MXPA00002436A

MXPA00002436A - Cepas de levadura para la produccion de acido lactico

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Publication number: MXPA00002436A
Application number: MXPA/A/2000/002436A
Authority: MX
Inventors: Danilo Porro; Michele Bianchi; Bianca Maria Ranzi; Laura Frontali; Marina Vai; Aaron Adrian Winkler; Lilia 8Alberghina
Original assignee: Ae Staley Manufacturing Company; Alberghina Lilia; Michele Bianchi; Laura Frontali; Danilo Porro; Bianca Maria Ranzi; Marina Vai; Aaron Adrian Winkler
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2001-11-21

Abstract

La presente invención se refiere a cepas de levadura transformadas con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica, LDH y modificadas además para la producción deácido láctico con rendimiento y productividades altos.

Description

CEPAS DE LEVADURA PARA LA PRODUCCIÓN DE ACIDO LÁCTICO La presente invención se refiere a cepas de levadura transformadas con por lo menos una copia de un gen se codifica para deshidrogenasa láctica (LDH), y modificadas además para la producción de ácido láctico con alto rendimiento y productividad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las aplicaciones del ácido láctico y sus derivados abarcan muchos campos de actividades industriales (es decir, químico, de cosméticos y farmacia), así como también aspectos importantes de la fabricación y el uso de alimentos. Además, hoy en día existe un interés creciente en la producción de dicho ácido orgánico para ser usado directamente en la síntesis de materiales poliméricos biodegradables. El ácido láctico puede ser producido mediante síntesis química o mediante fermentación de carbohidratos usando microorganismos. El último método es ahora comercialmente preferido, puesto que se han desarrollado microorganismos que producen exclusivamente un isómero, opuestamente a la mezcla racémica generada mediante síntesis química. Los microorganismos industriales más importantes, tales como las especies de los géneros Lactobacillus, Bacillus y Rhizopus, producen ácido L(+) láctico. Se conoce también la producción mediante fermentación de ácido D(-) láctico, o mezclas de ácido L(+) y D(-) láctico. Durante la fermentación típica de ácido láctico, existe un efecto inhibidor causado por el ácido láctico producido, sobre las actividades metabólicas del microorganismo productor. Además de la presencia del ácido láctico, la disminución del valor del pH inhibe también la actividad metabólica y el crecimiento de las células. Como resultado, se reduce en gran medida el nivel de producción de ácido láctico. Por lo tanto, la adición de Ca(OH)2, CaCO3, NaOH o NH4OH para neutralizar el ácido láctico y para prevenir de esta manera la disminución del pH, es una operación convencional en procedimientos industriales para contrarrestar los efectos negativos de la acumulación del ácido láctico libre. Estos procedimientos permiten la producción de lactato(s) manteniendo el pH a un valor constante en la escala de aproximadamente 5 a 7; este valor está bien arriba del pKa del ácido láctico, es decir, 3.86. Desventajas importantes están relacionadas con la neutralización del ácido láctico durante la fermentación. Principalmente, se requieren operaciones adicionales para regenerar el ácido láctico libre a partir de su sal, y para eliminar o recircular el catión de neutralización; este es un procedimiento costoso. Todas las operaciones y costos extra se podrían eliminar si el ácido láctico libre pudiera ser acumulado por microorganismos que crecen a valores de pH bajo, reduciendo al mínimo de esta manera la producción de lactato(s). te^g&^j ^í^g|^^ á^ Se ha propuesto el uso de levaduras recombinantes que expresan el gen para lactato deshidrogenasa para desviar el flujo glucolítico hacia la producción de ácido láctico. El documento FR-A-2 692 591 (Institut Nationale la Recherche Agronomique) describe cepas de levadura, particularmente cepas de Saccharomyces, que contienen por lo menos una copia de un gen que codifica para una lactato deshidrogenasa de una bacteria láctica, dicho gen estando bajo el control de secuencias que regulan su expresión en levaduras. Dichas cepas pueden producir la fermentación alcohólica y láctica, y esta fermentación denominada "intermedia" o "balanceada" podría ser explotada en áreas tales como elaboración de cerveza, enología y panificación. Porro et al., (Biotechnol. Prog. H, 294-298, 1995) han reportado también la transformación de S. cerevisiae con un gen que codifica para lactato deshidrogenasa de bovino. Sin embargo, debido a la alta producción de etanol, el rendimiento en la producción de ácido láctico mediante los procedimientos descritos, no se ha considerado como competitivo con el obtenible mediante el uso de bacterias lácticas. En la última década, "levaduras no convencionales" diferentes de S. cerevisiae, han despertado interés industrial