分布和为害，北方棉区比南方棉区受害严重。棉铃虫为多食性害虫，除为害棉花外，还能为害小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等作物，寄主植物多达20多科200余种。20世纪90年代左右，棉铃虫在我国连年暴发成灾，给棉花、玉米和蔬菜等作物生产带来了严重的威胁。据统计，1992年棉铃虫在我国各种作物上累计发生面积达2192万公顷，造成直接经济损失逾百亿元。

目前表达有杀虫剂的转基因植物已成为世界上作物害虫治理的重要手段。2007年，全世界此类转基因植物的种植面积为4210万公顷，占所有转基因植物总数的37％。其中转有苏云芽孢杆菌(Bt)中杀虫剂基因的Bt棉全世界种植面积达1400万公顷。我国1997年开始种植转基因Bt棉，至2007年已达到380万公顷。2011年，全世界转基因抗虫棉的种植面积达到6600万公顷。

但害虫基因突变可能危及转基因作物的抗虫功效，目前至少已发现9种害虫进化出不同程度的Bt抗性。研究表明，棉铃虫在大田环境中比在实验室条件下更容易产生遗传突变。中国北方转基因Bt棉田棉铃虫的大部分抗性等位基因为隐性的钙粘蛋白突变，包含通过实验室筛选鉴定的删除突变。因此，寻找新的杀虫靶标，培育新的抗虫种质，避免或延缓害虫抗性的产生是一项非常紧迫的工作。

RNA干扰(RNA Interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象，小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中发挥关键作用。RNA干涉普遍存在于植物、动物和真菌中，是真核生物中存在的一种抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，在农业害虫生物防治领域具有广阔的应用前景。1998年，Kennerdell与Carthew首次利用RNAi技术研究了黑腹果蝇frizzled与frizzled 2基因的功能。随后的众多研究也表明，在注射或进食靶标序列dsRNA后，昆虫靶标基因的表达也可被有效阻断。通过体外显微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害虫稻飞虱不同表达模式的基因。黄曲条跳甲在注射跨膜气味受体基因PsOr1dsRNA后，对十字花科寄主的偏好性减弱。棉铃虫有一受棉酚诱导的P450基因GIP，当棉铃虫幼虫进食表达dsGIP的转基因烟草后，幼虫中肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升，同时由于棉铃虫中肠内的GIP表达的下调而使幼虫生长受到抑制，对棉酚的耐受性降低。此外，通过dsRNA饲喂对白蚁内源纤维素基因与Hexamerin储存蛋白基因的干扰具有致死与致畸效应。经dsRNA饲喂后默冈比亚按蚊的几丁质酶基因可被有效沉默。在水稻中表达跨膜转运蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻对稻褐飞虱的抗性。目前很少有通过siRNA沉默害虫靶标基因的报道。

衣被蛋白I(coatomer protein I：COPI)是真核细胞内一种负责跨膜运输的蛋白质，由7个亚基组成。真核细胞内部内膜系统各个部分之间的物质传递常常通过膜泡运输方式进行，如从内质网到高尔基体；高尔基体到溶酶体；细胞分泌物的外排，都要通过过渡性小泡进行转运。大多数运输小泡是在膜的特定区域以出芽的方式产生的。其表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被(coat)。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。衣被能选择性地将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡，并如同模具一样决定运输小泡的外部特征。COPI是已知的三类具有代表性的衣被蛋白之一。其负责回收、转运内质网逃逸蛋白(escapedproteins)返回内质网，使逃逸蛋白返回正常驻留的部位，这样内质网不会因为磷脂和某些蛋白质的匮乏而停止工作。COPI衣被小泡还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。由此可见，COPI在真核生物的新陈代谢中发挥基础与关键的作用。

研究表明，在人工饲料中添加衣被蛋白Iβ亚基(COPIβ)dsRNA后，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)COPI的表达明显受抑制，幼虫生长停滞甚至死亡。其中饲喂12天后死亡率达50％时所需的COPIβdsRNA浓度为0.57ng/cm²。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种棉铃虫(Helicoverpa armigera)衣被蛋白I(coatomer protein I)β亚基(COPI β)的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫COPIβ基因siRNA，棉铃虫取食siRNA后，COPIβ基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。

本发明提供的技术方案是：一种棉铃虫COPIβ基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。该序列是发明人首次从棉铃虫中克隆的COPIβ基因，该基因能够作为RNAi的靶标，在棉铃虫的防治中具有很大的应用价值。

本发明还提供所述cDNA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

(2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQID NO.4所示；

(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增；

(4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-COPI，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选含pMD18-T-COPI的阳性克隆；

(5)将步骤(4)所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求1所述的cDNA。

所述棉铃虫COPIβcDNA的应用：所述的cDNA用于防治棉铃虫。从所述的cDNA序列中选取21bp(见SEQ ID NO1中第625-645位核苷酸)作为干涉靶标，合成双链siRNA，正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示。同时设计绿色荧光蛋白基因(EGFP)双链siRNA作为对照，正向序列如SEQ ID NO.7所示，反向序列如SEQ IDNO.8所示。将所述siRNA配制成溶液施用于烟草表面，棉铃虫取食含有COPIβsiRNA的烟草后，COPIβ表达受抑制，正常的代谢与生理过程受破坏，棉铃虫死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。

上述的应用，所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等棉铃虫寄主植物。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次克隆棉铃虫COPIβ基因cDNA。COPIβ是一种真核生物膜结构上的质子泵，在真核生物细胞内行使基础的、必不可少的功能，在昆虫的生长、发育、生殖等生命活动过程中发挥非常重要的作用。COPIβ的沉默会破坏细胞基本的代谢与生理过程，造成昆虫生长、发育、生殖等一系列生命活动的紊乱与异常。

