BR102013006235A2 - Método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta, construção de expressão, vetor de expressão recombinante, uso, método para a produção de uma planta transgênica, planta transgênica, parte passível de colheita de uma planta transgênica, produto produzido, método para a fabricação de um produto e método para o aperfeiçoamento da planta - Google Patents

Abstract

Plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento e um método de fabricação das mesmas. A presente invenção refere-se geralmente ao campo de biologia molecular de plantas e concerne a um método para otimizar diversos traços relacionados ao rendimento em piantas economicamente importantes. Mais especificamente, a presente invenção concerne a um método para otimizar traços relacionados ao rendimento em plantas por meio da modulação da expressão em uma planta de um ácido nucíeico que codifica um polipeptideo de flavodoxina de uma forma específica. A presente invenção também se refere a plantas que têm a expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fíavodoxina modulada por um tipo particular de promotor, tais plantas têm traços relacionados ao rendimento otimizados em comparação com as plantas de controle. A invenção também fornece construções até agora desconhecidas, úteis na execução dos métodos da invenção.

Description

“MÉTODO PARA OTIMIZAR UM OU MAIS TRAÇOS RELACIONADOS AO

RENDIMENTO EM UMA PLANTA, CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, VETOR

DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, USO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO

DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE

PASSÍVEL DE COLHEITA DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PRODUTO

PRODUZIDO, MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO E MÉTODO PARA O APERFEIÇOAMENTO DA PLANTA” O presente pedido reivindica prioridade dos seguintes pedidos: EP^I2162830.9, depositado em 2 de abril de 2012 e US 61/618859 depositado em 2 de abril de 2012, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência em relação a todo o conteúdo da descrição. É adicionalmente incorporado a título de referência o pedido de patente internacional ns. PCT/GB02/04612, publicado como W02003/035881, explicitamente as páginas 35 a 45 e, particularmente, as flavodoxinas e peptídeos de trânsito relacionados no mesmo; assim como EP1532257 e, particularmente, o promotor de PCPR apresentado no mesmo còmo “PR0123” e como SEQ ID NO: 14.

Fundamentos da invenção Campo da invenção A presente invenção refere-se geralmente ao campo de biologia molecular de plantas e se refere a um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas por meio do aumento da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina de uma forma particular. A presente invenção também se refere a plantas que têm expressão especifícamente aumentada de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina com direcionamento de plastídeo, tais plantas têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle correspondentes. A invenção também fornece construções úteis nos métodos, usos, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção.

Descrição da técnica relacionada A população mundial continuamente crescente e o suprimento cada vez menor de terra arável disponível para agricultura incentiva a pesquisa dirigida ao aumento da eficiência da agricultura. Os meios convencionais para aperfeiçoamentos de safra e horticultura utilizam técnicas de reprodução seletiva para identificar as plantas que têm características desejáveis. No entanto, tais técnicas de reprodução seletiva têm várias desvantagens, ou seja, estas técnicas são tipicamente intensivas em mão de obra e resultam em plantas que muitas vezes contêm componentes genéticos heterogêneos que podem nem sempre resultar no traço desejado que é transmitido a partir de plantas pai. Os avanços em biologia molecular têm permitido que a humanidade modifique o germoplasma de animais e plantas. A engenharia genética de plantas implica o isolamento e manipulação de material genético (tipicamente, na forma de DNA ou RNA) e a introdução subsequente deste material genético em uma planta. Tal tecnologia tem a capacidade de liberar safras ou plantas que têm diversos traços econômicos, agronômicos e horticulturais aperfeiçoados.

Um traço de interesse econômico consiste no rendimento aumentado. O rendimento é normalmente definido como a produção mensurável de valor econômico a partir de uma safra. O rendimento é diretamente dependente de vários fatores, por exemplo, o número e tamanho dos órgãos, arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramificações), produção de semente, senescência da folha e mais. O desenvolvimento da raiz, absorção de nutriente, tolerância ao estresse e vigor precoce também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. A otimização dos fatores mencionados anteriormente pode, portanto, contribuir para o aumento do rendimento da safra. O rendimento de semente é um traço importante, uma vez que as sementes de muitas plantas são importantes para a nutrição humana e animal.

As safras, tais como milho, arroz, trigo, canola e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica humana total, se através do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne produzidos em sementes processadas. Também é uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. As sementes contêm um emórião (a fonte de novos galhos e raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento do embrião durante a germinação e durante o crescimento precoce de mudas). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes e exige a transferência de metabólitos a partir das raízes, folhas e caules na semente do cultivar. O endosperma, em particular, se assemelha aos precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e sintetizam os mesmos em macromoléculas de armazenamento para completar o grão.

Outro trato importante para muitas safras consiste no vigor precoce. O aperfeiçoamento do vigor precoce é um objetivo importante dos programas modernos de melhoramento genético de arroz tanto em cultivares de arroz temperados e tropicais. As raízes longas são importantes para a fixação do solo adequada em arroz semeado em água. Onde o arroz é semeado diretamente em campos inundados, e onde as plantas precisam emergir rapidamente através da água, os galhos mais longos estão associados com o vigor. Onde a semeadura em sulcos é praticada, mesocótilos e coleóptilos maiores são importantes para a boa emergência da muda. A capacidade de criar o vigor precoce em plantas seria de grande importância na agricultura. Por exemplo, o vigor precoce insatisfatório tem sido uma limitação para a introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) com base no germoplasma do cinturão do milho (Corn Belt) no atlântico europeu.

Um traço importante consiste naquele de tolerância ao estresse abiótico aperfeiçoada. O estresse abiótico é uma causa principal de perda de safra mundial, que reduz os rendimentos médios para a maioria das plantas cultivadas principais por meio do que 50% (Wang et aí., Plant 218, 1-14, 2003).

Os estresses abióticos podem ser causados por secura, salinidade, deficiência de nutriente, extremos de temperatura, toxicidade química e estresse oxidante. A capacidade de aperfeiçoar a tolerância da planta ao estresse abiótico seria de grande vantagem econômica e iria permitir a cultivação de safras durante I condições adversas e em territórios onde a cultivação de safras não pode ser de outra forma possível. O estresse ambiental é um fator limitante principal para a produtividade e rendimento da safra. Muitos dos processos deletérios experimentados por plantas expostas a condições ambientais adversas são mediados por espécies reativas de oxigênio (ROS) que são geradas em cloroplastos através do desempenho falho do aparelho fotossintético (Foyer, C. H. et al. (1994) Plant Cell Environ. 17,507- 523, Hammond-Kosack, K. E., e Jones, J. D. G. (1996) Plant Cell 8, 1773-1791, Allen, R. (1995) Plant Physiol. 107 1 1049-1054), a auto-oxidação de componentes da cadeia de transporte de elétron fotossintético conduz à formação de radicais superóxido e seus derivados, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. Estes compostos reagem com uma ampla variedade de biomoléculas (de modo mais conspícuo, DNA), que causa a estase e morte da célula.

Para enfrentar os efeitos prejudiciais das espécies reativas de oxigênio (ROS), os organismos aeróbicos têm evoluído sistemas de defesa antioxidante altamente eficientes que são compostos tanto de constituintes enzimáticos como não enzimáticos. Em diferentes tecidos e organismos, os antioxidantes desempenham funções protetoras diferentes e muitas vezes complementares, tais como remoção direta de ROS 1, substituição de biomoléculas sensíveis oxidantes danificadas e atividades de reparo de DNA (Fridovich 1 I. (1997). J. Biol. Chem. 272,1851-1857). Ao menos parte da resposta celular contra o estresse oxidante é de uma natureza adaptativa e envolve a síntese de novo de membros comprometidos da barreira antioxidante. Diversas respostas multigênicas têm sido reconhecidas na bactéria aeróbica facultativa Escherichia coli, que incluem aquelas moduladas pelos reguladores soxRS e oxyR (Hidalgo, E., e Demple, B. (1996). In t Regjulation of Gene Expression in Escherichia coli, Molecular Biology Inteíligence Unit Series (E. C. C. Lin e A. S. Lynch, eds.), páginas 434 a 452, Austin, TX: R. G. Landis). A resposta de soxRS parece ser especificamente adaptada para enfrentar os desafios impostos pela exposição das células a radicais superóxido ou ao óxido nítrico. Muitos componentes diferentes da resposta têm sido identificados, que incluem duas flavoproteínas solúveis: ferredoxina contendo FAD-NADP+ redutase (FNR), e seu substrato parceiro de elétron flavodoxina (Liochev et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sei. USA 91,1328-1331, Zheng, M. et al (1999) J. Bacteriol. 181,4639-4643).

As flavodoxinas são pequenas proteínas nanoméricas (Mw 18.800) que contêm uma molécula de FMN ligada de maneira não covalente (Razquin, P. et al (1988) J. Bacteriol. 176, 7409- 7411). FNR é capaz de utilizar, com eficiências aproximadamente similares, tanto a flavodoxina como a proteína de ferro-enxofre ferredoxina como substratos para sua atividade de NADP(H) oxidoredutase. Em cianobactérias, a expressão de flavodoxina é induzida sob condições de privação de ferro, quando a ferredoxina não pode ser sintetizada.

Como parte da resposta de soxRS de E. coli, tanto os níveis de FNR como de flavodoxina aumentam acima de vinte vezes sob o tratamento das bactérias com compostos de propagação de superóxido, tais como o herbicida de ciclo de redox metil viologênio (MV) , enquanto que as quantidades de ferredoxina não são afetadas (Rodriguez, R. E. et al (1998) Microbiology 144,2375-2376). Ao contrário de FNR e ferredoxinas, os quais são amplamente distribuídos entre plastídeos, mitocôndria e bactérias, a ocorrência de flavodoxina parece ser muito restrita a bactérias. As flavodoxinas não têm sido isoladas a partir de tecidos de planta, e nenhum homólogo de flavodoxina tem sido reconhecido no genoma de Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Geqome Initiative (2000) Nature 408,796- 815). Tem sido descrito que as linhas 4 % de planta que têm sido projetadas para expressar uma flavoproteína, tal como a flavodoxina, exibem tolerância otimizada em comparação com o controle, plantas não tratadas, quanto expostas a uma condição de estresse ambiental (vide a publicação de patente internacional PCT/GB02/04612, publicada como W02003/035881, depositada em 10.10.2002 pelo requerente PLANT BIOSCIENCE LTD, a seguir mencionada como WO 03/035881). O rendimento de safra pode ser, portanto, aumentado por meio da otimização de um dos fatores mencionados acima.

Dependendo do uso final, a modificação de determinados traços de rendimento pode ser favorecida sobre outras. Por exemplo, para aplicações tais como produção de madeira ou forragem, ou recurso de biocombustível, um aumento nas partes vegetativas de uma planta pode ser desejável, e para aplicações tais como produção de farinha, amido ou óleo, um aumento em parâmetros da semente pode ser particularmente desejável. Até entre os parâmetros da semente, alguns podem ser preferidos a outros, dependendo da aplicação. Diversos mecanismos podem contribuir para aumentar o rendimento de semente, se for na forma de tamanho de semente aumentado ou número de semente aumentado.

Descobriu-se agora que diversos traços relacionados ao rendimento podem ser aperfeiçoados em plantas por meio da modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um poüpeptídeo de flavodoxina.

Breve Descrição da invenção A presente invenção está relacionada a um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas por meio do aumento especificamente da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um poüpeptídeo de flavodoxina que é direcionado para plastídeos. A presente invenção também se refere a plantas que têm expressão » % especificamente aumentada de um ácido nucleico que codifica um poüpeptídeo de flavodoxina com direcionamento de plastídeo, tais plantas têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em comparação com as plantas de controle. A invenção também fornece construções até agora desconhecidas que compreendem ácidos nucleicos que codificam flavodoxina, úteis na execução dos métodos da invenção.

Uma realização preferida consiste em um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, que compreende as etapas de aumentar a expressão, de preferência, por meio de métodos recombinantes, em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um poüpeptídeo de flavodoxina de uma forma particular, em que a expressão é sob o controle de uma sequência de promotor particular ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o poüpeptídeo de flavodoxina, e cultivar a(s) planta(s).

Por conseguinte, consiste em um objetivo da invenção fornecer uma construção de expressão e uma construção de vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um poüpeptídeo de flavodoxina, ligada de maneira operável a uma sequência de promotor benéfica. É fornecido o uso de tais construções genéticas para fabricação de uma planta transgênica que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, de preferência, biomassa e/ou rendimento de semente aumentado, em relação a plantas de controle.

Além disso, uma realização preferida consiste em plantas transgênicas transformadas com uma ou mais construções de expressão da invenção e, deste modo, expressando de uma forma particular os ácidos nucleicos que codificam um peptídeo de trânsito e uma proteína flavodoxina, > em ,que as plantas têm um ou mais traços relacionados ao rendimento 4 A otimizados. As partes passíveis de colheita das plantas transgênicas da presente invenção e produtos derivados a partir da planta transgênicas e suas partes passíveis de colheita também são parte da presente invenção.

Em particular, descobriu-se que surpreendentemente a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e uma flavodoxina, conforme definido no presente documento, sob o controle de um promotor de protoclorofilida redutase (PCPR), conforme definido no presente documento abaixo, resulta em biomassa aumentada, rendimento de semente aumentado e/ou teor de açúcar aumentado de plantas que compreendem a dita combinação de PCPR funcionalmente ligado ao dito ácido nucleico exógeno em comparação com as plantas de controle sob condições padrão e/ou de estresse abiótico.

Breve descrição das várias vistas dos desenhos A presente invenção será agora descrita com referência às seguintes figuras, nas quais: A Figura 1 representa a estrutura de domínio de SEQ ID NO: 2 com motivos e/ou domínios conservados. Os domínios foram identificados e visualizados com o uso do software InterProScan (vide Zdobnov E.M. e Apweiler R.; "InterProScan - an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro."; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8'; InterPro database, Release 36.0, 23 de fevereiro de 2012) (A) e o software InterproScan versão 4.8, InterPro database release 41 de 13 de fevereiro de 2013 (B). A Figura 2 representa o vetor binário usado para a expressão específica em cana de açúcar de um ácido nucleico que codifica flavodoxina (FLD) fundido a um peptídeo de trânsito de plastídeo (TP), representada por TP::FLD, sob o controle de um promotor de protoclorofilida redutase (pPCPR). A flavodoxina, peptídeo de trânsito e promotor de protoclorofilida redutase são t conforme apresentado no presente documento. 1 Descrição detalhada da invenção Definições As seguintes definições serão usadas por todo o presente pedido.

Os títulos e cabeçalhos da seção neste pedido são para propósito de conveniência e referência somente e não deveríam afetar de forma alguma o significado e interpretação deste pedido. Aos termos técnicos e expressões usadas dentro do escopo deste pedido é dado o significado comumente aplicado aos mesmos na técnica pertinente de biologia vegetal, biologia molecular, bioinformática e melhoramento genético da planta. Todas as seguintes definições de termo se aplicam ao conteúdo completo deste pedido.

Deve-se compreender que, para uso no relatório descritivo e nas reivindicações, “um" ou “uma” pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Deste modo, por exemplo, a referência a “uma célula” pode significar que ao menos uma célula pode ser utilizada. O termo “essencialmente”, “cerca de”, “aproximadamente” e similares, em conexão com um atributo ou um valor, particularmente, também definem exatamente o atributo ou exatamente o valor, respectivamente. O termo “cerca de” no contexto de um determinado valor ou faixa numérica se refere, em particular, a um valor ou faixa que está dentro de 20%, dentro de 10%, ou dentro de 5% do valor ou faixa determinada. Para uso na presente invenção, o termo “compreender" também abrange o termo “consistir em”.

Peptídeo(s) / Proteína(s) Os termos “peptídeos”, “oligopeptídeos”, “polipeptídeo” e “proteína” são usados de maneira intercambiável no presente documento e se referem a aminoácidos em uma forma polimérica de qualquer comprimento, ligados em conjunto por ligações de peptídeo, exceto onde mencionado em contrário no presente documento.

Polipucleotídeo(s) / Ácido(s) nucleico(s) / Sequência(s) de ácido nucleico / Seq^uênciaís) de nucleotídeo Os termos "polinucleotídeo(s)", "sequência(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de nucleotídeo", “ácido(s) nucleico(s)”, “molécula de ácido nucleico” são usados de maneira intercambiável no presente documento e se referem a nucleotídeos, ribonucleotídeos ou deoxiribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma não ramificada polimérica de qualquer comprimento.

Homólogo(s) Os “homólogos” de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, apagamentos e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e que tem substancialmente a mesma atividade funcional e biológica que a proteína não modificada a partir da qual são derivados. Os “homólogos” de um gene abrangem genes que têm uma sequência de ácido nucleico com substituições, apagamentos e/ou inserções de nucleotídeo em relação ao gene não modificado em questão e que tem substancialmente a mesma atividade funcional e/ou biológica que o gene não modificado a partir do qual são derivados, ou que codifica polipeptídeos que têm substancialmente a mesma atividade funcional e biológica que o polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico não modificada. O termo “nucieotídeo” se refere a um bloco de construção de ácido nucleico que consiste em uma núcieobase, uma pentose e ao menos um grupo fosfato. Deste modo, o termo “nucieotídeo” inclui um nucleosídeo monofosfato, nucleosídeo difosfato e nucleosídeo trifosfato.

Os ortólogos e paralógos são duas formas diferentes de homólogos e abrangem os conceitos evolucionários usados para descrever as relações ancestrais de genes ou proteínas. Os paralógos são genes ou proteínas dentro da mesma espécie que têm se originado através da A duplicação de um gene ou ancestral proteína; os ortólogos são genes ou proteína a partir de diferentes organismos que têm se originado através de especiação e também são derivados a partir de um gene ou proteína ancestral comum.

Um “apagamento” se refere à remoção de um ou mais aminoácidos a partir de uma proteína ou uma remoção de um ou mais nucleotídeos a partir de um ácido nucleico.

Uma “inserção” se refere a um ou mais resíduos de amínoácido que são introduzidos em um local predeterminado em uma proteína ou a um ou mais nucleotídeos que são introduzidos em um local predeterminado em uma sequência de ácido nucleico. Em relação a uma proteína, as inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal, assim como as inserções intrassequência de únicos ou múltiplos aminoácidos. Geralmente, as inserções dentro da sequência de amínoácido serão menores do que as fusões N- ou C- terminal, da ordem de cerca de 1 ao 10 resíduos. Os exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um ativador transcripcional, conforme usado no sistema de duplo híbrido de levedura, proteínas de revestimento de fago, (histidina)-6-tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação de maltose, dihidrofolato redutase, epítopo Tag 100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (peptídeo de ligação de calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C e epítopo VSV.

Uma “substituição” se refere à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que têm propriedades similares (tais como similar hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão a formar ou romper estruturas helicoidais α ou estruturas de folha β). As substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas sob polipeptídeo. As substituições de aminoácido são, de preferência, substituições de aminoácido conservadoras. As tabelas de substituição conservadora são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Company (Eds) e a Tabela 1 abaixo).

As substituições, apagamentos e/ou inserções de aminoácido podem ser prontamente feitas com o uso de técnicas sintéticas de peptídeo conhecidas na técnica, tais como síntese de peptídeo de fase sólida, e similares, ou por meio de manipulação recombinante de DNA. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir as variações de substituição, inserção ou apagamento de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as técnicas para fabricação de mutações de substituição em locais predeterminados em DNA são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica e incluem a mutagênese M13, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese sítio dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese sítio dirigida mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese sítio dirigida (vide Current Protocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y, (1989 e atualizações anuais)).

Derivados Os “derivados” de proteínas ou polipeptídeos incluem > polipeptídeos que podem, em comparação com a sequência de aminoácido da Ji forma de ocorrência natural da proteína ou polipeptídeo, tal como a proteína de interesse, compreender substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácido de ocorrência não natural, ou adições de resíduos de aminoácido de ocorrência não natural. Os “derivados” de uma proteína ou polipeptídeo também abrangem os polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido alterados de ocorrência natural (glicosilado, acilado, prenilado, fosforilado, miristoilado, sulfatado, etc.) ou alterado de maneira não natural em comparação com a sequência de aminoácido de uma fôrma de ocorrência natural do polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes ou adições de não aminoácido em comparação com a sequência de aminoácido a partir da qual o mesmo é derivado, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligante, ligado de maneira covalente ou não covalente à sequência de aminoácido, tal como uma molécula repórter que é ligada para facilitar sua detecção, e resíduos de aminoácido de ocorrência não natural em relação à sequência de aminoácido de uma proteína de ocorrência natural. Adicionalmente, os “derivados” também incluem fusões da forma de ocorrência natural da proteína com peptídeos de marcação, tais como FLAG, HIS6 ou tioredoxina (para uma revisão de peptídeos sinais, vide Terpe, Appl.

Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003). Os “derivados” de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que podem, em comparação com a sequência de nucleotídeo da forma de ocorrência natural do ácido nucleico, compreender apagamentos, alterações ou adições com os nucleotídeos de ocorrência não natural. Os “derivados” de um ácido nucleico também abrangem ácidos nucleicos que compreendem nucleotídeos alterados de ocorrência natural ou alterados de maneira não natural em comparação com a sequência de nucleotídeo de uma forma de ocorrência natural do ácido nucleico. Um derivado de uma proteína ou ácido nucleico ainda fornece substancialmente a > me^ma função, por exemplo, traço relacionado ao rendimento otimizado, ,.¾ quaYido expresso ou reprimido em uma planta, respectivamente.

Fragmentos funcionais O termo “fragmento funcional” se refere a qualquer ácido nucleico ou proteína que compreende somente uma parte do ácido nucleico completo ou proteína completa, respectivamente, mas ainda fornece substancialmente a mesma função, por exemplo, traço relacionado ao rendimento otimizado, quando expresso ou reprimido em uma planta, respectivamente.

Em casos onde a superexpressão de ácido nucleico é desejada, o termo “substancialmente a mesma atividade funcional” ou “substancialmente a mesma função" significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece traço(s) relacionado(s) ao rendimento otimizado/aumentado, quando expresso em uma planta. Prefere-se que substancialmente a mesma atividade funcional ou substancialmente a mesma função se refere à ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80 %, ao menos 90 %, ao menos 95%, ao menos 98 %, ao menos 99% ou 100% ou mais do traço(s) relacionado(s) ao rendimento otimizado/aumentado em comparação com a atividade funcional fornecida pela expressão exógena da sequência de nucleotídeo de flavodoxina completa ou da sequência de aminoácido de flavodoxina.

Domínio / Motivo / Sequência consenso / Assinatura O termo "domínio" se refere a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas relacionadas de maneira evolucionária. Enquanto que os aminoácidos em outras posições podem variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam os aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados por seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, podem ser i usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em A questão pertence a uma família de polipeptídeo identificada anteriormente. O termo “motivo” ou “sequência consenso" ou “assinatura” se refere a uma região conservada curta na sequência de aminoácido ou sequências de ácido nucleico relacionadas de maneira evolucionária. Para sequências de aminoácido, os motivos são muitas vezes partes altamente conservadas de domínios, mas também podem incluir somente parte do domínio, ou estar localizado fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo ficarem fora de um domínio definido).

As bases de dados especialistas existem para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequencies motifs and its function in automatic sequency interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Sycaules for Molecular Biology.

Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI

Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)) ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)) e a base de dados de famílias de proteína Pfam (R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L.

Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:211-222). Um conjunto de ferramentas para a análise in silico de sequências de proteína está disponível no servidor de proteômica ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et ai., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). Os domínios ou motivos também podem ser identificados com o uso de técnicas de rotina, tais como, por meio t de plinhamento de sequência. i Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, abrangência das sequências completas) de duas sequências que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de vãos. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a porcentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para executar a análise BLAST está publicamente disponível através do National Centre for Biotecnology Information (NCBI). Os homólogos podem ser prontamente identificados com o uso, por exemplo, do algoritmo de alinhamento de sequência múltipla ClustalW (versão 1.83), com os parâmetros de alinhamento em pares predefinido, e um método de pontuação em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas com o uso de um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanelia et al., BMC Bioinformatics. 10 de julho de 2003; 4:29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/identidade com o uso de proteína ou sequências de DNA). A edição manual menor pode ser executada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, conforme seria evidente para um elemento versado na técnica. Adicionalmente, em vez de utilizar sequências completas para a identificação de homólogos, os domínios específicos também podem ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados sobre toda a sequência de aminoácido ou ácido nucleico ou sobre os domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), com o uso dos programas mencionados acima que utilizam os parâmetros predefinidos. Para os alinhamentos locais, o algoritmo Smith-Waterman é particularmente útil í (Srpith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195-7).

BLAST RECÍPROCO

Tipicamente, isto envolve um primeiro BLAST que envolve submeter ao BLAST (isto é, execução do software BLAST com a sequência de interesse como sequência de consulta) uma sequência de consulta (por exemplo, com o uso de qualquer uma das sequências relacionadas na Tabela 2 ou 3) frente qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados NCBI publicamente disponível. BLASTN ou TBLASTX (com o uso de valores predefinidos padrão) são geralmente usados quando se inicia a partir de uma sequência de nucíeotídeo, e BLASTP ou TBLASTN (com o uso de valores predefinidos padrão) quando se inicia a partir de uma sequência de proteína.

Os resultados de BLAST podem ser opcionalmente filtrados. As sequências completas dos resultados filtrados ou resultados não filtrados são, então, submetidas ao BLAST posterior (segundo BLAST) frente às sequências a partir do organismo a partir do qual a sequência de consulta é derivada. Os resultados do primeiro e segundo BLAST são, então, comparados. Um paralógo é identificado se um ocorrência de classificação alta do primeiro BLAST for a partir da mesma espécie a partir da qual a sequência de consulta é derivada, um BLAST posterior, então, resulta de forma ideal na sequência de consulta entre as ocorrências maiores; um ortólogo é identificado se uma ocorrência de classificação alta no primeiro BLAST não for a partir da mesma espécie a partir da qual a sequência de consulta é derivada e, de preferência, os resultados sob BLAST posterior na sequência de consulta estando entre as ocorrências maiores.

As ocorrências de classificação alta são aquelas que têm um baixo valor E. Quanto menor o valor E, mas significante a pontuação (ou, em outras palavras, menor a chance que a ocorrência foi encontrada por acaso). A computação do valor E é bem conhecida na técnica. Em adição aos valores E, >

as comparações também são classificadas por porcentagem de identidade. A .* porcentagem de identidade se refere ao número de nucleotídeos idênticos (ou aminoácidos) entre as duas sequências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas sobre um comprimento particular. No caso de famílias grandes, o ClustalW pode ser usado, seguido por uma árvore de união vizinha, para ajudar a visualizar o agrupamento de genes relacionados e identificar os ortólogos e paralógos.

Peptídeo de trânsito Um “peptídeo de trânsito” (ou sinal de trânsito, peptídeo sinal, sequência sinal) é uma cadeia curta (3 a 60 aminoácidos de comprimento) de peptídeo que direciona o transporte de uma proteína, de preferência, para organelas dentro da célula, para determinados locais subcelulares ou para a secreção de uma proteína. Os peptídeos de trânsito também podem ser chamados de sinal de trânsito, peptídeo sinal, sequência sinal, sinais de direcionamento, ou sinais de localização (subcelular).

Hibridação O termo "hibridação", conforme definido no presente documento, é um processo em que as sequências de nucleotídeo complementares substancialmente homólogas se anelam umas às outras. O processo de hibridação pode ocorrer totalmente em solução, isto é, ambos os ácidos nucleicos complementares ficam em solução. O processo de hibridação também pode ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados a uma matriz, tal como esferas magnéticas, esferas de sefarose ou qualquer outra resina. O processo de hibridação pode ocorrer, adicionalmente, com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados a um suporte sólido, tal como uma membrana de nitro-celulose ou náilon ou imobilizados por meio, por exemplo, de foto litografia a, por exemplo, um suporte de vidro silicioso (o último conhecido como arranjos ou microarranjos » de 4ácido nucleico ou como chips de ácido nucleico). Com a finalidade de % % permitir que a hibridação ocorra, as moléculas de ácido nucleico são geralmente desnaturadas de maneira térmica ou química para fundir um filamento duplo em filamentos simples e/ou para remover grampos ou quaisquer estruturas secundárias a partir de ácidos nucleicos de filamento simples. O termo “severidade” se refere às condições sob as quais uma hibridação ocorre. A severidade de hibridação é influenciada por condições, tais como temperatura, concentração de sal, intensidade tônica e composição de tampão de hibridação. Geralmente, as condições de severidade baixa são selecionadas para serem de cerca de 30°C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em uma intensidade tônica e pH definidos. As condições de severidade média são quando a temperatura é de 20°C abaixo de Tm, e as condições de severidade alta são quando a temperatura é de 10°C abaixo de Tm. As condições de hibridação de severidade alta são tipicamente usadas para isolar as sequências de hibridação que têm alta similaridade de sequência a sequência de ácido nucleico alvo. No entanto, os ácidos nucleicos podem se desviar em sequência e ainda codificar um polipeptídeo substancialmente idêntico, devido à degeneração do código genético. Portanto, as condições de hibridação de severidade média podem ser às vezes necessárias para identificar tais condições moléculas de ácido nucleico. O Tm é a temperatura sob a intensidade iônica e pH definidos, na qual 50% da sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente compatível. O

Tm é dependente das conduções da solução, da composição base e do comprimento da sonda. Por exemplo, as sequências mais longas hibridizam específicamente em temperaturas maiores. A taxa máxima de hibridação é obtida a partir de cerca de 16°C até 32°C abaixo de Tm. A presença de cátions I mopovalentes na solução de hibridação reduzem a repulsão eletrostática entre & os clois filamentos de ácido nucleico promovendo, assim, a formação híbrida; este efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4M (para concentrações maiores, este efeito pode ser ignorado). O formamida reduz a temperatura de fusão de DNA-DNA e dúplices de DNA-RNA com 0,6 a 0,7°C para cada formamida por cento, e a adição de 50% de formamida permite que a hibridação seja executada a 30 a 45°C, embora a taxa de hibridação seja reduzida. As incompatibilidades de par de base reduzem a taxa de hibridação e a estabilidade térmica dos dúplices. Em média e para sondas grandes, o Tm diminui cerca de 1°C por % de incompatibilidade de base. O Tm pode ser calculado com o uso das seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos; 1) híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984);

Tm= 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] - 500x[Lc]-1 - 0,61 x% de formamida 2) híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA: Tm= 79,8°C+ 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc 3) híbridos de oligo-DNA ou oligo-RNAd: Para <20 nucleotídeos: Tm= 2 (In) Para 20 a 35 nucleotídeos: Tm= 22 + 1,46 (In) a ou para outro cátion monovalente, mas somente preciso na faixa de 0,01 a 0,4 M. b somente preciso para % de GC na faixa de 30% a 75%. c L = comprimento de dúplex em pares de base. d oligo, oligonucleotídeo; In, = comprimento eficaz de primer = 2x(n2. de G/C)+(n2. de ATT). » , A ligação não específica pode ser controlada com o uso de qualquer uma dentre uma série de técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, o bloqueio da membrana com soluções contendo proteína, adições de RNA, DNA e SDS heterólogo ao tampão de hibridação e o tratamento com Rnase. Para sondas não homólogas, uma série de hibridações pode ser executada por meio da variação de um dentre (i) reduzir progressivamente a temperatura de anelamento (por exemplo, a partir de 68°C a 42°C) ou (ii) reduzir progressivamente a concentração de formamida (por exemplo, a partir de 50% a 0%). O elemento versado na técnica tem conhecimento de diversos parâmetros que podem ser alterados durante a hibridação e que irão manter ou alterar as condições de severidade.

