CN101432430B - 产量增加的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于对照植物而增加植物产量的方法。更具体地，本发明涉及增加植物产量的方法，包括增加编码MYB(DNA-结合)结构域转录因子(MYB-TF)多肽的核酸序列在植物中的表达。一个特定实施方案中，本发明涉及增加植物产量的方法，包括优先地增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。本发明还涉及具有增加的编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达的植物，以及具有优先地在种子胚乳中增加的编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达的植物，该植物相对于对照植物而言产量增加。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。

Description

产量增加的植物及其制备方法

技术领域

本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于对照植物而增加植物产量的方法。更具体地，本发明涉及增加植物产量的方法，包括增加编码MYB(DNA-结合)结构域转录因子(MYB-TF)多肽的核酸序列在植物中的表达。一个特定实施方案中，本发明涉及增加植物产量的方法，包括优先地在植物种子的胚乳中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。本发明还涉及编码MYB结构域转录因子多肽的核酸序列表达增加的植物，以及编码MYB结构域转录因子多肽的核酸序列优先在种子胚乳中表达增加的植物，该植物相对于对照植物产量增加。本发明还提供用于本发明方法的构建体。

背景技术

鉴于世界人口不断增长而农业可耕种土地的供给逐渐缩小，激起提高农业效率方面的研究。作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这样的选育技术有若干缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有从亲本植物遗传的异源遗传组分的植物，这些遗传组分并非总是产生期望性状。分子生物学的进展已经允许人类改造动物和植物的生殖质(germplasm)。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(通常为DNA或RNA的形式)及随后将所述遗传物质引入植物。这样的技术能够提供具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。

特别具有经济利益的性状是产量，就许多植物而言是种子的产量。产量通常定义为作物产生的具有经济价值的可衡量产物。其可以从数量和/或质量方面定义。产量直接取决于几种因素，例如：器官的数量和大小，植物结构(例如分枝数)，种子产出等等。根的发育，营养吸收和胁迫耐性也是决定产量的重要因素。因此优化上述因素之一可以有助于增加作物产量。植物种子是人类和动物营养的重要来源。诸如谷物、稻类、小麦、油菜(canola)和大豆的作物占人类总热量摄入的一半以上，而不论是通过直接消耗种子本身，还是消耗由加工的种子所饲养的肉类产品的情况。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多种代谢物的来源。种子含有胚(萌发后新枝和根的来源)和胚乳(在萌发和幼苗早期生长期间胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳可以同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。增加植物种子产量的能力，不论是通过种子数目、种子生物量、种子发育、种子饱满度，或者是通过任何其它种子相关的性状来增加种子产量，都将在农业上具有许多应用，甚至具有许多非农业用途，例如在诸如药物、抗体或者疫苗等物质的生物技术生产中的应用。

MYB结构域蛋白质是具有高度保守的DNA结合结构域的转录因子。MYB结构域最初于禽类成髓细胞性白血病病毒的癌基因(v-myb)中公开(Klempnauer等人(1982)Cell：453-63)。MYB蛋白质含有包含50-53个氨基酸的保守序列的一至四个不完全同向重复序列，该保守序列编码参与DNA结合的螺旋-转角-螺旋结构(Rosinski & Atchley(1998)J Mol Evol 46：74-83)。MYB结构域转录因子多肽已经在包含植物的许多高等真核生物中鉴定出来(Jiang等人(2004)Genome Biology 5：R46)。MYB结构域转录因子多肽构成植物中最大转录因子家族之一(在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中至少为130个)，但是在MYB结构域之外却具有很少的序列保守性。因此，基于MYB编码区之外鉴定的保守基序将它们聚类为不同亚群(Jiang等人，见上文)。

来自稻的一个MYB结构域转录因子多肽OsMYB4通过使用玉米编码C1 MYB的核酸分子作为探针进行杂交而克隆得到(Suzuki等人(1997)Gene 198：393-398；NCBI蛋白质检索号BAA23340)。OsMYB4的MYBDNA结合结构域由两个重复序列形成，该重复序列最相似于通常在动物MYB DNA结合结构域中发现的三个重复序列(R1、R2和R3)中的第二和第三重复序列，因此是R2R3-型MYB多肽家族的一部分。OsMYB4 mRNA水平优先地在发育的种子中观察到，因此推定OsMYB4在种子成熟中发挥作用(Suzuki等人，见上文)。

WO 03/007699公开了编码OsMYB4转录因子的核酸序列。其还公开了使用多核苷酸改变植物对胁迫的抗性或者耐受性的方法，以及使用多核苷酸改变生物途径和改变基因表达的方法。

美国专利申请2004/0045049和2004/0019927提供了编码OsMYB4转录因子和其拟南芥直向同源物(在申请中称为G211)的核酸序列。据报道，在拟南芥中过表达G211影响叶和花序的发育，产生小的丛生植物，其具有比野生型对照低的种子产量。

发明内容

目前令人惊讶地发现增加编码MYB(DNA-结合)结构域转录因子(MYB-TF)多肽的核酸序列在植物中的表达产生产量比对照植物增加的植物。已经发现优先增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达，产生相对于对照植物，产量增加的植物。

本发明提供了相对于对照植物增加植物产量的方法，其包括增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物中的表达。在特定的实施方案中，本发明提供了相对于对照植物增加植物产量的方法，包括优先地增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文可以替换使用，并且指任何长度的氨基酸多聚体形式。

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”在本文可以替换使用，并且指任何长度的核苷酸多聚体形式，其或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸或者是两者的组合。

选择对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为同一植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的失效合子(nullizygote)。本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

本文中所定义的术语“增加的产量”指植物一部分或者多部分生物量(重量)的增加，该植物部分可以包含地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。

特别地，这些可收获部分是种子，并且实施本发明方法产生种子产量比对照植物的种子产量增加的植物。

种子产量的增加可以表现为下述一个或者多个方面：a)种子生物量(种子总重量)的增加，其可以是单个种子基础上的和/或每株植物和/或每公顷或者每英亩上的种子生物量的增加；b)每株植物花朵数的增加；c)(饱满)种子数的增加；d)种子饱满率的增加，种子饱满率表示为饱满种子数除以种子总数的比率；e)增加的收获指数，收获指数表示为可收获的部分(例如种子)的产量除以总生物量的比率；以及f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的饱满种子数和它们的总重量而外推得出。增加的TKW可以由增加的种子大小和/或种子重量引起，也可以由胚和/或胚乳大小的增加引起。

种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。另外，种子产量的增加也可以表现为种子表面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子外周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或者由于改良的结构而可以发生产量的增加。

以玉米为例，产量增加可以表现为以下一个或多个方面：每公顷或每英亩植物数量的增加，每株植株穗数的增加，穗行数、行粒数、粒重、千粒重、谷穗长度/直径的增加，种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增加，等等。以稻为例，产量增加可以表现为以下一个或多个方面：每公顷或每英亩的植物数量的增加、每株植株的圆锥花序数量的增加、每个圆锥花序的小穗数量的增加、每个圆锥花序的花(小花)数量(其表示为饱满种子数对主圆锥花序(primary panicles)数目的比率)的增加、种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。

根据本发明优选的特征，实施本发明方法产生相对于对照植物种子产量增加的植物。因此根据本发明，提供了相对于对照植物种子产量而增加植物种子产量的方法，该方法包括增加编码MYB结构域转录因子多肽的核酸序列在植物中的表达。在特定的实施方案中，提供相对于对照植物的种子产量而增加植物种子产量的方法，该方法包括优先地增加编码MYB结构域转录因子多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。

由于本发明的转基因植物具有增加的产量，相对于对应野生型植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现出增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或者可以基本上遍及整株植物。生长速率增加的植物甚至可以表现出较早的开花。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力(萌发时增加的幼苗活力)。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原来可能的情况更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分增加，可以允许再播种同一植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再播种和收获稻类植物)。与之类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选地收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。就一些作物植物而言，也有可能从同一砧木收获更多的次数。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还使得能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以由生长曲线获取多种参数，来确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需的时间)，等等。

实施本发明的方法产生具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物中的表达。特定实施方案中，提供增加植物生长速率的方法，该方法包括优先地增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。

无论植物是处于非胁迫条件下还是暴露于各种胁迫，相对于对照植物，都发生产量和/或生长速率的增加。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长、丧失重新开始生长能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致受胁迫植物的生长与非胁迫条件下的对照植物相比，下降低于40％、35％或30％，优选低于25％、20％或15％，更优选低于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于耕作方法(灌溉、施肥、农药处理)的发展，栽培的作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫可以是植物接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、营养缺失、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或冰冻温度而引起。非生物胁迫可以是由于水胁迫(特别是由于干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。

特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件或者轻度干旱的条件下实施，以产生相对于对照植物种子产量增加的植物。如Wang等(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱导生长和细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)公开了在干旱胁迫和高盐度胁迫之间特别高程度的“对话”。例如，干旱和/或盐碱化主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传导路径和细胞应答，例如胁迫蛋白的产生，抗氧化剂的上调、可混溶溶质的累积以及生长阻抑。本文所用的术语“非胁迫”条件为允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员知晓给定地点的正常土壤条件和气候条件。

实施本发明方法产生在非胁迫条件下或者在轻度干旱条件下生长的植物，其种子产量相对于在相当条件下生长的对照植物而增加。因此，根据本发明，提供增加非胁迫条件下或者轻度干旱条件下生长的植物的产量的方法，该方法包括增加如上定义的编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物中的表达。一个特定实施方案中，本发明涉及增加生长在非胁迫条件下或者生长在轻度干旱条件下的植物产量的方法，包括优先地增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。

可以有利地对任何植物应用本发明的方法。

本文所用术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都包含目的基因/核酸序列。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都包含目的基因/核酸序列。