considerable como hospederos para la expresión de proteínas heterólogas. Ejemplos son las levaduras que utilizan metanol, tales como Hansenula polimorpha y Pichia pastoris, y las levaduras que utilizan lactosa, tales como Kluyveromyces lactis. Además de permitir el uso de una gama más amplia de substratos como fuentes de carbono y energía, se han expuesto otros argumentos hacia el uso industrial de "levaduras no convencionales". Hablando en términos generales, la biomasa y el rendimiento del producto son menos afectados, en algunas de estas levaduras, por las condiciones extremas del ambiente celular. Existen "levaduras no convencionales" tolerantes de altos niveles de azúcares (es decir, 50-80% en p/v en medio de glucosa; Torulaspora -sin. Zygosaccharomyces- delbrueckii, Zygosaccharomyces rouxii y Zygosaccharomyces bailii; Ok T y Hashinaga F., Journal of General & Applied Microbiology 43(1 ): 39-47, 1997) y tolerantes de ácido láctico (Zygosaccharomyces rouxii y Zygosaccharomyces bailii; Houtsma PC, et al., Journal of Food Protection 59(12), 1300-1304, 1996). Como ya se subrayó, el costo del procesamiento corriente abajo podría ser reducido notablemente si el procedimiento de fermentación se llevara a cabo bajo una o más de las "condiciones extremas" mencionadas anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con una ppmera modalidad, esta invención provee cepas de levadura que carecen de la capacidad de producción de etanol o que tienen una capacidad reducida de producción de etanol, y transformadas con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica (LDH) enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en levaduras. Más particularmente, esta invención provee cepas de levadura que tiene una actividad reducida de piruvato deshidrogenasa y una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y transformadas con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica (LDH) enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en levaduras. De conformidad con otra modalidad, esta invención provee cepas de levadura de especies de Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces, transformados con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica (LDH) enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión del gen en dichas levaduras. De conformidad con una modalidad más, la invención provee también células de levadura transformadas con un gen heterólogo para LDH, y que sobreexpresan un transportador de lactato. Otras modalidades son los vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica para una deshidrogenasa láctica enlazada funcionalmente a una secuencia de promotor de levaduras, y un procedimiento para la preparación de ácido DL-, D- o L-láctico, cultivando las cepas de levadura metabólicamente manipuladas descritas anteriormente, ¿• V Í¡éá>m í ii ¿' en un medio de fermentación que contenga una fuente de carbono, y recuperando el ácido láctico del medio de fermentación. Además, la invención provee procedimientos para mejorar la productividad (g/l/hr), producción (g/l) y rendimiento (g/g) sobre la fuente de carbono de ácido láctico, cultivando dichas cepas de levadura en un medio de fermentación manipulado, y recuperando el ácido láctico del medio de fermentación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado que la producción de ácido láctico se puede lograr mediante levaduras metabólicamente modificadas que pertenecen a los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces. Más particularmente, se ha encontrado que se obtienen rendimientos muy altos en la producción de ácido láctico mediante cepas de levadura manipuladas para reemplazar por lo menos la fermentación etanólica por fermentación láctica. Se pueden obtener rendimientos incluso mayores (>80% g/g) en la producción de ácido láctico mediante cepas de levadura manipuladas para reemplazar la fermentación etanólica y el uso de piruvato por las mitocondrias, por la fermentación láctica. Para este propósito, la invención provee también células de levadura transformadas que tienen una actividad de LDH incrementada, por ^^ ^ ^ *g^ ^^ * = ejemplo, como una consecuencia de un número incrementado de copias de LDH por célula, o debido al uso de promotores más fuertes que controlen la expresión de LDH. Un número de copias incrementado de LDH por célula significa por lo menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica para deshidrogenasa láctica, de preferencia por lo menos dos copias, más preferiblemente cuatro copias o, incluso más preferiblemente, por lo menos 10 a 50 copias de dicha secuencia de ácido nucleico. Para lograr la producción más alta de ácido láctico, las células de levadura transformadas de conformidad con la invención sobreexpresan preferiblemente un transportador de lactato. Esto se puede lograr transformando las células de levadura con una o más copias de un gen que se requiere para el