CN108486129A

CN108486129A - 植物耐低温基因AtBTF3L及其应用

Info

Publication number: CN108486129A
Application number: CN201810164617.5A
Authority: CN
Inventors: 杨淑华; 丁杨林; 张晓燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明涉及植物耐低温基因AtBTF3L及其应用。所述植物耐低温基因AtBTF3L及其编码蛋白质的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次从拟南芥中克隆得到植物耐低温基因AtBTF3L基因并通过过表达实验验证了该基因的生物学功能，为培育耐低温植物新品种提供了宝贵的基因资源。

Description

植物耐低温基因AtBTF3L及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及植物耐低温基因AtBTF3L及其应用。

背景技术

在植物生长发育过程中不可避免地会遭受各种外界不良环境的侵染。随着全球气候的剧烈变化，温度胁迫(不利于植物生长的温度)已经严重威胁到经济作物的品质与产量。随之增多的世界人口数量，温度胁迫已经成为全球粮食安全的最为严重的威胁因素之一。据统计，我国大约70％的国土面积处于严寒和寒冷地区。因此，研究植物抵抗低温胁迫的抗性机理，选育并获得抗低温品种，在农业生产上具有重要的十几应用价值。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，属十字花科植物，由于其独有的特性，已经作为模式植物广泛应用于植物生物学的研究。通过农杆菌介导的转基因技术等多种技术方法，可以将拟南芥中的基因进行过表达，来研究这些基因在各种逆境条件下的响应，从而为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供植物耐低温基因AtBTF3L及其应用。

本发明的构思如下：发明人通过对编码植物新生多肽链偶联蛋白AtBTF3L编码的基因AtBTF3L(BASIC TRANSCRIPTION FACTOR 3LIKE)的研究，发现过表达该基因的转基因植株表现出抗冷表型。

为了实现本发明目的，本发明提供的植物耐低温基因AtBTF3L，其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

AtBTF3L基因来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，由1725个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第589位到第1447位碱基。该基因共有5个内含子。分别是自5’端第134位到第588；自5’端第657位到第742；自5’端第892位到第990；自5’端第1048位到第1131；自5’端第1171位到第1262。基因AtBTF3L编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供含有所述基因AtBTF3L的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或细胞系。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本发明还提供所述基因AtBTF3L或所述含有基因AtBTF3L的生物材料在提高植物抗寒能力中的应用。

所述应用包括：

1)使植物包含基因AtBTF3L；或

2)使植物过表达基因AtBTF3L。

本发明还提供所述基因AtBTF3L或所述含有基因AtBTF3L的生物材料在制备抗低温型转基因植物中的应用。具体为：在植物体内过表达植物耐低温AtBTF3L基因，提高植物抗低温性。

本发明还提供所述基因AtBTF3L或所述含有基因AtBTF3L的生物材料在植物育种中的应用，其中，所述育种的目的为了提高植物的抗寒能力。

前述的应用，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选拟南芥。

本发明进一步提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，采用农杆菌介导法将所述基因AtBTF3L转入到拟南芥植株中，获得ATBTF3L基因过表达的转基因植株。

所述方法包括以下步骤：

1)提取拟南芥基因组DNA，设计引物F和R，以拟南芥基因组DNA为模板PCR扩增基因AtBTF3L，将扩增产物构建到植物表达载体，如pSuper1300-Myc上，得到重组表达载体；

2)用上述重组表达载体转化农杆菌(如GV3101)，然后利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥；

其中，步骤1)中所述载体pSuper1300-Myc是由pCAMBIA1300载体改造而来，在pCAMBIA1300载体的多克隆位点序列5’端之前添加一个35S启动子，在多克隆位点序列3’端后面添加一个Myc标签，即为载体pSuper1300-Myc。

步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和4所示。

将本发明的AtBTF3L基因过表达后，植物表现为耐低温的表型。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。

本发明首次从拟南芥中克隆得到植物耐低温基因AtBTF3L基因并通过过表达实验验证了该基因的生物学功能。AtBTF3L基因编码的蛋白在不同生物物种(原核和真核生物)中非常保守且具有重要的生物学功能，本发明发现过表达拟南芥AtBTF3L基因能够显著提高拟南芥植株的耐冷性。因此，本发明提供了一个非常重要的并且可能具有普适性的抗冷基因资源，为培育耐低温品种提供了优秀的候选基因；为更多、更好地挖掘耐冷基因提供了依据。