在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)超家族的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自以下的饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：槭树属物种(Acer spp.)，猕猴桃属物种(Actinidia spp.)，秋葵属物种(Abelmoschus spp.)，剑麻(Agavesisalana)，冰草属物种(Agropyron spp.)，匍匐茎剪股颖(Agrostis stolonifera)，葱属物种(Allium spp.)，苋属物种(Amaranthus spp.)，Ammophila arenaria，凤梨(Ananas comosus)，番荔枝属物种(Annona spp.)，旱芹(Apiumgraveolens)，落花生属物种(Arachis spp)，木菠萝属物种(Artocarpus spp.)，石刁柏(Asparagus officinalis)，燕麦属物种(Avena spp.)(例如，燕麦(Avenasativa)，野燕麦(Avena fatua)，比赞燕麦(Avena byzantina)，Avena fatua var.sativa，杂种燕麦(Avena hybrida))，阳桃(Averrhoa carambola)，箣竹属物种(Bambusa spp)，冬瓜(Benincasa hispida)，巴西栗(Bertholletia excelsea)，甜菜(Beta vulgaris)，芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)，芜青(Brassica rapa ssp).[canola，oilseed rape，(turnip rape)]，Cadabafarinosa，茶(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，Cannabis sativa，辣椒属物种(Capsicum spp.)，Carex elata，番木瓜(Carica papaya)，大花假虎刺(Carissa macrocarpa)，山核桃属物种(Carya spp.)，红花(Carthamustinctorius)，栗属物种(Castanea spp.)，吉贝(Ceiba pentandra)，栽培菊苣(Cichorium endivia)，樟属物种(Cinnamomum spp.)，西瓜(Citrullus lanatus)，柑桔属物种(Citrus spp.)，椰子属物种(Cocos spp.)，咖啡属物种(Coffeaspp.)，野芋(Colocasia esculenta)，Cola spp.，黄麻属物种(Corchorus spp)，芫荽(Coriandrum sativum)，榛属物种(Corylus spp.)，山楂属物种(Crataegusspp.)，番红花(Crocus sativus)，南瓜属物种(Cucurbita spp.)，黄瓜属物种(Cucumis spp.)，菜蓟属物种(Cynara spp.)，野胡萝卜(Daucus carota)，山马蝗属物种(Desmodium spp.)，龙眼(Dimocarpus longan)，薯蓣属物种(Dioscorea spp.)，柿树属物种(Diospyros spp.)，稗属物种(Echinochloa spp.)，油棕属物种(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)，美洲油棕(Elaeisoleifera)，子(Eleusine coracana)，Erianthus spp，枇杷(Eriobotryajaponica)，桉属物种(Eucalyptus spp.)，红仔果(Eugenia uniflora)，荞麦属物种(Fagopyrum spp.)，水青冈属物种(Fagus spp.)，苇状羊茅(Festucaarundinacea)，无花果(Ficus carica)，金桔属物种(Fortunella spp.)，草莓属物种(Fragaria spp.)，银杏(Ginkgo biloba)，大豆属物种(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max，Soja hispida或Soja max))，陆地棉(Gossypiumhirsutum)，向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthusannuus)，萱草(Hemerocallis fulva)，木槿属物种(Hibiscus spp.)，大麦属物种(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))，甘薯(Ipomoea batatas)，核桃属物种(Juglans spp.)，莴苣(Lactuca sativa)，香豌豆属物种(Lathyrusspp.)，兵豆(Lens culinaris)，亚麻(Linum usitatissimum)，荔枝(Litchichinensis)，百脉根属物种(Lotus spp.)，棱角丝瓜(Luffa acutangula)，羽扇豆属物种(Lupinus spp.)，Luzula sylvatica，番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum)，Lycopersicon lycopersicum，Lycopersicon pyriforme)，硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)，苹果属物种((Malus spp.)，凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)，曼密苹果(Mammeaamericana)，芒果(Mangifera indica)，木薯属物种(Manihot spp.)，人心果(Manilkara zapota)，紫花苜蓿(Medicago sativa)，草木樨属物种(Melilotusspp.)，薄荷属物种(Mentha spp.)，芒(Miscanthus sinensis)，苦瓜属物种(Momordica spp.)，黑桑(Morus nigra)，芭蕉属物种(Musa spp.)，烟草属物种(Nicotiana spp.)，木犀榄属(Olea spp.)，仙人掌属物种(Opuntia spp.)，鸟足豆属物种(Ornithopus spp)，稻属物种(Oryza spp).(例如稻(Oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia))，稷(Panicum miliaceum)，柳枝稷(Panicumvirgatum)，鸡蛋果(Passiflora edulis)，欧防风(Pastinaca sativa)，狼尾草属物种(Pennisetum spp.)，鳄梨属物种(Persea spp.)，欧芹(Petroselinumcrispum)，草庐(Phalaris arundinacea)，菜豆属物种(Phaseolus spp.)，Phleum pratense，刺葵属物种(Phoenix spp.)，南方芦苇(Phragmitesaustralis)，酸浆属物种(Physalis spp.)，松属物种(Pinus spp.)，阿月浑子(Pistacia vera)，豌豆属物种(Pisum spp.)，早熟禾属物种(Poa spp.)，杨属物种(Populus spp.)，牧豆树属物种(Prosopis spp.)，李属物种(Prunus spp.)，番石榴属物种(Psidium spp.)，石榴(Punica granatum)，西洋梨(Pyruscommunis)，栎属物种(Quercus spp.)，蓝花子(Raphanus sativus)，波叶大黄(Rheum rhabarbarum)，茶藨子属物种(Ribes spp.)，蓖麻(Ricinuscommunis)，悬钩子属物种(Rubus spp.)，甘蔗属物种(Saccharum spp.)，柳属物种(Salix spp.)，接骨木属物种(Sambucus spp.)，黑麦(Secale cereale)，胡麻属物种(Sesamum spp.)，白芥属物种(Sinapis spp.)，茄属物种(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)，红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))，两色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜属物种(Spinacia spp.)，蒲桃属物种(Syzygium spp.)，万寿菊属物种(Tagetes spp.)，酸豆(Tamarindus indica)，可可树(Theobroma cacao)，车轴草属物种(Trifolium spp.)，Triticosecale rimpaui，小麦属物种(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)，硬普通小麦(Triticum durum)，圆柱小麦(Triticum turgidum)，Triticum hybernum，马卡小麦(Triticum macha)，普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))，小金莲花(Tropaeolum minus)，金莲花(Tropaeolu mmajus)，越桔属物种(Vacciniumspp.)，野豌豆属物种(Vicia spp.)，豇豆属物种(Vigna spp.)，香堇(Violaodorata)，葡萄属物种(Vitis spp.)，玉蜀黍(Zea mays)，沼生菰(Zizaniapalustris)，枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、油菜(canola)、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选植物为单子叶植物。单子叶植物的实例包含甘蔗。更优选植物是谷类。谷类的实例包含稻、玉米、小麦、大麦、粟(millet)、黑麦、小黑麦、高粱或燕麦。

本文定义的术语“MYB-TF多肽”指任何如下多肽，该多肽从N端至C端含有(i)包含两个MYB重复序列的R2R3 MYB结构域；(ii)与由SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中任何一个或者多个所示的MYB4结构域以递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性的MYB4结构域。

上文定义的MYB-TF多肽的实例在实施例1的表A中给出。

作为备选地或者另外地，本文定义的“MYB-TF多肽”指任何如下多肽序列，该序列当用于构建MYB系统树(例如图3中所示的系统树)时，倾向于与包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示多肽序列的多肽序列群组(图3，粗箭头；圆圈显示系统树上该群组的起点)成簇聚类(cluster)，而不与任何其它群组成簇聚类。产生系统树的优选方法公开在Kranz等人(1998)Plant Journal 16(2)：263-276)中。

本领域技术人员使用已知的制作这种系统树的技术和软件，例如，GCG，EBI或CLUSTAL软件包，使用缺省参数，可以容易地确定讨论的任何多肽序列是否符合“MYB-TF多肽”的定义。聚类在包含如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4表示的多肽序列的群组中的任何序列都被认为符合上述的“MYB-TF多肽”定义，并且被认为适合用于本发明的方法。

作为备选地或者另外地，本文定义的“MYB-TF多肽”指任何这样的多肽序列，其按递增的优选顺序与SEQ ID NO：2所示多肽序列具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性。

MYB-TF多肽的同源物也可以用于实施本发明的方法。蛋白质的“同源物”包含肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于讨论中的未修饰蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其所来源自的未修饰蛋白质相似的生物学活性和功能活性。

缺失指从蛋白质中移除一个或者多个氨基酸。

插入指将一个或者多个氨基酸残基引入到蛋白质的预定位点。插入可以包含N端和/或C端融合以及单个或者多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入小于N或者C端融合，数量级为大约1-10个残基。N或者C端融合蛋白质或者肽的实例包含酵母双杂交系统中使用的转录激活因子的结合结构域或者激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag-100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

取代指使用具有相似特性(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或者打破α-螺旋结构或者β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸代替蛋白质中的氨基酸。氨基酸取代通常是单个残基取代，但是视施加于多肽的功能限制而定，也可以是成簇取代；插入通常是在大约1-10个氨基酸残基的数量级上。氨基酸取代优选是保守氨基酸取代。保守取代表是本领域所熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company和下述表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

 

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术(例如固相肽合成等等)或者通过重组DNA操作而容易地完成。操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或者缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点造成取代突变的技术是本领域技术人员所熟知的，包括M13诱变，T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或者其它定点诱变方法。

同源物(或者同源蛋白质)可以使用本领域熟知的常规技术，如序列比对而容易地鉴定。用于对比的序列比对方法是本领域所熟知的，这样的方法包含GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)发现两个全序列的比对，该比对将最大化匹配数并最小化空位数。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性的百分比并实施两个序列之间的相似性统计学分析。用于实施BLAST分析的软件通过美国国家生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information)而可公开获得。可以容易地鉴定同源物，例如使用可以从位于京都大学生物信息中心(Kyoto University Bioinformatics Center)的GenomeNet service获得的ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用缺省成对比对参数和百分比的打分方法而鉴定。可以进行少量人工编辑以最优化保守基序之间的比对，这对于本领域技术人员而言是清楚明白的。

同源物也包含涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念的直系同源物和旁系同源物。旁系同源物是相同物种内通过祖先基因的加倍而起源的基因，直系同源物是来自不同生物的通过物种形成而起源的基因。

可通过进行所谓的交互blast研究，容易地发现直系同源物和旁系同源物。这可通过第一blast(涉及针对任何序列数据库，例如公众可获得的NCBI数据库，对查询序列(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)进行blast分析)来进行。当始于核苷酸序列时，可使用BLASTN或TBLASTX(使用标准缺省值)，当始于蛋白质序列时，可使用BLASTP或TBLASTN(使用标准缺省值)。可任选地过滤BLAST结果。然后将过滤的结果或未滤过的结果中的全长序列对来自查询序列所来源的生物的序列进行反向BLAST分析(第二BLAST)(当查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2时，第二blast因此将针对稻序列进行)。然后比较第一和第二BLAST的结果。如果来自第二blast的高级别命中事件与查询序列源于相同的物种，那么鉴定为旁系同源物；如果高级别命中事件与查询序列源于不相同的物种，那么鉴定为直系同源物。高级别命中事件是具有低E值的命中事件。E值越低，得分越显著(或换句话说，偶然发现该命中事件的概率越低)。E值的计算在本领域内是熟知的。在大家族的情况下，可使用ClustalW，然后构建邻接树，以帮助显现相关基因的聚类和鉴定直系同源物和旁系同源物。除了E值之外，还可以通过同一性百分比来对比较进行打分。同一性百分比指在特定长度上两个比较的核酸(或多肽)序列之间相同的核苷酸(或者氨基酸)数目。优选MYB-TF多肽同源物与SEQ IDNO：2所示未修饰MYB-TF多肽按递增的优选顺序具有至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性或者相似性(功能同一性)。一般认为MYB-TF多肽同源物之间在MYB结构域之外的同一性百分比低。优选地，MYB-TF多肽同源物是表A中所给出的任何多肽序列，或者是表A中所给出的任何SEQ ID NOs的任何直向同源物或者旁系同源物。