Além das condições de hibridação, a especificidade da hibridação tipicamente também depende da função de lavagens de pós-hibridação. Para remover secundários resultantes a partir da hibridação não específica, as amostras são lavadas com soluções salinas diluídas. Os fatores críticos de tais lavagens incluem a intensidade iônica e a temperatura da solução de lavagem final: quanto menor a concentração de sal e quanto maior a temperatura de lavagem, maior a severidade da lavagem. As condições de lavagem são tipicamente executadas em ou abaixo da severidade de hibridação. Uma hibridação positiva gera um sinal que é ao menos duas vezes àquele de secundários. Geralmente, as condições severas adequadas para os ensaios de hibridação de ácido nucleico ou procedimentos de detecção de amplificação de gene são conforme apresentado acima. As condições mais ou menos severas também podem ser selecionadas. O elemento versado na técnica tem conhecimento de diversos parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e que irão manter ou alterar as condições de severidade.

Por exemplo, as condições de hibridação de severidade alta típicas para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos incluem a > hibridação a 65°C em 1x SSC ou a 42°C em 1x SSC e 50% de formamida, seguida pela lavagem a 65°C um 0,3x SSC. Os exemplos de condições de hibridação de severidade média para híbridos de DNA mais longo do que 50 nucleotídeos incluem a hibridação a 50°C em 4x SSC ou a 40°C em 6x SSC e 50% de formamida, seguida pela lavagem a 50°C em 2x SSC. O comprimento do híbrido consiste no comprimento antecipado para o ácido nucleico de hibridação. Quando os ácidos nucleicos de sequência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado por meio do alinhamento das sequências e identificação das regiões conservadas descritas no presente documento. 1xSSC é 0,15M de NaCI e 15mM de citrato de sódio; a solução de hibridação e soluções de lavagem podem incluir, adicionalmente, 5x reagente de Denhardt, 0,5 a 1,0 % de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 0,5 % de pirofosfato de sódio. Em uma realização preferida, as condições de severidade alta se referem à hibridação a 65°C em 0,1x SSC que compreende 0,1 SDS e opcionalmente 5x reagente de Denhardt, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 0,5 % de pirofosfato de sódio, seguida pela lavagem a 65°C em 0,3x SSC. Para os propósitos de definição do nível de severidade, pode ser feita referência a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque ou a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais).

Variante de splice O termo “variante de splice”, para uso na presente invenção, abrange as variantes de uma sequência de ácido nucleico na qual os íntrons e/ou éxons selecionados têm sido cortados, substituídos, deslocados ou adicionais, ou na qual os íntrons têm sido reduzidos ou aumentados. Tais variantes irá consistir naquelas em que a atividade biológica da proteína é substancialmente retida; isto pode ser alcançado retendo-se seletivamente os segmentos funcionais da proteína. Tais variantes de Splice podem ser encontradas na natureza ou serem feitas pelo homem. Os métodos para predizer e isolar tais variantes de splice são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Foissac e Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélico Os “alelos” ou “variantes alélicos” são formas alternativas de um determinado gene, localizado substancialmente na mesma posição cromossômica. Os variantes alélicos abrangem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), assim como pequenos polimorfismos de inserção/apagamento (INDELs). O tamanho de INDELs é usualmente menor do que 100 bp. Os SNPs e INDELs formam um conjunto maior de variantes de sequência em cepas polimórficas de ocorrência natural da maioria dos organismos.

Endógeno A referência no presente documento a um ácido nucleico e/ou proteína “endógena” se refere ao ácido nucleico e/ou proteína em questão conforme encontrado em uma planta em sua forma natural (isto é, sem existir qualquer intervenção humana como tecnologia/engenharia de DNA recombinante), mas também se refere aquele mesmo gene (ou um ácido nucleico/gene substancialmente homólogo) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzida em uma planta (um transgene). Por exemplo, uma planta transgênica que contém tal transgene pode encontrar uma redução substancial da expressão de transgene e/ou redução substancial da expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo ou pode ser feito pelo homem, por exemplo, por meio de síntese química.

Exógeno O termo ácido nucleico ou gene “exógeno” (em contraste com “endógeno”) se refere a um ácido nucleico que tem sido introduzido em uma planta por meio de tecnologia DNA recombinante. Um ácido nucleico “exógeno” pode não ocorrer em uma planta em sua forma natural, ser diferentes do ácido nucleico em questão conforme encontrado em uma planta em sua forma natural ou pode ser idêntico a um ácido nucleico encontrado em uma planta em sua forma natural, mas integrado não dentro de seu ambiente genético natural. O significado correspondente de “exógeno” é aplicado no contexto de expressão de proteína. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um transgene, isto é, um ácido nucleico exógeno, pode, quando em comparação com a expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do respectivo gene ou proteína no total. Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção inclui um ácido nucleico de flavodoxina exógeno integrado em qualquer local genético e, opcionalmente, a planta também pode incluir o gene endógeno dentro do contexto genético natural.

Transposição de gene / Evolução direcionada A “transposição de gene” ou “evolução direcionada" consiste em iterações de transposição de DNA seguidas por triagem e/ou seleção adequada para gerar variantes de ácidos nucleicos ou partes dos mesmos que codificam proteínas que têm uma atividade biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes US 5.811.238 e 6.395.547).

Cassete de expressão “Cassete de expressão” para uso na presente invenção consiste em DNA capaz de ser expresso em uma céluia hospedeira ou em um sistema de expressão in-vitro. Prefere-se que o DNA, parte do DNA ou a disposição dos elementos genéticos que formam o cassete de expressão sejam artificiais. O elemento versado na técnica está plenamente ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes no cassete de expressão a fim de serem expressos de maneira bem sucedida. O cassete de expressão compreende uma sequência de interesse a ser expressão ligada de maneira operável a uma ou mais sequências de controle (ao menos a um promotor), conforme descrito no presente documento. Os elementos reguladores adicionais podem incluir potencializadores transcricionais, assim como translacionais, um ou mais NEENA, conforme descrito no presente documento, e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento. Os elementos versados na técnica estão plenamente cientes de sequências potencializadoras e de terminação que podem ser adequadas para o uso na execução da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não transladada 5' (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, conforme descrito na seção de definições para expressão aumentada/superexpressão. Outras sequências de controle (além de promotor, potencializador, silenciador, sequências de íntron, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem consistir em elementos de estabilização de proteína e/ou RNA. Tais sequências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por um elemento versado na técnica. O cassete de expressão pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira e replicado em conjunto com o genoma da dita célula hospedeira.

Construção I construção genética Artificial, isto é o DNA (tal como, mas não limitado a, plasmídeos ou DNA viral) - artificial em parte ou total ou artificial na disposição dos elementos genéticos contidos - capaz de aumentar ou diminui a expressão de DNA e/ou proteína de interesse tipicamente por meio de replicação em uma célula hospedeira e usado para a introdução de uma sequência de DNA de interesse em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A replicação I pode ocorrer após a integração no genoma da célula hospedeira ou através da A presença da construção como parte de um vetor ou um cromossomo artificial dentro da célula hospedeira.

As células hospedeiras da invenção podem consistir em qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas, tais como células de espécie Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, células de fungos, algas ou cianobactéria ou célula de plantas. O elemento versado na técnica está plenamente ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes na construção genética com a finalidade de transformar, selecionar e propagar de maneira bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

Tipicamente, a construção / construção genética é uma construção de expressão e compreende um ou mais cassetes de expressão que podem conduzir à superexpressão (construção de superexpressão) ou expressão reduzida de um gene de interesse. Uma construção pode consistir em um cassete de expressão. A(s) sequência(s) de interesse é/são ligadas de maneira operável a uma ou mais sequências de controle (ao menos a um promotor) conforme descrito no presente documento. Os elementos reguladores adicionais podem incluir potencializadores transcricionais, assim como translacionais, um ou mais NEENA conforme descrito no presente documento, e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento.

Os elementos versados na técnica estão plenamente cientes de sequências potencializadoras e de terminação que podem ser adequadas para o uso na execução da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não transladada 5’ (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, conforme descrito na seção de definições para expressão aumentada/superexpressão. Outras sequências de controle (além de promotor, » potpncializador, silenciador, sequências de íntron, regiões 3’UTR e/ou 5’UTR) Λ podem consistir em elementos de estabilização de proteína e/ou RNA. Tais sequências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por um elemento versado na técnica.

As construções genéticas da invenção podem incluir, adicionalmente, uma origem de sequência de replicação que é exigida para manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando se exige que uma construção genética seja mantida em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (por exemplo, molécula de plasmídeo ou cosmídeo). As origens preferidas de replicação incluem, mas não se limitam a, o f1-ori e colE1.

Para a detecção da transferência satisfatória das sequências de ácido nucleico conforme usado nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas que compreendem estes ácidos nucleicos, é vantajoso utilizar genes marcadores (ou genes repórteres). Portanto, a construção genética pode, opcionalmente, compreender um gene marcador selecionável.

Os marcadores selecionáveis são descritos em maiores detalhes na seção de “definições” no presente documento. Os genes marcadores podem ser removidos ou cortados da célula transgênica uma vez que não são mais necessários. As técnicas para remoção de marcador são conhecidas na técnica, as técnicas úteis são descritas acima na seção de definições.

Construção de vetor/ vetor Isto é o DNA (tal como, mas não limitado a, plasmídeos ou DNA viral) - artificial em parte, total ou artificial na disposição dos elementos genéticos contidos - capaz de replicação em uma célula hospedeira e usado para a introdução de uma sequência de DNA de interesse em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. Um vetor pode consistir em uma construção ou pode compreender ao menos uma construção. Um vetor pode replicar sem se integrar no genoma de uma célula hospedeira, por exemplo, » A unVVetor de plasmídeo em uma célula hospedeira bacteriana, ou pode integrar parte ou todo seu DNA no genoma da célula hospedeira e, deste modo, conduzir à replicação e expressão de seu DNA. As células hospedeiras da invenção podem consistir em qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas, tais como células da espécie Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, células de fungos, algas ou cianobactérias ou célula de plantas. O elemento versado na técnica está plenamente ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes na construção genética a fim de transformar, selecionar e propagar de maneira bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse. Tipicamente, o vetor compreende ao menos um cassete de expressão. A uma ou mais sequência(s) de interesse é ligada de maneira operável a uma ou mais sequências de controle (ao menos a um promotor) conforme descrito no presente documento.

Os elementos reguladores adicionais podem incluir potencializadores transcricionais, assim como translacionais, um ou mais NEENA conforme descrito no presente documento e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento. Os elementos versados na técnica estão plenamente cientes de sequências potencializadoras e de terminação que podem ser adequadas para o uso na execução da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não transladada 5’ (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, conforme descrito na seção de definições. Outras sequências de controle (além de promotor, potencializador, silenciador, sequências de ítron, regiões 3’UTR e/ou 5’UTR) podem consistir em elementos de estabilização de proteína e/ou RNA. Tais sequências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por um elemento versado na técnica.

Elemento regulador / Sequência de controle( / Promotor / Sequência de pro^notor.

Os termos “elemento regulador”, “sequência de controle”, “promotor” e “sequência de promotor” se referem a sequências de ácido nucleico reguladoras capazes de efetuar a expressão das sequências associadas. Os elementos reguladores podem consistir em promotor(es). Os termos “promotor" e “sequência de promotores” tipicamente se refere a uma sequência de controle de ácido nucleico localizada a montante do início transcricional de um gene e que está envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas, direcionando, assim, a transcrição de um ácido nucleico ligado de maneira operável. São abrangidos pelos termos mencionados anteriormente as sequências reguladoras transcricionais derivadas a partir de um gene genômico eucariótico clássico (que inclui a caixa TATA que é exigida para a iniciação de transcrição precisa, com ou sem uma sequência de caixa CCAAT) e os elementos reguladores adicionais (isto é, sequências de ativação, potencializadores e silenciadores) que alteram a expressão de gene em resposta a estímulos de desenvolvimento e/ou externos, ou de uma maneira específica de tecido. Também este incluída no termo uma sequência reguladora transcricional de um gene procariótico clássico, em tal caso, pode incluir uma sequência de caixa -35 e/ou sequências reguladoras transcricionais de caixa -10. O termo “elemento regulador” também abrange uma molécula de fusão sintética ou derivado que confere, ativa ou otimiza a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão.

Um “promotor de planta” compreende elementos reguladores, que mediam a expressão de um segmento de sequência de codificação em células de planta. Consequentemente, um promotor de planta não precisa ser de origem vegetal, mas pode se originar a partir de vírus ou microrganismos, por exemplo, a partir de vírus que atacam as células de planta. O “promotor de planta” também pode se originar a partir de uma célula de planta, por exemplo, 1 a partir da planta que é transformada com a sequência de ácido nucleico a ser expressa no processo inventivo e descrita no presente documento. Isto também se aplica a outros sinais reguladores de “planta”, tais como terminadores de “planta”. Os promotores a montante das sequências de nucleotídeo úteis nos métodos da presente invenção podem ser modificados por uma ou mais substituição(s), inserção(s) e/ou apagamento(s) de nucleotídeo sem interferir com a funcionalidade ou atividade de quaisquer promotores, o quadro de leitura aberta (ORF) ou a região reguladora 3', tal como terminadores, ou outras regiões reguladoras 3' que ficam localizadas longe do ORF. Adicionalmente, é possível que a atividade dos promotores seja aumentada pela modificação de sua sequência, ou que sejam completamente substituídos pode promotores mais ativos, até os promotores a partir de organismos heterólogos. Para a expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico precisa, conforme descrito no presente documento, ser ligada de maneira operável a ou compreender um promotor adequado que expressa o gene no momento certo e com o padrão de expressão espacial exigido.

Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, a intensidade do promotor e/ou padrão de expressão de um promotor candidato pode ser analisada, por exemplo, ligando-se operavelmente o promotor a um gene repórter e avaliando-se o nível ou padrão de expressão do gene repórter em diversos tecidos da planta. Os genes repórteres bem conhecidos adequados incluem, por exemplo, beta-glucuronidase ou beta- galactosidase. A atividade do promotor é avaliada por meio da medição da atividade enzimática do beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. A intensidade do promotor e/ou padrão de expressão podem ser, então, conforme comparado com aquele de um promotor de referência (tal como, aquele usado nos métodos da presente invenção). Alternativamente, a intensidade do promotor pode ser avaliada por meio da quantificação de níveis de mRNA ou mediante a comparação de níveis de mRNA do ácido nucleico usado nos métodos da presente invenção, com os níveis de mRNA dos genes de organização, tais como 18S rRNA, com o uso de métodos conhecidos na técnica, tais como Northern blotting com análise densitométrica de autoradiogramas, PCR quantitativa em tempo real ou RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Geralmente, o termo “promotor fraco” é destinado a um promotor que conduz a expressão de uma sequência de codificação em um baixo nível. O termo “baixo nível” é destinado em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições, a cerca de 1/500.0000 transcrições por célula. De modo contrário, um “promotor forte” conduz a expressão de uma sequência de codificação em alto nível, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1000 transcrições por célula. Geralmente, o termo “promotor de intensidade média” se destina a um promotor que conduz a expressão de uma sequência de codificação em um nível menor do que um promotor forte, em particular, em um nível que é, em todos os casos, abaixo daquele obtido quando sob o controle de um promotor 35S CaMV.

Ligado de maneira operável O termo “ligado de maneira operável” ou “funcionalmente ligado” é usado de maneira intercambiável e, para uso na presente invenção, se refere a uma ligação funcional entre a sequência de promotor e o gene de interesse, de tal modo que a sequência de promotor seja capaz de direcionar a transcrição do gene de interesse. O termo "ligação funcional" ou "funcionalmente ligado" em relação aos elementos reguladores, deve ser compreendido como, por exemplo, a disposição sequencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma sequência de ácido nucleico a ser expressa e, se adequado, os eleryientos reguladores adicionais (tais como, por exemplo, um terminador, t NEENA conforme descrito no presente documento ou um RENA conforme descrito no presente documento) de tal forma que cada um dos elementos reguladores possa cumprir sua função pretendida para permitir, modificar ou de outra forma influenciar a expressão da dita sequência de ácido nucleico. Como um sinônimo, a expressão “ligação operável” ou “ligado de maneira operável” pode ser usada. A expressão pode resultar, dependendo da disposição das sequências de ácido nucleico, em RNA senso ou antissenso. Com esta finalidade, a ligação direta no senso químico hão é necessariamente exigida.

As sequências de controle genéticas, tais como, por exemplo, sequências potencializadoras, também podem exercer sua função na sequência alvo a partir de posições que são mais distantes, ou de fato a partir de outras moléculas de DNA. As disposições preferidas são aquelas em que a sequência de ácido nucleico a ser expressa é posicionada de maneira recombinante atrás da sequência que age como promotor, de modo que as duas sequências sejam ligadas de maneira covalente uma à outra. A distância entre a sequência de promotor e sequência de ácido nucleico recombinante a ser expressa é, de preferência, menor do que 200 pares de base, especialmente de preferência, menor do que 100 pares de base, de forma especialmente muito preferencial, menor do que 50 pares de base. Em uma realização preferida, a sequência de ácido nucleico a ser transcrita fica localizada atrás do promotor de tal forma que o início da transcrição seja idêntico ao início desejado do RNA quimérico da invenção. A ligação funcional, e uma construção de expressão, pode ser gerada por meio de técnicas de clonagem e recombinação usuais conforme descrito (por exemplo, em Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY);

Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Jk Assoe, e Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands). No entanto, as sequências adicionais que, por exemplo, agem como um ligante com locais de divagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo sinal, também podem ser posicionadas entre as duas sequências. A inserção de sequências também pode conduzir à expressão de proteínas de fusão. Prefere- se que a construção de expressão, que consiste em uma ligação de uma região reguladora, por exemplo, um promotor e sequência de ácido nucleico a ser expressa, possa existir em uma forma de vetor integrado e ser inserida em um genoma da planta, por exemplo, por meio de transformação.

Promotor constitutivo Um “promotor constitutivo” se refere a um promotor que é ativo de maneira transcricional durante a maioria, mas não necessariamente todas, das fases de crescimento e desenvolvimento e sob a maioria das condições ambientais, em ao menos uma célula, tecido ou órgão.

Um “promotor ubíquo” é ativo em substancialmente todos os tecidos ou células de um organismo.

Um “promotor regulado por desenvolvimento” é ativo durante determinados estágios de desenvolvimento ou em partes da planta que se submetem a mudanças de desenvolvimento.

Um “promotor induzível” tem iniciação de transcrição induzida ou aumentada em resposta a um produto químico (para uma revisão vide Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), estímulo ambiental ou físico, ou pode ser “induzível por estresse”, isto é, ativado quando uma planta é exposta a diversas condições de estresse, ou um “induzível por patógeno", isto é, ativado quando uma planta é exposta a diversos patógenos.

Um “promotor específico de órgão” ou “específico de tecido” consiste naquele que é capaz de iniciar, de preferência, a transcrição em í» A determinados órgãos ou tecidos, tais como as folhas, raízes, tecido de semente, etc. Por exemplo, um “promotor específico de raiz” é um promotor que é ativo de maneira transcricional predominantemente em raízes de planta, substancialmente, com a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite qualquer expressão vazada nestas outras partes de planta. Os promotores capazes de iniciar a transcrição em determinadas células são mencionados no presente documento somente como “específico de célula”.

Um “promotor específico de semente” é ativo de maneira transcricional predominantemente em tecido de semente, mas não necessariamente de forma exclusiva em tecido de semente (em casos de expressão vazada). O promotor específico de semente pode ser ativo durante o desenvolvimento de semente e/ou durante a germinação. O promotor específico de semente pode ser específico de endosperma/aleurona/embrião.

Um “promotor específico de tecido verde” conforme definido no presente documento consiste em um promotor que é ativo de maneira transcricional predominantemente em tecido verde, substancialmente, com a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite qualquer expressão vazada nestas partes de planta.

Outro exemplo de um promotor específico de tecido consiste em um promotor específico de meristema, o qual é ativo de maneira transcricional predominantemente em tecido merístemático, substancialmente com a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite qualquer expressão vazada nestas partes de planta.

Terminador O termo “terminador” abrange uma sequência de controle que consiste em uma sequência de DNA no final de uma unidade transcricional que sinaliza o processamento 3’ e poliadenilação de uma transcrição primária e terminação de transcrição. O terminador pode ser derivado a partir do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes da planta, ou a partir de "Γ- ΟΝΑ. O terminador a ser adicionado pode ser derivado a partir, por exemplo, dos genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente, a partir de outro gene da planta, ou com preferência menor, a partir de qualquer outro gene eucariótico.

Marcador selecionável (gene) / Gene repórter O "marcador selecionável", "gene marcador selecionável" ou “gene repórter” inclui qualquer gene que confere um fenótipo em uma célula na qual é expresso para facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com uma construção de ácido nucleico da invenção. Estes genes marcadores possibilitam a identificação de uma transferência bem sucedida das moléculas de ácido nucleico através de uma série de princípios diferentes. Os marcadores adequados podem ser selecionados a partir de marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo traço metabólico ou que permitem a seleção visual. Os exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem os genes que conferem resistência a antibióticos (tais como nptll que fosforila neomicina e kanamicina, ou hpt, que fosforila higromicina, ou genes que conferem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamieina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar que fornece resistência a Basta®; aroA ou gox que fornece resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência a, por exemplo, imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonilureia), ou genes que fornecem um traço metabóiico (tal como, manA que permite que as plantas utilizem mannose como única fonte de carbono ou xilose ísomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos, tais corno a resistência a 2-deoxiglicose). A expressão de genes marcadores .4 visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β- galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (tal como o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína fluorescente verde, GFP, e derivados da mesma). Esta lista representa somente um pequeno número de marcadores possíveis. O elemento versado na técnica está familiarizado com tais marcadores.

Diferentes marcadores são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção.

Sabe-se que sob a integração estável ou transitória de ácidos nucleicos em células de plantas, somente uma minoria das células recolhem o DNA externo e, se desejado, integra o mesmo em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (tal como aqueles descritos acima) é usualmente introduzido nas células hospedeiras em conjunto com o gene de interesse. Estes marcadores pode, por exemplo, ser usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais por meio, por exemplo, do apagamento por meio de métodos convencionais. Adicionalmente, as moléculas de ácido nucleico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, se não em um vetor separado.

As células que têm sido estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por meio de seleção (por exemplo, as células que têm integrado o marcador selecionável sobrevivem, enquanto que as outras células morrem).

Desde que os genes marcadores, particularmente, os genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicos 1 têrrí sido introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para introduzir os ácidos nucleicos emprega de forma vantajosa as técnicas que possibilitam a remoção ou corte destes genes marcadores. Tal método consiste no que é conhecido como cotransformação. O método de cotransformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo contendo o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores. No caso da transformação com Agrobacteria, os transformantes usualmente recebem somente uma parte do vetor, isto é, a sequência flanqueada pelo T-DNA, o qual usualmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos a partir da planta transformada por meio da execução de cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposão são usados para a transformação em conjunto com o ácido nucleico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico que confere a expressão de uma transposase, de maneira transitória ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposão salta para fora do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação tem ocorrido com sucesso e é perdido. Em uma série de casos adicionais, o transposão salta para um local diferente. Nestes casos, o gene marcador precisa ser eliminado por meio da execução de cruzamentos. Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas que tornam possível, ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um método vantajoso adicional depende do que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem consiste no fato de que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O sistemas mais I conhecido deste tipo consiste no que é conhecido como o sistema Cre/lox. Λ % Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador estiver integrado entre as sequências ΙοχΡ, o mesmo é removido uma vez que a transformação tem ocorrido com sucesso, por meio da expressão da recombinase. Os sistemas de recombinação adicionais consistem no sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et ai., J.

Cell Biol., 149, 2000: 553-566), Uma integração específica de local no genoma da planta das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados a microrganísmos, tais como, levedura, fungos ou bactérias. ’ Transgênico/Transgene/Recombinante Para os propósitos da invenção, "transgênico", “transgene” ou "recombinante" se refere, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico, um cassete de expressão, construção genética ou um vetor que compreende a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as sequências de ácido nucleico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas aquelas construções produzidas por meio de métodos recombinantes, nos quais (a) as sequências dos ácidos nucleicos de flavodoxina ou uma parte dos mesmos, ou (b) sequência(s) de controle genética(s) que é ligada de maneira operável com a sequência de ácido nucleico de flavodoxina de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) a) e b) não estão localizados em seu ambiente genético natural ou têm sido modificados por meio de métodos recombinantes, por exemplo, modificados e/ou inseridos pelo homem, por exemplo, por meio de métodos de tecnologia genética. { A modificação pode adotar a forma, por exemplo, de uma I substituição, adição, apagamento, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. Compreende-se que o ambiente genético natural se refere ao local cromossômico ou genômico natural na planta original ou a presença em uma biblioteca genômica ou a combinação com o promotor natural.

Além disso, a ligação de uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito para o direcionamento de plastídeo com um ácido nucleico que codifica flavodoxina, conforme definjdo no presente documento, que é não ligado de maneira natural a um dito peptídeo de trânsito cria uma sequência recombinante.

Um ácido nucleico, cassete de expressão, construção genética ou construção de vetor recombinante compreende, de preferência, um gene natural e um promotor natural, um gene natural e um promotor não natural, um gene não natural e um promotor natural, ou um gene não natural ou promotor natural.

No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é, de preferência, retido, ao menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico ao menos em um lado e tem um comprimento de sequência de ao menos 50 bp, de preferência, ao menos 500 bp, especialmente de preferência, ao menos 1000 bp, com a máxima preferência, ao menos 5000 bp.

Um cassete de expressão de ocorrência natural- por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima- se torna um cassete de expressão recombinante quando este cassete de expressão é modificado pelo homem por meio de métodos sintéticos não naturais ("artificial"), tais como, por exemplo, tratamento mutagênico. Os „4 méíodos adequados são descritos, por exemplo, nos documentos sob os n—. US 5.565.350, WO 00/15815 ou US200405323. Adicionalmente, um cassete de expressão de ocorrência natural- por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima- se torna um cassete de expressão recombinante quando este cassete de expressão não é integrado no ambiente genético natural, mas em um ambiente genético diferente.

Deve-se observar adicionalmente que no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucleico isolado” ou “proteína isolada” pode, em alguns casos, ser considerado como um sinônimo para um “ácido nucleico recombinante” ou uma “proteína recombinante”, respectivamente, e se refere a um ácido nucleico ou proteína que não está localizado em seu ambiente genético natural e ambiente celular, respectivamente. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo ou pode ser feito pelo homem, por exemplo, por meio de síntese química. Em uma realização, uma sequência de ácido nucleico isolada ou molécula de ácido nucleico isolada consiste naquela que não está em sua cercania nativa ou seus arredores de ácido nucleico nativos, mas é física ou funcionalmente conectada a outras sequências de ácido nucleico ou moléculas de ácido nucleico e é encontrada como parte de uma construção de ácido nucleico, sequência de vetor ou cromossomo.

Para uso na presente invenção, o termo “transgênico” em relação a organismos, por exemplo, planta transgênica se refere a um organismo, por exemplo, uma planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta quer contém de maneira exógena o ácido nucleico, construção, vetor ou cassete de expressão descrito no presente documento ou uma parte do mesmo que é, de preferência, introduzida por processos que não são essencialmente I biolpgicos, de preferência, por meio de transformação mediada por * A

Agrobacteria ou bombardeio de partícula. Compreende-se que uma planta transgênica para os propósitos da invenção se refere, deste modo, ao fato de que, conforme acima, os ácidos nucleicos descritos no presente documento não estão presentes, ou não se originam a partir do genoma da dita planta, ou estão presentes no genoma da dita, mas não em seu ambiente genético natural no genoma da dita planta, sendo que é possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de maneira homóloga ou heteróloga. No entanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método estejam em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência tem sido modificada em relação à sequência natural, e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais têm sido modificadas. Compreende-se que transgênico, de preferência, significa que a expressão de sequências de ácido nucleico de ocorrência natural nesta planta que ocorrem em um ambiente genético não natural no genoma, isto é, expressão homóloga, ou que a expressão heteróloga de sequências de ácido nucleico de ocorrência não natural nesta planta ocorre. As plantas transgênicas preferidas são mencionadas no presente documento.

Modulação O termo “modulação” se refere, em relação à expressão ou expressão de gene, a um processo no qual o nível de expressão é alterado pela dita expressão de gene em comparação com a planta de controle, o nível de expressão pode ser aumentado ou diminuído. A expressão original não modulada pode ser de qualquer tipo de expressão de um RNA (rRNA, tRNA) ou mRNA estrutural com translação subsequente. Para os propósitos desta invenção, a expressão original não modulada também pode ser a ausência de qualquer expressão. O termo “modular a atividade” ou o termo “modular a expressão” deverá se referia a qualquer mudança da expressão das sequências de ácido nucleico inventivas e/ou proteínas codificadas, o qual conduz a traço(s) de relacionados ao rendimento aumentados ou diminuídos, tais como, mas não se limitam, a rendimento de semente aumentado ou diminuído e/ou crescimento aumentado ou diminuído das plantas. A expressão pode aumentar a partir de zero (ausência de, ou expressão imensurável) a uma determinada quantidade, ou pode diminuir a partir de uma determinada quantidade a pequenas quantidades imensuráveis ou zero.

Expressão O termo “expressão” ou “expressão de gene” se refere à transcrição de um gene específico, genes específicos ou construção genética específica. O termo “expressão” ou “expressão de gene” se refere, em particular, à transcrição de um gene, genes ou construção genética em RNA (rRNA, tRNA) ou mRNA estrutural com ou sem translação subsequente do último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e o processamento do produto de mRNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão de gene” também pode incluir a translação do mRNA e com a mesma a síntese da proteína codificada, isto é, expressão de proteína.

Expressão aumentada / expressão otimizada / superexpressão O termo “expressão aumentada”, “expressão otimizada” ou “superexpressão”, para uso na presente invenção, se refere a qualquer forma de expressão que adicional ao nível de expressão do tipo selvagem original.

