CN104017819A - 一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，步骤包括：对多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因进行PCR扩增；上述多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因体外低能离子注入，构建载体并转化受体菌；筛选高活性的丝氨酸羟甲基转移酶菌株并测序。本发明的有益效果在于，利用低能离子辐照技术，将低能离子直接作用于不同来源丝氨酸羟甲基转移酶基因，造成丝氨酸羟甲基转移酶基因体外辐照损伤和修饰，再与载体连接、转化受体菌，经体内修复与突变后，对突变基因文库进行表达和筛选，获得丝氨酸羟甲基转移酶突变基因，完成体外进化。本方法亦可应用于其他酶分子的体外进化。

Description

一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法
技术领域
本发明涉及一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，属于微生物酶基因定向进化与分子改造技术的技术领域。
背景技术
体外进化是指通过人为创造特殊的进化条件，模拟天然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个人工突变酶库中通过一定筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性优势的突变酶。体外进化是在试管内完成的高分子进化过程，为改变酶的底物特异性和催化活性提供了强有力的手段。它不需要了解蛋白质的空间结构和功能的关系，只需通过对基因的多轮突变或重组构建突变文库，并结合具有特定筛选压力的高通量筛选方法从中选出目的菌株。与自然进化相比，酶分子的体外进化过程完全是在人为控制下进化的，使酶分子朝向人们期望的特定目标进行。
酶基因的体外进化是改善酶的酶学性质最为有效的方法之一。完成体外进化的先决条件是编码酶基因的可用性、合适的表达系统、有效的构建突变体文库的方法和合适的筛选或选择系统。目前，常用的体外进化构建突变体文库策略有：易错PCR；利用致突变菌株；DNA重组；交错延伸等。例如，1992年，Cadwell利用易错PCR的方法，大约在每1000bp引入了一个突变。1994年，Stemmer提出DNA重排，利用DNA酶将基因降解，再用包含和不包含引物的PCR进行片段重组。该方法进一步改进为“DNA家族重排”，能由一个基因家族构建嵌合体文库。随后，Arnold实验室又发展了二种形式的DNA重排方法：交错延伸和嵌合杂合酶递增截断。1998年Bornscheuer和Greener分别利用缺失DNA修复功能的大肠杆菌衍生菌株Epicurian coli XL1-Red(致突变菌株)构建了突变文库。
建库策略虽然多种多样，但也有明显的缺点和不足，易错PCR虽然简单易行，但为非偏爱氨基酸取代，突变率低且只能点突变；致突变菌株方法往往是整个生物体或质粒被突变，也只能点突变；DNA重组的方法优点是要求能够使用几条亲本基因，可创建嵌合体，有用突变合并并舍弃有害突变，但要求序列同源，这点往往难以满足。交错延伸的方法类似于DNA重排，无需片段纯化，更加简单，但仍然要求序列同源，且必须对PCR操作具体优化。所以有必要寻找一种简单易行，突变率高且只针对特定基因的建库方法。
低能离子束注入技术作为一门新兴技术在很多学科领域发挥着重要作用，我国科技工作者利用该技术在植物、微生物的离子束诱变育种方面取得了丰硕的成果，为生物遗传改良开辟了新途径。离子辐照引发生物学效应的机理研究表明，离子辐照通过能量、质量、电荷等作用而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。当低能离子与DNA作用时，可使DNA产生单链、双链的断裂、基团脱落、释磷、释碱基；注入的活性离子、移位原子或基团可能嵌入DNA分子中，取代失去的原子或基团，造成DNA分子多种多样的碱基损伤或修饰，而这种损伤或修饰的DNA在引入宿主后，经历修复过程，在损伤部位不可避免的会出现碱基的错配，在新一轮的复制中错配的碱基就会被保留下来，损伤或修饰的类型越复杂，修复时错误的概率就越大，越容易导致多位点高密度的碱基变异。
鉴于低能离子束对DNA分子具有较强的损伤和修饰作用，为基于低能离子辐照技术的高效丝氨酸羟甲基转移酶基因体外进化提供了理论和实践基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，利用低能离子辐照技术，将低能离子直接作用于不同来源丝氨酸羟甲基转移酶基因，造成丝氨酸羟甲基转移酶基因体外辐照损伤和修饰，再与载体连接、转化受体菌，经体内修复与突变后，对突变基因文库进行表达和筛选，获得丝氨酸羟甲基转移酶突变基因，完成体外进化。本方法亦可应用于其他酶分子的体外进化。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，步骤包括：
(1)对多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因进行PCR扩增；
(2)上述多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因体外低能离子注入，构建载体并转化受体菌；
(3)筛选高活性的丝氨酸羟甲基转移酶菌株并测序。
进一步地，步骤包括：
(1)将多种不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因的微生物在培养基中培养；
(2)提取上述微生物全基因组；
(3)对上述微生物全基因组进行PCR扩增目丝氨酸羟甲基转移酶基因，使用的引物对为Primer-F5'：ATAGGATCCATGTTACGCGACG；Primer-R5'：GGCCTCGAGTTAAAAAACGAAC；
(4)对丝氨酸羟甲基转移酶基因纯化并经BamHI/HindIII或BamHI/XhoI双酶切后，低温冷冻干燥；
(5)干燥后的丝氨酸羟甲基转移酶基因接受低能离子辐照；
(6)辐照后丝氨酸羟甲基转移酶基因经洗脱后，与同样经BamHI/HindIII或BamHI/XhoI双酶切的载体连接，转化受体菌；
(7)挑选抗性平板上单克隆至96孔板上培养，离心后添加反应液反应，使用显色液显色后分光光度计检测；
(8)对丝氨酸羟甲基转移酶活性较高的菌株测序。
进一步地，上述(1)的微生物包括肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黄杆菌、纳豆芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌。