MYB-TF多肽可以是SEQ ID NO：2的衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，其相比较于蛋白质的天然形式的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示序列，可以包括非天然氨基酸残基对氨基酸的取代或者非天然氨基酸残基的添加。任何表A中所给出的多肽序列的衍生物，或者表A中所给出的任何SEQ ID NOs的任何直向同源物或者旁系同源物的衍生物都是适合用于本发明方法的其它实例。

蛋白质的“衍生物”还包括这样的肽、寡肽、多肽，其相比较于多肽的天然形式的氨基酸序列可以包含天然改变的(糖基化、酰基化、泛素化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化，硫酸化等等)或者非天然改变的氨基酸残基。衍生物相比较于衍生其的氨基酸序列也可以包含一个或者多个非氨基酸取代或者添加，例如共价或者非共价结合至氨基酸序列的报告分子或者其它配体，例如结合至序列以有利于序列被检测的报告分子，和相比较于天然蛋白质的氨基酸序列而言的非天然氨基酸残基。

术语“结构域”指沿着进化相关蛋白质的序列比对(如上文所述实施)在特定位点保守的一组氨基酸。在同源物之间其它位点的氨基酸可以改变，而在特定位点高度保守的氨基酸表明这些氨基酸对于蛋白质的结构、稳定性或者活性是必要的氨基酸。由于它们通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守性而被鉴定，因此它们可以被用作鉴定子以确定具有新近确定的序列的多肽是否属于已前鉴定的多肽家族。

使用专门数据库可以鉴定MYB-TF多肽中的MYB结构域(包括MYB重复序列)，例如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；由德国海德堡EMBL托管)，InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；由英国欧洲生物信息学研究所(EBI)托管)，Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；分子生物学智能系统第二次国际大会会议录，Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编著，pp53-61，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)，作为对科学团体的服务而提供ExPASy蛋白质组学服务器(由瑞士的瑞士生物信息研究所(SIB)托管)或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002)，由英国Sanger研究所托管。MYB结构域包含多达4个不完全重复序列，每个形成大约53个氨基酸的螺旋-转角-螺旋结构。MYB重复序列的特征是规律间隔色氨酸残基。

如SEQ ID NO：38((D/N)(D/A)XF(S/T/P/-)SFL(N/D)(S/A)L(I/M)N(E/D)所示，如SEQ ID NO：27((D/N)(D/A)XF(S/T/-)SFL(N/D)SL(I/M)N(E/D)所示(其中X是任何氨基酸，并且其中-表示没有氨基酸)，和/或如SEQ ID NO：28(DDDFSSFLDSLIND)所示的MYB4结构域可以使用如上文公开的用于比较的序列比对方法进行鉴定。在一些情况中，可以调整缺省参数以修改搜索的严格性。例如使用BLAST，报道针对数据库序列的匹配的统计学显著性阈值(称为：“预期”值)可以提高以显示低严格性的匹配。通过这种方法，可以鉴定短的几乎完全的匹配，包括没有改变、或者具有在任何位点的一个或者多个保守改变、或者具有在任何位点的一个、两个或者三个非保守改变；或者具有在任何位点的一个缺失的SEQ IDNO：38的MYB4结构域和/或SEQ ID NO：27的MYB4结构域。例如SEQ ID NO：2所示的稻MYB-TF多肽的MYB4结构域在SEQ ID NO：28(DDDFSSFLDSLIND)中给出。优选地，用于实施本发明方法的MYB-TF多肽包含这样的MYB4结构域，其与由SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28之任一个或者多个所示的MYB4结构域按递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性。

另外，MYB-TF多肽(至少以其天然形式)通常具有DNA结合活性和激活结构域。使用常规的技术和方法，本领域技术人员可以容易地确定激活结构域和DNA结合活性的存在。使用对于本领域技术人员而言的标准技术可以容易地鉴定与MYB-TF多肽相互作用的蛋白质(例如在转录复合物中与MYB-TF多肽相互作用的蛋白质)。

编码MYB-TF多肽的核酸序列的实例包括但不限于表A中给出的任何核酸序列，或者编码表A中给出的任何SEQ ID NOs的直向同源物或者旁系同源物的任何核酸序列。编码MYB-TF多肽的核酸序列的变体可以适合用于本发明方法中。适合的变体包括编码MYB-TF多肽的核酸序列的部分和/或能够与编码MYB-TF多肽的基因/核酸序列杂交的核酸序列。其它变体包括编码MYB-TF多肽的核酸序列的剪接变体和等位基因变体。

本文定义的术语“部分”指编码多肽的DNA的片段，其中该多肽从N端至C端包含(i)含有两个MYB重复序列的R2R3MYB结构域；(ii)与SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中任何一个或者多个所示的MYB4结构域按递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性的MYB4结构域。部分可以例如通过在编码MYB-TF多肽的核酸序列中产生一个或者多个缺失而制备。该部分可以以分离的形式使用，或者可以融合到其它编码(或者非编码)序列上，以便例如产生组合几种活性的蛋白质。当融合到其它编码序列上，一旦翻译产生的多肽可以比预测的MYB-TF部分大。优选该部分编码具有基本上与SEQ ID NO：2的MYB-TF多肽相同的生物活性的多肽。

优选地，该部分是由表A中给出的任何核酸序列之一所表示的核酸序列的一部分，或者是编码表A给出的任何SEQ ID NOs的直向同源物或者旁系同源物的任何核酸序列的一部分。最优选，该部分是SEQ ID NO：1所示核酸序列的一部分。

可用于本发明方法的、编码MYB-TF多肽的核酸序列的另一种变体是能够在降低的严格条件，优选在严格条件下与衍生自如上定义的核酸序列的探针杂交的核酸序列，该杂交序列编码这样的多肽，该多肽从N端至C端包含(i)含有两个MYB重复序列的R2R3MYB结构域；(ii)与SEQID NO：38，SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中任何一个或者多个所示的MYB4结构域按递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性的MYB4结构域。

优选地，该杂交序列能够杂交表A中给出的任何核酸序列(或者衍生自其的探针)，或者能够杂交编码表A给出的任何SEQ ID NOs的直向同源物或者旁系同源物的任何核酸序列，或者能够杂交任何上述序列(靶序列)的一部分。最优选，杂交序列能够与SEQ ID NO：1(或者衍生自其的探针)杂交。探针通常在长度上小于1000bp，优选小于500bp。通常，对于DNA-DNA杂交，例如Southern印迹，探针长度在100-500bp之间变化，然而针对DNA-DNA杂交，例如在PCR扩增中，探针中的杂交区通常短于50个核苷酸，但是长于10个核苷酸。

本文定义的“杂交”是一个过程，其中基本上同源互补的核苷酸序列彼此退火。杂交过程可以完全在溶液中发生，即互补核酸分子两者都在溶液中。杂交过程也可以发生于其中互补核酸分子之一固定在基质，例如磁珠、琼脂糖珠或者任何其它树脂上时。杂交过程还可以发生于互补核酸分子之一固定在固相载体(例如硝酸纤维素或者尼龙膜)上或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或者微阵列或者核酸芯片)时。为了使杂交发生，通常热变性或者化学变性核酸分子，以使得双链融化为两个单链，和/或从单链核酸分子中除去发夹或者其它二级结构。

术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受多种条件的影响，例如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成。通常，选择的低严格条件为在确定的离子强度和pH，比具体序列的热解链温度(T_m)低大约30°C。中等严格条件是温度比T_m低20℃，高严格条件是温度比T_m低10°C。高严格杂交条件通常用于分离其与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，因为遗传密码的简并性，核酸序列可以互相不同并且仍然编码基本上相同的多肽。因此，可能有时需要中等严格杂交条件以鉴定这样的核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。T_m取决于溶液条件以及探针的碱基组成和长度。例如，更长的序列在更高的温度下特异性杂交。低于T_m大约16℃至32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在减少了2条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体形成；该效应对于不超过0.4M的钠浓度是可见的(对于更高浓度，该效应可以被忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每1％的甲酰胺降低0.6至0.7℃，50％甲酰胺的加入允许在30至45℃下进行杂交，尽管杂交速率将降低。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均地和对于大的探针，每1％碱基错配，T_m减少大约1℃。取决于杂交体的类型，可使用下列公式计算T_m：

·DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

T_m＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

·寡DNA或寡RNA^d杂交体：

对于<20个核苷酸：T_m＝2(l_n)

对于20-35个核苷酸：T_m＝22+1.46(l_n)

^a或对于其他一价阳离子，但是只有在0.01-0.4M范围内是准确的。

^b只对在30％至75％的范围内的％GC是准确的。

^cL＝碱基对中的双链体的长度

^d寡，寡核苷酸；l_n，引物的有效长度＝2x(G/C的数目)+(A/T的数目)。

可以使用多种已知技术之一来控制非特异性结合，例如使用含有蛋白质的溶液封闭膜、向杂交缓冲液中添加异源RNA，DNA和SDS以及使用Rnase处理。对于非同源探针，可以通过改变下述内容之一实施一系列的杂交：(i)渐进性降低退火温度(例如从68℃降低至42℃)或者(ii)渐进性降低甲酰胺浓度(例如从50％降低至0％)。本领域技术人员明白多种参数可以在杂交过程中改变并且其将维持或者改变条件的严格性。

除了杂交条件，杂交特异性一般也是杂交后洗涤的函数。为了除去由非特异性杂交产生的背景，使用稀盐溶液洗涤样品。这样洗涤的关键因素包括终洗涤溶液的离子强度和温度：越低的盐浓度和越高的洗涤温度，则洗涤严格性越高。洗涤条件通常以等于或者低于杂交严格性实施。阳性杂交给出至少是背景两倍的信号。一般地，核酸杂交试验或者基因扩增检测方法的合适严格条件在上文列出。也可以选择较高或者较低的严格条件。本领域技术人员明白多种参数可以在洗涤过程中改变以及其将维持或者改变条件的严格性。