Para os propósitos desta invenção, o nível de expressão do tipo selvagem original também poderia ser zero, isto é, ausência de expressão ou expressão imensurável. A referência no presente documento à “expressão aumentada”, “expressão otimizada” ou “superexpressão” é tomada para se referir a um aumento na expressão de gene e/ou, na medida em que se refere a polipeptídeos, níveis de polipeptídeo aumentados e/ou atividade de polipeptídeo aumentada, em relação a plantas de controle. O aumento em expYessão, níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo é em ordem crescente, de preferência, de ao menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 100% ou até mais em comparação com aquele das plantas de controle. O aumento em expressão pode ser em ordem crescente, de preferência, de ao menos 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000% ou 5000% ou até mais em comparação com aquele das plantas de controle. Em casos onde as plantas de controle têm somente muito pouca expressão, níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo da sequência em questão e/ou do gene recombinante é sob o controle de forte(s) elemento(s) regulador(es), o aumento em expressão, níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo pode ser de ao menos 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes, 3000 vezes, 5000 vezes, 10 000 vezes, 20 000 vezes, 50 000 vezes, 100 000 vezes ou até mais em comparação com aquele das plantas de controle.

Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos de genes são bem documentados na técnica e incluem, por exemplo, a superexpressão conduzida por promotores adequados, o uso de potencializadores de transcrição ou potencializadores de translação. Os ácidos nucleicos isolados que servem como elementos promotores ou potencializadores podem ser introduzidos em uma posição adequada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo, a fim de regular de modo ascendente a expressão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por meio de mutação, apagamento e/ou substituição (vide, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., W09322443), ou os promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta na í orientação e distância adequada a partir de um gene da presente invenção, a Ji fimude controlar a expressão do gene.

Se a expressão de polipeptídeo for desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada a partir do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de planta ou a partir de T-DNA. A sequência de extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada a partir, por exemplo, dos genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente, a partir de outro gene de planta, ou com menos preferência, a partir de qualquer outro gene eucariótico, Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não transladada 5' (UTR) ou à sequência de codificação da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem de amadurecimento que se acumula no citosol. A inclusão dè um íntron passível de splice na unidade de transcrição tanto em construções de expressão vegetal como animal tem se mostrado aumentar a expressão de gene tanto nos níveis de proteína como mRNA até 1000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Tal potencialização de íntron de expressão de gene é tipicamente maior quando colocado próxima à extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso dos íntrons de milho Adh1-S íntron 1, 2 e 6, o íntron Brònze-1 é conhecido na técnica. Para informações gerais vide: The Corn Handbook, capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Para se obter a expressão aumentada ou superexpressão de um polipeptídeo de forma mais comum, o ácido nucleico que codifica este polipeptídeo é superexpresso em orientação de senso com um sinal de poliadenilação. Os íntrons ou outros elementos de potencialização podem ser usados em adição a um promotor adequado para conduzir a expressão com o i padrão de expressão pretendido. Em contraste a isto, a superexpressão da mesma sequência de ácido nucleico como construção antissenso não irá resultar em expressão aumentada da proteína, mas expressão diminuída da proteína.

Expressão diminuída A referência no presente documento à “expressão diminuída” ou “redução ou eliminação substancial de expressão” é tomada para se referir a uma diminuição em expressão de gene endógeno e/ou níveis de polipeptídeo e/ou atividade de polipeptídeo em relação a plantas de controle. A redução ou eliminação substancial é, em ordem crescente de preferência, de ao menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até maior em comparação com aquela das plantas de controle.

Transformação O termo “introdução” ou “transformação”, conforme mencionado no presente documento, abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a transferência. O tecido da planta capaz de propagação clonai subsequente, se por meio de organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta completa regenerada a partir da mesma. O tecido particular escolhido irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis para, e melhor adequado a, as espécies particulares que são transformadas. Os alvos de tecido exemplificadores incluem discos foliares, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido do calo, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema apícal, brotos axilar e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de maneira transitória ou estpvel em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula de planta transformada resultante pode ser, então, usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida pelos elementos versados na técnica. Alternativamente, uma célula de planta que não pode ser regenerada em uma planta pode ser escolhida como célula hospedeira, isto é, a célula de planta transformada resultante não tem a capacidade de regenerar em uma planta (completa). A transferência de genes externos no genoma de uma planta é chamada de transformação. A transformação de espécie de planta é agora uma técnica razoavelmente rotineira. Vantajosamente, qualquer um dentre os vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula progenitora adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos de planta ou célula de plantas podem ser utilizados para a transformação transitória ou estável. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção de DNA livre, a injeção do DNA diretamente na planta, bombardeio de arma de partícula, transformação com o uso de vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio/polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shiliito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099- 1102); microinjeção em material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gene Genet 202: 179-185); bombardeio de partícula revestida de D NA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não integrativo), e similares. As plantas transgênicas, que incluem plantas cultivadas transgênicas, são produzidas, de preferência, através da transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso consiste na ^.transformação em planta. Com esta finalidade, é possível, por exemplo, jl permitir que as agrobactérias ajam em sementes de planta ou inocular o meristema da planta com as agrobactérias. Tem se comprovado particularmente conveniente, de acordo com a invenção, permitir que uma suspensão de agrobactérias transformada aja sobre a planta intata ou ao menos sobre o primórdio de flor. A planta é subsequentemente cultivada até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de arroz incluem os métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dentre os seguintes: pedido de patente europeu EP 1198985 A1, Aldemita e Hodges (Plant 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), tais descrições estão aqui incorporadas a título de referência como se apresentada em sua totalidade. No caso de transformação de milho, o método preferido é conforme descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), tais descrições estão aqui incorporadas a título de referência como se apresentada em sua totalidade. Os ditos métodos são adicionalmente descritos a título de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Trangenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev.

Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a construção a ser expressa é, de preferência, clonada em um vetor, o qual é adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactérias transformadas por tal vetor podem ser, então, usadas de maneira conhecida para a transformação de plantas, tais como as plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana está dentro do escopo da presente invenção não considerado como uma planta cultivada), ou plantas A cultivadas, tais como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, por meio da imersão de folhas machucadas ou folhas talhadas em uma solução de agrobacterium e, então, cultivando-se as mesmas em meios adequados. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hõfgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenics Plant, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15 a 38.

Em adição à transformação de células somáticas, as quais têm, então, que ser regeneradas em plantas intatas, é também possível transformar as células de meristemas de planta e, em particular, aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametos transformados seguem o desenvolvimento da planta natural, dando origem a plantas transgênicas. Deste modo, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobacteria e as sementes são obtidas a partir das plantas em desenvolvimento das quais uma determinada proporção é transformada e, deste modo, transgênica [Feldman, KA e Marks MD (1987). Mol Gene Genet 208:1-9; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Cingapura, páginas 274 a 289]. Os métodos alternativos com base na remoção repetida das inflorescências e incubação do local de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, de modo que as sementes transformadas possam ser semelhantemente obtidas em um ponto no tempo posterior (Chang (1994).

Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gene Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especialmente eficaz consiste no método de infiltração de vácuo com suas modificações, tais como o método de “imersão floral”. NO caso de infiltração de vácuo de Arabidopsis, as plantas intatas sob pressão reduzida são^ tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R

Acâd Sei Paris Life Sei, 316: 1194-1199], enquanto que no caso do método de "imersão floral”, o tecido floral em desenvolvimento é incubado brevemente com uma suspensão de agrobacterium tratada com tensoativo [Clough, SJ e Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743], Uma determinada proporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos e estas sementes podem ser distinguidas a partir de sementes não transgências por meio do cultivo sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável de plastídeos é vantajosa devido ao fato de que os plastídeos que são herdados maternamente consiste na maioria das safras que reduzem ou eliminam o risco do fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma de cloroplasto é geralmente alcançada por meio de um processo que tem sido esquematicamente exibido em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229], Brevemente, as sequências a serem transformadas são clonadas em conjunto com um gene marcador selecionável entre as sequências de flanqueamento homólogas ao genoma de cloroplasto. Estas sequências de flanqueamento homólogas direcionar a integração específica de local para o plastoma. A transformação de plastídeo tem sido descrita para diferentes espécies de planta e uma visão geral é dada em Bock (2001) Transgenic Plastids in basic research and plant Biotechnology. J Mol Biol. 21 de setembro de 2001; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. O progresso biotecnológico tem sido recentemente relatado na forma de transformantes de plastídeo livres de marcador, os quais podem ser produzidos por um gene marcador cointegrado transitório (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

As células de planta geneticamente modificadas podem ser regeneradas através de todos os métodos com os quais o elemento versado na técinica está familiarizado. Os métodos adequados podem ser encontrados nas 1 puÒlicações mencionadas anteriormente por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer. Alternativamente, as células de planta geneticamente modificadas são não regeneráveis em uma planta completa.

Geralmente após a transformação, as células de planta ou agrupamentos de célula são selecionadas para a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes expressáveis em planta cotransferidos com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta completa. Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em regra, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira descrita acima podem ser plantadas e, após um período de cultivo inicial, submetidas a uma seleção adequada por meio de aspersão. Uma possibilidade adicional consiste em cultivar as sementes, se adequado, após a esterilização, em placas de ágar com o uso de um agente de seleção adequado, de modo que somente as sementes transformadas possam crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são selecionadas acerca da presença de um marcador selecionável, tal como aqueles descritos no presente documento.

Após a transferência de DNA e regeneração, as plantas supostamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, com o uso da análise Southern, acerca da presença do gene de interesse, número de cópia e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados com o uso da análise Northern e/ou Western, sendo que ambas as técnicas são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica.

As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por um^ variedade de meios, tais como, propagação clonal ou técnicas clássicas de melhoramento genético. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser reproduzida e os transformantes de segunda geração de homozigoto (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem ser, então, adícíonalmente propagadas através de técnicas clássicas de melhoramento genético. Os organismos transformados gerados podem adotar uma variedade de formas. Por exemplo, podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; os transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um rizoma transformados enxertado em um descendente não transformado).

Por todo este relatório descritivo, deve-se compreender que uma planta, parte de planta, semente ou célula de planta transformada com - ou transformada de maneira intercambiável por - uma construção ou transformada com ou por um ácido nucleico se refere a uma planta, parte de planta, semente ou célula de planta que carrega a dita construção ou o dito ácido nucleico como um transgene devido ao resultado de uma introdução da dita construção ou dito ácido nucleico por meio biotecnológico. A planta, parte de planta, semente ou célula de planta compreende, portanto, a dita construção recombinante ou o dito ácido nucleico recombinante. Qualquer planta, parte de planta, semente ou célula de planta que não contém mais a dita construção recombinante ou o dito ácido nucieico recombinante após a introdução no passado, se denomina segregante nulo, zigoto nulo ou controle nulo, mas não é considerado uma planta, parte de planta, semente ou célula de planta transformada com a dita construção ou com o dito ácido nucieico dentro do significado deste pedido.

Marcação de ativação de T-DNA A marcação de “ativação de T-DNA” (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) envolve a inserção de T-DNA, que contém usualmente um propiotor (também pode consistir em um potencializador de translação ou um A íntron), na região genômica do gene de interesse ou10 kb acima ou a jusante da região de codificação de um gene em uma configuração de tal modo que o promotor direcione a expressão do gene alvo. Tipicamente, a regulação da expressão do gene alvo por seu promotor natural é interrompida e o gene cai sob o controle do promotor recém introduzido. O promotor é tipicamente embutido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inserido no genoma da planta, por exemplo, através de infecção de Agrobacterium e conduz à expressão modificada de genes próximos ao T-DNA inserido. As plantas transgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à expressão modificada de genes próximos ao promotor introduzido.

TILLING O termo “TILLING” é uma abreviação de “Targeted Induced Local Lesions In Genomes - lesões locais induzidas em alvos no genoma” e se refere a uma tecnologia de mutagênese útil para gerar e/ou identificar os ácidos nucleicos que codificam proteínas com a expressão e/ou atividade modificada. TILLING também permite a seleção de plantas que carregam tais variantes mutantes. Estas variantes mutantes podem exibir a expressão modificada, em intensidade, em local ou em tempo (se as mutações afetam o promotor, por exemplo). Estas variantes mutantes pode exibir atividade maior do que exibida pelo gene em sua forma natural. TILLING combina a mutagênese de alta densidade com os métodos de triagem de alta taxa de rendimento. As etapas tipicamente seguidas no TILLING são: (a) mutagênese de EMS (Redei GP e Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Cingapura, World Scientific Publishing Co, páginas 16 a 82;

Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis.

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137 a 172; Lightner J e Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, I

Me|hods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91 a 1^04); (b) preparação de DNA e fusão de indivíduos; (c) amplificação de PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e anelamento para permitir a formação de heterodúplices; (e) DHPLC, onde a presença de um heteroduplex em uma fusão é detectada como um pico extra no cromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) sequenciamento do produto de PCR mutante. Os métodos para TILLING são bem conhecidos na técnica (McCalIum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisto por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinacão homóloga A “recombinação homóloga” permite a introdução em um genoma de um ácido nucleico selecionado em uma posição selecionada definida. A recombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada rotineiramente em ciências biológicas para organismos inferiores, tais como levedura ou o musgo Physcomitrella. Os métodos para a execução de recombinação homóloga em plantas têm sido descritos não somente para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84), mas também para plantas cultivadas, por exemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida e Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8), e existem abordagens que são geralmente aplicáveis independentemente do organismo alvo (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Tracq(s) relacionado ao rendimento Um “traço relacionado ao rendimento” consiste em um traço ou característica que está relacionado ao rendimento da planta. Os traços relacionados ao rendimento podem compreender um ou mais dentre a seguinte lista não limitadora de características: tempo de floração precoce, rendimento, biomassa, rendimento de semente, vigor precoce, índice de verdor, taxa de crescimento, traços agronômicos, tais como, por exemplo, tolerância à > submersão (o qual conduz ao rendimento aumentado em arroz), Eficiência do uso de água (WUE), Eficiência do uso de nitrogênio (NUE), etc.

Deve-se compreender que o termo “um ou mais traços relacionados ao rendimento” se refere a um traço relacionado ao rendimento, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que dez traços relacionados ao rendimento de uma planta em comparação com uma planta de controle. A referência no presente documento a “traço relacionado ao rendimento otimizado” é tomada para se referir a um aumento em relação a plantas de controle em um traço relacionado ao rendimento, por exemplo, em vigor precoce, rendimento de semente e/ou em biomassa, de uma planta completa ou de um ou mais partes de uma planta, as quais podem incluir (i) partes acima do solo, de preferência, partes acima do solo passíveis de colheita e/ou (ii) partes baixo do solo, de preferência, partes abaixo do solo passíveis de colheita.

Em particular, tais partes passíveis de colheita são raízes, tais como raiz principal, caules, raízes de beterraba, tubérculos, folhas, flores ou sementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas que têm rendimento de semente aumentado em relação ao rendimento de semente de plantas de controle, e/ou biomassa aumentada acima do solo, em particular biomassa do caule em relação à biomassa acima do solo, e em particular, biomassa do caule de plantas de controle, e/ou biomassa de raiz aumentada em relação à biomassa de raiz de plantas de controle e/ou biomassa de raiz de beterraba aumentada em relação à biomassa de raiz de beterraba de plantas de controle. Além disso, é particularmente considerado que o teor de açúcar (em particular, o teor de sucrose) nas partes acima do solo, particularmente, caule (em particular, de plantas de cana de açúcar) e/ou nas partes abaixo do solo, em particular, em raízes que incluem raiz principal, e tubérculos, e/ou em raízes de beterraba (em particular, em beterrabas) é aumentada em relação ao teor de açúcar (em particular, o teor de sucrose) em parte(s) da planta de controle correspondentes.

Por todo o presente pedido, a tolerância de e/ou a resistência a um ou mais produtos agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância à herbicida, não é considerada um traço relacionado ao rendimento dentro do significado deste termo do presente pedido. Uma tolerância de e/ou a resistência alterada a um ou mais produtos agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância a herbicida aperfeiçoada, não consiste em um "traço relacionado ao rendimento otimizado”, conforme utilizado por todo este pedido.

Em uma realização particular da presente invenção, qualquer referência a um ou mais traço(s) relacionado ao rendimento otimizado se destina a excluir a restauração da expressão e/ou atividade do polipeptídeo POI em uma planta na qual a expressão e/ou a atividade do polipeptídeo POI tem sido reduzida ou desabilitada quando em comparação com a planta do tipo selvagem original ou variedade original. Por exemplo, a superexpressão do polipeptídeo POI em uma variedade mutante de inativação (knock-out) de uma planta, em que o dito polipeptídeo POI ou um ortólogo úu paralógo tem sido inativado não é considerado otimização de um ou mais traço(s) relacionado ao rendimento dentro do significado da presente invenção.

Rendimento O termo “rendimento”, em geral, se refere a um produto mensurável de valor econômico, tipicamente relacionado a uma safra especificada, a uma área e a um período de tempo. As partes de planta individuais contribuem diretamente para o rendimento com base em seu número, tamanho e/ou peso, ou o rendimento real consiste no rendimento por metro quadrado para uma safra e ano, o qual é determinado pela divisão de produção total (inclui tanto a produção colhida como estimada) por metros quadrados plantados.

Os termos “rendimento de uma planta" e “rendimento de planta” são usados de maneira intercambiável no presente documento e se destina a referir à biomassa vegetativa, tal como a biomassa de raiz e/ou galho, a órgãos reprodutores e/ou a propágulos, tais como sementes daquela planta.

As flores em milho são unissexuais; as inflorescências macho (pendões) se originam a partir do caule apical e as inflorescências fêmea (espigas) surgem a partir de ápices de broto axilar. A inflorescência fêmea produz pares de espiguetas sobre a superfície de um eixo central (espiga de milho). Cada uma das espiguetas fêmea encerra dois florículos férteis, um deles irá usualmente amadurecer em uma semente de milho, uma vez fertilizado. Por conseguinte, um aumento de rendimento em milho pode ser manifestado como um ou mais dentre os seguintes: aumento no número de plantas estabelecidas por metro quadrado, um aumento no número de espigas por planta, um aumento no número de fileiras, o número de sementes por fileira, peso da semente, peso de mil sementes, comprimento/diâmetro da espiga, aumento na taxa de preenchimento de semente, o qual é o número de florículos preenchidos (isto é, florículos que contêm semente) divido pelo número total de florículos e multiplicado por 100), entre outros.

As inflorescências em plantas de arroz são chamadas de panículas. A panícula suporta espiguetas, as quais são as unidades básicas das panículas, e que consistem em um pedicelo e um florículo. O florículo é sustentado no pedicelo e inclui uma flor que é coberta por duas glumas protetoras: uma gluma maior (a lema) e uma gluma menor (a pálea). Por conseguinte, tomando o arroz como um exemplo, um aumento de rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dentre os seguintes: número de plantas por metro quadrado, número de panículas por planta, » comprimento de panícula, número de espiguetas por panícula, número de flores (ou florículos) por panícula; um aumento na taxa de preenchimento de semente que consiste no número de florículos preenchidos (isto é, florículos que contêm sementes) divido pelo número total de florículos e multiplicado por 100; um aumento em peso de mil sementes, entre outros.

Tempo de floração precoce As plantas que têm um “tempo de floração precoce”, para uso na presente invenção, consistem em plantas que começam a florescer mais cedo do que as plantas de controle. Por conseguinte, este termo se refere a plantas que mostram um início mais precoce da floração. O tempo de floração de plantas pode ser avaliado por meio da contagem do número de dias (“tempo para florescer”) entre a semeadura e a emergência de uma primeira inflorescência. O ”tempo de floração” de uma planta pode, por exemplo, ser determinado com o uso do método conforme descrito no documento sob o na. WO 2007/093444.

Vigor precoce O “vigor precoce” se refere a crescimento bem equilibrado saudável ativo especialmente durante os estágios precoces de crescimento da planta, e pode resultar a partir da adaptação da planta aumentada devido, por exemplo, às plantas que são melhores adaptadas ao seu ambiente (isto é, a otimização do uso de recursos de energia e divisão entre galho e raiz). As s plantas que têm vigor precoce também mostram sobrevivência de muda aumentada e um melhor estabelecimento da safra, o qual muitas vezes resulta em campos altamente uniformes (com a safra crescendo de maneira uniforme, isto é, com a maioria das plantas atingindo os diversos estágios de desenvolvimento substancialmente ao mesmo tempo), e muitas vezes rendimento melhor e maior. Portanto, o vigor precoce pode ser determinado por meio da medição de diversos fatores, tais como peso de mil sementes, porcentagem de germinação, porcentagem de emergência, crescimento de 1 mucla, altura da muda, comprimento da raiz, biomassa de raiz e galho e muito mais.

Taxa de crescimento aumentada A taxa de crescimento aumentada pode ser específica para uma ou mais partes de uma planta (que inclui sementes), ou pode ser por substancialmente toda a planta. As plantas que têm uma taxa de crescimento aumentada podem ter um ciclo de vida mais curto. O ciclo de vida de uma planta pode ser tomado para se referir ao tempo necessário para crescer a partir de uma semente madura até o estágio onde a planta tem sementes maduras produzidas, similar ao material de partida. Este ciclo de vida pode ser influenciado por fatores, tais como, velocidade de germinação, vigor precoce, taxa de crescimento, índice de verdor, tempo de floração e velocidade de amadurecimento de semente. O aumento na taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durante substancialmente todo o ciclo de vida da planta completa. A taxa de crescimento aumentada durante os estágios precoces no ciclo de vida de uma planta pode refletir o vigor otimizado. O aumento em taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta permitindo que as plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do quê seria de outra forma possível (um efeito similar pode ser obtido com tempo de floração mais cedo).

Se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, isto pode permitir a semeadura adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo, a semeadura e colheita de plantas de arroz seguida pela semeadura e colheita de plantas de arroz adicionais todos dentro de um período de crescimento convencional). Semelhantemente, se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, pode permitir a semeadura adicional de sementes de diferentes espécies de plantas (por exemplo, a semeadura e colheita de plantas de milho seguido, por exemplo, pela semeadura e colheita adicional de soja, batata ou qualquer outra planta adequada). Os tempos de colheita adicionais a partir do mesmo rizoma no caso de algumas plantas cultivadas também pode ser possível. A alteração do ciclo de colheita de uma planta pode conduzir a um aumento em produção de biomassa anual por metro quadrado (devido a um aumento no número de vezes (por exemplo, em um ano) que qualquer planta particular pode ser desenvolvida e colhida). Um aumento em taxa de crescimento também pode permitir a cultivação de plantas transgênicas em uma área geográfica mais ampla do que suas çontrapartes do tipo selvagem, uma vez que as limitações territoriais para cultivar uma safra são muitas vezes determinadas por condições ambientais adversas no momento da plantação (período precoce) ou no momento da colheita (período posterior). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for reduzido. A taxa de crescimento pode ser determinada por meio da derivação de diversos parâmetros a partir de curvas de crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo levado para as plantas alcançarem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo levado para as plantas alcançarem 90% de seu maximal tamanho), entre outros.

Rendimento de semente O rendimento de semente aumentado pode se manifestar como um ou mais dentre os seguintes: a) um aumento em biomassa da semente (peso da semente total) que pode ser em uma base de semente individual e/ou por planta e/ou por metro quadrado; b) número aumentado de flores por planta; c) número aumentado de sementes; d) taxa de preenchimento de semente aumentada (a qual é expressa como a razão entre o número de florículos preenchidos divida pelo i núrjiero total de florículos); e) índice de colheita aumentado, o qual é expresso como uma razão do rendimento de partes passíveis de colheita, tais como sementes, dividida pela biomassa de partes de planta acima do solo; e f) peso de mil sementes aumentado (TKW), o qual é extrapolado a partir do número de sementes contadas e seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar a partir de um tamanho de semente e/ou peso de semente aumentado, e também pode resultar a partir de um aumento em tamanho de embrião e/ou endosperma.

Os termos “florículos preenchidos” e “sementes preenchidas” podem ser considerados sinônimos.

Um aumento em rendimento de semente também pode ser manifestado como um aumento em tamanho de semente e/ou volume de semente. Adicionalmente, um aumento em rendimento de semente também pode se manifestar como um aumento em área de semente e/ou comprimento de semente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente, índice de verdor O “índice de verdor” para uso na presente invenção é calculado a partir de imagens digitais de plantas. Para cada pixel que pertence ao objeto vegetal na imagem, a razão do valor de verde versus o valor de vermelho (no modelo de RGB para codificar a cor) é calculada. O índice de verdor é expresso como a porcentagem de pixels para quais a razão de verde para vermelho excede um determinado limiar. Sob condições de crescimento normais, sob condições de crescimento de estresse salino e sob condições de crescimento de disponibilidade de nutriente reduzida, o índice de verdor de plantas é medido na última imagem antes da floração.

Em contrapartida, sob condições de crescimento de estresse hídrico, o > índjce de verdor de plantas é medido na primeira imagem após a secura.

Biomassa O termo “biomassa”, para uso na presente invenção, é destinado a se referir ao peso total de uma planta ou parte de planta. O peso total pode ser medido como peso seco, peso fresco ou peso úmido. Dentro da definição de biomassa, pode ser feita uma distinção entre a biomassa de uma ou mais partes de uma planta, as quais podem incluir qualquer um ou mais dentre os seguintes: Partes acima do solo, tais como, mas não limitadas a, biomassa de galho, biomassa da semente, biomassa de folha, etc.;

Partes passíveis de colheita acima do solo, tais como, mas não limitadas a, biomassa de galho, biomassa da semente, biomassa de caule, biomassa de folha, toletes, etc.; partes abaixo do solo, tais como, mas não limitadas a, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc.; partes passíveis de colheita abaixo do solo, tais como, mas não limitadas a, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc.; partes passíveis de colheita parcialmente abaixo do solo tais como, mas não limitadas a, raízes de beterraba e outras áreas de hipocótilo de uma planta, rizomas, estolhos ou colmos subterrâneos rastejantes; biomassa vegetativa, tal como biomassa de raiz, biomassa de galho, etc.; órgãos reprodutores; e propágulos, tais como semente.

Raiz Em uma realização preferida, por todo este pedido, qualquer referência à “raiz“ como biomassa ou partes passíveis de colheita ou como órgão, por exemplo, de teor de açúcar aumentado, deve ser compreendida 1 corpo uma referência às partes passíveis de colheita parcialmente inseridas em ou em contato físico com o solo, tal como, mas não se limita a, raízes de beterraba e outras áreas de hipocótilo de uma planta, rizomas, estolhos ou colmos subterrâneos rastejantes, assim como partes passíveis de colheita abaixo do solo, tais como, mas não limitadas a, raiz, raiz primária, tubérculos ou bulbos, mas não inclui folhas.

Resistência ao estresse Um aumento em rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre se a planta estiver sob condições de não estresse ou se a planta for exposta a diversos estresses em comparação com as plantas de controle. As plantas tipicamente respondem à exposição ao estresse crescendo mais lentamente.

Em condições de estresse severo, a planta pode até parar o crescimento totalmente. O estresse brando, por outro lado, é definido no presente documento como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta, o qual não resulta na interrupção do crescimento da planta totalmente, sem a capacidade de retomar o crescimento. O estresse brando no sentido da invenção conduz a uma redução no crescimento das plantas sob estresse de menos do que 40%, 35%, 30% ou 25%, com mais preferência, menos do que 20% ou 15% em comparação com a planta de controle sob condições de não estresse. Devido aos avanços em práticas da agricultura (irrigação, fertilização, tratamentos de pesticida), os estresses severos não são muitas vezes encontrados em plantas cultivadas. Como uma consequência, o crescimento comprometido induzido pelo estresse brando é muitas vezes uma característica indesejável para a agricultura. O “estresse biótíco” é compreendido como o impacto negativo feito às plantas por outros organismos vivos, tais como bactérias, vírus, fungos, nematódeos, insetos, outros animais ou outras plantas. Os “estresses bióticos” são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, tais como baçtérias, vírus, fungos, plantas, nematódeos e insetos, ou outros animais, o A % qual pode resultar em efeitos negativos sobre o crescimento e/ou rendimento da planta. O “estresse abiótico” é compreendido como o impacto negativo de fatores não vivos sobre a planta viva em um ambiente específico. Os “estresses abióticos” podem ser devidos à secura ou água em excesso, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidante e temperaturas quentes, frias e congelantes. O “estresse abiótico” pode ser um estresse osmótico causado por um estresse hídrico, por exemplo, devido à secura, estresse salino, ou estresse por congelamento. O estresse abiótico também pode ser um estresse oxidante ou um estresse por frio. O “estresse por congelamento” é destinado a se referir ao estresse devido a temperaturas de congelamento, isto é, temperaturas nas quais as moléculas de água disponíveis congelam e se transformam em gelo. O “estresse por frio”, também chamado de “estresse por resfriamento”, é destinado a se referir a temperaturas frias, por exemplo, temperaturas abaixo de 10°, ou de preferência, abaixo de 5°C, mas nas quais as moléculas de água não congelam. Conforme relatado em Wang et al. (Plant (2003) 218: 1-14), o estresse abiótico conduz a uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam de maneira adversa o crescimento da planta e produtividade. A secura, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidante são conhecidos como interconectados e podem induzir o crescimento e dano celular através de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descreve um grau particularmente alto de “linha cruzada” entre o estresse hídrico e estresse de alta salinidade. Por exemplo, secura e/ou salinização são manifestadas principalmente como estresse osmótico, resultando na interrupção da homeóstase e distribuição de íon na célula. O estresse oxidante, o qual frequentemente acompanha a alta ou baixa temperatura, salinidade ou estresse hídrico, pode causar a desnaturação de proteínas estruturais e funcionais. Como uma consequência, estes estresses ambientais variados muitas vezes ativam caminhos de sinalização de célula similares e respostas celulares, tais como a produção de proteínas de estresse, a regulação ascendente de antioxidantes, o acúmulo de solutos compatíveis e interrupção do crescimento. O termo condições de “não estresse”, para uso na presente invenção, são aquelas condições ambientais que permitem o crescimento ótimo de plantas. Os elementos versados na técnica estão cientes das condições normais do solo e condições climáticas para um determinado local. As plantas com ótimas condições de crescimento, (crescimento sob condições de não estresse) tipicamente rendem em ordem crescente de preferência ao menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% ou 75% da produção média de tal planta em um determinado ambiente. A produção média pode ser calculada com base em colheita e/ou estação. Os elementos versados na técnica estão cientes das produções de rendimento médio de uma safra.

Aumentar / Aperfeiçoar / Otimizar Os termos “aumentar”, “aperfeiçoar” ou “otimizar” no contexto de um traço relacionado ao rendimento são intercambiáveis no sentido do pedido ao menos um aumento de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, de preferência, ao menos 15% ou 20%, com mais preferência, 25%, 30%, 35% ou 40% no(s) traço(s) relacionado(s) ao rendimento em comparação com as plantas de controle, conforme definido no presente documento.