进一步地，上述(1)的培养基，以g/L为计量，成分包括蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10，pH7.2，余量为水；或蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH7.2，余量为水；或甘油10，蛋白胨10，酵母提取物1.5，氯化钠3，K2HPO4.12H2O4.5，MgSO4.7H2O0.3,自然pH，余量为水。
进一步地，上述(2)的全基因组的提取方法为：先收集菌体，再用细菌DNA提取试剂盒提取。
进一步地，上述(3)的PCR扩增，在目的基因两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列。
进一步地，上述(6)的转化采用热激法。
进一步地，上述(7)的显色液为包括5％p-氨基苯甲醛、5％硫酸的正丁醇溶液。
进一步地，上述(8)的菌株测序是采用pET系列载体通用引物测序。
本发明的有益效果：
本发明通过低能离子直接注入方法损伤和修饰丝氨酸羟甲基转移酶基因获得基因突变。获得的基因突变位点多，频率高，碱基转换，颠换均有发生，操作简单，是一种较好的酶基因体外进化方法。
附图说明
图1为本实施案例使用的pET-28a-c(+)载体的示意图；
图2为本实施案例使用的pET-32a-c(+)载体的示意图。
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一
以大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：
1、将大肠杆菌培养在如下50ml培养基(g/L)中：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.2，37℃摇床培养过夜。收集培养液，抽滤后用滤纸吸干，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20℃。以丝氨酸羟甲基转移酶基因为目的基因，以基因组DNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增和纯化，目的片段长为1254bp。设计引物如下：
Primer-F5'：CGCGGATCCATGTTAAAGCGTG
Primer-R5'：GGCAAGCTTTTATGCGTAAACC
2、纯化后的PCR产物经BamHI/HindIII双酶切后，常规琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收，回收产物放入无菌96孔板中，每孔20μl，-20℃冷冻30min后，经冷冻干燥机-60℃，10mTorr冷冻干燥3h。96孔板去盖后置于低能离子注入机真空室中进行N+注入，注入室内气压5～8×10-3Pa；离子能量为5KeV，束流10μA，2秒钟注入10Do(1Do＝2.6×1013个/cm2)。
3、注入完成后每孔加10μl TE缓冲液润洗，将同样双酶切回收的质粒pET-28a(参见图1)加入96孔板中，按T4连接酶说明书操作，连接质粒和目的DNA。
4、连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，后涂布于含卡那霉素抗性的平板上，于37℃恒温培养箱中培养过夜(8h)。从转化平板中挑取单菌落的一部分于新的无菌96孔板中，每孔含LB培养基200μl，37℃培养1h后,每孔加0.6μl IPTG30℃继续培养3h,6000rpm离心5min,去除上清液。
5、离心后每孔添加0.2ml反应液(含0.2M丝氨酸，0.002M吲哚的pH8.30.1M磷酸盐缓冲液)反应30min,0.1ml酸性Ehrlich试剂显色，596nm检测吸光度。以未经过离子注入的含丝氨酸羟甲基转移酶基因重组菌为对照，挑选596nm处吸光值低于对照组的菌株，发现一株重组菌丝氨酸羟甲基转移酶活性较对照组提高15％，保留该克隆并送样测序。
实施例二
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ACCC10075)出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：
1、将枯草芽孢杆菌培养在如下50ml培养基(g/L)中：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH7.2，37℃摇床培养过夜。收集培养液，抽滤后用滤纸吸干，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20℃。以丝氨酸羟甲基转移酶基因为目的基因，以基因组DNA为模板，用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增和纯化，目的片段长为1248bp。设计引物如下：
Primer-F5'：CGCGGATCCATGA AACATTTACC
Primer-R5'：GGCCTCGAGTTAATAATCTAATTC
2、纯化后的PCR产物经BamHI/XhoI双酶切后，常规琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收，回收产物放入无菌96孔板中，每孔约20μl，-20℃冷冻30min后，经冷冻干燥机-70℃,10mTorr冷冻干燥2h。96孔板去盖后置于低能离子注入机真空室中进行N+注入，注入室内气压5～8×10-3Pa；离子能量为10KeV，束流5μA，1秒钟注入5Do(1Do＝2.6×1013个/cm2)。
3、注入完成后每孔加10μl TE缓冲液润洗，将同样双酶切回收的质粒pET-32a(参见图2)加入96孔板中，按T4连接酶说明书操作，连接质粒和目的DNA。
4、连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，后涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，于37℃恒温培养箱中培养过夜(10h)。从转化平板中挑取单菌落的一部分于新的无菌96孔板中，每孔含LB培养基200μl，37℃培养2h后,每孔加0.7μl IPTG30℃继续培养2h,6000rpm离心5min,去除上清液。