目前，RNAi技术已经在害虫生物防治领域展现出广阔的应用前景，以害虫靶基因dsRNA或siRNA作为有效成分研制生物农药是一个新的发展方向。据报道，dsRNA常被用于对害虫靶标基因进行敲除，而不是siRNA。本发明人首次以棉铃虫COPIβ为干涉靶标，设计与合成COPIβsiRNA，对棉铃虫进行饲喂，以沉默COPIβ的转录表达，抑制棉铃虫的种群数量，研究基础好，前瞻性高，害虫产生抗性的风险低，是一种防治棉铃虫的好方法。此外，siRNA与dsRNA相比具有合成成本低，稳定性好的特点，更适合于生物农药的研制，因此本发明具有重大的应用前景。

由于棉铃虫食性杂，寄主广泛，除为害棉花外，还能为害小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵、烟草等作物，寄主植物多达20多科200余种。因此，本发明所设计的COPIβsiRNA可施用于其它寄主植物，同样可用于棉铃虫的生物防治。

附图说明

图1为棉铃虫COPIβ基因的克隆。M：250bp ladder marker；1：COPI βcDNA(1397bp)。

图2为COPI βsiRNA饲养第4天时棉铃虫的取食情况。将COPI βsiRNA配制成水溶液，以EGFP(绿色荧光蛋白)siRNA为对照，将烟草叶片从植株上剪下置于培养皿，将siRNA溶液涂布在叶片表面，每个培养皿饲养1头棉铃虫幼虫，及时更换叶片。

图3为棉铃虫取食COPI βsiRNA后死亡率提高。将siRNA溶液涂布在烟草叶片表面，饲喂棉铃虫，在饲喂第8天统计棉铃虫的死亡率。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

本发明从棉铃虫克隆到衣被蛋白Iβ亚基(COPI β)的cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(a)序列特征：

序列长度：1397碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉铃虫(Helicoverpa armigera)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

(2)SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特征

序列长度：465氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

本发明棉铃虫COPIβ基因cDNA序列SEQ ID NO.1的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

(2)根据鳞翅目，鞘翅目，膜翅目，双翅目昆虫COPI β基因的保守序列设计简并引物：

COPIβforward：5’-ACYGGYTCRGATGACATGCA-3’(SEG ID NO.3)

COPIβreverse：5-’ATGAAGCARTCDCCSACCCA-3’(SEG ID NO.4)

(3)以cDNA为模板，PCR扩增COPIβ基因；

PCR条件为：首先将下述试剂混合在一起，

棉铃虫cDNA： 1μl

脱氧核苷酸底物dNTPs： 2μl

10×Taq DNA聚合酶缓冲液：2μl

Ex-Taq DNA聚合酶： 0.2μl

COPIβforward(10μM)： 0.4μl

COPIβreverse(10μM)： 0.4μl

ddH₂O：14μl

总体积：20μl

反应条件为：首先94℃预变性3分钟；然后进行如下循环：94℃30秒，61.6℃30秒，72℃90秒，共进行35循环；最后72℃延伸10分钟。如图1所示，其中M为250bp laddermarker，1号泳道为预期的COPIβcDNA序列(1397bp)。

(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-COPIβ，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选含pMD18-T-COPIβ的阳性克隆；

(5)将步骤(4)所得的阳性克隆进行序列测定，得到COPIβ基因1397bp序列。

上述获得的COPIβcDNA用于棉铃虫的生物防治，包括以下步骤：

(1)棉铃虫COPIβsiRNA设计

以上述获得的COPIβcDNA为模板，通过siRNA Designer V2.0设计双链siRNA，同时设计绿色荧光蛋白基因(EGFP)双链siRNA作为对照，siRNA序列如下：

siRNA-sense： 5’-GGAUCUAAUAAUGUGGCAAUCTT-3’(SEG ID NO.5)

siRNA-antisense：5’-GAUUGCCACAUUAUUAGAUCCTT-3’(SEG ID NO.6)

EGFP-sense： 5’-GCGCACCAUCUUCUUCAAGTT-3’(SEG ID NO.7)

EGFP-antisense： 5’-CUUGAAGAAGAUGGUGCGCTT-3’(SEG ID NO.8)

(2)siRNA对棉铃虫的饲喂

将步骤(1)的siRNA配制成水溶液，将三生烟(Nicotiana tabacum)叶片从植株上剪下，置于培养皿中，将siRNA溶液涂布在烟草叶片表面，每个培养皿饲养1头棉铃虫幼虫，及时更换叶片，并涂布siRNA。如图2所示，饲喂COPIβsiRNA的棉铃虫比饲喂EGFP siRNA的棉铃虫对烟草的取食量大。此外每天记录棉铃虫死亡率，在饲喂第8天统计总死亡率。如图3所示，在试验的第8天，饲喂COPIβsiRNA的棉铃虫比饲喂EGFPsiRNA的棉铃虫死亡率高40％以上。

Claims

1.一种棉铃虫COPIβ基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种棉铃虫COPIβ基因表达的蛋白，其特征在于，其由权利要求1所述的cDNA所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

(2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEGID NO.4所示；

(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；

(4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选含目的片段的阳性克隆；

4.一种如权利要求1所述cDNA的应用，其特征在于：从权利要求1所述的cDNA序列中选取SEQ ID NO.1中第625-645位21bp作为干涉靶标合成siRNA，siRNA正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示。将合成的siRNA配制成溶液涂布在烟草叶片表面对棉铃虫进行饲喂，棉铃虫取食烟叶后，COPIβ基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草、棉花、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等棉铃虫寄主植物。