Melhoramento genético assistido por marcador Tais programas de melhoramento genético às vezes exigem a introdução de variação alélica por meio do tratamento mutagênico das plantas, com o uso, por exemplo, de mutagênese EMS; alternativamente, os programas podem começar com uma coleção de variantes alélicos da chamada origem í “natural” causada de maneira não intencional. A identificação de variantes alélicos, então, ocorre, por exemplo, por PCR. Isto é seguido por uma etapa para a seleção de variantes alélicos superiores da sequência em questão e que geram rendimento aumentado. A seleção é tipicamente realizada por meio do monitoramento do desempenho de crescimento de plantas que contêm diferentes variantes alélicos da sequência em questão. O desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ou no campo. As etapas opcionais adicionais incluem cruzar as plantas nas quais o variante alélico superior foi identificado com outra planta. Isto poderja ser usado, por exemplo, para fazer uma combinação de características fenotípicas interessantes. USO COMO SONDAS EM (MAPEAMENTO DE GENE) O uso de ácidos nucleicos que codificam a proteína de interesse para mapear de maneira genética e física os genes exige somente uma sequência de ácido nucleico de ao menos 15 nucleotídeos de comprimento.

Estes ácidos nucleicos podem ser usados como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DNA genômico da planta digerido por restrição podem ser sondados com os ácidos nucleicos que codificam a proteína de interesse. Os padrões de banda resultantes podem ser, então, submetidos a análises genéticas com o uso de programas de computador, tais como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) com a finalidade de construir um mapa genético. Além disso, os ácidos nucleicos podem ser usados para sondar Southern blots que contêm DNAs genômicos tratados com endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos que representam pai e progênie de um cruzamento genético definido. A segregação dos polimorfismos de DNA é observada e usada para calcular a posição do ácido nucleico que codifica a proteína de interesse no mapa genético obtido anteriormente com o uso desta população I (Bojistein et al. (1980) Am, J. Hum. Genet. 32:314-331). A produção e o uso de sondas derivadas de gene de planta para o uso em mapeamento genético é descrita em Bernatzky e Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Inúmeras publicações descrevem o mapeamento genético de clones de cDNA específicos com o uso da metodologia descrita acima ou variações da mesma. Por exemplo, as populações de intercruzamento F2, populações de retrocruzamento, populações aleatoriamente casadas, linhas isogênicas próximas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser usados para o mapeamento. Tais metodologias são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica.

As sondas de ácido nucleico também podem ser usadas para o mapeamento físico (isto é, colocação de sequências em mapas físicos; vide Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas 319 a 346, e as referências citadas no mesmo).

Em outra realização, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas no mapeamento de hibridação in situ de fluorescência direta (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Embora os métodos atuais de mapeamento de FISH favoreçam o uso de grandes clones (vários kb a várias centenas de kb; vide Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), os aperfeiçoamentos em sensibilidade podem permitir o desempenho do mapeamento de FISH com o uso de sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos à base de amplificação de ácido nucleico para o mapeamento genético e físico pode ser realizada com o uso dos ácidos nucleicos. Os exemplos incluem amplificação específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligação específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077- 1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) Nucleic Acid >

Re|. 18:3671), mapeamento híbrido por radiação (Walter et al. (1997) Nat.

I

Genet. 7:22-28) e mapeamento Happy (Dear e Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a sequência de um ácido nucleico é usada para projetar e produzir pares de primer para o uso na reação de amplificação ou em reações de extensão de primer. O projeto de tais primers é bem conhecido pelos elementos versados na técnica. Em métodos que empregam o mapeamento genético à base de PCR, pode ser necessário identificar as diferenças de sequência de DNA entre as pais do cruzamento de mapeamento na região que corresponde a presente sequência de ácido nucleico. Isto, no entanto, não é geralmente necessário para os métodos de mapeamento.

Planta O termo “planta”, para uso na presente invenção abrange plantas completas, ancestrais e progênie das plantas e partes de planta, que incluem sementes, galhos, caules, folhas, raízes (que incluem tubérculos), flores, e tecidos e órgãos, em que cada um dentre os mencionados anteriormente compreende o gene/ácido nucleico de interesse. O termo “planta” também abrange células de planta, culturas de suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos, novamente em que cada um dentre os mencionados anteriormente compreende o gene/ácido nucleico de interesse.

Planta(s) de controle A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte de rotina de um procedimento experimental e pode incluir plantas do tipo selvagem correspondentes ou plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta ou até da mesma variedade que a planta a ser avaliada. A planta de controle também pode consistir em um zigoto nulo da planta a ser avaliada. Os zigotos nulos (ou plaptas de controle nulas) consistem em indivíduos que perdem o transgene por segregação. Adicionalmente, as plantas de controle são desenvolvidas sob condições de crescimento igual das plantas da invenção, isto é, nas proximidades de, e simultaneamente com, as plantas da invenção. Uma “planta de controle”, para uso na presente invenção, se refere não somente a plantas completas, mas também a partes de planta, que incluem sementes e partes de semente.

Material de propagação O “material de propagação” consiste em qualquer tipo de órgão, tecido ou célula de uma planta capaz se desenvolver em uma planta completa. O “material de propagação” pode ser com base na reprodução vegetativa (também conhecida como propagação vegetativa, multiplicação vegetativa ou clonagem vegetativa) ou reprodução sexual. O material de propagação pode consistir, portanto, em sementes ou partes dos reprodutores não órgãos, como caule ou folha. Em particular, em relação à Poaceae, o material de propagação adequado também pode consistir em seções do caule, isto é, recortes do caule (como toletes).

Colmo Um “colmo” consiste no caule de um Poaceae e é também conhecido como a “cana para moer”, em particular, espécie Saccharum como a cana de açúcar. No contexto de Poaceae, “colmo”, “caule”, “galho” ou “haste” são usados de maneira intercambiável.

Tolete Um “tolete” consiste em uma seção do caule de um Poaceae, em particular, espécie Saccharum como a cana de açúcar, que é adequada para ser usada como material de propagação. As expressões sinônimas a “broto” são “cana de semente”, “recorte de caule”, “seção do colmo” e “pedaço de semente”. t , A seguir, a expressão “conforme definido na reivindicação/item X“ á se ciestina a direcionar o elemento versado na técnica para aplicar a definição conforme apresentado no item/reivindicação X. Por exemplo, “um ácido nucleico conforme definido no item 1” deve ser compreendido de modo que na definição do ácido nucleico conforme no item 1 seja aplicada ao ácido nucleico.

Em consequência, o termo “conforme definido no item” ou "conforme definido na reivindicação” pode ser substituído pela definição correspondente daquele item ou reivindicação, respectivamente.

Descrição detalhada A presente invenção mostra que o aumento da expressão em uma planta de um ácido nucleico de flavodoxina que codifica um polipeptídeo de flavodoxina com o uso de um tipo particular de promotor e o direcionamento de plastídeo resulta em plantas que têm um ou mais traços relacionado ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle.

Qualquer referência mais adiante no presente documento a uma “proteína útil nos métodos da invenção” é tomada para se referir a um polipeptídeo de flavodoxina conforme definido no presente documento.

Qualquer referência mais adiante no presente documento a um “ácido nucleico útil nos métodos da invenção” é tomada para se referir a um ácido nucleico capaz de codificar tal polipeptídeo de flavodoxina com direcionamento de plastídeo. Em uma realização, qualquer referência a uma proteína ou ácido nucleico ou construção de expressão “útil nos métodos da invenção” deve ser compreendida como proteínas ou ácidos nucleicos ou construção de expressão “útil nos métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção". O ácido nucleico a ser introduzido em uma planta (e, portanto, útil na execução dos métodos da invenção) consiste em qualquer ácido nucleico que codifica o tipo de proteína que será descrita agora, mais adiante nesse documento também chamado de “ácido nucleico de ΡΟΓ, “gene I PO^I”, “ácido nucleico de flavodoxina”, “ácido nucleico de flavodoxina” ou “gene de^flavodoxina”, de preferência, que codifica a dita proteína com um sinal alvo para o plastídeo de uma planta.

Qualquer referência no presente documento a “um promotor particular” é tomada para se referir a um promotor de PCPR conforme definido no presente documento.

Deste modo, um ácido nucleico de flavodoxina que codifica um polipeptídeo de flavodoxina é útil nas construções genéticas, métodos, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da presente invenção. Prefere-se que o ácido nucleico de flavodoxina consista em uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo da mesma; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um Λ fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo da mesma; de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridação severas.

Com mais preferência, o ácido nucleico de flavodoxina isolado que compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequênbia com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina que tem em ordem crescente de preferência ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridação de alta severidade.

As porcentagens de identidade de um ácido nucleico são I indicadas com referência a toda a região de nucleotídeo dada em uma sequência especificamente apresentada no presente documento.

Em uma realização preferida, o ácido nucleico de flavodoxina útil nos métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção codifica um polipeptídeo que compreende um ou mais dos domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM PFQ0258, de preferência, quando analisados com o software InterproScan conforme descrito no exemplo 2. Adicionalmente preferida é uma localização e/ou ordem do um ou mais domínios e/ou motivos relacionados na tabela B dentro da sequência de polipeptídeo do polipeptídeo de flavodoxina que é substancialmente igual àquela mostrada para SEQ ID NO: 2 na figura 1.

Com a máxima preferência, o ácido nucleico de flavodoxina isolado compreende ou consiste em uma sequência conforme representada em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, um complemento da mesma, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com qualquer uma destas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar das mesmas, sob condições de hibridação severas e, de preferência, que codifica um polipeptídeo que compreende um ou mais dos domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM PF00258. de preferência, quando analisado com o software InterproScan, conforme descrito no exemplo 2.

Os ácidos nucleicos de flavodoxina preferidos são mencionados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Em uma realização, o ácido nucleico de flavodoxina compreende uma sequência de ácido nucleico mencionada na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Mais preferida como ácido nucleico de flavodoxina é uma sequência de ácido nucleico que compreende o gene de flavodoxina de Anabaena sp., de preferência, Anpbaena PCC7119, ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803.

Mais preferida como ácido nucleico de flavodoxina é uma sequência de ácido nucleico que compreende o gene de flavodoxina de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119.

Em uma realização, a invenção se refere a métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos conforme descrito no presente documento, que compreende o gene de flavodoxina otimizado por códon de Anabaena conforme apresentado em SEQ ID NO: 13 que codifica a proteína de flavodoxina de SEQ ID NO: 2 ou fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo da mesma, conforme descrito no presente documento, em que o dito polipeptídeo de flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo é ligado a um peptídeo de trânsito, conforme descrito no presente documento, e funcionalmente ligado a um promotor adequado para a expressão em plantas. Os promotores adequados além do promotor apresentado em SEQ ID NO: 7 são conhecidos na técnica.

Em uma realização, a invenção se refere a métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos conforme descrito no presente documento, que compreende o gene de flavodoxina de Synechocystis sp. PCC 6803 conforme apresentado em SEQ ID NO: 15 ou que codifica a proteína de flavodoxina da SEQ ID NO: 16, ou fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo da mesma, conforme descrito no presente documento, em que o dito poiipeptídeo de flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo é ligado a um peptídeo de trânsito, conforme descrito no presente documento, e funcionalmente ligado a um promotor adequado para a expressão em plantas. Os promotores adequados além do promotor apresentado em SEQ ID NO: 7 são conhecidos na técnica. As sequências dos polipeptídeos codificados são mostradas em SEQ ID NO: 16 & 18, com ou sem > um,peptídeo de trânsito FNR de ervilha, respectivamente. ) Os variantes de ácido nucleico adicionais úteis na prática dos métodos da invenção incluem partes de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina, fragmentos funcionais de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina, ácidos nucleicos que se hibridizam a ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina, variantes de splice de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina, variantes alélicos de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina e variantes de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina obtidos por meio de transposição de gene. Os termos sequência de hibridação, variante de splice, variante alélico e transposição de gene são conforme descrito no presente documento.

Os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina não precisam ser ácidos nucleicos completos, uma vez que o desempenho dos métodos da invenção nem sempre dependem do uso de sequências de ácido nucleico completas. De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional de qualquer uma das sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou uma parte de um ácido nucleico que codifica um ortólogo, paralógo ou homólogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Um fragmento de um ácido nucleico pode ser preparado, por exemplo, fazendo-se um ou mais apagamentos para o ácido nucleico. As partes podem ser usadas em forma isolada ou podem ser fundidas a outras sequências de codificação (ou não codificação) com a finalidade de, por exemplo, produzir uma proteína que combina várias atividades. Quando fundido a outras sequências de codificação, o polipeptídeo resultante produzido > sob,translação pode ser maior do que previsto para a parte de proteína. % Os fragmentos de um ácido nucleico de flavodoxina descritos no presente documento codificam um polipeptídeo de flavodoxina conforme definido no presente documento ou ao menos uma parte do mesmo, o qual tem substancialmente a mesma atividade biológica que as sequências de aminoácido dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que a parte consiste em uma parte de qualquer um dos ácidos nucleicos dados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou é uma parte de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou paralógo de qualquer uma dentre as sequências de aminoácido dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que a parte tenha ao menos cerca de 100, ao menos cerca de 200, ao menos cerca de 300, ao menos cerca de 400, ao menos cerca de 500, ao menos cerca de 600, ao menos cerca de 700, ao menos cerca de 800, ao menos cerca de 900, ao menos cerca de 1000 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento de qualquer uma dentre as sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que o ácido nucleico de flavodoxina compreenda ao menos cerca de 100, ao menos cerca de 200, ao menos cerca de 300, ao menos cerca de 400, ao menos cerca de 500 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, ou até o comprimento total da sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15.

Prefere-se que a parte do ácido nucleico de flavodoxina tenha cerca de 400 a 425, cerca de 425 a 450, cerca de 450 a 475, cerca de 475 a 500, cerca de 500 a 525, cerca de 525 a 550, cerca de 550 a 575, cerca de 575 a 600, cerca de 625 a 650, cerca de 650 a 675, cerca de 675 a 700, cerca de 700 a 725, cerca de 725 a 750, cerca de 750 a 775, cerca de 775 a 800, cerca > de 800 a 825, cerca de 825 a 850, cerca de 850 a 875, cerca de 875 a 900, cerca de 925 a 950, cerca de 950 a 975, cerca de 975 a 1000 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que a parte de ácido nucleico de flavodoxina tenha cerca de 400 a 425, cerca de 425 a 450, cerca de 450 a 475, cerca de 475 a 500 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, ou até o comprimento total da sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15.

Outra variante de ácido nucleico consiste em um ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições de severidade reduzida, de preferência, sob condições severas, com mais preferência, sob condições altamente severas, com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento, ou com uma parte conforme definido no presente documento ou um complemento de qualquer um. > A sequência de hibridação é capaz de hibridizar ao complemento de qualquer um dos ácidos nucleicos dados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou a uma parte de qualquer uma destas sequências, sendo que uma parte é conforme definido no presente documento, ou a sequência de hibridação é capaz de hibridizar ao complemento de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou paralógo de qualquer uma dentre as sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, Com a máxima preferência, a sequência de hibridação é capaz de hibridizar ao complemento de um ácido nucleico dado em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou ao complemento de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo conforme representado por SEQ ID NO: 2 ou 16 ou a uma parte do mesmo. Em uma realização, as condições de hibridação são de média severidade, de I preferência, de alta severidade, conforme definido no presente documento.

Prefere-se que a sequência de hibridação codifique um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que compreende SEQ ID NO: 2 ou 16.

As variantes de splice preferidas consistem em variantes de splice de um ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou uma variante de splice de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou paralógo de SEQ ID NO: 2 ou 16.

Adicionalmente, as variantes de ácido nucleico também podem ser obtidas por mutagênese sítio-direcionada. Vários métodos estão disponíveis para se alcançar a mutagênese sítio-direcionada, sendo que o mais comum consiste em métodos à base de PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.). Os polipeptídeos de flavodoxina que se diferem da sequência de SEQ ID NO: 2 ou 16 por um oU vários aminoácidos (substituição(s), inserção(s) e/ou apagamento(s) conforme definido no presente documento) podem ser igualmente úteis para aumentar o rendimento de plantas nos métodos, construções e plantas da invenção.

Os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina podem ser derivados a partir de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucleico pode ser modificado a partir de sua forma nativa em composição e/ou ambiente genômico através da manipulação humana deliberada. Prefere-se que o ácido nucleico que codifica polipeptídeo de fiavodoxina seja a partir de uma bactéria, de preferência, uma cianobactéria, com a máxima preferência, a partir de Anabaena.

Em outra realização, a presente invenção se estende a DNA cromossômico recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico (que inclui um promotor particular empregado) útil nos métodos da invenção, em que o dito ácido nucleico está presente no DNA cromossômico corpo consequência de métodos recombinantes, mas não em seu ambiente genético natural. Em uma realização adicional, o DNA cromossômico recombinante da invenção é compreendido em uma célula de planta. O DNA compreendido dentro de uma célula, particularmente uma célula com paredes celulares como uma célula de planta, é melhor protegido contra degradação ou dano do que uma sequência de ácido nucleico sem proteção. O mesmo é válido para uma construção de DNA compreendida em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de planta.

Em uma realização preferida, a invenção se refere a composições que compreendem o DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção e uma célula hospedeira, de preferência, uma célula de planta, em que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção são compreendidos dentro da célula hospedeira, de preferência, dentro de uma célula de planta ou uma célula hospedeira com uma parede celular. Em uma realização adicional, a dita composição compreende células hospedeiras mortas, células hospedeiras vivas ou uma mistura de células hospedeiras mortas e vivas, em que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção podem ficar localizados em células hospedeiras mortas e/ou célula hospedeira viva. Opcionalmente, a composição pode compreender, adicionalmente, células hospedeiras que não compreendem o DNA cromossômico recombinante da invenção ou a construção da invenção. As composições da invenção podem ser usadas em processos de multiplicar ou distribuir o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção e, ou alternativamente, para proteger o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção contra rompimento e/ou degradação, conforme explicado no presente documento acima. O DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção podem ser usados como um marcador de qualidade das composições da invenção, como um indicador de > origem e/ou as uma indicação de produtor.

I v Um polipeptídeo de flavodoxina, conforme descrito no presente documento, é útil nas construções genéticas, métodos, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da presente invenção. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina consista em um polipeptídeo de flavodoxina bacteriano, por exemplo, um polipeptídeo de flavodoxina cianobacteriano, tal como a flavodoxina da cianobactéria Anabaena PCC7119 (Fillat M. et al (1991) Biochem J. 280 187-191), SEQ ID NO: 2 ou a flavodoxina de Synechocystis apresentada em SEQ ID NO: 16. Outros polipeptídeos de flavodoxina adequados incluem as flavodoxinas a partir de bactérias anoxigênicas fotossintéticas, enterobactérias, diazotrofos e algas. Os exemplos de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina adequados para o uso de acordo com a presente invenção são exemplificados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Enquanto que um polipeptídeo de flavodoxina do tipo selvagem é preferido, um polipeptídeo de flavodoxina também pode consistir em um fragmento, mutante, derivado, variante ou alelo de tal sequência do tipo selvagem.

Os fragmentos, mutantes, derivados, variantes e alelos adequados são aqueles que retêm as características funcionais do polipeptídeo codificado pelo gene de flavoproteína do tipo selvagem, especialmente a capacidade de agir como um antioxidante. As mudanças para uma sequência, para produzir um mutante, variante ou derivado, podem ser por meio de um ou mais dentre adição, inserção, apagamento ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucleico, que conduz à adição, inserção, apagamento ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo codificado.

Certamente, as mudanças para o ácido nucleico que não fazem diferença para a sequência de aminoácido codificada estão incluídas.

Um polipeptídeo que é um membro da família de flavodoxina ou qu^ é uma variante de sequência de aminoácido, alelo, derivado ou mutante da A mesma pode compreender uma sequência de aminoácido que compartilha mais do que cerca de 30% de identidade de sequência, mais do que cerca de 35%, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 45%, mais do que cerca de 55%, mais do que cerca de 65%, mais do que cerca de 70%, mais do que cerca de 80%, mais do que cerca de 90% ou mais do que cerca de 95%, de preferência, mais do que cerca de 96%, mais do que cerca de 97%, mais do que cerca de 98%, ou mais do que cerca de 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo de flavodoxina codificado por um ácido nucleico de flavodoxina, conforme mostrado na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Um polipeptídeo que é um membro da família de flavodoxina ou que é uma variante de sequência de aminoácido, alelo, derivado ou mutante da mesma pode compreender uma sequência de aminoácido que compartilha mais do que cerca de 30% de identidade de sequência, mais do que cerca de 35%, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 45%, mais do que cerca de 55%, mais do que cerca de 65%, mais do que cerca de 70%, mais do que cerca de 80%, mais do que cerca de 90% ou mais do que cerca de 95%, de preferência, mais do que cerca de 96%, mais do que cerca de 97%, mais do que cerca de 98%, ou mais do que cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da flavodoxina de Anabaena PCC7119.

Em determinadas realizações, um polipeptídeo de flavodoxina pode mostrar pouca homologia geral, ou seja, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40% ou cerca de 45%, com a sequência de flavodoxina de Anabaena PCC7119 (SEQ ID NO: 2) ou a flavodoxina de Synechocystis (SEQ ID NO: 16), mesmo que este possua substancialmente a 3 mesma atividade de anti-oxidação. No entanto, em domínios ou regiões funcionalmente significantes, a homologia de aminoácido pode ser muito maior.

Por exemplo, um polipeptídeo de flavodoxina compreende um domínio de I ligação de FMN que tem alta homologia ao domínio de ligação de FMN de .* flavodoxina (um domínio semelhante à flavodoxina). Os supostos domínios ou ) regiões funcionalmente significantes podem ser identificados com o uso de processos de bioinformática, que inclui a comparação das sequências de homólogos.

Em uma realização preferida, o polipeptídeo de flavodoxina útil nos métodos, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção j consiste em um polipeptídeo que compreende um ou mais dos domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM PF00258, de preferência, quando analisados com o software InterproScan conforme descrito mo exemplo 2. Adicionalmente preferida PE uma localização e/ou ordem do um ou mais domínios e/ou motivos relacionados na tabela B ) dentro da sequência de polipeptídeo do polipeptídeo de flavodoxina que é substancialmente igual àquela mostrada para a SEQ ID NO: 2 na figura 1.

Mais preferido como polipeptídeo de flavodoxina é um polipeptídeo que compreende ou consiste na proteína de flavodoxina codificada por qualquer uma das sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na i listagem de sequência, de preferência, de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119, ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803, com mais preferência, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou 16 codificado pelo ácido nucleico conforme apresentado em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, respectivamente, e com a máxima preferência, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina consista em um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um polipeptídeo que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, > 62°/o, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75^o, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle; (ii) um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle.

Com mais preferência, o polipeptídeo de flavodoxina consiste em um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um polipeptídeo que tem em ordem crescente de preferência ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; (ii) um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico que tem em ordçm crescente de preferência ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina confira um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo de flavodoxina.

As porcentagens de identidade de um polipeptídeo ou proteína são indicadas com referência à sequência de aminoácido inteira especificamente apresentada no presente documento.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina compreenda ao menos cerca de 50, ao menos cerca de 75, ao menos cerca de 100, ao menos cerca de 110, ao menos cerca de 120, ao menos cerca de 130, ao menos cerca de 140, ao menos cerca de 145, ao menos cerca de 150, ao menos cerca de 155, ao menos cerca de 160, ao menos cerca de 165, ou ao menos cerca de 167 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência,. contados a partir do N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 16. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina tenha substancialmente a mesma atividade biológica que SEQ ID NO: 2 ou 16. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina confira um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo de flavodoxina.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina compreenda ao menos cerca de 50, ao menos cerca de 75, ao menos cerca de 100, ao menos ? cerca de 110, ao menos cerca de 120, ao menos cerca de 130, ao menos 1 cerca de 140, ao menos cerca de 145, ao menos cerca de 150, ao menos cerca de 155, ao menos cerca de 160, ao menos cerca de 165 ou ao menos cerca de 167 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de aminoácido codificadas pelas sequências de ácido nucleico apresentadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina tenha substancialmente a mesma atividade biológica que a respectiva sequência da Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina confira um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo de flavodoxina.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina compreenda cerca de 50 a 75, cerca de 75 a 100, cerca de 100 a 110, cerca de 110 a 120, cerca de 120 a 130, cerca de 130 a 140, cerca de 140 a 150, cerca de 150 a 160, cerca de 160 a 170 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico apresentadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina tenha substancialmente a mesma atividade biológica que a respectiva sequência da Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina confira um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo de flavodoxina.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina compreenda cerca de 50 a 75, cerca de 75 a 100, cerca de 100 a 110, cerca de 110 a 120, cerca 1 de ^120 a 130, cerca de 130 a 140, cerca de 140 a 150, cerca de 150 a 160, cerca de 160 a 170 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 16. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina tenha substancialmente a mesma atividade biológica que SEQ ID NO: 2 ou 16. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina confira um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo de flavodoxina.

Com mais preferência, o polipeptídeo de flavodoxina isolado compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2 ou 16, ou é codificado por um ácido nucleico com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle.

Os polipeptídeos codificados por variantes alélicos úteis nos métodos da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica que o polipeptídeo de flavodoxina de SEQ ID NO: 2 ou 16 e qualquer uma das sequências de aminoácido codificadas pelas sequências de ácido nucleico descritas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Os variantes alélicos existem na natureza, e está incluído nos métodos da presente invenção o uso destes alelos naturais. Prefere-se que o variante alélico consista em um variante alélico de SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um variante alélico de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou paralógo de SEQ ID NO: 2 ou 16.

Em outra realização, as sequências de polipeptídeo úteis nos métodos, construções, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção têm substituições, apagamentos e/ou inserções em comparação com t a sequência de SEQ ID NO: 2 ou 16, em que as substituições, inserções e/ou a apagamentos de aminoácido pode se situar na faixa a partir de 1 a 10 aminoácidos cada. A invenção também fornece construções genéticas, como construções de expressão ou cassetes de expressões, ou construções de vetor, que compreendem um ácido nucleico de flavodoxina. Prefere-se que estas construções genéticas sejam adequadas para a introdução e/ou expressão em plantas, parte de plantas ou célula de plantas de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina. As construções de expressão podem ser inseridas em construções de vetores, os quais podem estar comercialmente disponíveis, adequadas para a transformação em células de planta ou células hospedeiras e adequadas para a expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também fornece o uso de uma construção genética conforme definido no presente documento nos métodos da invenção. Deste modo, outra realização da presente invenção consiste em uma construção de expressão ou cassete de expressão que compreende um ácido nucleico de flavodoxina.

As construções genéticas da invenção podem ser compreendidas em uma célula hospedeira, célula de planta, semente, produto agrícola, planta ou parte de planta. As células de planta ou células hospedeiras são transformadas com uma construção genética, tal como uma construção de vetor ou uma construção de expressão que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos de flavodoxina descritos no presente documento.

Em uma realização, a construção genética da invenção confere rendimento ou traços relacionados ao rendimento aumentados para uma planta, quando tem sido introduzida na dita planta, tal planta expressa o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de flavodoxina compreendido na construção genética. Em outra realização, a construção genética da invenção t confere rendimento ou traços relacionados ao rendimento aumentados para % uma planta que compreende células de planta nas quais a construção tem sido introduzida, tais células de planta expressam o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de flavodoxina compreendido na construção genética. O elemento versado na técnica está plenamente ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes na construção genética, com a finalidade de transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

Mais especifica mente, a presente invenção fornece uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucleico de flavodoxina que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido acima; (b) uma ou mais sequência de controles capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nucleico de (a), em que a sequência de controle consiste, de preferência, em uma sequência de promotor; e opcionalmente (c) uma sequência de terminação de transcrição.

Com a máxima preferência, a presente invenção fornece uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucleico de flavodoxina que codifica um polipeptídeo de flavodoxina conforme definido acima; (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito; (c) uma sequência de promotor, ligada de maneira operável ao ácido nucleico de (a) e (b), em que a sequência de promotor compreende o promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase), um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma; e opcionalmente > ^ (d) uma sequência de terminação de transcrição.

Em uma realização preferida, qualquer referência a um promotor de PCPR ou um promotor de protoclorofilida redutase por todo este pedido deve ser compreendida como referência a um promotor que em seu contexto genético natural controla a expressão de um ácido nucleico que codifica uma protoclorofilida redutase. Prefere-se que o dito promotor seja a partir de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea, com mais preferência, a partir de um Poaceae, até com mais preferência, a partir de arroz e com a máxima preferência, o promotor com uma sequência as apresentada em SEQ ID NO: 7.

Prefere-se que o ácido nucleico de flavodoxina da construção de expressão compreenda qualquer um dos ácidos nucleico de flavodoxina descritos no presente documento, de preferência, conforme apresentado na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo do mesmo. Prefere-se que o ácido nucleico de trânsito seja selecionado a partir das sequências de ácido nucleico que codificam qualquer um dos peptídeos de trânsito descritos no presente documento, de preferência, conforme apresentado na Tabela 3, um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo do mesmo.

Prefere-se que a sequência de promotor compreenda uma sequência de promotor de PCPR conforme descrito no presente documento, de preferência, o promotor de PCPR de arroz (promotor de protoclorofilida redutase), ou um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma.

Prefere-se que o ácido nucleico de flavodoxina da construção de expressão compreenda um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 93%, ao menos I 94^o, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, em que o ácido nucleico tem, de preferência, a mesma atividade biológica que SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo de flavodoxina que confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle; (ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i); (iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina que tem em ordem crescente de preferência ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou ao menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, o polipeptídeo de flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridação severas, em que o ácido nucleico tem, de preferência, substancialmente a mesma atividade biológica que SEQ ID NO: 2 ou 16 ou uma sequência complementar da mesma, de preferência, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo de flavodoxina que confere um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle.

Com a máxima preferência, o ácido nucleico de flavodoxina da construção de expressão compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, um complemento da mesma, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou uma molécula de ácido nucleico r qu^ hibridiza com qualquer uma destas moléculas de ácido nucleico sob 1 condições de hibridação severas.