5、离心后每孔添加0.3ml反应液(含0.3M丝氨酸，0.003M吲哚的pH8.30.2M磷酸盐缓冲液)反应30min,0.1ml酸性Ehrlich试剂显色，596nm检测吸光度。以未经过离子注入的含丝氨酸羟甲基转移酶基因重组菌为对照，挑选596nm处吸光值低于对照组的菌株，发现一株重组菌丝氨酸羟甲基转移酶活性较对照组提高10％，保留该克隆并送样测序。
实施例三
以黄杆菌(Flavobacterium columnare ATCC49512)出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：
1、将黄杆菌培养在如下50mL培养基(g/L)中：甘油10，蛋白胨10，酵母提取物1.5，氯化钠3，K2HPO4.12H2O4.5MgSO4.7H2O,自然pH，37℃摇床培养过夜。收集培养液，抽滤后用滤纸吸干，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20℃。以丝氨酸羟甲基转移酶基因为目的基因，以基因组DNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增和纯化，目的片段长为1275bp。设计引物如下：
Primer-F5'：ATAGGATCCATGTTACG CGACG
Primer-R5'：GGCCTCGAGTTAAAAAACGAAC
2、纯化后的PCR产物经BamHI/XhoI双酶切后，常规琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收，回收产物放入无菌96孔板中，每孔约25μl，-20℃冷冻1h后，经冷冻干燥机-70℃，10mTorr冷冻干燥2h。96孔板去盖后置于低能离子注入机真空室中进行N+注入，注入室内气压5～8×10-3Pa；离子能量为10KeV，束流10μA，3秒钟注入15Do(1Do＝2.6×1013个/cm2)。
3、注入完成后每孔加10μl TE缓冲液润洗，将同样双酶切回收的质粒pET-28a加入96孔板中，按T4连接酶说明书操作，连接质粒和目的DNA。
4、连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，后涂布于含卡那霉素抗性的平板上，于37℃恒温培养箱中培养过夜(10h)。从转化平板中挑取单菌落的一部分于新的无菌96孔板中，每孔含LB培养基200μl，37℃培养3h后,每孔加0.8μl IPTG30℃继续培养2h,6000rpm离心5min,去除上清液。
5、离心后每孔添加0.4ml反应液(含0.4M丝氨酸，0.004M吲哚的pH8.30.2M磷酸盐缓冲液)反应30min,0.1ml酸性Ehrlich试剂显色，596nm检测吸光度。以未经过离子注入的含丝氨酸羟甲基转移酶基因重组菌为对照，挑选596nm处吸光值低于对照组的菌株，发现一株重组菌丝氨酸羟甲基转移酶活性较对照组提高20％，保留该克隆并送样测序。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)对多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因进行PCR扩增；
(2)所述多种来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因体外低能离子注入，构建载体并转化受体菌；
(3)筛选高活性的丝氨酸羟甲基转移酶菌株并测序。
2.根据权利要求1所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将多种不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因的微生物在培养基中培养；
(2)提取所述微生物全基因组；
(3)对所述微生物全基因组进行PCR扩增目丝氨酸羟甲基转移酶基因，使用的引物对为Primer-F5'：ATAGGATCCATGTTACGCGACG；Primer-R5'：GGCCTCGAGTTAAAAAACGAAC；
(4)对丝氨酸羟甲基转移酶基因纯化并经BamHI/HindIII或BamHI/XhoI双酶切后，低温冷冻干燥；
(5)干燥后的丝氨酸羟甲基转移酶基因接受低能离子辐照；
(6)辐照后丝氨酸羟甲基转移酶基因经洗脱后，与同样经BamHI/HindIII或BamHI/XhoI双酶切的载体连接，转化受体菌；
(7)挑选抗性平板上单克隆至96孔板上培养，离心后添加反应液反应，使用显色液显色后分光光度计检测；
(8)对丝氨酸羟甲基转移酶活性较高的菌株测序。
3.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(1)的微生物包括肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黄杆菌、纳豆芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌。
4.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(1)的培养基，以g/L为计量，成分包括蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10，pH7.2，余量为水；或蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH7.2，余量为水；或甘油10，蛋白胨10，酵母提取物1.5，氯化钠3，K2HPO4.12H2O4.5，MgSO4.7H2O0.3,自然pH，余量为水。
5.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(2)的全基因组的提取方法为：先收集菌体，再用细菌DNA提取试剂盒提取。
6.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(3)的PCR扩增，在目的基因两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列。
7.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(6)的转化采用热激法。
8.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(7)的显色液为包括5％p-氨基苯甲醛、5％硫酸的正丁醇溶液。
9.根据权利要求2所述的高效丝氨酸羟甲基转移酶体外进化的方法，其特征在于，所述(8)的菌株测序是采用pET系列载体通用引物测序。
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