transporte del lactato. Las cepas de conformidad con la invención se pueden obtener mediante varios métodos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética dirigidas a la expresión de la actividad de una lactato deshidrogenasa, e inactivando o suprimiendo actividades enzimáticas que intervienen en la producción de etanol, por ejemplo, actividades de piruvato descarboxilasa y de alcohol deshidrogenasa, e inactivando o suprimiendo actividades enzimáticas que intervienen en la utilización del piruvato por las mitocondrias. Puesto que la piruvato descarboxilasa cataliza el primer paso en la vía del alcohol, se prefieren cepas de levadura que tengan una actividad de piruvato descarboxilasa (PDC) sustancialmente reducida, o que carezcan de la misma, y expresen un gen heterólogo para lactato deshidrogenasa. Además, puesto que la piruvato deshidrogenasa cataliza el primer paso en la utilización del piruvato por las mitocondrias, se prefieren también cepas de levadura que tengan actividad de piruvato deshidrogenasa (PDH) sustancialmente reducida, o que carezcan de la misma, y que expresen un gen heterólogo para lactato deshidrogenasa. Puesto que el lactato es excretado en el medio mediante un transportador de lactato, se prefieren también células que produzcan ácido 10 láctico y que sobreexpresen el transportador de lactato. La expresión de un gen para LDH en cepas de levadura permite la producción de ácido láctico a valores de pH ácido, de modo que se obtiene directamente el ácido libre, y se reducen al mínimo la conversión y recuperación problemáticas de las sales de lactato. En esta invención, el pH 15 del medio de fermentación puede ser inicialmente mayor de 4.5, pero disminuirá hasta un pH de 4.5 o menos, de preferencia hasta un pH de 3 o menos al término de la fermentación. Cualquier tipo de cepa de levadura se puede usar de conformidad con la invención, pero se prefieren las especies de Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces debido a que estas cepas pueden crecer y/o metabolizar a pH muy bajo, especialmente en la escala de pH de 4.5 o menos; se han desarrollado métodos de ingeniería genética para estas cepas, y estas cepas están ampliamente aceptadas para su uso en aplicaciones relacionadas a alimentos. Además, se pueden obtener buenos rendimientos de ácido láctico mediante cepas de Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces transformadas con un gen que codifica para deshidrogenasa láctica que tenga actividad de piruvato descarboxilasa y/o piruvato deshidrogenasa de "tipo silvestre". El término "actividad reducida de piruvato descarboxilasa" significa una concentración reducida de enzima en la célula, o actividad catalítica reducida o no específica de la enzima. El término "actividad reducida de piruvato deshidrogenasa" significa una concentración reducida de enzima en la célula, o actividad catalítica reducida o no específica de la enzima. De conformidad con la invención, se prefiere el uso de cepas en donde la producción de etanol sea de cero o se aproxime a este valor, pero es aceptable una producción reducida, por ejemplo, por lo menos 60% menor, de preferencia por lo menos 80% menor, y aún más preferiblemente por lo menos 90% menor que el valor normal de las cepas de tipo silvestre. De conformidad con la invención, se prefiere el uso de cepas en donde las actividades de piruvato descarboxílasa y/o piruvato deshidrogenasa sean de cero o se aproximen a este valor, pero es aceptable una actividad reducida, por ejemplo, por lo menos 60% menor, de preferencia por lo menos 80% menor, y aún más preferiblemente por lo menos 90% menor que el valor normal de las cepas de tipo silvestre. Un ejemplo de K. lactis que no tiene actividad de PDC, ha sido descrito en Mol. Microbiol. 19 (1 ), 27-36, 1996. Ejemplos de cepas de Saccharomyces que tienen una actividad reducida de PDC, están disponibles de ATCC bajo los números de acceso 200027 y 200028. Otro ejemplo de una cepa de Saccharomyces que tiene actividad reducida de PDC como consecuencia de la deleción del gen regulador PDC2, ha sido descrito en Hohmann S (1993) (Mol Gen Genet 241 :657-666). Un ejemplo de una cepa de Saccharomyces que no tiene actividad de PDC, ha sido descrito en Flikweert M. T. et al. (Yeast, 12:247- 257, 1996). En S. cerevisiae, la reducción de la actividad de PDC se puede lograr mediante deleción de los genes estructurales (PDC1 , PDC5, PDC6), o deleción del gen regulador (PDC2). Un ejemplo de cepa de Kluyveromyces que no tiene actividad de PDH, ha sido descrito en Zeeman et al. (Genes involved in pyruvate metabolism in K. lactis; Yeast, vol. 13, artículo especial, Abril de 1997, Décima Octava Conferencia Internacional sobre Genética y Biología Molecular de Levaduras, página 143). Un ejemplo de cepa de Saccharomyces que no tiene actividad de PDH, ha sido descrito en Pronk J T. et al. (Microbiology. 140 (parte 3):601-10, 1994).