Mais outra realização se refere a construções genéticas úteis nos métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção, em que a construção genética compreende o ácido nucleico de flavodoxina da invenção funcionalmente ligado ao promotor, conforme apresentado no presente documento acima, e adicionalmente ligado de modo funcional a um ou mais dentre 1) ácidos nucleicos que otimizam a expressão de ácido nucleico (NEENAs): (a) conforme apresentado no pedido de patente internacional publicado como WO2011/023537 na tabela 1 da página 27 à página 28 e/ou SEQ ID NO: 1 a 19 e/ou conforme definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional que NEENAs estão com o presente incorporados a título de referência; e/ou (b) conforme apresentado no pedido de patente internacional publicado como WO2011/023539 na tabela 1 da página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a 19 e/ou conforme definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional que NEENAs estão com o presente incorporados a título de referência; e/ou (c) conforme contido ou apresentado em: (i) o pedido de prioridade europeu depositado em 5 de julho de 2011 como EP 11172672.5 na tabela 1 da página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a 14937, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 5, 14936 ou 14937, e/ou conforme definido nos itens i) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu que NEENAs estão com o presente incorporados a título de referência; e/ou (ii) o pedido de prioridade europeu depositado em 6 de julho de t 201,1 como EP 11172825.9 na tabela 1 da página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a a 65060, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 3, e/ou conforme definido nos itens i) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu que NEENAs estão com o presente incorporados a título de referência; e/ou b) equivalentes que têm substancialmente o mesmo efeito de otimização; e/ou 2) funcionalmente ligado a uma ou mais moléculas de ácido nucleico de otimização de confiabilidade (RENA) a) conforme contido ou apresentado no pedido de prioridade europeu depositado em 15 de setembro de 2011 como EP 11181420.8 na tabela 1 da página 26 e/ou SEQ ID NO: 1 a 16 ou 94 a 116666, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 16, e/ou conforme definido no ponto i) a v) do item a) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu que a(s) molécula(s) de RENA estão com o presente incorporados a título de referência; ou b) equivalentes que tem substancialmente o mesmo efeito de otimização.

Uma realização preferida da invenção se refere a uma construção genética útil nos métodos, construções de vetor, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção e que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina da invenção sob o controle de um promotor conforme descrito no presente documento acima, em que o NEENA, RENA e/ou o promotor é heterólogo à molécula de ácido nucleico de flavodoxina da invenção.

As construções genéticas - como as construções de expressão - descritas no presente documento e as construções de vetor descritas no presente documento são úteis nos métodos, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção. Prefere-se que as mesmas confiram um aumento de um ou mais traços relacionados ao rendimento, quando introduzidas estavelmente em uma planta conforme descrito no presente documento. Prefere-se que as plantas que carregam a construção da invenção mostrem um aumento em um ou mais traços relacionados ao rendimento cultivadas sob condições de não estresse, condições de secura ou condições de deficiência de nitrogênio, com mais preferência, sob condições de não estresse. O promotor em uma construção genética descrita no presente documento pode consistir em um promotor nativo ou pode ser um promotor não nativo ao ácido nucleico descrito no presente documento, isto é, um promotor que não regula a expressão do dito ácido nucleico em seu ambiente genético natural.

Em uma realização, o promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase) em uma construção genética descrita no presente documento consiste em um promotor ativo em tecido(s) verde(s), folhas e/ou caules, de preferência, um promotor específico de tecido verde com substancíalmente o mesmo padrão de expressão temporal e/ou espacial e/ou substancialmente a mesma intensidade de expressão que o promotor mostrado em SEQ ID NO; 7, e de preferência, é de origem vegetal ou sintético.

Vantajosamente, o promotor de PCPR específico de tecido verde está resultando em um aumento mais forte de um ou mais traços relacionados ao rendimento desejados que qualquer outro promotor, se natural ou sintético, tal como promotor ubíquo ou constitutivo, promotor regulado por desenvolvimento, promotor induzível, promotor específico de órgão ou específico de tecido, por exemplo, um promotor específico de raiz, promotor específico de semente, promotores específicos de endosperma, promotores específicos de embrião, promotores específicos de embrião, promotores específicos de aleurona, promotor específico de tecido verde, promotor específico de caule, específico de folha ou específico de meristema. , Prefere-se que a sequência de promotor ligada de maneira 1 opeVável ao ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e uma flavodoxina, conforme definido no presente documento, compreenda um promotor de PCPR - com mais preferência, o promotor de PCPR a partir de arroz e até com mais preferência, o promotor de PCPR conforme apresentado no documento sob ο η2. EP1532257 como “PR0123” com SEQ ID NO: 14, ou conforme apresentado em SEQ ID NO: 7 do presente pedido - , ou um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma. Com mais preferência, a sequência de promotor consiste no promotor de PCPR - com mais preferência, o promotor de PCPR a partir de arroz e até com mais preferência o promotor de PCPR conforme apresentado no documento sob o η2. EP1532257 como “PR0123” com SEQ ID NO: 14, ou conforme apresentado em SEQ ID NO: 7 do presente pedido -, ou um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma. Em uma realização, os fragmentos funcionais ou variantes de promotor têm em ordem crescente de preferência ao menos 50%, ao menos 51%, ao menos 52%, ao menos 53%, ao menos 54%, ao menos 55%, ao menos 56%, ao menos 57%, ao menos 58%, ao menos 59%, ao menos 60%, ao menos 61%, ao menos 62%, ao menos 63%, ao menos 64%, ao menos 65%, ao menos 66%, ao menos 67%, ao menos 68%, ao menos 69%, ao menos 70%, ao menos 71%, ao menos 72%, ao menos 73%, ao menos 74%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou até 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 7.

Prefere-se que a parte da sequência de promotor consista em uma parte funcional de SEQ ID NO: 7. Prefere-se que a parte tenha ao menos » % cerca de 400, ao menos cerca de 500, ao menos cerca de 600, ao menos cerca de 700, ao menos cerca de 800, ao menos cerca de 900, ao menos cerca de 1000, ao menos cerca de 1100 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 7.

Prefere-se que a parte do sequência de promotor tenha cerca de 400 a 425, cerca de 425 a 450, cerca de 450 a 475, cerca de 475 a 500, cerca de 500 a 525, cerca de 525 a 550, cerca de 550 a 575, cerca de 575 a 600, cerca de 625 a 650, cerca de 650 a 675, cerca de 675 a 700, cerca de 700 a 725, cerca de 725 a 750, cerca de 750 a 775, cerca de 775 a 800, cerca de 800 a 825, cerca de 825 a 850, cerca de 850 a 875, cerca de 875 a 900, cerca de 925 a 950, cerca de 950 a 975, cerca de 975 a 1000, cerca de 1000 a 1025, cerca de 1025 a 1100, cerca de 1100 a 1125, cerca de 1125 a 1150, cerca de 1150 a 1175, cerca de 1170 a 1179 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 7. A sequência de promotor preferida compreende ou consiste em SEQ ID NO: 7. O peptídeo de trânsito codificado pelo ácido nucleico de trânsito tem, de preferência, cerca de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37. 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou mais aminoácidos de comprimento. Prefere-se que o peptídeo de trânsito direcione o transporte de uma proteína para outras organelas dentro da célula. Prefere-se que o peptídeo de trânsito direcione o polipeptídeo de flavodoxina para o núcleo, mitocôndria, matriz mitocondriai, retículo endoplasmático, cloroplastos, apicoplastos, cromoplasto, cianela, % tilacoide, amiloplasto, peroxisoma, glioxisoma e/ou hidrogenosoma. Com a máxima preferência, o peptídeo de trânsito direciona o polipeptídeo de flavodoxina para um plastídeo, de preferência, para um cloroplasto. Prefere-se que o peptídeo de trânsito seja clivado a partir do polipeptídeo, de preferência, por uma peptidase sinal, depois que o polipeptídeo é transportado. Em outra realização, o peptídeo de trânsito não é clivado a partir do polipeptídeo depois que o polipeptídeo é transportado.

Um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado para o uso de acordo com determinadas realizações da presente invenção pode consistir em qualquer sequência de peptídeo que direciona um polipeptídeo para o cloroplasto de uma célula de planta. Os peptídeos adequados podem ser prontamente identificados por um elemento versado na técnica e alguns exemplos são mostrados na Tabela 3. Outros exemplos são conhecidos na técnica.

Em algumas realizações preferidas, um peptídeo de trânsito pode compreender ou consistir no peptídeo de trânsito de cloroplasto da ferredoxina- NADP+ redutase contendo FAD (FNR), com mais preferência, da FNR de ervilha ou Cyanophora paradoxa, tal peptídeo de trânsito tem, até com mais preferência, a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 ou 10, respectivamente.

Sua sequência de codificação é, de preferência, conforme mostrado em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, respectivamente.

Um ácido nucleico que codifica qualquer polipeptídeo de flavodoxina conforme definido acima pode ser usado de acordo com a presente invenção com qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado, conforme definido acima. Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina não seja fundido a um peptídeo de trânsito com o qual é naturalmente associado, isto é, é fundido a um peptídeo de trânsito heterogêneo. Os polipeptídeos de flavodoxina, os I qu^is não são encontrados em plantas, não são naturalmente associados com os peptídeos de trânsito de cloroplasto.

Uma sequência de ácido nucleico de trânsito preferida que codifica um peptídeo de trânsito é dada em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9. Prefere-se que a sequência de ácido nucleico de trânsito compreenda ou consista em uma sequência de ácido nucleico de trânsito conforme dado em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, ou fragmentos ou variantes funcionais da mesma. Os fragmentos ou variantes funcionais da sequência de ácido nucleico de trânsito preferidos têm em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 3, 8 ou 9 ou qualquer uma das sequências de ácido nucleico que codificam os peptídeos de trânsito mostrados na Tabela 3.

Em uma realização, o peptídeo de trânsito se difere de qualquer peptídeo de trânsito naturalmente ligado à(s) proteína(s) de flavodoxina da tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Prefere-se que a parte da sequência de ácido nucleico de trânsito tenha ao menos cerca de 15, ao menos cerca de 30, ao menos cerca de 45, ao menos cerca de 60, ao menos cerca de 75, ao menos cerca de 90, ao menos cerca de 120, ao menos cerca de 135, ao menos cerca de 150 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ do ácido nucleico, de comprimento de qualquer uma das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9.

Prefere-se que a parte da sequência de ácido nucleico de trânsito i teq,ha 15 a 45, cerca de 24 a 60, cerca de 60 a 75, cerca de 75 a 102, cerca de A 10^ a 126, cerca de 126 a 150 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9.

Um peptídeo de trânsito preferido é dado em SEQ ID NO: 4 ou 10.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito compreenda ou consista em um peptídeo de trânsito conforme dado em SEQ ID NO: 4 ou 10, ou fragmentos ou variantes funcionais do mesmo. Os fragmentos ou variantes funcionais de peptídeo de trânsito preferidos têm em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NOs: 4 ou 10, ou qualquer um dos peptídeos de trânsito mostrados na Tabela 3.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito compreenda ao menos cerca de 5, ao menos cerca de 10, ao menos cerca de 15, ao menos cerca de 20, ao menos cerca de 25, ao menos cerca de 30, ao menos cerca de 35, ao menos cerca de 40, ao menos cerca de 45 ou ao menos cerca de 50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 10.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito compreenda ao menos cerca de 5, ao menos cerca de 10, ao menos cerca de 15, ao menos cerca de 20, ao menos cerca de 25, ao menos cerca de 30, ao menos cerca de 35, ao mepos cerca de 40, ao menos cerca de 45 ou ao menos cerca de 50 % \t aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal, de preferência, a partir do N- terminai da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de aminoácido apresentadas na Tabela 3.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito compreenda cerca de 5 a 20, cerca de 20 a 25, cerca de 25 a 30, cerca de 30 a 35, cerca de 35 a 40, cerca de 40 a 45, cerca de 45 a 50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-termínal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4 ou 10.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito compreenda cerca de 5 a 20, cerca de 20 a 25, cerca de 25 a 30, cerca de 30 a 35, cerca de 35 a 40, cerca de 40 a 45, cerca de 45 a 50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal, de preferência, a partir do N-terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de aminoácido apresentadas na Tabela 3.

Os peptídeos de trânsito de cloroplasto preferidos adicionais são mencionados na Tabela 3.

Prefere-se que a construção de expressão compreenda um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por,SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, 11 ou 18, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; e/ou (iii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) ou (ii); e opcionalmente uma sequência de promotor conforme descrito no presente documento.

Prefere-se que a parte funcional do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina e um peptídeo de trânsito tenha ao menos cerca de 100, ao menos cerca de 200, ao menos cerca de 300, ao menos cerca de 400, ao menos cerca de 500, ao menos cerca de 600 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’, de preferência, a partir da extremidade 5’ do ácido nucleico, de comprimento de qualquer uma das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Prefere-se que a parte funcional do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina e um peptídeo de trânsito tenha cerca de 400 a 425, cerca de 425 a 450, cerca de 450 a 475, cerca de 475 a 500, cerca de 500 a 525, cerca de 525 a 550, cerca de 550 a 575, cerca de 575 a 600, cerca de 625 a 650, cerca de 650 a 675 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’, de preferência, a partir da extremidade 5’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico dadas em SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Com mais preferência, a construção de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico conforme apresentado em SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Adicionalmente preferida é uma construção de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito que compreende uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo da mesma.

Prefere-se que o polipeptídeo que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito compreenda ao menos cerca de 140, ao menos cerca de 150, ao menos cerca de 160, ao menos cerca de 170, ao menos cerca de 180, ao menos cerca de 190, ao menos cerca de 200, ao menos cerca de 210, ao menos cerca de 220 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir do N-terminal ou C-terminal, de preferência, a partir do N-terminai da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina compreende cerca de 100 a 110, cerca de 110 a 120, cerca de 120 a 130, cerca de 130 a 140, cerca de 140 a 150, cerca de 150 a 160, cerca de 160 a 170, cerca de 170 a 180, cerca de 180 a 190, cerca de 190 a 200, ce,rca de 200 a 210, cerca de 210 a 2^0 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, V contados a partir do N-terminal ou C-terminal, de preferência, a partir do N- terminal da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6.

Deste modo, uma realização adicional consiste em um polipeptídeo de flavodoxina codificado por uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucleico de flavodoxina que codifica um polipeptídeo de flavodoxina conforme descrito no presente documento; e. (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito conforme descrito no presente documento; em que a construção de expressão compreende uma sequência de promotor em ligação funcional à sequência de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de flavodoxina e a sequência de ácido nucleico de trânsito e em que a sequência de promotor compreende o promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase), de preferência, ou um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma.

Prefere-se que o polipeptídeo que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito compreenda um peptídeo de trânsito a partir de ferredoxina-NADP+ redutase contendo FAD (FNR) de ervilha e uma proteína de flavodoxina a partir de Anabaena sp. (PCC7119).

Prefere-se que o polipeptídeo de fusão que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito compreenda uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de í identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por 1 SE& ID NO: 6, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo.

Com mais preferência, o polipeptídeo que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido conforme apresentado em SEQ ID NO: 6.

Em algumas realizações preferidas, um polipeptídeo de fusão que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e um peptídeo de direcionamento de cloroplasto compreende ou consiste, de preferência, na sequência mostrada em SEQ ID NO: 6. Uma molécula de ácido nucleico adequada que codifica tal polipeptídeo de fusão compreende ou consiste, de preferência, na sequência mostrada em SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Prefere-se que a construção de expressão compreenda um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito a partir de ferredoxina-NADP+ redutase contendo FAD (FNR) de ervilha e uma proteína de flavodoxina a partir de Anabaena sp. (PCC7119) e um promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase), de preferência, a sequência de promotor compreende ou consiste nas sequências de nucleotídeo descritas em SEQ ID NO: 7.

Prefere-se que a construção de expressão compreenda um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucleico que tem em ordem crescente de preferência ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17, ou um fragmento, derivado, ortólogo ou par^ilógo da mesma; 1 (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de trânsito que compreende uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com ao menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, ou um fragmento, derivado, ortólogo ou paralógo do mesmo; e (iii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) ou (ii); e ligada de maneira operativa à mesma uma sequência de promotor que compreende em ordem crescente de preferência ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 77%, ao menos 78%, ao menos 79%, ao menos 80%, ao menos 81%, ao menos 82%, ao menos 83%, ao menos 84%, ao menos 85%, ao menos 86%, ao menos 87%, ao menos 88%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou até 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 7.

Prefere-se que a construção de expressão compreenda um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina conforme descrito em SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17 e ligada de maneira operável à mesma uma sequência de promotor conforme mostrado em SEQ ID NO: 7.

Opcionalmente, uma ou mais sequências de terminação de > transcrição podem ser usadas na construção introduzida em uma planta. Os elementos versados na técnica estão plenamente cientes de sequências de terminação que podem ser adequadas para o uso na execução da invenção.

Prefere-se que a construção compreenda um cassete de expressão que compreende uma sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina e uma sequência de terminação de transcrição. Prefere-se que a sequência de terminação de transcrição consista em um terminador zeina (t-zeina) ligado à extremidade 3’ da sequência de codificação de flavodoxina. Com a máxima preferência, o cassete de expressão compreende uma sequência que tem em ordem crescente de preferência ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade com a sequência do terminador zeina (t-zeina). A construção genética, construção de vetor ou construção de expressão descrita no presente documento pode compreender, adicionalmente, uma ou mais sequências que codificam um marcador selecionável.

Os marcadores selecionáveis preferidos podem ser selecionados a partir de marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo traço metabólico ou que permitem a seleção visual. Os exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência a antibióticos (tais como nptll que fosforila a neomicina e kanamicina, ou hpt, que fosforila a higromicina, ou genes que conferem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar que fornece resistência a Basta®; aroA ou gox que fornecem resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência a, por exemplo, imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonilureia), ou genes que fornecem um traço metabólico (tal como manA que > permite que as plantas utilizem mannose como única fonte de carbono ou 1 xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos, tais como a resistência a 2-deoxiglicose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β- galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (tal como, o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína fluorescente verde, GFP, e derivados da mesma). Esta lista representa somente um pequeno número de marcadores possíveis. O elemento versado na técnica está familiarizado com tais marcadores.

Diferentes marcadores são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção.

Sabe-se que em tentativas de integrar de forma estável ou transitória os ácidos nucleicos em células de planta, somente uma minoria das células absorve o DNA externo e, se desejado, o integra em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada.

Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (tal como aqueles descritos no presente documento) é usualmente introduzido nas células hospedeiras em conjunto com o gene de interesse. Estes marcadores podem ser, por exemplo, usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais por meio, por exemplo, de apagamento por meio de métodos convencionais. Adicionalmente, as moléculas de ácido nucleico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usado nos métodos da invenção, ou de outro modo em um vetor separado. As células que têm sido estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por meio de seleção (por exemplo, células que têm integrado o marcador selecionável sobrevivem, enquanto que as outras células morrem). % Uma realização adicional da presente invenção consiste em uma construção de vetor que compreende um ácido nucleico de flavodoxina, uma construção de expressão ou cassete de expressão que contém o ácido nucleico de flavodoxina, conforme descrito no presente documento.

Uma realização preferida consiste em uma construção de vetor recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de trânsito conforme descrito no presente documento (de preferência, selecionada a partir de Tabela 3) e um polipeptídeo de flavodoxina conforme descrito no presente documento (a sequência de codificação, de preferência, selecionada a partir da Tabela 2 e/ou da listagem de sequência) e, ligada de maneira operável à mesma, uma sequência de promotor conforme descrito no presente documento (de preferência, conforme descrito em SEQ ID

NO: 7), em que a sequência de promotor compreende o promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase), ou um fragmento ou variante funcional, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma.

Uma realização preferida adicional consiste em uma construção de vetor recombinante que compreende: (i) um ácido nucleico de flavodoxina que tem ao menos 60% de identidade, de preferência, ao menos 70% de identidade de sequência, ao menos 80 %, ao menos 90%, ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional da mesma, ou um ortólogo ou paralógo da mesma; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de flavodoxina que tem ao menos 60% de identidade, de preferência, ao menos 70% de identidade de sequência, ao menos 80 %, ao menos 90%, ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de ideptidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou 16, um fragmento funcional da 1 mesma, um ortólogo ou um paralógo da mesma; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; ligado de maneira operável com (b) uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor compreende, de preferência, o promotor de PCPR (promotor de protoclorofilida redutase), de preferência, ou um fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo ou paralógo da mesma; e, de preferência, (c) uma sequência de terminação de transcrição.

Adicionalmente, é fornecida uma construção de vetor recombinante que compreende: (i) um ácido nucleico de flavodoxina que tem ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou 16; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; ligado de maneira operável com (b) uma sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico de (a); de preferência, conforme descrito em SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortóiogo ou um paralógo do mesmo; e de preferência, (c) uma sequência de terminação de transcrição consiste em uma realização adicional da invenção. ü Uma realização preferida adicional consiste em uma construção de vetor recombinante que compreende: (i) um ácido nucleico de flavodoxina que tem ao menos 60% de identidade, de preferência, ao menos 70% de identidade de sequência, ao menos 80 %, ao menos 90%, ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional do mesmo, um ortóiogo ou um paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína de flavodoxina que tem ao menos 60% de identidade, de preferência, ao menos 70% de identidade de sequência, ao menos 80 %, ao menos 90%, ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou 16, um fragmento funcional do mesmo, um ortóiogo ou um paralógo do mesmo; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; ligado de maneira operável com (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito; de preferência, conforme descrito em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9; (c) uma sequência de promotor ligada de maneira operável aos ácidos nucleicos de (a) e (b); de preferência, conforme descrito em SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; e de preferência, (d) uma sequência de terminação de transcrição.

Adicionalmente, é fornecida uma construção de vetor recQmbinante que compreende: » % (i) um ácido nucleico de flavodoxina que tem ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que tem ao menos 95 %, ao menos 98%, ao menos 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou 16; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ij) ligado de maneira operável com (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito; de preferência, conforme descrito em SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, em que o peptídeo de trânsito e a proteína codificada pelo ácido nucleico de flavodoxina estão em ligação funcional um com o outro; (c) uma sequência de promotor ligada de maneira operável aos ácidos nucleicos de (a) e (b); de preferência, conforme descrito em SEQ ID NO: 7; e de preferência, (d) uma sequência de terminação de transcrição, onde a sequência de terminação de transcrição está em ligação funcional com o ácido nucleico de flavodoxina.

Uma realização preferida da presente invenção consiste em uma construção de vetor que compreende SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17. Prefere-se que o vetor de expressão compreenda SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17 e a sequência de promotor conforme representado por SEQ ID NO: 7 ligada de maneira operável a SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

As construções de vetor da invenção podem incluir, adicionalmente, uma origem de sequência de replicação que é exigida para a manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é A quando se exige que uma construção genética seja mantida em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (por exemplo, molécula de plasmídeo ou cosmideo). As origens de replicação preferidas incluem, mas não são limitadas a, a f1 -ori e colE1.

Para a detecção da transferência bem sucedida das sequências de ácido nucleico, conforme usado nos métodos da invenção, e/ou seleção de plantas transgênicas que compreendem estes ácidos nucleicos, é vantajoso utilizar genes marcadores (ou genes repórteres). Portanto, a construção de vetor pode compreender opcionalmente um gene marcador selecionável. Os exemplos para gene marcador selecionável são descritos no presente documento. Os genes marcadores podem ser removidos ou cortados da célula transgênica uma vez que não são mais necessários. As técnicas para a remoção de marcador são conhecidas na técnica, as técnicas úteis são descritas no presente documento.

De acordo com outra realização, a presente invenção fornece a método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento, e opcionalmente selecionar plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é expresso especificamente pelo uso de um promotor particular.

Uma realização adicional da presente invenção consiste em um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a exp/essão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um % Ã peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina e opcionalmente selecionar plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é expresso especificamente pelo uso de um promotor particular e direcionado para o(s) plastídeo(s). Prefere-se que a expressão do ácido nucleico exógeno seja sob o controle de uma sequência de promotor endógena ou exógena.

Prefere-se que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados compreendam rendimento aumentado em relação a plantas de controle e, de preferência, compreendam biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle e, de preferência, compreendam biomassa acima do solo alimentada, biomassa abaixo do solo aumentada, rendimento de semente aumentado e/ou rendimento de açúcar aumentado (como açúcar passível de colheita por planta, por peso fresco, por peso seco ou por área) em relação a plantas de controle.

Em uma realização preferida, o rendimento de semente é aumentado.

Em outra realização preferida, a biomassa acima do solo é aumentada. O desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas que têm um traço relacionado ao rendimento aumentado em relação ao traço relacionado ao rendimento de plantas de controle.

Os métodos inventivos para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, conforme descrito no presente documento, que compreendem introduzir, de preferência, por meio de métodos recombinantes, e expressar em uma planta o(s) ácido(s) nucleico(s) e/ou > construções, conforme definido no presente documento, e de preferência, a eta^pa adicional de cultivar as plantas e, opcionalmente, a etapa de coletar as plantas ou parte(s) das mesmas.

Em uma realização, o traço relacionado ao rendimento aumentado consiste em rendimento de semente aumentado, de preferência, índice de colheita aumentado, preenchimento de semente aumentado, número total de semente aumentado, peso total da semente aumentado e tempo, quantidade e qualidade de floração aperfeiçoada. Com mais preferência, o traço relacionado ao rendimento aumentado consiste em índice de colheita aumentado, preenchimento de semente aumentado e/ou peso total da semente aumentado.

Em outra realização, o traço relacionado ao rendimento aumentado consiste em biomassa aumentada, em particular, biomassa acima do solo, de preferência, biomassa de caule, em relação à biomassa acima do solo, e, em particular, biomassa de caule, de plantas de controle e/ou biomassa de raiz aumentada em relação à biomassa de raiz de plantas de controle e/ou biomassa de raiz de beterraba aumentada em relação à biomassa de raiz de beterraba de plantas de controle. Além disso, é particularmente considerado que o teor de açúcar (em particular, o teor de sucrose) nas partes acima do solo, particularmente, caule (em particular, de plantas de cana de açúcar) e/ou nas partes abaixo do solo, em particular, em raízes que incluem a raiz principal e tubérculos e/ou em raízes de beterraba (em particular, em beterrabas) é aumentado em relação ao teor de açúcar (em particular, o teor de sucrose) em parte(s) correspondente(s) da planta de controle. A biomassa acima do solo preferida consiste em biomassa de caule. A biomassa de caule otimizada pode ser exibida em um aumento em comprimento de caule, amplitude ou largura de caule, densidade do caule, peso do caule, diâmetro do caule, número de nós e/ou entrenós, diâmetro ou > quantidade de vasculatura do caule ou feixes vasculares, em particular, floema 1 e/ou xilema. Além disso, o teor de seiva do caule é, de preferência, otimizado.

Adicionalmente, o teor de sucrose, de preferência, o teor de sucrose do caule é, de preferência, otimizado.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser executados sob condições de estresse e não estresse. As condições de estresse consistem, de preferência, em condições de estresse abiótico, com mais preferência, secura, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutriente devido a uma ou mais deficiência de nutriente, tal como deficiência de nitrogênio, com a máxima preferência, secura e/ou deficiência de nitrogênio.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são executados com o uso de plantas que necessitam de tolerância ao estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à secura, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutriente devido a um ou mais deficiência de nutriente, tal como deficiência de nitrogênio.

Em um exemplo, os métodos da presente invenção podem ser executados sob condições de estresse, tais como secura ou secura branda, para gerar plantas com rendimento aumentado em relação a plantas de controle. Prefere-se que, quando submetidas ao estresse hídrico, as plantas transgênicas tenham biomassa aumentada, de preferência, biomassa acima do solo e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser executados sob condições de estresse, tais como deficiência de nutriente para gerar plantas que têm rendimento aumentado em relação a plantas de controle. A deficiência de nutriente pode resultar a partir de uma falta de nutrientes, tais como nitrogênio, fosfatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, magnésio, manganês, ferro e boro, entre outros. Prefere-se que, quando subrnetidas à deficiência de nutriente, as plantas transgênicas tenham % * biomassa aumentada, de preferência, biomassa acima do solo, e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em mais outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser executados sob condições de estresse, tais como estresse salino, para gerar plantas que têm rendimento aumentado em relação a plantas de controle. O termo estresse salino não é limitado ao sal comum (NaCI), mas pode consistir em qualquer um ou mais dentre: NaCI, KCI, LiCI, MgCI2, CaCI2, entre outros. Prefere-se que, quando submetidas ao estresse salino, as plantas transgênicas tenham biomassa aumentada, de preferência, biomassa acima do solo, e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em mais outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser executados sob condições de estresse, tais como estresse ao frio ou estresse ao congelamento, para gerar plantas que têm rendimento aumentado em relação a plantas de controle. Prefere-se que, quando submetidas ao estresse ao frio, as plantas transgênicas tenham biomassa aumentada, de preferência, biomassa acima do solo, e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em outra realização preferida, os métodos da presente invenção são executados sob condições de não estresse.

Em mais outra realização, é fornecido um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um ou mais dentre qualquer um dos ácidos nucleicos exógenos dados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou que compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional, um ortólogo, paralógo ou homólogo de qualquer uma das sequências de ácido nucleico dadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência ou , (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de % .,¾ identidade com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com a atividade biológica de uma flavodoxina ou uma ferredoxina; ou (v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas que se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou (vi) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer dois dentre (i) a (iv) acima.

Prefere-se que o ácido nucleico exógeno também codifique qualquer um dos peptídeos de trânsito dados na Tabela 3.

Um método preferido para aumentar a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina consiste em introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, até com mais preferência, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos.

De acordo com uma realização, é fornecido um método para aperfeiçoar os traços relacionados ao rendimento, conforme fornecido no presente documento, em plantas em relação a plantas de controle, que > compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico A exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos.

Em outra realização, é fornecido um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional, ortólogo, paralógo ou variante de splice de qualquer um dos ácidos nucleicos dados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Em mais outra realização, é fornecido um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um variante alélico de um ou mais dentre qualquer um dos ácidos nucleicos dados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Por conseguinte, uma realização preferida consiste em um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina, em que a expressão é sob o controle de uma sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina. Prefere-se que a sequência de promotor compreenda a sequência de nucleotídeo do promotor de protociorofilida redutase, ou fragmentos ou derivados funcionais do mesmo. O promotor de protociorofilida redutase, de preferência, compreende a sequência de SEQ ID NO: 7.

Em uma realização preferida, o peptídeo de trânsito direciona o polipeptídeo de flavodoxina para um plastídeo, de preferência, para um clor,oplasto. Prefere-se que o peptídeo de trânsito de cloroplasto seja i selecionado a partir dos peptídeos de trânsito relacionados na Tabela 3.

Prefere-se que o polipeptídeo de flavodoxina seja codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico relacionado na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Com mais preferência, o polipeptídeo de flavodoxina é a partir de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119, ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803. Com a máxima preferência, o peptídeo de trânsito é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; e/ou por (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo.

Mais preferido é o polipeptídeo de flavodoxina que é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; e/ou por (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou 1 um4a sequência complementar do mesmo.

A

Um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, de preferência, compreende (a) transformar estavelmente uma célula de planta com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e que codifica um polipèptídeo dé flavodoxina, em que o polipeptídeo de flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; e/ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar do mesmo; em ligação funcional com uma sequência de promotor; (b) regenerar a planta a partir da célula de planta; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno.