例如，对于长度超过50个核苷酸的DNA杂交体，通常高严格杂交条件包括在65℃，1×SSC中或者在42℃，1×SSC和50％甲酰胺中杂交，接着在65℃，0.3×SSC中洗涤。对于长度超过50个核苷酸的DNA杂交体，中等严格杂交条件的实例包括在50℃，4×SSC中或者在40℃，6×SSC和50％甲酰胺中杂交，接着在50℃，2×SSC中洗涤。杂交体的长度是预期的杂交的核酸分子的长度。当杂交已知核酸序列时，杂交体长度可以通过如本文所述比对序列和鉴定保守区而确定。

1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交和洗涤可以另外包含5×Denhardt′s试剂，0.5-1.0％ SDS，100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA，0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性的水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或者参考Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新)。

MYB-TF多肽可以由可变剪接变体编码。此处使用的术语“可变剪接变体”包括其中已切除、置换或添加选定的内含子和/或外显子或其中已缩短或增长内含子的核酸序列的变体。此类变体是其中蛋白质的基本生物学活性得到保留的变体，可通过选择性保留蛋白质的功能片段而获得这样的变体。可在自然界中发现或可人工制备此类剪接变体。用于产生此类剪接变体的方法在本领域内是已知的。

优选的剪接变体是编码MYB-TF多肽的核酸序列的剪接变体，该多肽从N端至C端包含(i)含有两个MYB重复序列的R2R3MYB结构域；(ii)与SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中任何一个或者多个所示的MYB4结构域按照递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性的MYB4结构域。其它编码包含上述特征的MYB-TF多肽的核酸序列的优选剪接变体是如表A中给出的核酸序列的剪接变体，或者是编码表A中给出的任何SEQ ID NOs的直向同源物或者旁系同源物的任何核酸序列的剪接变体。最优选的是SEQ ID NO：1所示核酸序列的剪接变体。

MYB-TF多肽也可以由编码如下多肽的核酸序列的等位基因变体编码，其中所述多肽从N端至C端包含(i)含有两个MYB重复序列的R2R3MYB结构域；(ii)与SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中任何一个或者多个所示的MYB4结构域按递增的优选顺序具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或者更高的序列同一性的MYB4结构域。

编码包含如上定义特征的MYB-TF多肽的核酸序列的优选等位基因变体是如表A中给出的核酸序列的等位基因变体，或者是编码表A中所示任何SEQ ID NOs的直向同源物或者旁系同源物的任何核酸序列的等位基因变体。最优选的是由SEQ ID NO：1所示核酸序列的等位基因变体。等位基因变体天然存在，并且本发明方法包括对这些天然等位基因变体的使用。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性株系中，SNP和INDEL形成了最大的序列变体集合。

也可以使用定向进化(或者基因改组)以产生编码MYB-TF多肽的核酸序列变体。其由反复的DNA改组和然后适当的筛选和/或选择组成，以产生编码MYB-TF多肽或者其具有修饰生物学活性的同源物或者部分的核酸序列或者其部分的变体(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；US专利5,811,238和6,395,547)。

可以使用定点诱变以产生编码MYB-TF多肽的核酸序列变体。多种方法可使用以完成定点诱变，最常用的方法是基于PCR的方法(CurrentProtocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。

编码MYB-TF多肽的核酸序列可以衍生自任何天然或者人工来源。通过考虑周到的人工操作可以对组合物和/或基因组环境中的核酸序列的天然形式进行修饰。一个实施方案中，MYB-TF核酸序列来自植物，优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选地核酸序列来自稻(oryza sativa)。

可以通过将遗传修饰引入植物，优选引入MYB-TF基因座而获得编码MYB-TF多肽的核酸序列表达的增加。本文定义的基因座指基因座区域，其包含目的基因和编码区上下游10KB的区域。特定实施方案中，编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达优先地在植物种子胚乳中增加。

可以例如通过下述方法任何之一或者多种引入遗传修饰：T-DNA激活，TILLING和同源重组，或者可以通过在植物中引入和表达编码MYB-TF多肽的核酸序列来引入遗传修饰。编码MYB-TF多肽的核酸的表达增加。特定实施方案中，编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达优先地在植物种子胚乳中增加。遗传修饰引入之后，接着任选地基于编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物中的表达增加，进行筛选步骤，其中所述增加的表达导致相对于对照植物具有产量增加的植物。在特定实施方案中，遗传修饰引入之后，接着任选地基于编码MYB-TF多肽的核酸序列优先地在植物种子胚乳中的表达增加，进行筛选步骤，其中所述增加的表达导致相对于对照植物具有产量增加的植物。

T-DNA激活标签(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或者内含子)的T-DNA插入到目的基因的基因组区或者基因编码区上下游10kb区，以产生使得启动子指导靶基因表达的构型。一般地，破坏靶基因天然启动子对其表达的调控，并且使得基因接受新插入启动子的调控。启动子通常嵌入T-DNA。将此T-DNA随机插入植物基因组中，例如通过农杆菌(Agrobacterium)感染插入，并引起在插入T-DNA附近的基因的表达改变。获得的转基因植物将由于在引入的启动子附近的基因的表达改变而显示出显性表型。待引入的启动子可以是任何能够增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物中表达的启动子。特定实施方案中，所选启动子优先地增加在植物种子胚乳中的表达。

也可以使用TILLING(定向诱导基因组局部突变技术)，在编码MYB-TF多肽的基因的基因座中引入遗传修饰。其是可以用于产生和/或鉴定具有改变的表达和/或活性的MYB-TF多肽编码核酸序列的诱变技术。TILING也允许选择带有该突变变体的植物。这些突变的变体可以展示出表达在强度或位置或时间上的改变(例如，如果突变影响启动子的话)。这些突变的变体可以展示出比其天然形式的基因更高的MYB-TF活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法结合在一起。TILLING中通常进行的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)，Methods inArabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，编.Singapore，WorldScientific Publishing Co，pp.16-82；Feldmann等人，(1994)，MeyerowitzEM，Somerville CR，编，Arabidopsis.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，pp 137-172；Lightner J和Caspar T(1998)，J Martinez-Zapater，J Salinas，编，Methods on Molecular Biology，第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，pp 91-104)；(b)个体的DNA制备和合并(pooling)；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以使异源双链体能够形成；(e)DHPLC，其中合并物中异源双链体的存在在色谱图中检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。用于TILLING的方法在本领域内是众所周知的(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol18：455-457；由Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50进行综述)。携带这些突变变体的植物具有增加的编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。特定实施方案中，携带这些突变变体的植物具有在植物种子胚乳中优先增加的编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。

T-DNA激活和TILLING是能够产生遗传修饰的技术实例，该遗传修饰包括在植物中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达，或者包括优先地在植物种子胚乳中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。

同源重组允许在确定的选定位置将选定的核酸导入基因组。同源重组是生物科学中常规用于低等生物例如酵母或苔藓剑叶藓属(Physcomitrella)的标准技术。不仅针对模式植物(Offringa等人(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且还针对农作物植物例如稻(Terada等人(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr OpinBiotech 15(2)：132-8)描述了用于在植物中进行同源重组的方法。待靶向的核酸序列优选是在植物中调控编码MYB-TF多肽的核酸序列的天然表达的区域。可以将强组成型启动子或者将强胚乳特异性启动子引入此区域，从而部分地或者基本上全部地将其取代。

引入遗传修饰(在本发明中其不必位于MYB-TF基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达如上定义的编码MYB-TF多肽的核酸序列。编码MYB-TF多肽的核酸的表达被增加。在特定实施方案中，引入遗传修饰(在本发明中其不必位于MYB-TF基因的基因座中)的优选方法是引入如上定义的编码MYB-TF多肽的核酸序列并且优先地增加其在植物种子胚乳中的表达。

待引入植物中的核酸序列可以是全长核酸序列，或者可以是如上定义的部分或者杂交序列或者其它核酸变体。

本发明方法依赖在植物中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。特定实施方案中，本发明方法依赖优先地增加编码MYB-TF多肽的核酸序列在植物种子胚乳中的表达。增加基因或者基因产物表达的方法是本领域众所周知的，包含例如由合适启动子引发的过表达，使用转录增强子或者翻译增强子。可以将起启动子或者增强子元件作用的分离核酸序列引入非异源形式的多核苷酸的合适位置(通常是上游)，以便上调编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。例如可以通过突变、缺失和/或取代体内改变内源性启动子(参见，Kmiec，U.S.Pat.No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以合适方向和离本发明基因合适的距离引入植物细胞中，以便调控基因表达。

如果期望多肽表达，通常期望将多腺苷酸化区域包括在多核苷酸编码区3′-末端。多腺苷酸化区域可以来自天然基因，来自多种其它植物基因或者来自T-DNA。待添加的3′末端序列可以衍生自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者作为备选来自其它植物基因，或者较不优选地来自任何其它真核生物基因。

还可向5′非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在细胞溶胶中积累的成熟信使的量。已显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可以使基因的表达在mRNA和蛋白质水平上增加多达1000倍，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。当置于转录单位的5′末端附近时，基因表达的该内含子增强作用通常最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途在本领域内是已知的。关于一般信息参见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot，Eds.，Springer，N.Y.(1994)。

其它调控序列(除了启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。

本发明还提供了遗传构建体和载体，以有助于本发明方法中有用的核酸序列的引入和/或优先在植物种子胚乳中的表达。

因此，本发明提供了构建体，其包含：

(i)编码上文所定义MYB-TF多肽的核酸序列；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列在植物、植物部分或者植物细胞中表达的一个或者多个调控序列；任选地

(iii)转录终止序列。

优选地，调控序列之一是至少下述之一：(i)组成型启动子，优选GOS2启动子；或者(ii)胚乳特异性启动子，优选谷醇溶蛋白启动子。

可使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明的方法的构建体。可将基因构建体插入适合用于转化入植物和适合用于在转化细胞中表达目的基因的载体，该载体可商购获得。

使用包含目的序列(即编码MYB-TF多肽的核酸序列)的载体转化植物。本领域技术人员非常清楚那些为了成功转化、选择和繁殖含有目的序列的宿主细胞而必须存在于载体中的遗传元件。将目的序列有效地连接到一种或者多种调控序列(至少启动子)上。术语“调控元件”、“调控序列”和“启动子”在本文都可以互换使用，并且应广义地理解为指能实现与其连接的序列的表达的调控性核酸序列。上述术语包括来源于经典真核基因组基因的转录调控序列(包括准确的转录起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和响应发育和/或外部刺激或以组织特异性的方式改变基因表达的额外调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默基因)。该术语还包括经典原核基因的转录调控序列，在该情况下其可包含-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”还包括赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中的表达的合成的融合分子或衍生物。此处使用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，这样启动子序列就能够起始目的基因的转录。