Los genes para PDC están altamente conservados entre los diferentes géneros de levaduras (Bianchi et al., Molecular Microbiology, 19(1 ):27-36, 1996; Lu P. et al., Applied & Environmental Microbiology, 64(1 ):94-7, 1998). Por lo tanto, se pueden anticipar fácilmente que siguiendo 5 procedimientos moleculares clásicos, como es reportado por Lu P. et al., citado anteriormente, es posible identificar, clonar y desorganizar los genes que se requieren para una actividad de piruvato descarboxilasa en las especies de levadura Torulaspora y Zygosaccharomyces. Además, se puede anticipar también que siguiendo los mismos procedimientos clásicos, como es reportado por Neveling U. et al. (1998, Journal of Bacteriology, 180(6): 1540-8, 1998), es posible aislar, clonar y desorganizar los genes que se requieren para la actividad de PDH en las especies de levadura Torulaspora y Zygosaccharomyces. La actividad de piruvato descarboxilasa se puede medir mediante métodos conocidos; véase por ejemplo, Ulbrich J., Methods in Enzymology, Vol. 18, p. 109-115, 1970, Academic Press, New York. La actividad de piruvato deshidrogenasa se puede medir mediante métodos conocidos, por ejemplo, de conformidad con Neveling U. et al., citado anteriormente. 20 Se pueden obtener cepas adecuadas seleccionando mutaciones y/o manipulando genéticamente cepas de tipo silvestre o de colecciones. Se pueden seleccionar cientos de mutantes mediante procedimientos de "selección de alto rendimiento". La modulación de la actividad de piruvato . descarboxilasa mediante el uso de nutrientes que sustentan diferentes velocidades de flujo glucolítico (Biotechnol. Prog. 11 , 294-298, 1995), no demostró ser satisfactoria. Un método preferido para disminuir o destruir la actividad de piruvato descarboxilasa y/o la actividad de piruvato deshidrogenasa en una cepa de levadura de conformidad con la invención, consiste en la deleción del gen o los genes correspondientes. Estas deleciones se pueden llevar a cabo mediante métodos conocidos, tales como los descritos en Bianchi et al., (Molecular Microbiol. 19 (1 ), 27-36, 1996; Flikweert M. T. et al., Yeast, 12:247-257, 1996 y Pronk J T. et al., Microbiology. 140 (parte 3): 601-10, 1994), mediante deleción o inserción por medio de marcadores seleccionables, por ejemplo, el marcador URA3, de preferencia el marcador URA3 de Saccharomyces cerevisiae. En forma alternativa, se pueden introducir deleciones, mutaciones de punto y/o mutaciones de cambio de marco en los promotores funcionales y genes que se requieren para las actividades de PDC y/o PDH. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en Nature, 305, 391-397, 1983. Otro método para reducir estas actividades podría ser la introducción de codones de detención en las secuencias de genes, o la expresión de moléculas de ARN mensajero antisentido para inhibir la traducción de moléculas de ARN mensajero de PDC y PDH.

Una cepa de Kluyveromyces lactis, en donde el gen para PDC ha sido reemplazado por el gen URA3 de S. Cerevisiae, ya ha sido descrita en Molecular Microbiology 19(1 ). 27-36, 1996. El gen que codifica para lactato deshidrogenasa puede ser de cualquier especie (por ejemplo, mamífero tal como bovino, o bacteriana), y puede codificar para L(+) LDH o D(-) LDH. En forma alternativa, ambos tipos de genes para LDH pueden ser expresados simultáneamente. Además, se puede usar cualquier variante natural o sintética de secuencias de ADN para LDH, cualquier secuencia de ADN con alta identidad con un gen para LDH de tipo silvestre, o cualquier secuencia de ADN que complemente la actividad normal de la LDH. Se puede usar cualquier gen transportador, por ejemplo, el gen JEN1 , que codifica para el transportador de lactato de S. cerevisiae. La transformación de las cepas de levadura se puede llevar a cabo por medio de vectores integrativos o replicativos, lineales o de plásmidos. Las células recombinantes de la invención se pueden obtener mediante cualquier método que permita que un ADN extraño sea introducido en una célula (Spencer Jf, et al., Journal of Basic Microbiology 28(5): 321-333, 1988), por ejemplo, mediante transformación, electroporación, conjugación, fusión de protoplastos, o cualquier otra técnica conocida. Respecto a la transformación, se han descrito varios protocolos: En particular, se puede llevar a cabo tratando las células intactas en presencia de acetato de litio y polietilenglicol de conformidad con Ito H. et al. (J. Bacteriol., 153:163, 1983), o en presencia de etilenglicol y sulfóxido de dimetilo de conformidad con Durrens P. et al. (Curr. Genet., 18:7, 1990). Un protocolo alternativo ha sido descrito también en el documento EP 361991. La electroporación se puede llevar a cabo de conformidad con Becker D. M y Guarente L. (Methods in Enzymology, 194:18, 1991 ). Se puede preferir el uso de vectores integrativos no bacterianos cuando se use la biomasa de levaduras, al final del procedimiento de fermentación, como medio de abastecimiento o para otros propósitos de reproducción, agrícolas o alimentarios. En una modalidad particular de la invención, el ADN recombinante forma parte de un plásmido de expresión que puede ser de replicación autónoma o integrativa. En particular, para S. cerevisiae y K. lactis, se pueden obtener vectores de replicación autónoma mediante el uso de secuencias de replicación autónoma en el hospedero seleccionado. Especialmente, en levaduras, pueden ser orígenes de replicación derivados de plásmidos (2µ, PKD1 , etc.), o incluso secuencias de cromosomas (ARS). Los vectores integrativos se pueden obtener mediante el uso de secuencias de ADN homologas en ciertas regiones del genoma del hospedero permitiendo, mediante recombinación homologa, la integración del vector. Herramientas genéticas para la expresión de genes están muy bien desarrolladas para S. cerevisiae, y se describen en Romanos, M. A. et al.