Prefere-se que o peptídeo de trânsito seja selecionado a partir dos peptídeos de trânsito mostrados na Tabela 3, com mais preferência, é codificado pelos ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3, 8 ou 9 ou tem a sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 4 ou 10. Prefere-se que a sequência de promotor compreenda uma sequência de ácido nucleico conforme representado por SEQ ID NO: 7.

Como uma alternativa para o ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 que codifica o peptídeo de trânsito do variante * de ^EQ ID NO: 10 pode ser usado.

Prefere-se que a planta usada no método da presente invenção consista em uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Prefere-se que a planta seja um Poaceae. Com mais preferência, a planta monocotiledônea é do gênero saccharum, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense e Saccharum spontaneum. O desempenho dos métodos da invenção gera plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados. Em particular, o desempenho dos métodos da invenção gera plantas que têm vigor precoce aumentado e/ou rendimento aumentado, especialmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle. Os termos “vigor precoce”, “rendimento”, “biomassa” e “rendimento de semente" são descritos em maiores detalhes na seção de “definições” no presente documento. A presente invenção fornece, deste modo, um método para aumentar os traços relacionados ao rendimento, especialmente a biomassa e/ou rendimento de semente de plantas, em relação a plantas de controle, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno, conforme descrito no presente documento. Prefere-se que o ácido nucleico exógeno também codifique um peptídeo de trânsito, de preferência, uma sequência de trânsito de cloroplasto. Prefere-se que o dito traço relacionado ao rendimento otimizado compreenda biomassa otimizada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle, e de preferência, compreenda biomassa acima do solo otimizada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle. , De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o 1 desempenho dos métodos da invenção gera plantas que têm uma taxa de crescimento aumentada em relação a plantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento. O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas sob condições de não estresse e/ou sob condições de estresse com traços relacionados ao rendimento aumentados em relação a plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de não estresse e/ou sob condições de estresse, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina. Prefere-se que o método compreenda a etapa de introduzir um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, e de preferência, um peptídeo de trânsito, na dita planta, de preferência, sob o controle de uma sequência de promotor endógena ou exógena, conforme descrito no presente documento. Prefere-se que o dito traço relacionado ao rendimento otimizado seja obtido sob condições de estresse hídrico, estresse salino ou deficiência de nitrogênio. O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas sob condições de secura, com traços relacionados ao rendimento aumentados em relação a plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis.

Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de secura, tal método compreende aumentar a expressão em uma t planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de 1 flavodoxina, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos. O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, particularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, com traços relacionados ao rendimento aumentados em relação a plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis.

Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos. O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas sob condições de estresse salino, com traços relacionados ao rendimento aumentados em relação a plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de estresse salino, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, em que o ditq ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos.

Em uma realização da invenção, o rendimento de semente é aumentado.

Em outra realização da invenção, a biomassa acima do solo é aumentada, de preferência, biomassa de caule, colmo e/ou tolete, com mais 1 preferência, em Poaceae, até com mais preferência, em uma espécie Saccharum, com a máxima preferência, em cana de açúcar, e opcionalmente a biomassa abaixo do solo e/ou crescimento de raiz não é aumentado em comparação com as plantas de controle.

Em uma realização adicional, o açúcar passível de colheita total, de preferência, glicose, frutose e/ou sucrose, é aumentado, de preferência, em adição a outros traços relacionados ao rendimento aumentados, conforme definido no presente documento, por exemplo, biomassa, e com mais preferência, também em adição a um aumento em teor de açúcar, de preferência, teor de glicose, frutose e/ou sucrose.

Os métodos para aumentar a expressão de ácidos nucleicos ou genes, ou produtos de gene, são bem documentados na técnica e os exemplos são fornecidos no presente documento.

Conforme mencionado acima, um método preferido para modular a expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina consiste em introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina; no entanto, os efeitos de executar o método, isto é, otimizar os traços relacionados ao rendimento, também podem ser alcançados com o uso de outras técnicas bem conhecidas, que incluem, mas não se limitam a, marcação de ativação de T-DNA, TILLING, recombinação homóloga. Uma descrição destas técnicas é fornecida na seção de definições.

Desde que os genes marcadores, partícularmente, genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica, uma vez que os ácidos nucleicos têm sido introduzidos de maneira bem sucedida, o processo de acordo com a invenção para introduzir os ácidos nucleicos de modo vantajoso emprega as técnicas que possibilitam a remoção e excisão destes genes marcadores. Tal método consiste no que é conhecido como cotransformação, O método de cotransformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo contendo o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores. No caso de transformação com Agrobacteria, os transformantes usualmente recebem somente uma parte do vetor, isto é, a sequência flanqueada pelo T-DNA, a qual usualmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos a partir da planta transformada por meio da execução de cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposão são usados para a transformação em conjunto com o ácido nucleico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico que confere a expressão de um transposase, de modo transitório ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposão salta para fora do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação tem ocorrido com sucesso e é perdido. Em uma série de casos adicionais, o transposão salta para um local diferente. Nestes casos, o gene marcador precisa ser eliminado por meio da execução de cruzamentos. Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas que tornam possível, ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um método vantajoso adicional depende do que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem consiste no fato de que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O sistema mais conhecido deste tipo consiste no que é conhecido como o sistema Cre/lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marpador estiver integrado entre as sequências loxP, o mesmo é removido uma vez que a transformação tem ocorrido com sucesso, por meio da expressão da recombinase. Os sistemas de recombinação adicionais consistem no sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol.

Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração específica de local no genoma da planta das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível.

Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados a microrganismos, tais como, levedura, fungos ou bactérias.

Uma realização preferida da presente invenção consiste no uso de uma construção de expressão de acordo com ou um vetor de expressão recombinante descrito no presente documento em um método para fabricação de uma planta transgênica que tem um traço relacionado ao rendimento otimizado, de preferência, biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado, em relação a plantas de controle, e com mais preferência, a biomassa acima do solo aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Deste modo, uma realização preferida consiste em uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica obtenível por meio de um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle ou por meio de um método para a produção de plantas transgênicas, conforme descrito no presente documento, em que a dita planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina sob o controle de uma sequência de promotor, conforme descrito no presente documento.

Prefere-se que a planta transgênica, parte de planta transgênica > ou pélula de planta transgênica seja transformada com uma construção de a exptessão ou com um vetor de expressão recombinante descrito no presente documento.

Em uma realização preferida, a planta, parte de planta, semente, tolete ou propágulo da invenção tem um ou mais traço(s) relacionado(s) ao rendimento aumentado(s) sob condições de não estresse e/ou sob condições de secura e/ou deficiência de nitrogênio, com mais preferência, sob condições de não estresse.

Com a máxima preferência, a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica tem um traço relacionado ao rendimento otimizado, de preferência, uma biomassa otimizada e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle. A invenção também inclui células hospedeiras que contêm um ácido nucleico isolado exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina conforme definido acima. Em uma realização, as células hospedeiras de acordo com a invenção consistem em células de planta, leveduras, bactérias ou fungos. As células hospedeiras bacterianas preferidas são Escherichia coli ou Agrobacterium. As plantas hospedeiras para os ácidos nucleícos, construção, cassete de expressão ou o vetor usado no método de acordo com a invenção consistem, em princípio, vantajosamente em todas as plantas que são capazes de sintetizar os polipeptídeos usados no método inventivo. Em uma realização particular, as células de planta da invenção superexpressam a molécula de ácido nucleico da invenção.

Deste modo, uma realização da presente invenção consiste em um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um poiipeptídeo de flavodoxina, conforme descrito no presente documento, operativamente ligado a uma sequência de promotor, de preferência, um promotor de protoclorofiiida redutase, conforme descrito no presente > doqumento, compreendido em uma célula hospedeira, em que a célula A hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula de planta, célula bacteriana, célula de levedura, célula de fungo e célula de mamífero, de preferência, célula de planta, com mais preferência, uma célula de Poaceae, até com mais preferência, uma célula do gênero Saccharum, com a máxima preferência, uma célula de cana de açúcar.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a qualquer planta, em particular, a qualquer planta conforme definido no presente documento. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas que incluem legumes de pasto ou forragem, plantas ornamentais, safras alimentícias, árvores ou arbustos. De acordo com uma realização da presente invenção, a planta é uma planta cultivada. Os exemplos de plantas cultivadas incluem, mas não se limitam a, chicória, cenoura, mandioca, trevo, soja, beterraba, girassol, canola, alfalfa, semente de colza, semente de linho, algodão, tomate, batata e tabaco.

De acordo com outra realização da presente invenção, a planta consiste em uma planta monocotiledônea. Os exemplos de plantas monocotiledôneas incluem cana de açúcar. De acordo com outra realização da presente invenção, a planta é um cereal. Os exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticale, sorgo, farro, espelta, einkorn, teff, milo e aveias. Em uma realização particular, as plantas da invenção ou usadas nos métodos da invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em milho, trigo, arroz, soja, algodão, colza de semente oleaginosa que inclui canola, cana de açúcar, beterraba e alfalfa.

As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas que incluem legumes I de ,pasto ou forragem, plantas ornamentais, safras alimentícias, árvores ou 1 arbustos selecionados a partir da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amarandeste modo spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza de semente oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Cameliia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Caríca papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Eriandeste modo sp., Eríobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Heliandeste modo spp. (por exemplo, Heliandeste modo annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Majpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., % &

Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscandeste modo sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorgo bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outras.

As plantas preferidas são Poaceae. A planta mais preferida é cana de açúcar, de preferência, do gênero saccharum. A planta mais preferida é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense e Saccharum spontaneum.

Em relação às sequências da invenção ou úteis nos métodos, construções, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção, em 1 uma realização, um ácido nucleico ou uma sequência de polipeptídeo que se A origma não a partir de plantas maiores é usado nos métodos da invenção ou na construção de expressão útil nos métodos da invenção. Em outra realização, um ácido nucleico ou uma sequência de polipeptídeo de origem vegetal é usado nos métodos, construções, plantas, partes passíveis de colheita e produtos da invenção, devido ao fato de que o dito ácido nucleico e polipeptídeos tem a característica de um uso de códon otimizado para a expressão em plantas, e do uso de aminoácidos e locais regulatórios comuns em plantas, respectivamente. A planta de origem pode consistir em qualquer planta, mas, de preferência, aquelas plantas conforme descrito no presente documento. Em mais outra realização, uma sequência de ácido nucleico que se origina não a partir de plantas maiores, mas artificialmente alteradas para ter o uso de códon de plantas maiores é usada na construção de expressão útil nos métodos da invenção.

De acordo com outra realização, a presente invenção fornece um método para produzir plantas que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, em que o dito método compreende as etapas de aumentar a expressão na dita planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme descrito no presente documento, e opcionalmente selecionar plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados.

De acordo com outra realização, a presente invenção fornece um método para produzir plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, em que o dito método compreende as etapas de aumentar a expressão na dita planta de um ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina, conforme descrito no presente documento, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no premente documento, e opcionalmente selecionar plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados.

Deste modo, a invenção fornece, adicionalmente, plantas ou células hospedeiras transformadas com uma construção conforme descrito no presente documento. Em particular, a invenção fornece plantas transformadas com uma construção conforme descrito no presente documento, tais plantas têm traços relacionados ao rendimento aumentados conforme descrito no presente documento.

Uma realização preferida consiste, portanto, em um método para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que tem traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, biomassa e/ou rendimento de semente aumentada, que compreende: (a) introduzir uma construção de vetor recombinante descrita no presente documento em uma planta, uma parte de planta ou uma célula de planta; (b) gerar uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica a partir da planta transformada, parte de planta transformada ou célula de planta transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina.

Em uma realização, os métodos para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que tem traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, compreende a etapa de coletar as sementes da planta transgênica e plantar as sementes e cultivar as sementes até plantas, em que as sementes compreendem o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, e a sequência de promotor ligada de maneira I operável ao mesmo. % % Em outra realização, os métodos da invenção são métodos para a produção de uma planta transgênica de Poaceae, de preferência, uma planta da espécie Saccharum, uma parte transgênica da mesma, ou uma célula de planta transgênica da mesma, que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, compreendem a etapa de coletar toletes a partir da planta transgênica e plantar os toletes e cultivar os toletes até plantas, em que os toletes compreendem o ácido nucleico exógeno que codifica o polipeptídeo POI e a sequência de promotor ligada de maneira operável ao mesmo. A invenção também fornece um método para a produção de plantas transgênicas que têm biomassa otimizada, de preferência, biomassa acima do solo, e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle, que compreende a introdução e expressão em uma planta de qualquer ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para a produção de plantas transgênicas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, particularmente, biomassa e/ou rendimento de semente aumentado, tal método compreende: (i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta um ácido nucleico que codifica polipeptídeo de flavodoxina ou uma construção genética que compreende um ácido nucleico que codifica polipeptídeo de flavodoxina; e (ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovem o crescimento e desenvolvimento da planta, de preferência, que promovem o I crescimento e desenvolvimento de plantas que têm um ou mais traços I relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle. O ácido nucleico de (i) pode consistir em qualquer um dos ácidos nucleicos capazes de codificar um polipeptídeo de flavodoxina conforme descrito no presente documento. Prefere-se que o ácido nucleico também codifique um peptídeo de trânsito que direciona a flavodoxina para o plastídeo e, de preferência, o ácido nucleico é ligado de maneira operável a uma sequência de promotor descrita no presente documento. O cultivo da célula de planta sob condições que promovem o crescimento e desenvolvimento da planta, pode ou não incluir a regeneração e/ou crescimento à maturidade. Consequentemente, em uma realização particular da invenção, a célula de planta transformada pelo método de acordo com a invenção é regenerável em uma planta transformada. Em outra realização particular, a célula de planta transformada pelo método de acordo com a invenção não é regenerável em uma planta transformada, isto é, células que não são capazes de regenerar em uma planta com o uso de técnicas de cultura de célula conhecidas na técnica. Embora as células de plantas tenham geralmente a característica de totipotência, algumas células de planta não podem ser usadas para regenerar ou propagar plantas intatas a partir das ditas células. Em uma realização da invenção, as células de planta da invenção consistem em tais células. Em outra realização, as células de planta da invenção consistem em células de planta que não se sustentam de uma maneira autotrófica. Em exemplo consiste em células de planta que não se sustentam através de fotossíntese por meio da síntese de carboidrato e proteína a partir de substâncias inorgânicas, tais como água, dióxido de carbono e sal mineral. O ácido nucleico pode ser introduzido diretamente em uma célula de planta ou na própria planta (que inclui, a introdução em um tecido, órgão ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com uma característica % preferida da presente invenção, o ácido nucleico é, de preferência, introduzido em uma planta ou célula de planta por meio de transformação. O termo “transformação” é descrito em maiores detalhes na seção de “definições" no presente documento.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são executados com o uso de plantas que necessitam de tolerância ao estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à secura, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutriente devido a um ou mais deficiência de nutriente, tal como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, a presente invenção se estende a qualquer célula de planta ou planta produzida por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, e a todas as partes de planta e propágulos das mesmas. A presente invenção abrange plantes ou partes das mesmas (que incluem, sementes e/ou toletes) obteníveis por meio dos métodos de acordo com a presente invenção. As plantas, partes de planta ou células de planta compreendem um transgene de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido acima, de preferência, em uma construção genética, tal como um cassete de expressão. A presente invenção se estende adicionalmente para abranger a progênie de uma célula transfectada ou transformada primária, tecido, órgão ou planta completa que tem sido produzida por meio de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, sendo que a única exigência consiste no fato de que a progênie exibe substancialmente a(s) mesma(s) característica(s) genotípicas e/ou fenotípicas que aquelas produzidas pela pai nos métodos de acordo com a invenção.

Em uma realização adicional, a invenção se estende a sementes e/ou toletes que compreende de maneira exógena os cassetes de expressão 1 da j/ivenção, as construções genéticas da invenção ou os ácidos nucleicos que \ codificam o polipeptídeo de flavodoxina e/ou o fragmento funcional de flavodoxina, derivado, ortólogo, e/ou paralógo do mesmo, conforme descrito no presente documento e ligado de maneira operável a um promotor particular conforme descrito no presente documento.

Tipicamente, uma planta desenvolvida a partir da semente ou tolete da invenção também irá mostrar traços relacionados ao rendimento otimizados. A invenção também se estende a partes passíveis de colheita de uma planta transgênica da presente invenção, tais como, mas não se limitam a, sementes, folhas, frutos, flores, caules, toletes, raízes, rizomas, tubérculos e bulbos, em que as partes passíveis de colheita compreendem a construção da invenção e/ou um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e/ou o polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido no presente documento, com direcionamento para o plastídeo e expresso especificamente pelo uso de um promotor particular, e/ou Em particular, tais partes passíveis de colheita consistem em raízes, tais como raiz principal, rizomas, frutos, caules, toletes, raízes de beterraba, tubérculos, bulbos, folhas, flores e/ou sementes. As partes passíveis de colheita preferidas são semente e/ou recortes de caule (como toletes de cana de açúcar, mas não se limitam a toletes).

Em outra realização, as partes acima do solo, partes passíveis de colheita acima do solo ou biomassa acima do solo devem ser compreendidas como biomassa vegetativa acima do solo que inclui sementes e/ou frutos.

Em uma realização adicional, a invenção se refere a um grão de pólèn transgênico que compreende a construção da invenção e/ou um derivado haploide da célula de planta da invenção. Embora em uma realização particular o grão de pólen da invenção possa não ser usado para regenerar uma planta intata sem a adição de material genético adicional e/ou não é capaz de fotossíntese, o dito grão de pólen da invenção pode ter usos na introdução do traço relacionado ao rendimento otimizado em outra planta por meio da fertilização de um óvulo da outra planta com o uso de um grão de pólen vivo da invenção, produzindo uma semente a partir do óvulo fertilizado e cultivando uma planta a partir da semente resultante. Adicionalmente, os grãos de pólen encontram uso como marcadores de origem geográfica e/ou temporal. A invenção se refere adicionalmente a produtos derivados ou produzidos a partir de uma planta transgênica descrita no presente documento ou um ou mais produtos de uma planta transgênica passíveis de colheita descritos no presente documento, de preferência, diretamente derivados ou diretamente produzidos, a partir de uma ou mais partes passíveis de colheita d tal planta transgênica. Os produtos preferidos são péletes secos, caules prensados, toletes, farinha ou pós, fibras, tecido, papel ou papelão contendo fibras produzidas pelas plantas da invenção, óleo, gordura e ácidos graxos, amido, carboidratos, - que inclui amidos, papel ou papelão contendo carboidratos produzidos pelas plantas da invenção -, seiva, suco, resíduos ou proteínas. Os carboidratos preferidos são amidos, celulose e/ou açúcares, de preferência, sucrose. Também são produtos preferidos as fibras secas residuais, por exemplo, do caule (como bagaço a partir da cana de açúcar após a remoção do suco de cana), molassa ou torta de filtro, de preferência, a partir de cana de açúcar. Os ditos produtos podem ser produtos agrícolas.

Prefere-se que o produto compreenda - por exemplo, como um indicador da qualidade particular do produto - a construção da invenção, um 1 ácid,o nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, conforme A descrito no presente documento, e/ou um polipeptídeo de flavodoxina exógeno conforme descrito no presente documento, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o polipeptídeo de flavodoxina é direcionado para os plastídeos e expresso especificamente pelo uso de um promotor particular.

Em outra realização, a invenção se refere à semente moída e/ou caule moído antifalsificação que tem como uma indicação de origem e/ou como uma indicação de produtor uma célula de planta da invenção e/ou a construção da invenção, em que o caule moído consiste, de preferência, em caule de Poaceae moído, com mais preferência, cana de açúcar moída. A invenção também inclui métodos para a fabricação de um produto que compreende a) cultivar as plantas da invenção e b) produzir o dito produto a partir de, pelas plantas da invenção ou partes das mesmas, que incluem caule e/ou sementes. Em uma realização adicional, os métodos compreendem as etapas de a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir o dito produto a partir de, ou com as partes passíveis de colheita de plantas de acordo com a invenção. Prefere-se que o produto compreenda a construção genética, ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção conforme descrito no presente documento. Com mais preferência, o produto é produzido a partir de sementes ou do caule da planta transgênica, de preferência, a partir das sementes.

Em uma realização, o método para a fabricação de um produto que compreende a) cultivar as plantas Poaceae da invenção, de preferência, a planta que consiste em uma espécie Saccharum e, com mais preferência, cana de açúcar, b) obter o caule a partir das plantas da invenção, e c) cortar o caule em pedaços, de preferência, em pedaços adequados como material de » propagação, de preferência, em um ou mais toletes. Prefere-se que os toletes 1 compreendam a construção, ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção conforme descrito no presente documento.

Em outra realização, o método para a fabricação de um produto que compreende a) cultivar as plantas de Poaceae da invenção, de preferência, a planta que consiste em uma espécie Saccharum e, com mais preferência, cana de açúcar, b) obter o caule a partir das plantas da invenção ou partes das mesmas, e c) extrair o suco, de preferência, o suco de cana a partir do caule e/ou extrair as fibras residuais após a extração do suco, e opcionalmente d) extrair açúcar, de preferência, sucrose, a partir do suco do caule.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são executados com o uso de plantas que necessitam de tolerância ao estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à secura, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutriente devido a um ou mais deficiência de nutriente, tal como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, o método da invenção consiste em um método para a fabricação de tecido por meio de a) cultivar as plantas da invenção que são capazes de produzir fibras utilizáveis na fabricação de tecido, por exemplo, algodão, b) remover as partes passíveis de colheita, conforme descrito no presente documento, a partir das plantas, e c) produzir fibras a partir da dita parte passível de colheita e d) produzir tecido a partir das fibras de c).

Outra realização da invenção se refere a um método para a produção de matéria-prima para biorreatores, processos de fermentação ou plantas de biogás, que compreende a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir matéria-prima para biorreatores, processos de fermentação ou plantas de biogás. Em uma realização preferida, o método da invenção consiste em um método para produzir álcooi(is) a partir de material vegetal que compreende a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita, conforme descrito no presente documento, a partir das plantas e c) opcionalmente produzir matéria-prima para o processo de fermentação, e d) - após a etapa b) ou c) - produzir um ou mais álcool(is) a partir da dita matéria-prima ou partes passíveis de colheita, de preferência, por meio do uso de microrganismos, tais como fungos, algas, bactérias ou leveduras, ou culturas de célula. Um exemplo típico seria a produção de etanol com o uso de partes passíveis de colheita que contêm carboidrato, por exemplo semente de milho, partes do caule da cana de açúcar ou partes de raiz de beterraba da beterraba, ou produtos derivados a partir das mesmas, por exemplo, suco ou seiva a partir de cana de açúcar, beterraba, amido de milho ou xarope de amido de milho. Em uma realização, o produto é produzido a partir do caule da planta transgênica. Em outra realização, o produto é produzido a partir da semente da planta.

Em outra realização, o método da invenção consiste em um método para a produção de um ou mais polímeros que compreende a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita, conforme descrito no presente documento, a partir das plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das partes passíveis de colheita, opcionalmente que envolvem produtos intermediários, d) produzir um ou mais polímero(s) por meio da reação de ao menos um dos ditos monômeros com outros monômeros ou reação dos ditos monômero(s) uns com o s outros. Em outra realização, o método da invenção é um método para a produção de um composto farmacêutico que compreende a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das partes passíveis de colheita, opcionalmente que envolvem produtos intermediários, d) produzir A um ^composto farmacêutico a partir das partes passíveis de colheita e/ou produtos intermediários. Em outra realização, o método da invenção é um método para a produção de um ou mais produtos químicos que compreende a) cultivar as plantas da invenção, b) remover as partes passíveis de colheita conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir um ou mais blocos de construção de produto químico, tais como, mas não limitadas a, acetato, piruvato, lactato, ácidos graxos, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos, carotenoides, terpenoides ou esteroides a partir das partes passíveis de colheita, opcionalmente que envolvem produtos intermediários, d) produzir um ou mais produto(s) químico(s) por meio da reação de ao menos um dos ditos blocos de construção com outro bloco de construção ou reagindo o(s) dito(s) bloco(s) de construção um com o outro. A presente invenção também é direcionada a um produto obtido por meio de um método para a fabricação de um produto, conforme descrito no presente documento.

Em uma realização, os produtos produzidos pelos métodos da invenção são produtos vegetais, tais como, mas não se limitam a, um gênero alimentício, matéria-prima, um suplemento alimentar, suprimento de alimento, fibra, produto farmacêutico ou cosmético. Em outra realização, os métodos para a produção são usados para fazer produtos agrícolas tais como, mas não se limitam a, fibras, extratos de planta, farinha ou bagaço oleaginoso e outro material residual após um ou mais processos de extração, farinha, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e similares.

Os carboidratos preferidos são açúcares, de preferência, sucrose. Em uma realização, o produto agrícola é selecionado a partir do grupo que consiste em 1) fibras, 2) madeira, 3) extratos de planta, 4) farinha ou bagaço oleaginoso ou outro material residual após um ou mais processos de extração, 5) farinha, 6) proteínas, 7) carboidratos, 8) gorduras, 9) óleos, 10) polímeros, por exemplo % & celulose, amido, lignina, lignocelulose, e 11) combinações e/ou misturas de qualquer um de 1) a 10). Em uma realização preferida, o produto ou produto agrícola geralmente não compreende compreendem células de planta vivas, compreendem o cassete de expressão, construção genética, proteína e/ou polinucleotídeo conforme descrito no presente documento.

Prefere-se que o produto compreenda a construção genética, ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção conforme descrito no presente documento.

Em mais outra realização, os polinucleotídeos e/ou os polipeptídeos e/ou as construções genéticas da invenção são compreendidas em um produto agrícola. Em uma realização particular, as sequências de ácido nucleico e/ou sequências de proteína e/ou as construções genéticas da invenção podem ser usadas como marcadores de produto, por exemplo, onde um produto agrícola foi produzido pelos métodos da invenção. Tal marcador pode ser usado para identificar um produto que tem sido produzido por um processo vantajoso que resulta não somente em uma eficiência maior do processo, mas também a qualidade aperfeiçoada do produto devido à qualidade aumentada do material de planta e partes passíveis de colheita usadas no processo. Tais marcadores podem ser detectados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mas não limitado a, métodos à base de PCR para a detecção de ácido nucleico ou métodos à base de anticorpo para detecção de proteína. A presente invenção também abrange o uso de construções que compreendem ácidos nucieicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina e ligados de maneira operável ao promotor particular, conforme descrito no presente documento, e o uso destes polipeptídeos de flavodoxina expresso especificamente pelo uso de um promotor particular na otimização de qualquer um { dos traços relacionados ao rendimento em plantas mencionados antèriormente. Por exemplo, as construções que compreendem ácidos nucieicos que codificam polipeptídeo de flavodoxina e ligado de maneira operável ao promotor particular, conforme descrito no presente documento, ou os polipeptídeos de flavodoxina expressos por si mesmos especificamente pelo uso de um promotor particular, podem encontrar uso em programas de melhoramento genético, nos quais um marcador de DNA é identificado, o qual pode ser geneticamente ligado a uma combinação de gene que codifica polipeptídeo de flavodoxina - promotor conforme descrito no presente documento. A combinação de ácidos nucleicos/gene -promotor da invenção, ou os polipeptídeos de flavodoxina expressos por si próprios especificamente pelo uso de um promotor particular pode se usada para definir um marcador molecular. Este marcador de proteína ou DNA pode ser, então, usado em programas de melhoramento genético para selecionar plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, conforme definido no presente documento, nos métodos da invenção. Adicionalmente, os variantes alélicos de um ácido nucleico/gene que codifica polipeptídeo de flavodoxina ligado de maneira operável ao promotor particular, conforme descrito no presente documento, podem encontrar uso em programas de melhoramento genético assistidos por marcador. As combinações inventivas de um promotor particular e ácidos nucieicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina também podem ser usadas como sondas para mapear de maneira genética e física o local genômico de genes que são parte de, e como marcadores para traços ligados àqueles genes e seus locais de inserção. Tais informações podem ser úteis no melhoramento genético da planta a fim de desenvolver linhas com fenótipos desejados.

Uma realização preferida é um método para o melhoramento genético de uma planta com um ou mais traços relacionados ao rendimento > otimizados que compreende I (a) cruzar uma planta transgênica da invenção ou uma planta transgênica obtenível por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento com uma segunda planta; (b) obter semente a partir do cruzamento da etapa (a); (c) plantar as ditas sementes e cultivar as sementes a plantas; e (d) selecionar a partir das ditas plantas, plantas que expressam de maneira exógena o ácido nucleico que codifica polipeptídeo de flavodoxina descrito no presente documento, de preferência, que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, em que o ácido nucleico é, de preferência, funcionalmente ligado a uma sequência de promotor descrita no presente documento.

Opcionalmente, o método para melhoramento genético compreende, adicionalmente, a etapa de (e) produzir material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, em que o material de propagação compreende a construção genética e/ou construção de vetor da invenção.

Prefere-se que o material de propagação consista em recortes do caule ou sementes.

Outra realização preferida consiste em um método para o aperfeiçoamento da planta que compreende (a) obter uma planta transgênica pode meio de qualquer um dos métodos da presente invenção; (b) combinar dentro de uma célula de planta o material genético de ao menos uma célula de planta da planta de a) com o material genético de ao menos uma célula que se difere em um ou mais genes das células de planta das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda planta; { (c) obter semente a partir de ao menos uma planta gerada a partir 1 da uma célula de planta de b) ou da planta do cruzamento da etapa (b); (d) plantar as ditas sementes e cultivar as sementes a plantas; e (e) selecionar a partir das ditas plantas, plantas que expressam sob o controle de um promotor particular, conforme descrito no presente documento, o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina; e opcionalmente (f) produzir material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, em que o material de propagação compreende a construção genética e/ou construção de vetor da invenção.

Prefere-se que o material de propagação consista em recortes do caule ou sementes.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são executados com o uso de plantas que necessitam de tolerância ao estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à secura, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutriente devido a um ou mais deficiência de nutriente, tal como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, o teor de carboidrato de armazenamento total das plantas da invenção, ou partes das mesmas, e em particular das partes passíveis de colheita da(s) planta(s) é aumentado em comparação com a(s) planta(s) de controle e as partes de planta correspondentes das plantas de controle.

Os carboidratos de armazenamento consistem, de preferência, em açúcares, tais como, mas não limitados a, sucrose, frutose e glicose, e polissacarídeos, tais como, mas não limitados a, amidos, glucanos e frutanos. O teor de carboidrato de armazenamento total e o teor de grupos ou espécies individuais de carboidratos podem ser medidos em uma série de > maaeiras conhecidas na técnica. Por exemplo, o pedido internacional publicado como W02006066969 apresenta nos parágrafos [79] a [117] um método para determinar o teor de carboidrato de armazenamento total de cana de açúcar, que inclui teor de frutano.