本文所用术语“组成型启动子”是指在至少一种细胞、组织或器官(例如，植物种子胚乳)中在大多数，但不必是所有的，生长和发育期中在大多数环境条件下具有转录活性的启动子。下表2给出组成型启动子的实例。

组成型启动子在本发明方法中特别有用。应该清楚的是，本发明的应用不局限于如SEQ ID NO：1所示的编码MYB-TF多肽的核酸序列，本发明的应用也不局限于由组成型启动子驱动的、编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达。

表2：组成型启动子的实例

 

基因来源	表达方式	参考文献
			肌动蛋白	组成型	McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
CAMV 35S	组成型	Odell等人，Nature，313：810-812，1985

 

CaMV 19S	组成型	Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
			GOS2	组成型	de Pater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，
泛素	组成型	Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
			稻亲环蛋白	组成型	Buchholz等人，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
玉米H3组蛋白	组成型	Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
			肌动蛋白2		An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996

器官特异性或者组织特异性启动子是能够优先地在某些器官或者组织，例如叶、根、种子组织等等中启始转录的启动子。例如“根特异性启动子”是主要在植物根中，并基本上排除在任何其它植物部分中有转录活性的启动子，不过仍然允许在这些其它植物部分中存在渗漏表达。

胚乳特异性启动子是指能够优先地在植物种子的胚乳中驱动目的基因表达的任何启动子。此处提及的“优先地”在植物种子的胚乳中驱动表达，用于表示在胚乳组织中驱动与其有效连接的任何序列表达，而且除了由于渗漏启动子表达导致的任何残留表达外，基本上排除在植物的其他地方驱动表达。例如，谷醇溶蛋白启动子在植物种子胚乳中显示强表达，而在分生组织，更特别地茎分生组织和/或分生组织的discrimination centre中具有渗漏表达。胚乳特异性启动子可以是天然或者合成启动子。

优选，胚乳特异性启动子是从谷醇溶蛋白基因分离的启动子，例如由SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：41表示的稻谷醇溶蛋白RP6启动子(Wen等人，(1993)Plant Physiol 101(3)：1115-6)，或具有与该稻谷醇溶蛋白启动子相似强度和/或相似表达模式的启动子。可以例如通过将启动子与报告基因偶联，然后在植物的组织中检测报告基因的功能来分析相似的强度和/或相似的表达模式。一个众所周知的报告基因是β-葡糖醛酸糖苷酶和用于在植物组织中显现β-葡糖醛酸糖苷酶活性的比色GUS染色。应该清楚的是，本发明的应用不局限于编码如SEQ ID NO：2所示的MYB-TF多肽的核酸序列，本发明的应用也不局限于由谷醇溶蛋白启动子驱动的、编码MYB-TF多肽的核酸的表达。可以用于实施本发明方法的其它胚乳特异性启动子实例在下表3中显示。

表3：本发明使用的胚乳特异性启动子的实例

 

基因来源	参考文献
		谷蛋白(稻)	Takaiwa等人，(1986)Mol.Gen.Genet.208：15-22，；Takaiwa等人，(1987)FEBS Letts.221：43-47
玉米醇溶蛋白	Matzke等人，(1990)Plant Mol Biol，14(3)：323-32
		小麦LMW和HMW麦谷蛋白-1	Colot等人，(1989)Mol Gen Genet 216：81-90；Anderson等人，(1989)NAR 17：461-2
小麦SPA	Albani等人，(1997)Plant Cell，9：171-184
		小麦的麦醇溶蛋白	Rafalski等人，(1984)EMBO J.3：1409-15
大麦Itrl启动子	Diaz等人，(1995)Mol Gen Genet 248(5)：592-8
		大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白	Cho等人，(1999)Theor Appl Genet 98：1253-62；Muller等人，(1993)Plant J 4：343-55；Sorenson等人，(1996)Mol Gen Genet 250：750-60，
大麦DOF	Mena等人，(1998)Plant J.，116(1)：53-62
		blz2	Onate等人，(1999)J Boil Chem 274(14)9175-82
合成启动子	Vicente-Carbajosa等人，(1998)Plant J.13：629-640
		稻谷醇溶蛋白NRP33	Wu等人，(1998)Plant Cell Physiol.39(8)885-889
稻球蛋白Glb-1	Wu等人，(1998)Plant Cell Physiol.39(8)885-889
		稻球蛋白REB/OHP-1	Nakase等人，(1997)Plant Molec.Biol 33：513-522
稻ADP-葡萄糖PP	Russell等人，(1997)Trans Res 6：157-68
		玉米ESR基因家族	Opsahl-Ferstad等人，(1997)Plant J 12：235-46
高粱γ-高梁醇溶蛋白	DeRose等人，(1996)Plant Molec Biol 32：1029-35

其它组织特异性启动子的实例是能够优先地在年幼的正在扩展的组织中起始转录的启动子，例如β-扩展蛋白启动子。优选地，β-扩展蛋白启动子来自稻类，更优选基本上相似于SEQ ID NO：40所示的序列，最优选是由SEQ ID NO：40所示的序列。这样的启动子也可以用于实施本发明方法。

任选地，一种或者多种终止序列(也是调控序列)可以用于引入植物的构建体中。术语“终止子”包括如下调控序列，所述调控序列是在转录单位的末端为初级转录物的3’加工和多腺苷酸化以及转录的终止提供信号的DNA序列。另外的调控元件可包括转录增强子和翻译增强子。本领域技术人员知道可适合用于进行本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的或可容易地通过本领域技术人员获得。

本发明的遗传构建体还可包含为了在特定的细胞类型中维持和/或复制所必需的复制起点序列。一个实例是需要在细菌细胞中以附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)保持遗传构建体的时候。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

遗传构建体可以任选地包含选择标记基因。本文所用术语“选择标记基因”包括任何如下基因，所述基因对表达其的细胞赋予表型，从而帮助鉴定和/或选择被本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。适宜的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性，导入新的代谢性状或允许目测选择的标记。选择标记基因的实例包括赋予对抗生素(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、除草剂(例如提供对的抗性的bar；提供抗草甘膦的抗性的aroA或gox，或者赋予抗例如咪唑啉酮，膦丝菌素或磺酰脲抗性的基因)的抗性的基因，或提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或者用于木糖利用的木糖异构酶，或者例如抗2-脱氧葡萄糖的抗营养标记)。可视标记基因导致颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、发光(例如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白，GFP和其衍生物)的形成。可视标记基因的表达导致颜色形成(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或者β-半乳糖苷酶及其生色底物，例如X-Gal)、发光(例如萤光素/萤光素酶系统)或者荧光(绿色荧光蛋白、GFP及其衍生物)。这个列表仅仅代表少量可能标记。本领域技术人员熟悉这些标记。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。

本发明还涵盖通过本发明方法可获得的植物。因此本发明提供通过本发明方法可获得的植物、其植物部分或者植物细胞，该植物或者其部分或者细胞含有处于如上定义组成型启动子调控下的编码MYB-TF多肽的分离核酸。特定实施方案中，本发明提供通过本发明方法可获得的植物、其植物部分或者植物细胞，该植物或者其部分或者细胞包含处于胚乳特异性启动子调控下的编码MYB-TF多肽的分离核酸。

本发明还提供用于产生相比较于对照植物产量增加的转基因植物的方法，包括将编码MYB-TF多肽的核酸序列引入植物并且在植物中表达该核酸。特定实施方案中，本发明提供用于产生相比较于对照植物产量增加的转基因植物的方法，包括引入编码MYB-TF多肽的核酸序列并且优先在植物种子胚乳中表达该核酸。

更特别地，本发明提供用于产生相比较于对照植物产量增加的转基因植物的方法，该方法包括

(i)在植物、植物部分或者植物细胞中引入并表达编码MYB-TF多肽的核酸序列；

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育该植物细胞，并且其中编码MYB-TF多肽的核酸序列由组成型启动子或者由胚乳特异性启动子驱动表达。

可以直接将核酸序列引入植物细胞或者植物自身(包含引入植物的组织、器官或者任何其它部分)。根据本发明优选的特征，优选通过转化将核酸序列引入植物。

此处提及的术语“转化”包括将外源多核苷酸转移入宿主细胞，而无论用于转移的方法如何。可用本发明的遗传构建体转化能够随后进行克隆繁殖(通过器官发生或胚发生)的植物组织，然后从其再生完整的植物。选择的具体组织可发生变化，这取决于可获得的和最适合于将被转化的特定物种的克隆繁殖系统。示例性组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可将多核苷酸瞬时或稳定地导入宿主细胞，其可保持非整合状态例如作为质粒。可选择地，可将其整合入宿主基因组。然后以本领域技术人员已知的方法将所得的转化的植物细胞用于再生转化的植物。

植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，可使用几种转化方法中的任一方法将目的基因导入适宜的祖先细胞。转化方法包括脂质体的使用、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、DNA至植物的直接注射、基因枪轰击(particle gun bombardment)、使用病毒或花粉的转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)、原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)、植物材料的显微注射(Crossway A等人，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA包被的微粒轰击(Klein TM等人，(1987)Nature327：70)；使用(非整合型)病毒的感染等。优选通过农杆菌介导的转化，使用任何熟知的用于稻转化的方法，例如在下列文献资料之一中描述的方法，产生具有增加的MYB-TF多肽编码基因/核酸序列表达的转基因稻植物：公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等人(Plant J 6(2)：271-282，1994)(其公开内容完整地引入本文作为参考)。在玉米转化的情况下，优选方法是如Ishida等人(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)(其公开内容完整地引入此处作为参考)中描述的方法。

一般在转化之后，筛选存在一种或者多种标记的植物细胞或者细胞群，该标记由与目的基因共转移的可以在植物中表达的基因编码，之后将该转化的材料再生为整株植物。

DNA转移和再生之后，可以评估推定转化的植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成的情况，例如使用Southern分析。作为备选或者另外地，可以使用Northern和/或Western分析，或者定量PCR，监测新引入DNA的表达水平，所有技术对于本领域普通技术人员而言是熟知的。

产生的转化植物可以通过多种方式进行繁殖，例如通过克隆繁殖或者经典育种技术。例如，第一代转化植物(或T1)可以自交以产生纯合第二代(或T2)转化体，以及T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。

所产生的转化生物可采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，所有细胞经被转化而包含表达盒)；转化的和未转化的组织的嫁接物(例如，在植物中，嫁接至未转化的接穗上的转化的砧木)。

本发明显然可以延及由本文公开的任何方法生产的任何植物细胞或者植物，并可以扩展到其所有的植物部分和繁殖体。更特别地，本发明提供通过本发明方法可获得的植物、植物部分或者植物细胞，其中所述植物或者其部分或者细胞包含编码MYB-TF多肽的分离核酸，该核酸有效地连接组成型启动子或者胚乳特异性启动子。