附图说明

图1为本发明实施例2中过表达株系OE-4和OE-6中的AtBTF3L蛋白检测图。

图2为本发明实施例3中过表达株系OE-4和OE-6冷驯化和非冷驯化后低温处理植株恢复情况照片。

图3为本发明实施例3中过表达株系OE-4和OE-6冷驯化和非冷驯化后低温处理植株成活率统计图。

图4为本发明实施例4中AtBTF3L基因敲除拟南芥突变体的半定量PCR检测结果。

图5为本发明实施例4中AtBTF3L基因回补btf3l-1突变体后植株表现出耐冷表型。

图6为本发明实施例4中AtBTF3L基因回补btf3l-1突变体后经低温处理植株成活率统计图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中pBSK载体为常用的克隆载体，可市购；pSuper1300-Myc载体是从pCAMBIA1300改造而成，由中国农业大学生物学院巩志忠教授惠赠；pCAMBIA1300载体为常用的克隆载体，可市购；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株常用的克隆载体，多数分子生物学实验室均有保存。

以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD、等购自于TAKARA(大连)、Promega、NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自于Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工程公司；TRLzolRNA提取试剂盒购自于Invitrogen公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素及LB Medium等购自Sigma，硝酸纤维素膜购自Bio-Rad等公司；实施例中使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1植物耐低温基因AtBTF3L的克隆

根据拟南芥基因组数据库中公开的编号为At1g73230的序列，设计引物F和R，以拟南芥基因组DNA为模板，PCR扩增得到基因AtBTF3L，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2AtBTF3L基因过表达植株的构建与筛选

为了全面了解脂类转运蛋白对植物抗逆能力的影响，从拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)中克隆了编码植物新生多肽链偶联蛋白的基因AtBTF3L。根据编码区序列分析，设计引物将该基因的编码区扩增出来，连接到具有35S启动子的过表达载体pSuper1300-Myc上。

所用的引物为(SEQ ID NO:3和4)：

上游引物：5’-ATGAATAGGGAAAAGTTGATGAAG-3’

下游引物：5’-AGAAGCAGCAGCTTTGGGAGC-3’

将AtBTF3L基因连接到具有35S启动子的载体pSuper1300-Myc上的具体方法为：首先以基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物将AtBTF3L扩增出来，将PCR产物与pBSK载体相连，连接产物命名为AtBTF3L-pBSK；利用Xbal I和Kpn I将AtBTF3L从AtBTF3L-pBSK酶切后连入pSuper1300-Myc载体，连接产物命名为AtBTF3L-pSuper1300-Myc。

将上一步所得的质粒酶切后电泳，进行检测，具体的方法为：用Xbal I和Kpn I将AtBTF3L-pSuper1300-Myc酶切，利用1％的琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳后，UVP GelDocumentation凝胶分析系统扫描成像。将质粒测序，待测序正确后进行下一步试验。

将测序正确含有AtBTF3L-pSuper1300-Myc载体转化到农杆菌GV3101菌株中，再转入拟南芥野生型植株中，得的拟南芥转基因幼苗。具体的方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan 50μg/mL，Rif 50μg/mL，Gen 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜OD₆₀₀至1.0-2.0；4000rpm室温离心15min，收集菌体；用200mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中1min，用保鲜袋套上保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出来放回光照培养架上正常生长至收种。

pSuper1300-Myc载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的T₁代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T₂代种子进行潮霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。

筛选获得过表达株系OE-4(BTF3L OE-4#)和OE-6(BTF3L OE-6#)。

蛋白质免疫印迹方法检测所得过表达株系OE-4和OE-6。

提取野生型(WT)，OE-4和OE-6转基因植株总蛋白。测定所提取样品蛋白浓度。样品检测浓度为30μg。利用蛋白质免疫技术检测OE-4和OE-6植株中AtBTF3L蛋白含量。Anti-Myc抗体用于检测AtBTF3L蛋白，Anti-HSP90抗体用于检测内参蛋白HSP90。