Outro método para cana de açúcar é conforme exposto a seguir: As plantas de cana de açúcar transgênicas são cultivadas por 10 a 15 meses, na estufa ou no campo. As condições padrões para o crescimento das plantas são usadas. Os colmos de plantas de cana de açúcar que estão com 10 a 15 meses de idade e têm mais do que 10 entrenós são coletados. Depois que todas as folhas têm sido removidas, os entrenós do colmo são numerados a partir do topo (= 1) ao fundo (por exemplo = 36). Um disco de colmo com aproximadamente 1 a 2 g de peso é cortado a partir dó meio de cada entrenó.

Os discos de colmo de 3 entrenós são, então, combinados para gerar uma amostra e congelados em nitrogênio líquido.

Para a extração de açúcar, os discos de colmo são primeiramente cominuídos em um misturador Waring (disponível junto a Waring, New Hartford, Connecticut, EUA). Os açúcares são extraídos por meio de agitação por uma hora a 95°C em 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,0.

Posteriormente, os sólidos são removidos por filtração através de uma peneira de 30 pm. A solução resultante é subsequentemente empregada para a determinação de açúcar (vide no presente documento abaixo).

As plantas de cana de açúcar transgênicas são cultivadas por 10 a 15 meses. Em cada caso, um colmo de cana de açúcar da linha transgênica e uma planta de cana de açúcar do tipo selvagem é desfolhado, o colmo é dividido em segmento de 3 entrenós, e estes segmentos de entrenó são congelados em nitrogênio líquido em um recipiente de plástico de 50 ml vedado. O peso fresco das amostras é determinado. A extração para os propósitos da determinação de açúcar é feita conforme descrito abaixo.

I , Os teores de glicose, frutose e sucrose no extrato obtido de ϊ A acordo com o método de extração de açúcar descrito acima são determinados de maneira fotométrica em um ensaio de enzima através da conversão de NAD+ (dinucleótido de nicotinamida e adenina) em NADH (dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido). Durante a redução, o caráter aromático no anel nicotinamida é perdido e o espectro de absorção, deste modo, se altera.

Esta alteração no espectro de absorção pode ser detectada de maneira fotométrica. A glicose e frutose presentes no extrato são convertidas em glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato por meio da enzima hexoquinase e adenosina trifosfato (ATP). A glicose- 6-fosfato é subsequentemente oxidada pela enzima glicose-6-fosfato dehidrogenase para gerar 6-fosfogluconato.

Nesta reação, NAD+ é reduzido para gerar NADH, e a quantidade de NADH formado é determinada de maneira fotométrica. A razão entre o NADH formado e a glicose presente no extrato é 1:1, de modo que o teor de glicose possa ser calculado a partir do teor de NADH com o uso do coeficiente de absorção molar de NADH (6,31 por mmol e por cm de caminho óptico). Após a oxidação completa de glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato, o qual tem se formado de maneira semelhante na solução, é convertido pela enzima fosfoglucoisomerase para gerar glicose- 6-fosfato que, por sua vez, é oxidado para gerar 6- fosfogluconato. Novamente, a razão entre frutose e a quantidade de NADH formado é de 1 :1. Posteriormente, a sucrose presente no extrato é clivada pela enzima sucrase (Megazyme) para gerar glicose e frutose. As moléculas de glicose e frutose liberadas são, então, convertidas com as enzimas mencionadas anteriormente na reação dependente de NAD+ para gerar 6- fosfogluconato. A conversão de uma molécula de sucrose em 6-fosfogluconato resulta em duas moléculas de NADH. A quantidade de NADH formado é semelhantemente determinada de maneira fotométrica e usada para calcular o teor de sucrose, com o uso do coeficiente de absorção molar de NADH. i Os colmos de cana de açúcar são divididos em segmentos de três i % entrenós, em cada caso, conforme especificado acima. Os entrenós são numerados a partir do topo ao fundo (topo = entrenó 1, fundo = entrenó 21).

Adicionalmente, as plantas de cana de açúcar transgênicas podem ser analisadas com o uso de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, mas não limitado a: The Sampling of Sugarcane by the Full Width Hatch Sampler; ICUMSA (International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis, http://www.icumsa.org/index.php?id=4) Método GS 5-5 (1994) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlim (http://www.bartens.com/) The Sampling of Sugarcane by the Corer Method; ICUMSA Método GS 5-7 (1994) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlim (http://www.bartens.com/) The Determination of Sucrose by Gas Chromatography in Molasses and Factory Products - Official; and Cane Juice; ICUMSA Método GS 4/7/8/5-2 (2002) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlim (http://www.bartens.com/) The Determination of Sucrose, Glucose and Fructose by HPLC -in Cane Molasses-and Sucrose in Beet Molasses; ICUMSA Método GS 7/4/8-23 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlim (http://www.bartens.com/) The Determination of Glucose, Fructose and Sucrose in Cane Juices ,Syrups and Molasses, and of Sucrose in Beet Molasses by High Performance lon Chromatography; ICUMSA Método GS 7/8/4-24 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlim (http://www.bartens.com/).

Para safras além da cana de açúcar, métodos similares são conhecidos na técnica ou podem ser facilmente adaptados a partir de um A método conhecido para outra safra.

Em uma realização, a(s) planta(s) de controle não contêm um cassete de expressão da invenção e, por conseguinte, não compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina, conforme descrito no presente documento, ligado de maneira operável a um promotor particular, conforme definido no presente documento.

Em outra realização, a(s) planta(s) de controle carregam uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina, mas esta sequência de ácido nucleico não é funcionalmente ligada ao promotor empregado nas construções, vetores, plantas, usos e métodos da presente invenção, isto é, a expressão da dita sequência de ácido nucleico não está sob o controle do dito promotor.

Além disso, a presente invenção refere se às seguintes realizações específicas, em que a expressão “conforme definido na reivindicação/item X" se destina a direcionar o elemento versado na técnica a aplicar a definição conforme apresentado no item/reivindicação X. Por exemplo, “um ácido nucleico conforme definido no item 1” tem que ser compreendido de tal modo que a definição do ácido nucleico conforme no item 1 seja aplicada ao ácido nucleico. Em consequência, o termo “conforme definido no item” ou “conforme definido na reivindicação” pode ser substituído pela definição correspondente daquele item ou reivindicação, respectivamente: Realizações específicas 1. Um método para otimizar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a uma planta de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de 1 flavodoxina, em que a expressão é sob o controle de uma sequência de I promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina e em que a sequência de promotor compreende a sequência de nucleotídeo de um promotor de protoclorofilida redutase; ou fragmentos ou derivados funcionais do mesmo. 2. O método de acordo com realização 1, em que a sequência de nucleotídeo do promotor de protoclorofilida redutase compreende ao menos 70% da sequência representada por SEQ ID NO: 7. 3. O método de acordo com realização 1 ou 2, em que o peptídeo de trânsito direciona o polipeptídeo de flavodoxina parâ um plastídeo, de preferência, para um cloroplasto. 4. O método de acordo com realização 3, em que o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionado a partir dos peptídeos de trânsito relacionados na Tabela 4 ou homólogos dos mesmos. 5. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 4, em que o polipeptídeo de flavodoxina é codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico relacionados na Tabela 3 ou homólogos das mesmas. 6. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 5, em que o polipeptídeo de flavodoxina é a partir de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119. 7. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 6, em que o polipeptídeo de flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2, ou um fragmento funcional % A do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar dos mesmos; ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com a atividade biológica de uma flavodoxina o uma ferredoxina; ou (v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou (vi) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer um dentre (i) a (iv) acima. 8. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 7, que compreende (a) transformar estavelmente uma célula de planta com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, em que o polipeptídeo de flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que tem ao menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; e/ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar dos mesmos; (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com t a atividade biológica de uma ftavodoxina ou uma ferredoxina; ou * (v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, mas se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou (vi) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer um dentre (i) a (iv) acima; em que o ácido nucleico exógeno está em ligação funcional com uma sequência de promotor que compreende a sequência de nucleotídeo do promotor de protoclorofilida redutase, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um paralógo do mesmo; (b) regenerar a planta a partir da célula de planta; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno. 9. Método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 8, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados compreendem biomassa otimizada em relação a plantas de controle e, de preferência, compreende biomassa acima do solo otimizada em relação a plantas de controle. 10. Método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 9, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados são obtidos sob condições de não estresse ou condições de estresse abiótico. 11. Método de acordo com realização 10, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados são obtidos sob condições de estresse hídrico, estresse salino ou deficiência de nitrogênio. 12. Construção de expressão que compreende: (i) um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito, conforme definido em qualquer uma das realizações 3 ou 4, e um polipeptídeo de flavodoxina, conforme definido em qualquer uma das realizações 5 a 8; (ii) uma sequência de promotores capazes de conduzir a í expressão da sequência de ácido nucleico de (i), conforme definido na 1 realização 1 ou 2; e opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição. 13. Vetor de expressão recombinante que compreende uma construção de expressão de acordo com a realização 12. 14. Uso de uma construção de expressão de acordo com a realização 12 ou um vetor de expressão recombinante de acordo com a realização 13 em um método para fabricação de uma planta transgênica que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, de preferência, biomassa aumentada, em relação a plantas de controle, e com mais preferência, biomassa acima do solo aumentada em relação a plantas de controle. 15. Método para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, biomassa aumentada, que compreende: (a) introduzir uma construção de vetor recombinante de acordo com a realização 13 em uma planta, uma parte de planta ou uma célula de planta; (b) gerar uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica a partir da planta transformada, parte de planta transformada ou célula de planta transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina. 16. Método de acordo com a realização 15, que compreende, adicionalmente, a etapa de coletar material de propagação da planta transgênica e plantar o material de propagação e cultivar o material de propagação a plantas, em que o material de propagação compreende o ácido nuclpico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de A flavodoxina e a sequência de promotor ligada de maneira operável ao mesmo. 17. Planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica obtenível por meio de um método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, ou 16, em que a dita planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina sob o controle de uma sequência de promotor conforme definido em qualquer uma das realizações 1 a 8. 18. Planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica transformada com uma construção de expressão de acordo com a realização 12 ou com um vetor de expressão recombinante de acordo com a realização 13, e que compreende a sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, cada um conforme definido em qualquer uma das realizações 1 a 8. 19. Planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica de acordo com realização 17 ou 18, em que a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, de preferência, uma biomassa otimizada em relação a plantas de controle. 20. Parte passível de colheita de uma planta transgênica de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19, em que a dita parte passível de colheita consiste em um órgão acima do solo, de preferência, o caule ou partes do mesmo. 21. Produto produzido a partir de uma planta transgênica de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19, ou a partir da parte passível de colheita de uma planta transgênica de acordo com a realização 20. ^ 22. Um método para a fabricação de um produto que compreende as etapas de cultivar as plantas transgênicas de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19 e produzir o dito produto a partir de ou por meio das ditas plantas ou partes, de preferência, o caule, da planta. 23. Um método para o aperfeiçoamento da planta que compreende a) obter uma planta transgênica por meio do método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, ou 16; b) combinar dentro de uma célula de planta o material genético de ao menos uma célula de planta da planta de a) com o material genético de ao menos uma célula que se difere em um ou mais gene das células de planta das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda planta; c) obter semente a partir de ao menos uma planta gerada a partir da uma célula de planta de b) ou a planta do cruzamento da etapa (b); d) plantar as ditas sementes e cultivar as sementes a plantas; e e) selecionar a partir das ditas plantas, plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina; e opcionalmente f) produzir material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina. 24. A construção de expressão de acordo com a realização 12 ou um DNA cromossômico recombinante que compreende um cassete de expressão que compreende um promotor, conforme definido no item (ii) da realização 12, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito ligado a uma flavodoxina, conforme definido no item (i) da realização 12, e uma sequência de terminação de transcrição em ligação funcional, em que a construção ou o DNA cromossômico recombinante é compreendido em uma célula de planta. * % v 25. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, 16, 22 ou 23, ou a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19, ou o uso de acordo com a realização 14, a parte passível de colheita de acordo com a realização 20, ou o produto de acordo com realização 21, ou a construção ou DNA cromossômico recombinante de acordo com a realização 24, em que a célula de planta é a partir de ou a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha , trevo, puerária, luzerna, lentilhas, tremoços, ervilhacas, amendoim, arroz, trigo, milho, cevada, arabidopsis, lentilha, banana, colza de semente oleaginosa que inclui canola, algodão, batata, cana de açúcar, alfalfa, beterraba, painço, centeio, triticale, sorgo, farro, espelta, einkorn, teff, milo e aveias. 26. O método de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, 16, 22 ou 23, ou a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19, ou o uso de acordo com realização 14, a parte passível de colheita de acordo com a realização 20, ou o produto de acordo com realização 21, ou a construção ou DNA cromossômico recombinante de acordo com a realização 24, em que a célula de planta é a partir de ou a planta é uma poaceae, de preferência, do gênero saccharum, com mais preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinertse e Saccharum spontaneum.

Exemplos A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos, os quais são somente a título de ilustração. Os seguintes » exemplos não se destinam a limitar o escopo da invenção.

I

Em particular, as plantas usadas nos experimentos descritos são usadas devido ao fato de que plantas Arabidopsis, tabaco, arroz e milho são plantas modelos para o teste de transgenes. São amplamente usadas na técnica para a facilidade relativa de teste, enquanto que tem uma boa transferência dos resultados para outras plantas usadas na agricultura, tais como, mas não limitadas a, milho, trigo, arroz, soja, algodão, colza de semente oleaginosa que inclui canola, cana de açúcar, beterraba e alfalfa, ou outras safras dicotiledônea ou monocotiledônea.

Exceto onde indicado em contrário, a presente invenção emprega técnicas e métodos convencionais de biologia vegetal, biologia molecular, bioinformática e melhoramentos genéticos vegetais.

Manipulação de DNA: exceto onde mencionado em contrário, as técnicas de DNA recombinante são executadas de acordo com os protocolos padrão descritos em (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Os materiais e métodos padrão para o trabalho molecular vegetal são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D.

Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

Exemplo 1: Identificação de sequências relacionadas a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 As sequências (cDNA de comprimento completo, ESTs ou genômicas) relacionadas a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 são identificadas entre aquelas mantidas na base de dados de nucleotídeos Entrez no National Center for Biotechnology Information (NCBI) com o uso de ferramentas de pesquisa de sequência de base de dados, tais como a ferramenta de * alinhamento local básica (BLAST Basic Local Alignment Tool) (Altschul et al. 1 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). O programa é usado para encontrar regiões de similaridade local entre as sequências por meio da comparação de sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo com bases de dados de sequência e por meio do cálculo da significância estatística das correspondências. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é usado para o algoritmo TBLASTN, com ajustes predefinidos e o filtro para ignorar as sequências de baixa complexidade determinadas. A saída da análise é visualizada por comparação em pares e classificada de acordo com a pontuação de probabilidade (valor E), onde a pontuação reflete a probabilidade que um alinhamento particular ocorre por acaso (quanto menor o valor E, mais significante a ocorrência). Em adição aos valores E, as comparações também são pontuadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade se refere ao número de nucleotídeos idênticos (ou aminoácidos) entre duas sequências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas sobre um comprimento particular. Em alguns casos, os parâmetros predefinidos podem ser ajustados para modificar a severidade da pesquisa. Por exemplo, o valor E pode ser aumentado para mostrar correspondências menos severas. Desta forma, as correspondências curtas quase exatas podem ser identificadas.

Exemplo 2: Identificação de domínios compreendidos em sequências de POLIPEPTÍDEO ÚTEIS NA EXECUÇÃO DOS MÉTODOS DA INVENÇÃO O recurso integrado de base de dados de famílias de proteína, domínios e locais (InterPro) é uma interface integrada para as bases de dados de assinatura comumente usadas para pesquisas à base de texto e sequência. A base de dados InterPro combina estas bases de dados, as quais utilizam metodologias diferentes e graus variados de informações biológicas sobre proteínas bem caracterizadas para derivar assinaturas de proteína. As bases de ciados colaboradoras incluem SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom e Pfam, Smart e TIGRFAMs. Pfam é uma grande coleção de múltiplos alinhamentos de sequência e modelos de Markov ocultos que cobrem muitas famílias e domínios de proteína comuns. Pfam é hospedado no servidor Sanger Institute no Reino Unido. Interpro é hospedado no European Bioinformatics Institute no Reino Unido.

Os resultados da InterProScan (vide Zdobnov E.M. e Apweiler R.; "InterProScan - an integration platform for the signature -recognítion methods in InterPro"; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; base de dados InterPro, Release 36.0, 23 de fevereiro de 2012) da sequência de polipeptídeo, conforme representado por SEQ ID NO: 2, são apresentados na Tabela B e figura 1.

Uma análise repetida com o uso do software InterproScan versão 4.8, base de dados InterPro release 41 de 13 de fevereiro de 2013 gerou os domínios e motivos conforme relacionado na tabela B com as coordenadas conforme dado na última coluna da tabela B, e, além disso, os domínios e motivos PIRSF038996, G3DSA:3.40.50.360, PTHR30112, SSF52218 foram detectados.

Em uma realização, um polipeptídeo de flavodoxina compreende um domínio conservado (ou motivo) com ao menos 70%, 71%, 72%, 73%, 1 74°/|, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87°/o, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um domínio conservado a partir da tabela B.

Exemplo 3: Clonagem da sequência de ácido nucleico que codifica FLAVODOXINA

Construção de transformação de arroz: O ácido nucleico que codifica peptídeo de trânsito e polipeptídeo de flavodoxina (SEQ ID NO: 5 - ou códon otimizado para plantas maiores, conforme mostrado em SEQ ID NO: 14) ou que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina Synechocystis (SEQ ID NO: 17) foram sintetizados de modo que incluíssem os locais AttB para a recombinação Gateway (Life Technologies GmbH, Frankfurter StraBe 129B, 64293 Darmstadt, Alemanha).

Alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica a flavodoxina pode ser amplificada por PCR como o uso como modelo a biblioteca de cDNA no caso de eucariotos ou DNA genômico para procariotos, como Anabaena. O PCR é executado com o uso de uma Taq DNA polimerase de correção disponível comercialmente em condições padrão, com o uso de 200 ng de modelo em uma mistura de PCR de 50 μΙ. Os primers usados incluem os locais AttB para a recombinação Gateway. O fragmento de PCR amplificado é purificado também com o uso de métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, é, então, executada, durante a qual o fragmento de PCR recombina in vivo com o plasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um “clone de entrada”, pFLD. O plasmídeo pDONR201 pode ser adquirido a partir da Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.

Um ácido nucleico que funde o ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) para o peptídeo de trânsito de FNR de ervilha à sequência de codificação (SEQ ID NO: 2) da flavodoxina de Anabaena também pode ser gerado conforme desçrito nos parágrafos [0075] e [0076] da página 8 da patente europeia EP

A

1442127, os ditos parágrafos estão incorporados a título de referência. A sequência de ácido nucleico resultante pode ser fixada aos locais attB para permitir a recombinação Gateway. O clone de entrada que compreende o ácido nucleico que codifica flavodoxina sintetizado, de SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 (ligado ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito, conforme mostrado em SEQ ID NO: 5, 14 e 17, respectivamente, foi, então, usado em uma redução LR com um vetor de destino usado para a transformação de arroz. Este vetor contém como elementos funcionais dentro dos limites de T-DNA: um marcador de planta selecionável; um cassete de expressão de marcador selecionável; e um cassete de Gateway destinado para a recombinação in vivo de LR com a sequência de ácido nucleico de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor de PCPR (SEQ ID NO: 7) para a expressão específica foi localizada a montante deste cassete de Gateway. O dito promotor foi amplificado por PCR com o uso de DNA genômico de Oryza sativa, alternativamente, pode ser sintetizado.

Depois da etapa de recombinação de LR, o vetor de expressão resultante PCPR::TP::flavodoxina (Figura 2) que compreende a combinação (SEQ ID NO: 19, 20 ou 21) do promotor de SEQ ID NO: 7 com o ácido nucleico de peptídeo de trânsito de SEQ ID NO 3 e o ácido nucleico de flavodoxina (SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, respectivamente) foi transformado em uma cepa de Agrobacterium adequada de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica.

Como uma alternativa, o promotor de PCPR (SEQ ID DNO: 7) e o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina de Anabaena (SEQ ID NO: 5 - ou códon otimizado para plantas maiores, conforme mostrado em SEQ ID NO: 14) ou que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina de >

Synpchocystis (SEQ ID NO: 17) é sintetizado como uma peça e inserido em um vetor binário para a transformação mediada por Agrobacterium, ou em duas ou mais peças ligadas e conjunto ou montadas em um cassete de expressão dentro de um vetor, por exemplo, um vetor binário.

Construção de expressão de cana de açúcar Para a expressão do ácido nucleico que codifica a proteína de fusão (de peptídeo de trânsito a partir de Cyanophora paradoxa e flavodoxina a partir de Anabaena) conforme mostrado em SEQ ID NO: 11 sob o controle do promotor de PCPR, a sequência de promotor de PCPR (SEQ ID NO: 7) e o ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 que codifica o peptídeo de trânsito (SEQ ID NO: 10) e o ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que codifica a flavodoxina de Anabaena de SEQ ID NO: 2 foram sintetizados ligados à sequência de terminador de Zeina de milho. O cassete de expressão resultante é mostrado em SEQ ID NO: 12. Para aperfeiçoar a eficácia da seleção das plantas transformadas sobre plantas não transformadas, uma cassete de marcador de seleção que compreende um promotor de ubiquitina de milho que controla a expressão do marcador de seleção de nptll e o terminador de NOS, foi incluída a construção para o bombardeio de partícula. As plantas de cana de açúcar foram transformadas com o cassete de expressão, conforme mostrado em SEQ ID NO: 12 por meio de bombardeio de partículas. O dito cassete de expressão também pode ser usado para a transformação mediada por Agrobacterium de cana de açúcar ou outras plantas após a inserção em um vetor binário e introdução em Agrobacteria. A construção que compreende os cassetes de expressão para a expressão de peptídeo de trânsito-flavodoxina e o cassete de marcador selecionável pode ser isolada a partir do vetor, conforme necessário, e usada para o bombardeio de partículas de células de cana de açúcar, conforme descrito abaixo. i Exemplo 4: Transformação de planta Transformação de arroz A Agrobacterium que contém o vetor de expressão foi usada para transformar as plantas de Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar de arroz japonica Nipponbare foram descascadas. A esterilização foi realizada por meio da incubação por um minuto em 70% de etanol, seguido por 30 a 60 minutos, de preferência, 30 minutos em solução de hipoclorito de sódio (dependendo do grau de contaminação), seguido por uma lavagem de 3 a 6 vezes, de preferência, 4 vezes com água destilada estéril. As sementes esteriles foram, então, germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após a incubação em luz por 6 dias, os calos derivados de escutelo foram transformado com Agrobacterium, conforme descrito no presente documento abaixo. A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vetor de expressão foi usada para o cocultivo. A Agrobacterium foi inoculada no meio AB com os antibióticos adequados, cultivada por 3 dias a 28°C. As bactérias foram, então, coletadas e suspensas em meio de cocultivo líquido a uma densidade (OD600) de cerca de 1. Os calos foram imersos na suspensão por 1 a 15 minutos. Os tecidos de calo foram, então, secos sobre papel absorvente e transferidos para o meio de cocultivo solidificado e incubados por 3 dias no escuro a 25°C. Após a limpeza com água da Agrobacterium, os calos foram cultivados no meio contendo 2,4-D por 10 a 14 dias (tempo de crescimento para for indica: 3 semanas) sob luz a 28°C a 32°C, na presença de um agente de seleção. Durante este período, se desenvolveu o calo resistente com crescimento rápido. Após a transferência deste material para o meio de regeneração, o potencial embriogênico foi liberado e os galhos se desenvolveram nas quarto a seis semanas seguintes. Os galhos foram cortados a partir do calo e incubados por 2 a 3 semanas em um meio contendo auxijia a partir do qual foram transferidos para o solo. Os galhos endurecidos foram cultivados sob alta umidade e dias curtos na estufa. A transformação de cultivar de arroz indica também pode ser feita de uma forma similar, conforme dado acima de acordo com as técnicas bem conhecidas por um elemento versado na técnica. 35 a 90 transformantes de arroz TO independentes foram gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, somente as plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção foram mantidas para a colheita de semente T1. As sementes foram, então, coletadas três a cinco meses após o transplante. O método rendeu transformantes de local único em uma taxa acima de 50 % (Aldemita e Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Como uma alternativa, as plantas de arroz podem ser geradas de acordo com o seguinte método: A Agrobacterium que contém o vetor de expressão é usada para transformar plantas de Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar de arroz japonica Nipponbare são descascadas. A esterilização é realizada por meio da incubação por um minuto em 70% de etanol, seguido por 30 minutos em 0,2% de HgCI2, seguido por uma lavagem de 15 minutos de 6 vezes com água destilada estéril. As sementes esteriles são, então, germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após a incubação no escuro por quatro semanas, os caules derivados de escutelo embriogênicos são cortados e propagados no mesmo meio. Após duas semanas, os caules foram multiplicados ou propagados por meio de subcultura no mesmo meio por outras 2 semanas. Os pedaços de calo embriogênico são subcultivados em meio fresco 3 dias antes do cocultivo (para estimular a atividade de divisão de > céluja).

A A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vetor de expressão é usada para o cocultivo. A Agrobacterium é inoculada no meio AB com os antibióticos adequados e cultivada por 3 dias a 28°C. As bactérias são, então, coletadas e suspensas em meio de cocultivo líquido a uma densidade (OD600) de cerca de 1. A suspensão foi, então, transferida para um prato Petri e os calos imersos na suspensão por 15 minutos. Os tecidos de calo são, então, secos sobre papel absorvente e transferidos para o meio de cocultivo solidificado e incubados por 3 dias no escuro a 25°C. Os calos cocultivados são cultivados no meio contendo 2,4-D por 4 semanas no escuro a 28° na presença de um agente de seleção. Durante este período, se desenvolveram ilhas de calo resistente com crescimento rápido. Após a transferência deste material para um meio de regeneração e incubação na luz, o potencial embriogênico é liberado e os galhos se desenvolveram nas quarto a cinco semanas seguintes.

Os galhos são cortados a partir dos calos e incubados por 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual foram transferidos para o solo. Os galhos endurecidos foram cultivados sob alta umidade e dias curtos na estufa.

Aproximadamente 35 a 90 transformantes de arroz TO independentes são gerados para uma construção. Os transformantes primários são transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa.

Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, somente as plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção são mantidas para a colheita de semente T1. As sementes são, então, coletadas três a cinco meses após o transplante. O método rendeu transformantes de local único em uma taxa acima de 50 % (Aldemita e Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Transformação de milho A transformação de milho (Zea mays) é executada com uma modificação do método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech jk % 14(6): 745-50. A transformação é dependente de genótipo em milho e somente genótipos específicos são receptivos à transformação e regeneração. A linha inata A188 (University of Minnesota) ou híbridos com A188 como um pai são boas fontes de material doador para a transformação, mas outros genótipos podem ser usados de maneira bem sucedida também. As espigas são coletadas a partir da planta de milho aproximadamente 11 dias após a polinação (DAP), quando o comprimento do embrião imaturo é de cerca de 1 a 1,2 mm. Os embriões imaturos são cocultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e as plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Os embriões cortados são cultivados em meio de indução de calo, então, meio de regeneração de milho, contendo o agente de seleção (por exemplo, imidazolinona, mas diversos marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25 °C por 2 a 3 semanas, ou até os galhos se desenvolverem. Os galhos verdes são transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento de milho e incubados a 25 °C por 2 a 3 semanas, até as raízes se desenvolverem. Os galhos enraizados são transplantados para solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de trigo A transformação de trigo é executada com o método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite (disponível junto a CIMMYT, México) é comumente usado em transformação.

Os embriões imaturos são cocultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão e as plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Após a incubação com Agrobacterium, os embriões são, cultivados in vitro em meio de indução de calo, então, meio de 1 regeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo, imidazolínona, mas diversos marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25 °C por 2 a 3 semanas, ou até os galhos se desenvolverem. Os galhos verdes são transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento e incubados a 25 °C por 2 a 3 semanas, até as raízes se desenvolverem. Os galhos enraizados são transplantados no solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

TRANSFORMACÃO DE SOJA A soja é transformada de acordo com uma modificação do método descrito na patente A&M do Texas US 5.164.310. Diversas variedades de soja comerciais são receptivas à transformação por meio deste método. O cultivar Jack (disponível junto a Illinois Seed foundation) é comumente usado para transformação. As sementes de soja são esterilizadas para a semeadura in vitro. O hipocótilo, a radícula e um cotilédone são cortados a partir de mudas jovens com sete dias de idade. O epicótilo e o cotilédone restante são adicionalmente cultivados para desenvolver nós axilares. Estes nós axilares são cortados e incubados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão. Após o tratamento de cocultivo, os explantes são lavados e transferidos para o meio de seleção. Os galhos regenerados são cortados e colocados em um meio de prolongamento de galho. Os galhos não maiores do que 1 cm são colocados no meio de enraizamento até as raízes se desenvolverem. Os galhos enraizados são transplantados no solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de semente de colza/canola , Os pecíolos e hipocótilos cotiledôneos da muda jovem com 5 a 6 dias· de idade são usados como explantes para cultura de tecido e transformados de acordo com Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). O cultivar Westar comercial (Agriculture Canadá) é uma variedade padrão usada para transformação, mas outras variedades também podem ser usadas.

As sementes de canola são esterilizadas em superfície para a semeadura in vitro. Os explantes de pecíolo de cotilédone com o cotilédone fixado são cortados a partir das mudas in vitro, e inoculados com Agrobacterium (contendo o vetor de expressão) por meio da imersão da extremidade cortada do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os explantes são, então, cultivados por 2 dias no meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sucrose, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 hora em luz. Após dois dias de cocultivo com Agrobacterium, os explantes de pecíolo sãó transferidos para o meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina ou timentina (300 mg/l) por 7 dias e, então, cultivados no meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina ou timentina e agente de seleção até a regeneração de galho.

Quando os galhos tinham 5 a 10 mm de comprimento, são cortados e transferidos para o meio de alongamento de galho (MSBAP-0.5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Os galhos de cerca de 2 cm de comprimento são transferidos para o meio de enraizamento (MS0) para a indução de raiz. Os galhos enraizados são transplantados no solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de alfalfa Um clone de regeneração de alfalfa (Medicago sativa) é transformado com o uso do método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). A regeneração e transformação de alfalfa é dependente de genótipo e, portanto, uma planta de regeneração é exigida. Os métodos para se c^bter plantas de regeneração têm sido descritos. Por exemplo, estes podem ser''selecionados a partir do cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) ou qualquer outra variedade de alfalfa comercial, conforme descrito por Brown DCW e A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112).