Yeast, 8:423, 1992. Se han desarrollado también herramientas genéticas que permiten el uso de las especies de levaduras Kluyveromyces y Torulaspora como células hospederas para la producción de proteínas recombinantes (Spencer Jf, et al., citado anteriormente; Reiser J. et al., Advances in Biochemical Engineering-Biotechnology. 43, 75-102, 1990). Se han reportado algunos ejemplos de vectores que se replican en forma independiente en K. lactis, con base en el plásmido lineal pKG1 de K lactis (de Lovencourt L. et al. J. Bacteriol., 154:737, 1982), o que contienen una secuencia de cromosomas K. lactis mismo (KARS), confiriéndole al vector la capacidad para autorreplicarse y de segregarse correctamente (Das S., Hollenberg C. P., Curr. Genet., 6:123, 1982). Además, el reconocimiento de un plásmido similar a 2µ nativo a K. drosophilarum (plásmido pKD1- US 5 166 070), ha permitido el establecimiento de un sistema de hospedero/vector muy eficiente para la producción de proteínas recombinantes (véase el documento EP-A- 361 991 ). Vectores recombinantes a base de pKD1 contienen la secuencia original completa, fusionada a marcadores apropiados de levaduras y bacterias. En forma alternativa, es posible combinar parte de pKD1 , con vectores de expresión comunes de S. cerevisiae (Romanos M. A. et al., Yeast, 8:423, 1992) (Chen et al., Curr. Genet. 16:95,1989). Se sabe que el plásmido de 2µ de S. cerevisiae se replica y se mantiene establemente en Torulaspora. En esta levadura, la expresión de las proteínas heterólogas se ha obtenido mediante un procedimiento de co-trasformación, es decir, la presencia simultánea de un vector de expresión fe -HtiHlMiltf---«s*-a--*| para S. cerevisiae y del plásmido completo de 2µ (Compagno C. et al., Mol. Microb., 3:1003-1010, 1989). Como resultado de combinaciones inter- e intramoleculares, es posible aislar un plásmido híbrido, que posea la secuencia completa de 2µ y el gen heterólogo; dicho plásmido es en principio capaz de transformar directamente a Torulaspora. Además, se ha descrito también un plásmido episómico basado en la secuencia ARS1 de S. cerevisiae, pero la estabilidad de este plásmido es muy baja; véase Compagno et al., citado anteriormente. Recientemente, se ha aislado un plásmido endógeno similar a 2µ nombrado pTD1 en Torulaspora (Blaisonneau J. et al., Plasmid, 38:202-209, 1997); las herramientas genéticas actualmente disponibles para S. cerevisiae pueden ser transferidas al nuevo plásmido, obteniendo de esta manera vectores de expresión dedicados a las especies de la levadura Torulaspora. Los marcadores genéticos para la levadura Torulaspora comprenden, por ejemplo, URA3 (Watanabe Y et al., FEMS Microb. Letters, 145:415-420, 1996), para resistencia a G418 (Compagno C. et al., Mol.

Microb., 3:1003-1010, 1989), y para resistencia a cicloheximida (Nakata K. y Okamura K., Biosc. Biotechnol. Bíochem., 60:1686-1689, 1996). Plásmidos similares a 2µ de especies de Zygosaccharomyces, son conocidos y han sido aislados en Z. rouxii (pSR1 ), en Z. bisporus (pSB3), en Z. fermentati (pSM1 ) y en Z. bailii (pSB2) (Spencer JF. et al., citado anteriormente).