检测结果见图1，可以看出OE-4和OE-6中均能检测出AtBTF3L蛋白。

在其它植物中过表达AtBTF3L蛋白的方法可以参考本实施例进行。

实施例3过表达AtBTF3L植物的抗低温能力检测

首先使拟南芥野生型幼苗和实施例2中制备的AtBTF3L蛋白过表达株系OE-4和OE-6在MS固体培养基上生长。幼苗生长2周后，对幼苗进行低温处理(非冷驯化，NA)，处理时间为-1℃至-5℃梯度降温(每小时降低1℃)，并在-5℃条件下处理1小时。处理后的幼苗转移至4℃黑暗条件放置12h，之后将其在正常光照条件下培养3-4d，低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的组织逐渐变绿并恢复生长，拍摄照片并统计成活率，结果见图2和图3。图中冷驯化(CA)幼苗的处理方法与非冷驯化类似，处理温度和时间为-8℃，1小时。后续恢复和存活率统计方法与非冷驯化一致。

AtBTF3L过表达株系OE-4和OE-6及对照野生型株系，在冷驯化和非冷驯化后低温处理后的照片见图2；存活率统计结果见图3。结果表明，在冷驯化和非冷驯化条件下，OE-4和OE-6过表达植株较野生型均表现出抗低温的表型。

实施例4AtBTF3L基因敲除突变体的抗低温能力检测

为了进一步验证AtBTF3L基因在植物耐冷过程的作用，从拟南芥生物资源中心ABRC(Arabidopsis biological resource center)订购了AtBTF3L基因的T-DNA插入突变体，并设计引物鉴定该突变体为一个功能缺失突变体，命名为btf3l-1。另将AtBTF3L基因启动子区域(起始密码子上游1500bp)与AtBTF3L基因连接，构建到pCAMBIA1300载体，并通过农杆菌转化到AtBTF3L基因缺失突变体中，筛选获得BTF3L/btf3l-1回补植株，并设计引物鉴定BTF3L/btf3l-1回补植株中AtBTF3L基因的表达。检测方法如下：提取野生型，btf3l-1，BTF3L/btf3l-1植株的总RNA，然后反转录成cDNA，用设计的引物进行半定量PCR检测AtBTF3L基因的表达情况。实验结果如图4所示，在野生型和回补植株中均能检测到AtBTF3L基因，在btf3l-1突变体中则检测不到AtBTF3L基因。其中EF1α为内参基因。

突变体及回补植株鉴定所用的引物序列如下(SEQ ID NO:5和6)：

上游引物：5’-AGAAATCGATTAACAAGATG-3’

下游引物：5’-CTAAGAAGCAGCAGCT-3’

回补载体构建鉴定所用的引物序列为(SEQ ID NO:7和8)：

上游引物：5’-GCGTCGACCTGGGCTAGACCACAC-3’

下游引物：5’-GCGGTACCAGAAGCAGCAGCTTTG-3’

然后，对以上材料进行耐冷性分析，发现AtBTF3L基因缺失突变体btf3l-1表现不耐冷表型，AtBTF3L基因能够回补btf3l-1突变体不耐冷表型。处理恢复后突变见图5，存活率统计见图6。该结果进一步证明AtBTF3L基因在植物耐冷过程起到重要的正调控作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 植物耐低温基因AtBTF3L及其应用