本发明进一步延及至包括通过上述方法中的任何方法产生的原代转化的或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，唯一的要求是该后代展示出与在本发明的方法中亲本产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。

本发明还包括包含编码MYB-TF的分离的核酸的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。

本发明还延伸至植物的可收获部分例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及来源于，优选地直接来源于，这样的植物的可收获部分的产品，例如干颗粒饲料(pellet)或干粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包含编码MYB-TF多肽的核酸序列以及MYB-TF多肽在本发明方法中增加上文定义的植物产量的用途。

编码MYB-TF多肽的核酸序列，或MYB-TF多肽可用于育种程序，在所述育种程序中鉴定可与MYB-TF基因遗传连锁(genetically link)的DNA标记。该基因/核酸序列，或MYB-TF多肽可用于定义分子标记。然后可将该DNA或蛋白质标记用于育种程序以选择在本发明方法中具有上文定义的增加的产量的植物。

MYB-TF基因/核酸序列的等位基因变体也可用于标记辅助的育种程序。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过对植物进行诱变处理来导入等位基因变异；可选择地，该程序可始于非有意产生的所谓“天然”来源的等位基因变体的集合。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。之后进行目的序列的优良等位基因变体的选择，所述优良等位基因变体导致增加的产量。通常通过监测包含目的序列的不同等位基因变体的植物的生长性能来进行选择。可在温室或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将其中鉴定到了优良的等位基因变体的植物与其它植物杂交。这可用于例如产生有意义的表型特征的组合。

编码MYB-TF多肽的核酸序列还可用作对基因(所述MYB-TF核酸是所述基因的部分)进行遗传和物理作图的探针，和作为与这些基因连锁的性状的标记。这些信息可用于植物育种以产生具有期望的表型的品系。MYB-TF核酸序列的该用途只需要长度为至少15个核苷酸的核酸序列。MYB-TF核酸序列可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用MYB-TF核酸序列探测限制性酶消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，ALaboratory Manual)。然后使用计算机程序例如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)将所得的带型进行遗传分析以构建遗传图谱。此外，可使用该核酸序列探测包含限制性核酸内切酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中该组个体代表确定的遗传杂交的亲本和后代。记录DNA多态性的分离，将其用于计算MYB-TF核酸序列在之前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了用于遗传作图的植物基因来源的探针的制备和应用。许多出版物描述了使用上述方法学或其变型对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系(near isogenic line)和其他个体组可用于作图。此类方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

核酸探针还可用于物理作图(即，序列在物理图谱上的放置；参见Hoheisel等人In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，pp.319-346，和其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管FISH作图的现有方法有利于大克隆(数kb至数百kb；参见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)的使用，但灵敏度的提高可允许使用较短的探针进行FISH作图。

可使用核酸序列进行多种用于遗传和物理作图的基于核酸扩增的方法。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增的片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射性杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用于设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这样的引物的设计对于本领域技术人员来说是熟知的。在使用基于PCR的遗传作图的方法中，可能必需鉴定作图杂交(mapping cross)的两亲本在相应于本核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对于作图方法通常不是必需的。

根据本发明的方法产生具有如上定义的产量增加的植物。此增加的产量还可以与其它经济学有利性状相结合，所述其它有利性状为例如其它增加产量的性状、对其它非生物和生物胁迫的抗性、改良各种结构特征(architectural feature)和/或生物化学和/或生理学特征的性状。

附图描述

本发明现将参考下述附图进行描述，其中：

图1显示MYB-TF多肽的示意结构，从N端至C端包含含有两个MYB重复序列(两个小圈)的R2R3MYB DNA结合结构域(大圈)，和MYB4结构域(加框的)。这些结构域之外的多肽区域是可变的区域。

图2为由美国基因研究所(TIGR)(TC924083)暂时性汇编的与MYB-TF多肽相关的序列的列表。可以利用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库，通过关键词搜索或者通过使用目的核酸或者多肽序列以及BLAST算法，鉴定这些相关序列。这个列表是非穷尽的，可以使用数据库序列搜索工具在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中鉴定更相关的序列。

图3是植物R2R3 MYB-TF多肽的系统树，由Kranz等人(1998)PlantJournal 16(2)：263-276产生。包含目的进化枝的区域已从原树上被放大。显示了SEQ ID NO：2(来自稻)和SEQ ID NO：4(来自拟南芥)，并且使用粗箭头标出其在系统树上的位置。圆圈标出目的进化枝的起点。

图4是MYB-TF多肽序列的比对。使用Vector NTI suite(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序进行序列比对。采用空位开放罚分为10，以及空位延伸为0.01而进行多重比对。在有必要更好地放置一些保守区时，还实施了小量的人工编辑。所示的线将可用于实施本发明方法的MYB-TF多肽序列与其它MYB-TF多肽序列分离。跨所有显示的序列以大框标出两个MYB重复序列(R2和R3)。在这两个重复序列中的3个螺旋以小框标出。箭头标出保守Trp(W)残基。比对的多肽序列C末端的MYB4结构域被黑色框线框出，但是该框仅仅涵盖可以用于实施本发明方法的MYB-TF多肽序列。

图5显示在稻中表达编码MYB-TF多肽的稻核酸序列的载体，该核酸处于GOS2启动子(pGOS2)或者谷醇溶蛋白启动子(pProl)或者β-扩展蛋白启动子(pExp)的调控下。

图6详述了可以用于实施本发明方法的序列的实例。

实施例

现参考只用于举例说明目的下列实施例来描述本发明。下列实施例不旨在完全确定或以其它方式限定本发明的范围。

实施例1：鉴定与本发明方法使用的核酸序列相关的序列

使用数据库序列搜索工具例如基本局部比对工具(Basic LocalAlignment Tool)(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中，鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，本发明核酸序列编码的多肽被用于TBLASTN算法，使用缺省设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整缺省参数以更改搜索的严格度。例如可以提高E值以显示较低严格度的匹配。这样，可以鉴定短的几乎确切的匹配。

下表提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列的列表。

表A：与本发明方法中使用的核酸序列相关的核酸序列

 

名称	核酸SEQIDNO	多肽SEQIDNO		NCBI检索号	来源生物
						Orysa_MYB4	1	2	全长	D88620	稻
Arath_MYB5	3	4	全长	NM_112200	拟南芥
						Goshi_BNLGHi233	5	6	全长	AF336278	陆地棉
Lotco_MYB4	7	8	全长	AP007766.1	百脉根

 

					(Lotus corniculatus)
						Medtr_MYB4	9	10	全长	AC146760.13	蒺藜苜蓿(Medicagotrunculata)
Pethy_MYB4	11	12	全长	AY97332	碧冬茄(Petuniahybrida)
						Poptr_MYB4	13	14	全长	CA825038CN520600	似欧洲山杨(Populustremuloides)
Vitvi_MYB5b	15	16	全长	AY899404	葡萄(Vitis vinifera)
						Zeama_MYB4	17	18	全长	CZ363319AF470078	玉蜀黍
Antma_MYB4	19	20	partial	AJ568077	金鱼草(Antirrhinummajus)
						Lyces_MYB4	21	22	partial	DU949128.1	番茄
Solch_MYB4	23	24	partial	DN979550	Solanum chacoense
						Triae_MYB4	25	26	partial	CD897518	普通小麦
Brana_MYB4	32	33	全长	BN06MC2176547591244	欧洲油菜
						Eucgr_MYB4	34	35	全长	ADW16600	大桉(Eucalyptusgrandis)
Maldo_MYB4	36	37	全长	EG631283	苹果(Malusdomestica)
						Vitvi_MYB4Mybcs1	38	39	全长	AY555190	葡萄

一些情况中，相关序列已由研究机构，例如美国基因组研究所(TIGR)暂时汇编并予以公布。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库，通过关键词搜索或者通过采用目的核酸或者多肽序列的BLAST算法，鉴定此类相关序列。这种搜索的输出结果可以参见图2.

实施例2：相关多肽序列的比对

来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX基于普遍使用的渐进比对的聚类算法(Clustal algorithm)(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。可使用邻接聚类算法构建系统树。空位开放罚分的缺省值为10，空位延伸罚分的缺省值为0.1，选择的权重矩阵是Blosum 62(如果比对多肽)。

图4显示了在鉴定用于实施本发明方法的多肽中使用相关多肽进行多重序列比对的结果。使用Vector NTI suite(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序进行序列比对。采用空位开放罚分为10和空位延伸为0.01进行多重序列比对。当有必要更好放置一些保守区域时，还进行了少量的人工编辑。

显示的线将可以用于实施本发明方法的MYB-TF多肽序列与其它MYB-TF多肽序列分开。跨所有序列，以黑框框出两个MYB重复序列(R2和R3)。这两个重复序列中的3个螺旋采用淡框框出。保守Trp(W)残基使用箭头标出。仅仅针对可以用于实施本发明方法的MYB-TF多肽序列，用黑框框出比对的多肽序列C末端的MYB4结构域。

实施例3：计算可用于实施本发明方法的多肽序列之间的全局百分比同一性(global percentage identity)

使用可在本领域内获得的一个方法MatGAT(矩阵全局比对工具(Matrix Global Alignment Tool))软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)，确定可以用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。

比较所用的参数有：

               记分矩阵：Blosum 62

               首个空位：12

               延伸空位：2

多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。

与SEQ ID NO：2相比，可用于实施本发明方法的多肽序列之间的百分比同一性介于40％和56％之间。

表B：可用于实施本发明方法的MYB-TF多肽序列在全长上的全局相似性和同一性的MatGAT结果

 

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													1.Orysa_MYB4		41.2	45.1	44.2	45.1	47.8	40.1	43	42.5	41.1	42.7	55.9
2.Maldo_MYB4	50.1		41.8	43.4	53.9	47.6	50.7	50.1	52.1	50.4	56.6	39
													3.Arath_MYB5	59.6	48.2		78.9	48.8	54.1	43.1	50.5	45.4	47.1	47.3	44.7
4.Brana_MYB4	57.7	50.1	84.9		48.2	52.5	44.8	49.6	45.7	46.4	47.3	42.6
													5.Eucgr_MYB4	57.2	62.7	56.9	58.9		56.5	53.5	56.5	58.3	55	58.1	44.9
6.Goshi_BNLGHi233	59.6	54.9	65.9	64.5	66.2		50	58.7	54.6	52.2	54.8	47.3
													7.Lotco_MYB4	50.3	61.6	50.6	53.9	61.5	56.7		49.4	49.7	50	54.7	38.8
8.Pethy_MYB4	58	58.8	57.3	58	67.9	65.8	58.2		52.9	49.2	55.1	44.3
													9.Poptr_MYB4	53.2	61.3	55.7	56.6	66.8	58.9	61.2	62.7		51.3	55.4	39.8
10.Vitvi_MYB4 MybCs1	50.6	61.1	55.3	55.3	65	58.8	62.4	61.3	63.1		59	39.3
													11.Vitvi_MYB5b	54.3	68.9	54	57.6	70.7	62.4	67.6	65.9	68	72.2		41.5
12.Zeama_MYB4	66.9	48.2	60.4	56.3	56.2	60	49.1	58.7	51.3	51.6	52.7