El plásmido pSR1 es el mejor conocido: se replica en S. cerevisiae, pero no son reconocidos ARS de 2µ en Z. rouxii (Araki H. y Hoshima Y., J. Mol. Biol., 207:757-769, 1989). Se han descrito vectores episómicos basados en ARS1 de S. cerevisiae para Z. rouxii (Araki et al., Mol. Gen. Genet., 238:120-128,1993). Un marcador selectivo para Zygosaccharomyces es el gen ATP1 que permite crecer en medios que contienen G418 (Ogawa et al., Agrie. Biol. Chem., 54:2521-2529, 1990). Cualquier promotor de levaduras, ya sea inducible o constitutivo, se puede usar de conformidad con la invención. Hasta la fecha, promotores usados para la expresión de proteínas en S. cerevisiae están bien descritos por Romanos et al. (citado anteriormente). Los promotores usados comúnmente en la expresión de proteínas introducidas en K. lactis son PGK y PHO5 de S. cerevisiae (Romanos et al., citado anteriormente), o promotores homólogos tales como LAC4 (van den Berg J. A. et al., BioTechnology, 8:135, 1990) y KIPDC (US 5 631 143). Se prefiere particularmente el promotor del gen para piruvato descarboxilasa de K. lactis (KIPDC). Vectores para la expresión de genes heterólogos los cuales son particularmente eficaces para la transformación de cepas de Kluyveromyces lactis, se describen en el documento US 5 166 070, el cual se incorpora en la presente como referencia. Se prefieren particularmente promotores del gen para piruvato descarboxilasa, de preferencia de especies de Kluyveromyces, e incluso más preferiblemente de Kluyveromyces lactis, descritos en Molecular Microbiol 19 (1 ), 27-36, 1996. Son preferibles también promotores de triosa fosfato isomerasa y de alcohol deshidrogenasa, de preferencia de especies de Saccharomyces, e incluso más preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae (Romanos et al, citado anteriormente). Para la producción de ácido láctico, las cepas de levaduras de la invención se cultivan en un medio que contenga una fuente de carbono y otros nutrientes esenciales, y el ácido láctico es recuperado a un pH de 7 o menos, preferiblemente a un pH de 4.5 o menos, e incluso más preferiblemente a un pH de 3 o menos. Puesto que el pH del medio de cultivo es reducido, es necesaria una cantidad menor de agente neutralizante. La formación de sal de lactato es reducida en forma correspondiente, y se requiere proporcionalmente menos regeneración de ácido libre para recuperar el ácido láctico. El procedimiento de recuperación puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos (T. B. Vickroy, volumen 3, capítulo 38 de "Comprehensive Biotechnology" (editor: M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985.) (R. Datta et al., FEMS Microbiology Reviews 16, 221-231 ,1995). Típicamente, los microorganismos son removidos mediante filtración o centrifugación antes de la recuperación del ácido láctico. Métodos conocidos para la recuperación del ácido láctico incluyen, por ejemplo, la extracción de ácido láctico en una fase de solvente inmiscible o la destilación de ácido láctico o un éster del mismo. Se obtienen rendimientos mayores con respecto a la fuente de carbono (g de ácido láctico/g de glucosa consumida) y productividades mayores (g de ácido láctico/l/h), cultivando cepas de levadura, particularmente cepas de Saccharomyces, en medios se carezcan de iones Mg++ y Zn++, o que tengan una disponibilidad reducida de dichos iones. De preferencia, los medios de cultivo contendrán menos de 5 mM de Mg++ y/o menos de 0.02 mM de Zn++. La presente invención ofrece las siguientes ventajas en la producción de ácido láctico: 1. Cuando la fermentación se lleva a cabo a pH de 4.5 o menos, existe menos riesgo de contaminación por microorganismos extraños, comparativamente con el procedimiento convencional. Además, se puede simplificar la instalación de fermentación, y se puede facilitar el control de la fermentación. 2. Puesto que se añade menos agente de neutralización al medio de cultivo para neutralización, existe en forma correspondiente menos necesidad de usar ácidos minerales u otros agentes de regeneración para la conversión de la sal de lactato en ácido láctico libre. Por lo tanto, se puede reducir el costo de producción. 3. Puesto que se añade menos agente de neutralización al medio de cultivo, se reduce la viscosidad del caldo de cultivo. Por consiguiente, el caldo es más fácil de procesar. 4. Las células ceparadas de conformidad con la presente invención, se pueden utilizar de nuevo como microorganismos de siembra para una nueva fermentación de ácido láctico.