Alternativamente, a variedade RA3 (University of Wisconsin) tem sido selecionada para o uso na cultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Os explantes de pecíolo são cocultivados com uma cultura de um dia para outro de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo o vetor de expressão.

Os explantes são cocultivados por 3 dias no escuro em meio de indução de SH contendo 288 mg/ L de Pro, 53 mg/ L de tioprolina, 4,35 g/ L de K2SO4 e 100 pm de acetosiringinona. Os explantes são lavados em meio de Murashige- Skoog com metade da concentração (Murashige e Skoog, 1962) e colocados no mesmo meio de indução de SH sem acetosiringinona, mas com um agente de seleção adequado e antibiótico adequado para inibir o crescimento de Agrobacterium. Após várias semanas, os embriões somáticos são transferidos para o meio de desenvolvimento BOÍ2Y contendo nenhum reguladores de crescimento, nenhum antibiótico e 50 g/ L de sucrose. Os embriões somáticos são subsequentemente germinados no meio de Murashige-Skoog com metade da concentração. As mudas enraizadas foram transplantadas em potes e cultivadas em uma estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de algodão O algodão é transformado com o uso de Agrobacterium tumefaciens de acordo com o método descrito no documento sob o ne. US 5.159.135. As sementes de algodão são esterilizadas em superfície em solução de hipoclorito de sódio a 3 % durante 20 minutos e lavadas em água destilada > com, 500 pg/ml de cefotaxima. As sementes são, então, transferidas para o 1 meib SH com 50pg/ml de benomila para germinação. Os hipocótilos de mudas com 4 a 6 dias de idade são removidos, cortados em pedaços de 0,5 cm e são colocados em ágar a 0,8%. Uma suspensão de Agrobacterium (aproximadamente 108 células por ml, diluída a partir de uma cultura de um dia para o outro, transformada com o gene de interesse e marcadores de seleção adequados) é usada para a inoculação dos explantes de hipocótilo. Após 3 dias em temperatura ambiente e iluminação, os tecidos são transferidos para um meio sólido (1,6 g/l de Gelrite) com sais de Murashige e Skoog com vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina e 750 pg/ml de MgCL2, e com 50 a 100 pg/ml de cefotaxima e 400 a 500 pg/mí de carbenicilina para exterminar bactérias residuais. As linhas de célula individuais são isoladas após dois a três meses (com subculturas a cada quatro a seis semanas) e são adicionalmente cultivadas no meio seletivo para amplificação de tecido (30°C, fotoperíodo de 16 horas). Os tecidos transformados são subsequentemente cultivados no meio não seletivo durante 2 a 3 meses para dar origem a embriões somáticos. Os embriões com aspecto saudável de ao menos 4 mm de comprimento são transferidos para tubos com meio SH em vermiculita fina, suplementado com 0,1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina e ácido giberélico. Os embriões são cultivados a 30°C com um fotoperíodo de 16 horas, e as plantinhas no estágio de folha 2 a 3 são transferidas para potes com vermiculita e nutrientes. As plantas são fortalecidas e subsequentemente movidas para a estufa para o cultivo adicional.

Transformação de beterraba As sementes de beterraba (Beta vulgaris L.) são esterilizadas em 70% de etanol por um minuto seguido por 20 min. de agitação em 20% de alvejante de hipoclorito, por exemplo, alvejante regular Clorox® (comercialmente disponível junto a Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA „4 946^2, EUA). As sementes são enxaguadas com água estéril e secas a ar, seguido pela distribuição em meio de germinação (meio à base de Murashige e Skoog (MS) (Murashige, T., e Skoog, ., 1962. Physiol. Plan.t, vol. 15, 473-497) que inclui vitaminas B5 (Gamborg et al.; Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.) suplementado com 10 g/l de sucrose e ágar a 0,8%). O tecido de hipocótilo é usado essencialmente para a iniciação das culturas de galho de acordo com Hussey e Hepher (Hussey, G., e Hepher, A., 1978. Annals of Botany, 42, 477- 9) e é mantido no meio à base de MS suplementado com 30g/l de sucrose mais 0,25mg/i de benzilamino purina e ágar a 0,75%, pH 5,8 a 23 a 25°C com um fotoperíodo de 16 horas. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que carrega um plasmídeo binário que contém um gene marcador selecionável, por exemplo nptll, é usada em experimentos de transformação. Um dia antes da transformação, uma cultura de LB líquida que inclui antibióticos é cultivada em um agitador (28°C, 150 rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de ~1 ser alcançada. As culturas bacterianas cultivadas de um dia para o outro são centrifugadas e suspensas novamente em meio de inoculação (O.D. ~1) que inclui Acetosiringona, pH 5,5. O tecido de base de galho é cortado em fatias (1,0 cm x 1,0 cm x 2,0 mm, aproximadamente). O tecido é imerso por 30 s em meio de inoculação bacteriano líquido. O líquido em excesso é removido por secagem em papel absorvente. O cocultivo ocorreu por 24 a 72 horas no meio à base de MS, incluindo 30g/l de sucrose, seguido por um período não seletivo que inclui o meio à base de MS, 30g/l de sucrose com 1 mg/l de BAP para induzir o desenvolvimento de galho e cefotaxima para eliminar a Agrobacterium. Após 3 a 10 dias, os explantes são transferidos para o meio seletivo similar contendo, por exemplo, kanamicina ou G418 (50 a 100 mg/l de dependente de genótipo). Os tecidos são transferidos para o meio fresco a cada 2 a 3 semanas para manter a pressão de seleção. A iniciação muito rápida de galhos (após 3 a 4 dias) indica a regeneração de meristemas I existentes em vez da organogênese de meristemas transgênicos recém desenvolvidos. Os pequenos galhos são transferidos após vários ciclos de subcultura para o meio de indução de raiz contendo 5 mg/l de NAA e kanamicina ou G418. As etapas adicionais são tomadas para reduzir o potencial de gerar plantas transformadas que são quiméricas (parcialmente transgênicas). As amostras de tecido a partir de galhos regenerados são usados para análise de DNA. Outros métodos de transformação para beterraba são conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles de Linsey & Gallois (Linsey, K., e Gallois, P., 1990. Journal of Experimental Botany; vol. 41, No. 226; 529- 36) ou os métodos publicados no pedido internacional publicado como W09623891A.

Transformação de cana de açúcar As hastes são isoladas a partir de plantas de cana de açúcar cultivas no campo com 6 meses de idade (Arencibia et al., 1998. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et al., 1998. Plant, vol. 206, 20- 27). O material é esterilizado por imersão em um alvejante de hipoclorito a 20 %, por exemplo, alvejante regular Clorox® (comercialmente disponível junto a Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EUA) por 20 minutos. As seções transversais em torno de 0,5 cm são colocadas no meio na direção para cima.

O material de planta é cultivado por 4 semanas em meio à base de MS (Murashige, T., e Skoog, 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497), incluindo vitaminas B5 (Gamborg, O., et al., 1968. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado com 20 g/l de sucrose, 500 mg/l de hidrolisato de caseína, ágar a 0,8% e 5 mg/l de 2,4-D a 23°C no escuro. As culturas são transferidas após 4 semanas em meio fresco idêntico. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que carrega um plasmídeo binário contendo um gene marcador selecionável, por exemplo, hpt, é usada em experimentos de transformação. Um dia antes da 1 transformação, uma cultura de LB líquida que inclui antibióticos é cultivada em um agitador (28°C, 150 rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de ~0,6 ser alcançada. As culturas bacterianas cultivadas de um dia para o outro são centrifugadas e suspensas novamente em meio de inoculação à base de MS (O.D. ~0,4) que inclui acetosiringona, pH 5,5. Os pedaços de calo embriogênico de cana de açúcar (2 a 4 mm) são isolados com base nas características morfológicas como estrutura compacta e cor amarela e secos por 20 min. na capela de fluxo, seguido pela imersão em um meio de inoculação bacteriano líquido por 10 a 20 minutos. O líquido em excesso é removido por meio de secagem em papel absorvente. O cocultivo ocorreu por 3 a 5 dias no escuro em papel absorvente, o qual é colocado no topo do meio à base de MS, incluindo vitaminas B5, contendo 1 mg/l de 2,4-D. Após o cocultivo, os calos são lavados com água estéril, seguido por um período de cultivo não seletivo em meio similar contendo 500 mg/l de cefotaxima para eliminar as células de Agrobacterium. Após 3 a 10 dias, os explantes são transferidos para o meio seletivo à base de MS, incluindo vitaminas B5, contendo 1 mg/l de 2,4-D por outras 3 semanas contendo 25 mg/l de higromicina (dependente de genótipo). Todos os tratamentos são feitos a 23°C sob condições no escuro. Os calos resistentes são adicionalmente cultivados no meio desprovido de 2,4-D que inclui 1 mg/l de BA e 25 mg/l de higromicina sob o fotoperíodo de luz de 16 horas, resultando no desenvolvimento de estruturas de galho. Os galhos são isolados e cultivados em meio de enraizamento seletivo (à base de MS que inclui, 20g/l de sucrose, 20 mg/l de higromicina e 500 mg/l de cefotaxima). As amostras de tecido a partir dos galhos regenerados são usadas para análise de DNA. Outros métodos de transformação para cana de açúcar são conhecidos na técnica, por exemplo, a partir do pedido internacional publicado como W02010/151634A e a patente europeia concedida EP1831378. { Para a transformação por meio de bombardeio de partículas, a indução de calo e a transformação de cana de açúcar podem ser realizadas por meio do método de Snyman et al. (Snyman et al., 1996, S. Afr. J. Bot 62, 151- 154). A construção pode ser cotransformada com o vetor pEmuKN, o qual expressou o gene nptll (Beck et al. Gene 19, 1982, 327-336; acesso do banco de gene nfi. V00618) sob o controle do promotor pEmu (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588). As plantas são regeneradas pelo método de Snyman et al. 2001 (Acta Horticulturae 560, (2001), 105-108).

Exemplo 5: Procedimento de avaliação fenótípica Plantas de arroz 5.1 Procedimento de avaliação 35 a 90 transformantes de arroz TO independentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para o cultivo e colheita de semente T1. Nove eventos, dos quais a progênie T1 segregou 3:1 para presença/ausência do transgene, foram retidos. Para cada um destes eventos, aproximadamente seis mudas T1 contendo o transgene (hetero- e homozigotos) e aproximadamente seis mudas T1 desprovidas do transgene (zigotos nulos) foram selecionadas por meio do monitoramento visual da expressão de marcador. As plantas transgênicas e os zigotos nulos correspondentes foram cultivados lado a lado em posições aleatórias. As condições da estufa forem de dias curtos (12 horas em luz), 28°C na luz e 22°C no escuro,e uma umidade relativa de 70%. As plantas cultivadas sob condições de não estresse foram regadas em intervalos regulares para assegurar que a água e os nutrientes não fossem limitados e para satisfazer as necessidades da planta para completar o crescimento e desenvolvimento, exceto onde forem usadas em um ensaio de estresse. A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada ponto no tempo, as imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta a partir de ao menos 6 ângulos diferentes.

Os eventos T1 podem ser adicionalmente avaliados na geração T2 seguindo o mesmo procedimento de avaliação que para a geração T1, por exemplo, com menos eventos e/ou com mais indivíduos por evento.

Ensaio de secura Ensaio de secura precoce As plantas T1 ou T2 foram germinadas sob condições normais e transferidas para o solo de potes, como normalmente. Após a colocação em potes, as plantas em seus potes foram, então, transferidas para uma seção "seca" onde a irrigação foi evitada. As sondas de umidade de solo foram inseridas em potes escolhidos aleatoriamente para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC chegou abaixo de determinados limiares, as plantas foram automaticamente regadas novamente de maneira contínua até que um nível normal fosse alcançado novamente. As plantas foram, então, retransferidas novamente para condições normais. O ciclo de secura foi repetido duas vezes durante o estágio vegetativo com o segundo ciclo começando logo após a irrigação, depois que o primeiro ciclo de secura foi completo. As plantas foram representadas graficamente antes e depois de cada ciclo de secura. O restante do cultivo (maturação da planta, colheita de semente) foi igual ao para as plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento foram registrados conforme detalhado para o crescimento sob condições normais.

Ensaio de secura reprodutiva As plantas T1 ou T2 foram cultivadas em solo de potes sob condições normais até se aproximar do estágio de avanço. Foram, então, transferidas para uma seção "seca" onde a irrigação foi evitada. As sondas de umidade de solo foram inseridas em potes escolhidos aleatoriamente para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC chegou abaixo de determinados limiares, as plantas foram automaticamente regadas novamente de maneira contínua até que um nível normal fosse alcançado novamente. As plantas foram, então, retransferidas novamente para condições normais. O restante do cultivo (maturação da planta, colheita de semente) foi igual ao para as plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento foram registrados Conforme detalhado para o crescimento sob condições normais.

Ensaio de eficiência do uso de nitrogênio As plantas T1 ou T2 foram cultivadas em solo de potes sob condições normais, exceto para a solução de nutriente. Os potes foram regados a partir da transplantação à maturação com uma solução de nutriente específica contendo teor de nitrogênio (N) reduzido, usualmente entre 7 a 8 vezes menor. O restante do cultivo (maturação da planta, colheita de semente) foi igual ao para as plantas não cultivadas sob estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento foram registrados conforme detalhado para o crescimento sob condições normais.

Ensaio de estresse salino As plantas T1 ou T2 são cultivadas em um substrato feito de fibras de coco e partículas de argila assada (Argex) (razão de 3 para 1). Uma solução de nutriente normal é usada durante as primeiras duas semanas após o transplante das plantinhas na estufa. Após as primeiras duas semanas, 25 mM de sal (NaCI) é adicionado à solução de nutriente, até que as plantas fossem coletadas. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados conforme detalhado para o crescimento sob condições normais.

Cana de açúcar t , 5.2.1 As plantas de cana de açúcar transgênicas geradas * conforme descrito no Exemplo 4 que expressam o gene flavodoxina fundido a um peptídeo de trânsito são cultivadas por 10 a 15 meses, na estufa ou no campo. As condições padrão para o crescimento das plantas são usadas. 5.2.2 Método de extração de açúcar - . A extração dos açúcares é feita com o uso de métodos padrão, por exemplo, conforme descrito no presente documento acima. 5.2.3 Peso fresco e biomassa O peso fresco e biomassa verde são medidos com o uso de um método padrão, por exemplo, conforme descrito no presente documento acima. 5.2.4 Determinação de açúcar (glicose, frutose e sucrose) Os teores de glicose, frutose e sucrose no extrato obtido de acordo com o método de extração de açúcar descrito acima são determinados por meio de um dos métodos padrão, por exemplo, conforme descrito no presente documento acima. 5.3 Análise estatística de dados experimentais de planta de arroz: teste F

Um ANOVA de dois fatores (análise de variantes) foi usado como um modelo estatístico para a avaliação geral de características fenotípicas da planta . Um teste F foi realizado em todos os parâmetros medidos de todas as plantas de todos os eventos transformadas com o gene da presente invenção. O teste F foi realizado para verificar um efeito do gene sobre todos os eventos de transformação e para verificar um efeito geral do gene, também conhecido como efeito de gene global. O limiar para significância para um efeito de gene global verdadeiro foi ajustado em um nível de probabilidade de 5% para o teste F. Um valor de teste F significante aponta para um efeito de gene, que significa que não é > sorrpnte a mera presença ou posição do gene que está causando as I diferenças no fenótipo. 5.4 Parâmetros medidos em arroz A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada ponto no tempo, as imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta a partir de ao menos 6 ângulos diferentes, conforme descrito no documento sob o na. WO2010/031780. Estas medições foram usadas para determinar diferentes parâmetros.

Medição de parâmetro relacionado à biomassa A área acima do solo da planta (ou biomassa foliar) foi determinada pela contagem do número total de pixels nas imagens digitais a partir das partes de planta acima do solo discriminadas a partir do fundo.

Calculou-se a média deste valor para imagens tiradas no mesmo ponto no tempo a partir dos ângulos diferentes e foi convertido para um valor de superfície física expresso em mm quadrados por meio de calibração. Os experimentos mostram que a área da planta acima do solo medida desta forma se correlaciona com a biomassa de partes de planta acima do solo. A área acima do solo consiste na área medida no ponto no tempo no qual a planta tinha alcançado sua biomassa foliar máxima (AreaMax). O aumento em biomassa de raiz é expresso como um aumento em biomassa de raiz total (medida como biomassa máxima de raízes observada durante a vida útil de uma planta); ou como um aumento no índice de raiz/galho, medido como a razão entre a massa de raiz e a massa de galho no período de crescimento ativo da raiz e galho. Em outras palavras, o índice de raiz/galho é definido como a razão da rapidez do crescimento de raiz para a rapidez de crescimento de galho no período de crefcimento ativo da raiz e galho. A biomassa de raiz pode ser determinada com o uso de um método conforme descrito no documento sob o na. WO 2006/029987. A altura da planta foi medida. Uma indicação robusta da altura da planta consiste na medição do local do centro de gravidade, isto é, determinação da altura (em mm) do centro de gravidade da biomassa foliar. Isto evita a influência por uma única folha ereta, com base na assíntota do ajuste de curva ou, se o ajuste não for satisfatório, com base no máximo absoluto.

Parâmetros relacionados ao tempo de desenvolvimento O vigor de emergência (“EmVg”) é uma indicação do crescimento de planta precoce. Isto é a biomassa acima do solo da planta uma semana depois da recolocação em potes das mudas estabelecidas a partir de suas bandejas de germinação para seus potes finais. Isto é a área (em mm2) coberta pela biomassa foliar na imagem. Foi determinado pela contagem do número total de pixels de partes de planta acima do solo discriminadas do fundo. Calculou-se a média deste valor para imagens tiradas no mesmo ponto no tempo a partir dos ângulos diferentes e foi convertido para um valor de superfície física expresso em mm quadrados por meio de calibração. O “tempo para florescer” da planta pode ser determinado com o uso do método conforme descrito no documento sob o n°. WO 2007/093444. O parâmetro "primeira panícula” proporciona o número total de panículas na primeira florescência. O parâmetro “flores por panícula” consiste em um parâmetro calculado que estima o número médio de florículos por panícula em uma planta. Isto é calculado pelo número de semente total dividido pelo valor de parpmetro de primeira panícula.

I '' o verdor antes da floração é uma indicação do verdor de uma planta antes da floração. Isto é a proporção (expressa como %) de pixels verde e verde escuro na última imagem antes da floração.

Medições de parâmetro relacionado à semente As panículas primárias maduras foram coletadas, contadas, colocadas em bolsas, rotuladas com códigos de barras e, então, secas por três dias em um forno a 37°C. As panículas foram, então, trilhadas e todas as sementes foram coletadas e contadas. As sementes são usualmente cobertas por uma cobertura externa seca, a casca. As cascas preenchidas (no presente documento também chamadas de florículos preenchidos) foram separadas daquelas vazias com o uso de num dispositivo de sopro de ar. As cascas vazias foram descartadas e a fração restante foi contada novamente. As cascas preenchidas foram pesadas em uma balança analítica. O número total de sementes foi determinado pela contagem do número de cascas preenchidas que permaneceram após a etapa de separação. O peso de semente total foi medido pela pesagem de todas as cascas preenchidas coletadas a partir de uma planta. O número total de sementes (ou florículos) por planta foi determinado pela contagem do número de cascas (preenchidas ou não) coletadas a partir de uma planta. O peso de mil sementes (TKW) é extrapolado a partir do número de sementes contadas e seu peso total. O índice de colheita (Hl), na presente invenção, é definido como a razão entre o peso de semente total e a área acima do solo (mm ), multiplicada por um fator 106. O número de flores por panícula, conforme definido na » premente invenção, consiste na razão entre o número total de sementes I sobre o número de panículas primárias maduras. A “taxa de preenchimento de semente” ou “taxa de preenchimento” consistiu na proporção (expressão como uma %) do número de sementes preenchidas (isto é, florículos contendo sementes) sobre o número total de sementes (isto é, número total de florículos). Em outras palavras, a taxa de preenchimento de semente é a porcentagem de florículos que são preenchidos com semente.

Exemplo 6: Resultados da avaliação fenotípica das plantas TRANSGÊNICAS 6.1 Plantas de arroz Experimento 1: Três genes de flavodoxina testados sob condições padrão e condições de secura reprodutivas Com o uso do promotor de PCPR de SEQ ID NO: 7 e do ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 que codifica o peptídeo de trânsito de FNR de ervilha, três sequências de ácido nucleico de flavodoxina (SEQ IDNO. 1,13 e 15) foram expressas nas plantas transgênicas de arroz geradas, conforme descrito no presente documento acima, sob condições padrão e secura (vide exemplo 5). As três sequências de ácido nucleico foram Sequência de flavodoxina do tipo selvagem de Nostoc sp. PCC 7119 anabaena sp (SEQ ID NO: 1), Flavodoxina do tipo selvagem de Synechocystis sp. PCC 6803 (SEQ ID NO: 15), e Flavodoxina de A Nostoc anabaena otimizada para uso de códon de planta (SEQ ID NO: 13). TWS Peso total de semente; TTF Tempo para florescer Experimento 2: Flavodoxina de Nostoc anabaena sob condições de secura reprodutiva As plantas de arroz que carregam a construção que compreende o ácido nucleico da flavodoxina de Nostoc anabaena (SEQ ID NO: 1) ligado ao promotor de PCPR de SEQ ID NO: 7 e o ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 que codifica um peptídeo de trânsito foram testadas novamente sob condições de secura reprodutiva e os parâmetros adicionais foram medidos. TWS Peso total da semente; TTF Tempo para florescer;

ArMx AreaMax;

Hl índice de colheita; EmVg vigor de emergência Experimento 3: Flavodoxina de Nostoc anabaena sob condições padrão, secura precoce e baixo nitrogênio As plantas de arroz que carregam a construção que compreende o ácido nucleico da flavodoxina de Nostoc anabaena (SEQ ID NO: 1) ligado ao proqnotor de PCPR de SEQ ID NO: 7 e o ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 que codifica um peptídeo de trânsito foram testadas sob condições padrão, condições de secura precoce e condições de baixo nitrogênio. Os parâmetros adicionais foram medidos. TWS Peso total da semente; TTF Tempo para florescer;

ArMx AreaMax;

Hl índice de colheita; EmVg vigor de emergência Em todos os experimentos, as plantas de controle que não carregam a construção para superexpressão da flavodoxina foram usadas. 6.1.2 Sumários de resultados sobre múltiplos experimentos Peso total da semente: A tabela 4 resume o peso da semente de plantas de arroz que expressam a flavodoxina do tipo selvagem de Nostoc anabaena sob o controle do promotor de PCPR sobre as diferentes condições testadas. * $ Além disso, a taxa de preenchimento e índice de colheita das plantas de arroz foram aumentados em todos os experimentos.

Sob condições de estresse ambiental como secura ou limitação de nitrogênio, a biomassa das plantas acima do solo foi aumentada, conforme indicado pelo valor AreaMax das plantas.

Sumário de outros parâmetros medidos, porém não mostrados nas tabelas acima: O número total de semente e o valor de primeira panícula foram aumentados sob condições de secura precoce, mas diminuíram sob condições de secura reprodutiva. O índice de raiz para galho e flores por panícula foram aumentados sob condições de secura precoce, mas reduziram sobre outras condições. O verdor antes da floração, biomassa de raiz e peso de mil sementes mostraram-se predominantemente não afetados sob todas as condições. 6.1.3 Sumário As construções de PCPR-trânsito-peptídeo-flavodoxina expressas nas plantas de arroz transgênicas sob diferentes condições resultaram em parâmetros aumentados de rendimento de semente, assim como da biomassa acima do solo.

Sobre todas as condições experimentais, o peso de Semente total de plantas de arroz que expressam a flavodoxina do tipo selvagem de Nostoc anabaena sob o controle do promotor de PCPR e ligado a um peptídeo de trânsito, conforme descrito no presente documento, foi aumentado em 6 % em comparação com aquele das plantas de controle que não carregam esta construção. Além disso, a taxa de preenchimento e índice de colheita das plantas de arroz transgênicas foram aumentados sob todas as condições testadas. Sob as condições de estresse ambienta!, ou seja, secura e limitação de nitrogênio, a biomassa acima do solo, conforme indicado pelo valor AreaMax, foi aumentada em comparação com as plantas de controle.

Tabela 2 Exemplos de ácidos nucleicos de flavodoxina, conforme mencionado A no documento sob o n°. WO 03/035881 na página 35 a 38. i Λ % Tabela 3 - Exemplos de peptídeos de trânsito de cloroplasto, conforme mencionado no documento sob o n°. WO 03/035881, na página 39 a 45.

Claims (25)

1. MÉTODO PARA OTIMIZAR UM OU MAIS TRAÇOS RELACIONADOS AO RENDIMENTO EM UMA PLANTA, em relação a uma planta de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina, em que a expressão é sob o controle de uma sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina e em que a I sequência de promotor compreende a sequência de nucleotídeo de um promotor de protoclorofilida redutase; ou fragmentos ou derivados funcionais dos mesmos.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de nucleotídeo do promotor de protoclorofilida redutase compreende ao menos 70% da sequência representada por SEQ ID NO: 7.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o peptídeo de trânsito direciona o polipeptídeo de flavodoxiná para um plastídeo, de preferência, para um cloroplasto.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, em que o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionado a partir dos peptídeos de trânsito relacionados na Tabela 3 ou homólogos dos mesmos.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o polipeptídeo de flavodoxina é codificado por uma sequência de ácido nucleica selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico relacionado na Tabela 2 ou homólogos do mesmo.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o polipeptídeo de flavodoxina é a partir de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119, ou a partir de Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende (a) transformar estavelmente uma célula de planta com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e que codifica um polipeptídeo de flavodoxina, em que o ácido nucleico exógeno está em ligação funcional com uma sequência de promotor que compreende a sequência de nucleotídeo do I proçnotor de protoclorofilida redutase, conforme definido na reivindicação 1 ou 1 2, ou um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo ou um parálogo do mesmo; (b) regenerar a planta a partir da célula de planta; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados compreendem biomassa otimizada em relação a plantas de controle e, de preferência, compreendem biomassa acima do solo e/ou rendimento de semente aperfeiçoado em relação a plantas de controle.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados consiste no rendimento de semente aumentado da(s) planta(s) em comparação com a(s) planta(s) de controle.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados são obtidos sob condições de não estresse.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados são obtidos sob condições de estresse abiótico, de preferência, estresse hídrico, estresse salino e/ou deficiência de nitrogênio.

12. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, que compreende: (i) um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, e um polipeptídeo de flavodoxina; (ii) sequências de promotor capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nucleico de (i), conforme definido na reivindicação 1 ou 2; e opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição.

13. VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, que compreende uma construção de expressão conforme a reivindicação 12.

14. USO, de uma construção de expressão conforme a reivindicação 12, ou um vetor de expressão recombinante, a reivindicação 13, em um método para fabricação de uma planta transgênica que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, aumentada biomassa e, com mais preferência, biomassa acima do solo e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

15. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados em relação a plantas de controle, de preferência, biomassa aumentada, que compreende: (a) introduzir uma construção de vetor recombinante, conforme a reivindicação 13, ou uma construção de expressão, conforme a reivindicação 12, em uma planta, uma parte de planta ou uma célula de planta; (b) gerar uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica a partir da planta transformada, parte de planta transformada ou célula de planta transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, que compreende, adicionalmente, a etapa de coletar material de propagação da planta transgênica e plantar o material de propagação e cultivar o material de propagação para plantas, em que o material de propagação compreende o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina e a sequência de promotor ligada de maneira operável ao mesmo.

17. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica ou A célula de planta transgênica obtenível por meio de um método, conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 15, ou 16, em que a dita planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo de flavodoxina sob o controle de uma sequência de promotor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

18. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica, transformada com uma construção de expressão, conforme a reivindicação 12, ou com um vetor de expressão recombinante, conforme a reivindicação 13, e que compreende a sequência de promotor ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina, cada um conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

19. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica compreende a construção de expressão, conforme a reivindicação 12, e tem um ou mais traços relacionados ao rendimento otimizados, de preferência, uma biomassa otimizada em relação a plantas de controle, com mais preferência, rendimento de semente e/ou biomassa acima do solo aumentada.

21. PARTE PASSÍVEL DE COLHEITA DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, em que a dita parte passível de colheita compreende a construção de expressão, conforme a reivindicação 12, é um órgão acima do solo, de preferência, sementes e/ou o caule ou partes dos mesmos.

21. PRODUTO PRODUZIDO, a partir de uma planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, ou a k A partir da parte passível de colheita de uma planta transgênica, conforme a reivindicação 20, em que o produto compreende a construção de expressão conforme a reivindicação 12.

22. MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO, que compreende as etapas de cultivar as plantas transgênicas, conforme qualquer uma das reivindicações 17 a 19, e produzir o dito produto a partir de ou pelas ditas plantas ou partes, de preferência, sementes e/ou o caule, da planta.

23. MÉTODO PARA O APERFEIÇOAMENTO DA PLANTA, que compreende a) obter uma planta transgênica por meio do método conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 15 ou 16; b) combinar, dentro de uma célula de planta, o material genético de ao menos uma célula de planta da planta de a) com o material genético de ao menos uma célula que se difere em um ou mais genes a partir das células de planta das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda planta; c) obter a semente a partir de ao menos uma planta gerada a partir de uma célula de planta de b) ou da planta do cruzamento da etapa (b); d) plantar as ditas sementes e cultivar as sementes para plantas; e e) selecionar, a partir das ditas plantas, plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina; e opcionalmente f) produzir material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo de flavodoxina.

24. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 12, ou um DNA cromossômico recombinante que compreende 1 um'cassete de expressão que compreende um promotor, conforme definido na reivindicação 12, item (ii), um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito ligado a uma flavodoxina, conforme definido na reivindicação 12, item (i), e uma sequência de terminação de transcrição em ligação funcional, em que a construção ou o DNA cromossômico recombinante é compreendido em uma célula de planta.

25, MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 15, 16, 22 ou 23, ou a planta transgênica, parte dê planta transgênica ou célula de planta transgênica, conforme qualquer uma das reivindicações 17 a 19, ou o uso, conforme a reivindicação 14, a parte passível de colheita, conforme a reivindicação 20, o produto conforme a reivindicação 21, ou o construção ou DNA cromossômico recombinante, conforme a reivindicação 24 em que a célula de planta é a partir de ou a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha , trevo, puerária, luzerna, lentilhas, tremoços, ervilhacas, amendoim, arroz, trigo, milho, cevada, arabidopsis, lentilha, banana, colza de semente oleaginosa, que inclui, canola, algodão, batata, cana de açúcar, alfalfa, beterraba, painço, centeio, triticale, sorgo, farro, espelta, einkorn, teff, milo e aveias.