<130> KHP181111201.6

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

attacacatc gcatttactt aaagggcaaa accctccagc gccgcttgga tctctctctc 60

ctctgttctc tcttccctta tcttcttctt atacccttcg accaacgaag aaccctagaa 120

atcgattaac aaggtaagcc cacttcagca aatcgttcac tcatttcatt tccaagatat 180

tcgattgttt ccttctgatt tagcacaagg gtcaagatca tttttttgtt tttgttcttc 240

ctcgattcat atgttttttt tcattgatta ctgtttttga tattggttat cttgttttcc 300

aataacttgt tagttagtta aaagtaatgt ttgtgtaatg gtgacctaat cgattgaaaa 360

aattgaaact ttaggttaag ctcattgtaa caatacgagc tttgttcttc tcgctgcact 420

gttctcataa tcctagtgta atcaatttgt gggttgtgac tattgctcag tattactgtt 480

tttgtcattg gctaattaat aacagtatta gttattgtat atgcttaatt tataagatac 540

attttgggct aaatgggttt agctttgtgt gtttgttttg aaaaacagat gaatagggaa 600

aagttgatga agatggctaa cactgtccgc actggcggaa aggggacagt aagaaggtat 660

actcatttat gtcttttctg tgaatttgtg tttttgccat ttttcatgtt atattctcta 720

aacattttga ctctcatttc agaaagaaga aggctgttca caagaccact acaaccgatg 780

acaagaggct ccagagcact cttaagagag ttggagtcaa ttccattccc gccattgaag 840

aagttaacat ttttaaggat gatgtagtca ttcagttcat taaccctaaa ggtaaaacat 900

caaattttat ggctttataa atctcaggtt tcgtataaaa tttattgtat taatggttgt 960

tgtgtctctg ttttaatgtt gctatcacag ttcaagcttc aattgctgct aacacatggg 1020

ttgtgagtgg tacaccacag acgaaaagta agtgtttgta tcctcattgt tgatccaata 1080

ctattctcgg tttatgcata gtctaatctc ggaatgtgaa ttatcctgca gaattgcaag 1140

acattcttcc tcagattatc agccaacttg gtatgcagca ttaagtgtta cactctgatg 1200

tcctttccca aaccagtggt cccttaagtt aacattttgt tttcttgctt tgataatcgc 1260

aggaccagat aacttggaca acctgaagaa gctagcagag caattccaga aacaagctcc 1320

aggtgcaggt gatgtcccag caacaatcca agaagaggac gatgatgatg atgtcccaga 1380

tcttgtagtg ggagagactt tcgagacccc tgctactgaa gaggctccca aagctgctgc 1440

ttcttagagg aggaggaaga agaaggagaa gagctcacct gcaaaaccca tcataaaaat 1500

gtttgtcgct cgacctcttc tgagcactgt cagattcttg ttttctctaa tgcttgcgaa 1560

cagaaagact tggttttatt atcacttgat gctttttggt ccgaacagca attttccttt 1620

tattaaggtt agatcgcttt ttgtttacca cctgttcaaa tgagtactac tatgtcctgt 1680

cgcttcatac acttcttgca acacagtcct ttgttttgag tcaac 1725

<210> 2

<211> 165

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Asn Arg Glu Lys Leu Met Lys Met Ala Asn Thr Val Arg Thr Gly

1 5 10 15

Gly Lys Gly Thr Val Arg Arg Lys Lys Lys Ala Val His Lys Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Asp Asp Lys Arg Leu Gln Ser Thr Leu Lys Arg Val Gly Val

35 40 45

Asn Ser Ile Pro Ala Ile Glu Glu Val Asn Ile Phe Lys Asp Asp Val

50 55 60

Val Ile Gln Phe Ile Asn Pro Lys Val Gln Ala Ser Ile Ala Ala Asn

65 70 75 80

Thr Trp Val Val Ser Gly Thr Pro Gln Thr Lys Lys Leu Gln Asp Ile

85 90 95

Leu Pro Gln Ile Ile Ser Gln Leu Gly Pro Asp Asn Leu Asp Asn Leu

100 105 110

Lys Lys Leu Ala Glu Gln Phe Gln Lys Gln Ala Pro Gly Ala Gly Asp

115 120 125

Val Pro Ala Thr Ile Gln Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Val Pro Asp

130 135 140

Leu Val Val Gly Glu Thr Phe Glu Thr Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ala Ser

165

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaataggg aaaagttgat gaag 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaagcagca gctttgggag c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaaatcgat taacaagatg 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaagaagca gcagct 16

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgtcgacct gggctagacc acac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggtaccag aagcagcagc tttg 24

Claims

1.植物耐低温基因AtBTF3L，其特征在于，其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

2.含有权利要求1所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。

3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在提高植物抗寒能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

1)使植物包含基因AtBTF3L；或

2)使植物过表达基因AtBTF3L。

5.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在制备抗低温型转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在植物育种中的应用，其中，所述育种的目的为了提高植物的抗寒能力。

7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

9.一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，其特征在于，采用农杆菌介导法将权利要求1所述基因AtBTF3L转入到拟南芥植株中，获得ATBTF3L基因过表达的转基因植株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取拟南芥基因组DNA，设计引物F和R，以拟南芥基因组DNA为模板PCR扩增基因AtBTF3L，将扩增产物构建到植物表达载体pSuper1300-Myc上，得到重组表达载体；

2)用上述重组表达载体转化农杆菌，然后利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥；

其中，步骤1)中所述载体pSuper1300-Myc是由pCAMBIA1300载体改造而来，在pCAMBIA1300载体的多克隆位点序列5’端之前添加一个35S启动子，在多克隆位点序列3’端后面添加一个Myc标签，即为载体pSuper1300-Myc；

所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和4所示。