. Las células pueden ser separadas y recuperadas continuamente durante la fermentación de ácido láctico, de conformidad con la presente invención y, por lo tanto, la fermentación se puede llevar a cabo en forma continua. 6. Puesto que las cepas de levadura recombinantes carecen de capacidad de producción de etanol y actividad de piruvato deshidrogenasa, o tienen actividad reducida de producción de etanol y actividad reducida de piruvato deshidrogenasa, la producción de ácido láctico se puede llevar a cabo con mayor rendimiento, comparativamente con cepas de levaduras que tienen capacidad de tipo silvestre para producir etanol y capacidad de tipo silvestre para la utilización de piruvato por las mitocondrias. 7. La producción de ácido láctico por levaduras no convencionales manipuladas metabólicamente que pertenecen a las especies de Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces, se puede lograr a partir de fuentes de carbono no convencionales (es decir, galactosa-lactosa- sacarosa-rafinosa-maltosa-celobiosa-arabinosa-xilosa, por dar algunos ejemplos), cultivando las células en medio de cultivo con alto contenido de azúcar, y cultivando las células en presencia de alta concentración de ácido láctico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 se refiere a la clonación del gen para lactato deshidrogenasa que cambia el flujo glucolítico hacia la producción de ácido láctico. Las reacciones enzimáticas clave en el punto de ramificación de piruvato, son catalizadas por las siguientes enzimas: (i): piruvato descarboxilasa; (2): alcohol deshidrogenasa; (3): acetaldehído deshidrogenasa; (4): acetil-CoA sintetasa; (5): vaivén de la acetíl-CoA del citosol a las mitocondrias; (6): vaivén de la acetil-CoA de las mitocondrias al citosol; (7): lactato deshidrogenasa heteróloga; y (8): piruvato deshidrogenasa. Se han omitido las reacciones enzimáticas que intervienen en la síntesis anaplerótica. La figura 2 corresponde al diagrama del plásmido pVC1. Las figuras 3A y 3B corresponden al diagrama del plásmido pKSMD8/7 y pKSEXH/16, respectivamente. La figura 4 corresponde al diagrama del plásmido pEPL2. La figura 5 corresponde al diagrama del plásmido pLC5. La figura 6 corresponde al diagrama del plásmido pLAT-ADH. La figura 7A se refiere a la producción de ácido L(+) láctico de la cepa PM6-7a[pEPL2] transformada de Kluyveromyces lactis durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. La concentración de glucosa residual a T=49 no fue detectable. La producción de ácido D(-) láctico ¿¿a=* tampoco fue detectable. La actividad específica de LDH fue mayor de 3 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo de todo el experimento. Se han obtenido resultados similares usando la LDH de L. casei (datos no mostrados). 5 (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (I) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. La figura 7B se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa PM6-7a[pEPL2] transformada de Kluyveromyces lactis durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. El medio fue regulado 10 en su pH en el tiempo T=0 (pH=5.6) usando regulador de pH de fosfato a 200 mM. En este lote, el valor del pH disminuye mucho después que durante el lote mostrado en la figura 7A. La concentración de glucosa residual a T=49, no fue detectable. La actividad específica de LDH fue mayor de 3 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo del experimento. 15 Se han obtenido resultados similares usando la LDH de L. casei (datos no mostrados). (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (M) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. La figura 8A se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa PM1/C1 [pEPL2] transformada de Kluyveromyces lactis durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. La concentración de glucosa residual a T=60 fue de 12.01 g/l. Los tiempos de incubación más largos no dieron producciones más altas de biomasa y ácido L(+) láctico. La - '?¡Ütá..l actividad específica de LDH fue mayor de 3 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo de todo el experimento. Se han obtenido resultados similares usando la LDH de L. casei (datos no mostrados). (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (M) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. La figura 8B se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa PM1/C1 [pEPL2] transformada de Kluyveromyces lactis durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. El medio fue regulado en su pH al tiempo T=0 (pH=5.6) usando regulador de pH de fosfato a 200 mM. En este lote, el valor del pH disminuye mucho después que durante el lote mostrado en la figura 8A. La concentración de glucosa residual a T=87, fue de 0. La actividad específica de LDH fue mayor de 3 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo de todo el experimento. (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (M) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. Se han obtenido resultados similares usando la LDH bacteriana de L. casei (datos no mostrados). La figura 9A se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa BM3-12D[pLAZ10] transformada de Kluyveromyces en un biorreactor de tanque agitado (véase también el texto). Se han obtenido resultados similares usando la LDH de L. casei (datos no mostrados).