由SEQ ID NO：28(DDDFSSFLDSLIND)所示的保守MYB4结构域包含在SEQ ID NO：2(氨基酸坐标231-244；参见图4)中。当计算用于实施本发明方法的多肽序列的保守MYB4结构域与SEQ ID NO：28所示的保守MYB4结构域之间(而非全长多肽之间)的同一性百分比时，至少达到60％的氨基酸同一性。例如，当与SEQ ID NO：28所示保守MYB4结构域比对时，如果与保守MYB4结构域有5个氨基酸残基差异，那么计算出氨基酸同一性是64％。

实施例4：可用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域的鉴定

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。每个数据库有其自己的搜索算法和entry检索号。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。

SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C和图1，4。

表C：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果

 

InterPro检索号	起源数据库	原检索号	检索名
				IPR001005	Pfam	PF00249	Myb_DNA结合
	SMART	SM00717	SANT
					Profile	PS50090	MYB_3
	Prosite	PS00334	MYB_2
				IPR009057	SUPERFAMILY	SF46689	类同源异型域
无IPR整合的	Panther	PTHR10641	MYB-相关
					Panther	PTHR10641:SF30	R2R3-MYB转录因子

实施例5：克隆用于本发明方法中的核酸序列

DNA操作：除非另有说明，否则重组DNA技术根据Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或者Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，卷1和2中公开的标准方法实施。植物分子工作使用的标准材料和方法公开在Plant MolecularBiology Labfase(1993)，R.D.D.Croy，BIOS Scientific Publications Ltd出版(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)。

本发明方法中使用的核酸序列通过使用定制的稻幼苗cDNA文库(pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行PCR扩增得到。在标准条件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶实施PCR，其中在50μlPCR混合物中使用200ng模板。使用的引物是prmO5233(SEQ ID NO：30；有义，起始密码子用粗体表示，AttB1位点以斜体表示：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGAAGCGGAAGCGG3’)和prm05234(SEQ ID NO：31；反向，互补，AttB2位点以斜体表示：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATCTCCCGAAAGATTACTGT3’)，其包含用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。然后实施Gateway方法的第一步，BP反应，其间PCR片段体内与pDONR201质粒重组，根据Gateway术语法，产生“入门克隆(entry clone)”，pMYB-TF。作为Gateway

技术的一部分，质粒pDONR201购自Invitrogen。

实施例6：表达载体构建

随后在LR反应中使用入门克隆和用于稻转化的目的载体。该载体含有位于T-DNA边界内的功能性元件：植物选择标记；可筛选标记表达盒；以及Gateway盒，其旨在用于与已经克隆到入门克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组。

在一个实施例中，用于组成型表达的稻GOS2启动子(pGOS2；SEQ IDNO：39)定位于此Gateway盒的上游。

在第二实施例中，用于胚乳特异性表达的稻谷醇溶蛋白启动子(pProl；SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：41)定位于此Gateway盒的上游。

在第三实施例中，用于在年幼的扩展组织中表达的稻β-扩展蛋白启动子(pExp；SEQ ID NO：40)定位于此Gateway盒上游。

LR重组步骤之后，获得的表达载体pGOS2::MYB-TF，pProl::MYB-TF和pExp::MYB-TF(图5)根据本领域熟知的方法独立地转化入农杆菌菌株LBA4044中。

实施例7：植物转化

稻的转化

使用包含表达载体的两个农杆菌菌株分别独立地转化稻植物。使稻栽培种日本晴(rice japonica cultivar Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70％的乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl₂中孵育30分钟，之后用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟来进行消毒。然后在包含2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)中萌发无菌种子。在黑暗中温育4周后，切取小盾板来源的胚发生愈伤组织，然后在相同的培养基上进行繁殖。2周后，通过在相同的培养基上传代培养再另外2周来繁殖或增殖愈伤组织。在共培养前3天在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以增强细胞分裂活性)。

包含表达载体的农杆菌株系LBA4404用于共培养。将农杆菌接种在具有适宜的抗生素的AB培养基上，在28℃下培养3天。然后收集细菌，将其悬浮在液体共培养培养基中直至大约为1的密度(OD₆₀₀)。然后将悬浮液转移至培养皿(Petri dish)，将愈伤组织浸渍在悬浮液中15分钟。然后将愈伤组织在滤纸上吸干，之后转移至固化的共培养培养基，在25℃黑暗中温育3天。然后在选择剂存在的情况下在28℃黑暗中，在包含2，4-D的培养基上生长共培养的愈伤组织4周。在此期间，产生了快速生长的抗性愈伤组织岛。在将该物质转移至再生培养基和在光照下孵育后，胚发生潜力被释放，在接下来的4至5周中发育出芽。将芽从愈伤组织切下，然后在包含生长素的培养基上孵育2至3周，然后将它们从所述培养基转移至土壤中。在温室中在高湿度和短日照下生长出变硬的芽。

对于每一个构建体产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室。在进行确认T-DNA插入物的拷贝数的定量PCR分析后，只保留展示对选择剂具抗性的单拷贝转基因植物用于T1种子的收获。然后在移植后3至5个月收获种子。该方法以50％多的比率产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等人1993，Hiei等人1994)。

实施例8：表型评估方法

6.1评估设置

产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培育室转移到温室，以生长和收获T1种子。保留5至7个独立事件，在所述事件中T1后代就转基因的存在/不存在而言发生3:1分离。对于这些事件的每个，通过监测可视标记表达而选择大约10个含有转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和大约10个缺少转基因(失效合子)的T1幼苗。转基因植物和对应的失效合子以随机位置并行生长。温室条件为短日照(日照12小时)，日间为28℃以及夜间为22℃，相对湿度为70％。

对T2代实施评估时，方法与用于T1代的方法相同，只是每个事件有更多个体。从播种阶段直到成熟阶段，使植物多次通过数字影像室。在每个时间点上，对每株植物从至少6个不同角度采集数字影像(2048x1536像素，1千6百万色素)。使用合适软件从影像推导出地上生物量。

为了检测根相关参数，使植物生长在特别设计的具有透明底的盆中，以便允许观察根。植物生长过程中用数字相机通过盆底记录影像。使用合适软件从影像推导出根的特征，例如总投影面积(其可以与总根体积相关)、某粗度阈值之上的根的平均直径和长度(粗根长度或细根长度)。这些参数的变化反映根生物量的变化，例如增加的根面积、增加的根长度或者增加的粗根数都可以指示根生物量的增加。

6.2统计学分析：F检验

使用双因素ANOVA(方差分析)作为统计学模型，整体评估植物表型特征。对本发明基因转化的所有事件的所有植物的所有测定参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于所有转化事件的效应，以及证实基因的总体效应，也称为“总体基因效应”。对于此F检验，真实的总体基因效应的显著性阈值设定在5％的概率水平上。显著性F检验值表明“基因”效应，意味着引起表型差异的不仅仅只是该基因的存在或者定位。

6.3参数测量

生物量相关参数测量

从播种阶段到成熟阶段，植物多次通过数字影像室。在每个时间点上，对每株植物从至少6个不同角度采集数字影像(2048×1536像素，1千6百万色素)。

从区别于背景的地上植物部分的数字影像中通过计数总像素数而确定植物地上面积(或者叶生物量)。针对在相同时间点从不同角度采集的图像，对该值进行平均，并且通过校准将其转化为以平方毫米表示的物理表面积数值。实验证明这种方法测量的地上植物面积与地上植物部分的生物量相关联。地上面积是在植物已经达到其最大叶生物量时测量的面积。早期活力(early vigour)是萌发后三周植物(幼苗)的地上面积。

另外，从开花之前地上生物量的影像推导其它参数：绿度指数，其是开花之前最后影像中绿色和暗绿色像素的比例(以％表述)。

根生物量增加表现为总根生物量增加(测量为植物生命期间观察到的根最大生物量)；或者表现为根/枝条指数的增加(测量为根和枝条的活跃生长期中根生物量和枝条生物量之间的比例)；或者表现为粗根的增加；或者表现为细根的增加。

种子相关参数测量

收获成熟的主圆锥花序、计数、袋装、用条形码标记，然后在37℃在烘箱中干燥3天。然后对圆锥花序脱粒，收集所有种子并进行计数。使用鼓风机将饱满谷壳与空谷壳分离。弃去空谷壳，然后对剩余级分再次计数。在分析天平上称取饱满谷壳的重量。通过计数在分离步骤后留下的饱满谷壳的数目来确定饱满种子的数目。通过称取从植物收获的所有饱满谷壳的重量来测量每株植物的总种子重量。通过计数从植物收获的谷壳的数目来测量每株植物的总种子数目。根据计数的饱满种子的数目和其总重量推算千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为总种子重量和地上面积(mm²)之间的比率乘以因子10⁶。本发明中定义的每圆锥花序的花的总数是种子总数与成熟的主圆锥花序的数目之间的比率。本发明中定义的种子饱满率是饱满种子的数目占种子(或小花)的总数的比率(以％表示)。

实施例9：转基因稻植物表型评估的结果，其中该植物包含处于组成型启动子调控之下编码MYB-TF多肽的核酸序列

如表D所示，出苗时的幼苗活力(seedling vigor at emergence或出苗势(emergence vigor))，粗根数，(开花前)绿度指数，种子饱满率，每株植物总种子重，饱满种子数和收获指数在组成型表达编码MYB-TF多肽的核酸序列的转基因植物T1代中，相比较于对照植物都增加。

表D显示了两个最好的独立转基因事件中，其T1代相比较于对照植物，在幼苗的出苗势，粗根数，(开花前)绿度指数，种子饱满率，每株植物总种子重，饱满种子数和收获指数上的平均增加百分比。

 

参数	增加的百分比
		出苗势	65
粗根	17
		种子饱满率	21
每株植物的种子总重量	80
		饱满种子数	77
收获指数	54
		(开花前)绿度指数	5

实施例10：转基因稻植物表型评估的结果，其中该植物包含处于胚乳特异性启动子调控之下编码MYB-TF多肽的核酸序列

如表E所示，相比较于对照植物，优先在胚乳中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达的转基因植物在T1代和T2代中都具有增加了的每株植物总种子重量、饱满种子数和收获指数。

表E显示了相比较于对照植物，独立转基因事件在T1代和T2代中于产量(每株植物总种子重量)、饱满种子数和收获指数上的平均增加百分比。

 

	T1代中增加的百分比	T2代中增加的百分比
			每株植物种子总重量	20	27
饱满种子数	18	26
			收获指数	17	25

相比较于对照植物，优先在(植物种子)胚乳中增加编码MYB-TF多肽的核酸序列的表达的转基因植物也具有增加的总种子数、饱满率和出苗势。

实施例11：转基因稻植物表型评估的结果，其中该植物包含处于用于在年幼的扩展组织中表达的启动子调控之下的、编码MYB-TF多肽的核酸序列

在β-扩展蛋白启动子(用于在年幼的扩展组织中的表达)控制下表达编码MYB-TF多肽的核酸序列的转基因植物，在T1代相比较于对照植物，显示出增加的收获指数。(参见表F)。

表F显示了独立转基因事件的T1代相比较于对照植物在收获指数上的平均增加百分比。

 

参数	增加的百分比
		收获指数	16

实施例12：其它谷物转化的实例

玉米转化

使用由Ishida等人(1996)Nature Biotech14(6)：745-50描述的方法的改进方法进行玉米(Zea mays)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，只有特定的基因型易于进行转化和再生。近交系A188(University ofMinnesota)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但也可成功地使用其他基因型。在授粉后(DAP)大约11天，当未成熟的胚的长度为大约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗子。将未成熟的胚与包含表达载体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养，通过器官发生重获转基因植物。将切离的胚培养在愈伤组织诱导培养基上，然后培养在包含选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用不同的选择标记)的玉米再生培养基上。在光照的情况下在25℃孵育培养皿2至3周，或直至芽产生。将绿色的芽从各胚胎转移至玉米生根培养基，在25℃孵育2-3周，直至根产生。然后将生根的芽移植至温室土壤中。从展示对选择剂的抗性且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

小麦转化

使用由Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行小麦的转化。通常将栽培品种Bobwhite(可从CIMMYT，Mexico获得)用于转化。将未成熟的胚与包含表达载体的根瘤农杆菌共培养，通过器官发生恢复转基因植物。在与农杆菌孵育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上进行体外培养，然后在包含选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用不同的选择标记)的再生培养基上进行培养。在光照的情况下在25℃下孵育培养皿2至3周，或直至芽产生。将绿色的芽从各胚转移至生根培养基，在25℃下孵育2-3周，直至根产生。将生根的芽移植至温室土壤中。从展示对选择剂的抗性且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

大豆转化

按照Texas A&M专利US5,164,310中描述的方法的改进方法转化大豆。几种商品化大豆品种易于通过该方法进行转化。通常将栽培品种Jack(可从Illinois Seed foundation获得)用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗切取下胚轴、胚根和一片子叶。让上胚轴和剩下的子叶进一步生长产生腋节(axillary node)。切取这些腋节，将其与包含表达载体的根瘤农杆菌一起温育。在共培养处理后，洗涤外植体，然后转移至选择培养基。切取再生的芽，将其置于芽伸长培养基上。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基上直至根产生。将生根的芽转移至温室的土壤中。从展示对选择剂的抗性且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

油菜/Canola的转化

5-6日龄的幼苗的子叶柄和下胚轴用作组织培养的外植体，按照Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)对其进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但也可使用其他品种。对Canola种子进行表面消毒以进行体外播种。从体外幼苗切取具有附着的子叶的子叶柄外植体，然后通过将子叶柄外植体的切口末端浸入细菌悬浮液中接种农杆菌(包含表达载体)。然后将外植体在23℃、16小时光照下，在包含3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％ Phytagar的MSBAP-3培养基上培养2天。在与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移至包含3mg/l BAP、头孢氨噻肟、羧苄青霉素或替卡西林-克拉维酸(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7天，然后在具有头孢氨噻肟、羧苄青霉素或替卡西林-克拉维酸和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直至芽再生。当芽的长度为5-10mm时，将其切离，然后转移至芽伸长培养基(MSBAP-0.5，包含0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的芽转移至生根培养基(MS0)以进行根诱导。将生根的芽移植至温室的土壤中。从展示对选择剂的抗性且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

紫苜蓿的转化

使用(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化紫苜蓿(Medicago sativa)的再生克隆。紫苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因而需要再生的植物。已描述了用于获得再生植物的方法。例如，这些再生植物可选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或由Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)描述的任何其他商业紫苜蓿品种。可选择地，已选择RA3品种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等人，1978 Am J Bot65：654-659)。将子叶柄外植体与包含表达载体的根瘤农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培养。将外植体在黑暗中在包含288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培养3天。在一半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体，然后将其种在不含乙酰丁香酮但具有适宜的选择剂和适宜的抗生素(以抑制农杆菌的生长)的相同SH诱导培养基上。在几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、无抗生素但含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后在一半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发体细胞胚。将生根的幼苗移植入花盆和生长在温室中。从展示对选择剂的抗性且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

Claims (34)

1.相对于对照植物增加植物产量的方法，包括增加编码MYB结构域转录因子(MYB-TF)多肽的核酸序列在植物中的表达，和任选地选择具有产量增加的植物，

其中所述核酸编码SEQ ID NO：2所示多肽序列。

2.根据权利要求1的方法，其中所述编码MYB-TF多肽的核酸序列来自稻属。

3.根据权利要求1的方法，其中所述编码MYB-TF多肽的核酸序列来自稻。

4.根据权利要求1的方法，其中所述编码MYB-TF多肽的核酸为SEQID NO：1所示核酸序列。

5.根据权利要求1的方法，其中该表达优先地在植物种子胚乳中增加。

6.根据权利要求1的方法，其中所述增加的表达通过将遗传修饰引入植物中而实现。

7.权利要求6的方法，其中所述遗传修饰被引入植物中编码MYB-TF多肽的基因的基因座中。

8.根据权利要求6的方法，其中所述遗传修饰通过T-DNA激活、TILLING和同源重组中的任何一种或者多种而实现。

9.相对于对照植物增加植物产量的方法，包括将编码MYB-TF多肽的核酸序列引入植物并在植物中表达，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸。

10.根据权利要求9的方法，其中所述核酸序列有效地连接组成型启动子。

11.根据权利要求10的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。

12.根据权利要求1、6或9中任何一项的方法，其中所述植物产量是下述一种或者多种：(i)增加的出苗时幼苗活力；(ii)增加的根生物量；(iii)(开花前)增加的绿度指数；(iv)增加的种子饱满率；(v)增加的每株植物的种子总重量；(vi)增加的饱满种子数或者(vii)增加的收获指数。

13.相对于对照植物增加植物产量的方法，包括引入编码MYB-TF多肽的核酸序列，并优先地在植物种子胚乳中增加该核酸序列的表达，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸。

14.根据权利要求13的方法，其中所述核酸序列有效地连接胚乳特异性启动子。

15.根据权利要求14的方法，其中所述胚乳特异性启动子是谷醇溶蛋白启动子。

16.根据权利要求5、6或13中任何一项的方法，其中所述植物产量是下述一种或者多种：(i)增加的每株植物的种子总重量；(ii)增加的饱满种子数或者(iii)增加的收获指数。

17.产生植物部分或植物细胞的方法，包括根据在先权利要求任何一项的方法获得所述产量增加的植物，从所述植物获得植物部分或者植物细胞，其中所述植物部分或者细胞包含编码所述MYB-TF多肽的分离的核酸，该分离的核酸有效地连接组成型启动子或者连接胚乳特异性启动子。

18.构建体，其包含：

a.编码MYB-TF多肽的核酸序列，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸；

b.用于驱动(a)的核酸序列在植物、植物部分或者植物细胞中表达的GOS2启动子或胚乳特异性启动子；以及，任选地

c.转录终止序列。

19.根据权利要求18的构建体，其中所述用于驱动表达的启动子为谷醇溶蛋白启动子。

20.根据权利要求18或者19的构建体在增加植物产量中的用途。

21.产生植物部分或植物细胞的方法，包括由根据权利要求18或者19的构建体转化植物部分或者植物细胞，由此获得包含编码所述MYB-TF多肽的分离的核酸的植物部分或植物细胞。

22.产生相对于对照植物产量增加的转基因植物的方法，该方法包括：

(i)将编码MYB-TF多肽的核酸序列引入植物、植物部分或者植物细胞并在其中表达，其中所述核酸序列的表达由组成型启动子或者由胚乳特异性启动子驱动，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸；

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育该植物部分或者植物细胞。

23.根据权利要求22的方法，还包括获得所述相对于对照植物产量增加的转基因植物的植物部分或植物细胞，其中所述产量的增加归因于编码MYB-TF多肽的核酸转基因在植物中表达的增加，其中所述植物部分或植物细胞含有所述转基因。

24.权利要求22的方法，其中所述表达优先地在植物种子胚乳中增加。

25.根据权利要求1、9、13、17、21、22、23或24中任何一项的方法，其中所述植物是作物植物。

26.根据权利要求1、9、13、17、21、22、23或24中任何一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。

27.根据权利要求1、9、13、17、21、22、23或24中任何一项的方法，其中所述植物是谷类。

28.根据权利要求1、9、13、17、21、22、23或24中任何一项的方法，其中所述植物是稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、小黑麦、高粱或燕麦。

29.根据权利要求17、21、23、或24中任何一项的方法，其中所述转基因植物部分为植物的可收获部分。

30.衍生自根据权利要求1-16和22-28之任一项的方法产生的转基因植物和/或根据权利要求29中定义的植物可收获部分的产品，所述产品为干颗粒或干粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

31.编码MYB-TF多肽的核酸序列在相对于对照植物增加植物产量中的用途，其中该核酸序列有效地连接组成型启动子，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸。

32.根据权利要求31的用途，其中所述植物产量是下述一种或者多种：(i)增加的出苗时幼苗活力；(ii)增加的粗根数；(iii)(开花前)增加的绿度指数；(iv)增加的种子饱满率；(v)增加的每株植物的种子总重量；(vi)增加的饱满种子数或者(vii)增加的收获指数

33.编码MYB-TF多肽的核酸序列在相对于对照植物增加植物产量中的用途，其中该核酸序列有效地连接胚乳特异性启动子，其中所述核酸为如权利要求1-4中任一项所定义的编码MYB-TF多肽的核酸。

34.根据权利要求33的用途，其中所述增加的植物产量是下述一种或者多种：(i)增加的每株植物的种子总重量；(ii)增加的饱满种子数或者(iii)增加的收获指数。

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