(A) Células/ml; (O) concentración de glucosa, g/l (I) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. La figura 9B se refiere al rendimiento de ácido L(+) láctico a partir de la cepa BM3-12D[pLAZ10] de Kluyveromyces en un biorreactor de tanque agitado. Glucosa contra producción de ácido láctico. El rendimiento (g/g) es de 85.46%. La figura 10 se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa CBS817[pLAT-ADH] transformada de Torulaspora (sin. Zygosaccharomyces) delbrueckii durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. La concentración de glucosa residual a T=130, fue de 3 g/l. Los tiempos de incubación más largos no dieron producciones más altas de biomasa y ácido L(+) láctico. La actividad específica de LDH fue mayor de 0.5 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo de todo el experimento. (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (M) Producción de ácido L(+) láctico, g/l. La figura 11 se refiere a la producción de ácido L(+) láctico a partir de la cepa ATCC60483[pLAT-ADH] transformada de Zygosaccharomyces bailii durante su crecimiento en medios a base de Glu-YNB. La concentración de glucosa residual a T=60, fue de 8 g/l. Los tiempos de incubación más largos no dieron producciones mayores de biomasa y ácido L(+) láctico. La actividad específica de LDH fue mayor de 0.5 U/mg del contenido total de proteínas de la célula a lo largo de todo el experimento. Se obtuvieron resultados similares usando una cepa diferente (ATCC36947, datos no mostrados). (A) Células/ml; (-) valor de pH; (O) producción de etanol, g/l (M) Producción de ácido L(+) láctico, g/l.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Se dan las siguientes definiciones para ayudar a los expertos en la técnica a entender la descripción detallada de la presente invención. "Amplificación" se refiere a incrementar el número de copias de una molécula deseada de ácido nucleico. "Codón" se refiere a una secuencia de tres nucleótidos que especifica un aminoácido particular. "Deleción" se refiere a una mutación que remueve uno o más nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico. "ADN ligasa" se refiere a una enzima que une covalentemente dos piezas de ADN de doble cadena. "Electroporación" se refiere a un método para introducir ADN extraño en células que usa una carga de CD breve y de alto voltaje para permeabilizar las células hospederas, haciendo que incorporen en las mismas ADN extracromosómico.

El término "endógeno" se refiere a materiales que se originan en el interior del organismo o célula. "Endonucleasa" se refiere a una enzima que hidroliza ADN de doble cadena en posiciones internas. El término "expresión" se refiere a la transcripción de un gen para producir el ARN mensajero correspondiente, y la traducción de esta molécula de ARN mensajero para producir el producto génico correspondiente, es decir, un péptido, polipéptido o proteína. El término "expresión de ARN antisentido" se refiere a la transcripción de un ADN para producir una primera molécula de ARN capaz de hibridar con una segunda molécula de ARN que codifica para un producto génico, por ejemplo, una proteína. La formación del híbrido de ARN-ARN inhibe la traducción de la segunda molécula de ARN para producir el producto génico. La frase "enlazado funcionalmente" se refiere a un promotor o región de promotor y una secuencia estructural o de codificación en tal orientación y distancia, que la transcripción de la secuencia estructural o de codificación puede ser dirigida por el promotor o región de promotor. El término "gen" se refiere a ADN cromosómico, ADN plasmídico, ADNc, ADN sintético u otro ADN que codifica para una molécula de péptido, polipéptido, proteína o ARN, y regiones que flanquean la secuencia de codificación que interviene en la regulación de la expresión. 3¡¿^ — *¡j¡g¡¡¡¡j^~¡¡¡¡¡ El término "genoma" abarca el cromosoma y los plásmidos dentro de una célula hospedera. Las moléculas de ADN codificadoras de la presente invención introducidas en células hospederas, pueden ser por lo tanto integradas cromosómicamente o localizadas en plásmidos. "ADN heterólogo" se refiere a ADN de una fuente diferente de aquella de la célula receptora. "ADN homólogo" se refiere a ADN de la misma fuente de aquella de la célula receptora. "Hibridación" se refiere a la capacidad de una cadena de ácido nucleico para unirse con una cadena complementaria mediante apareamiento de bases. La hibridación ocurre cuando secuencias complementarias en las dos cadenas de ácido nucleico se unen a alguna otra. "Lactato deshidrogenasa" (LDH) se refiere una proteína que cataliza la conversión de piruvato y NADH a ácido láctico y NAD+. L(+) LDH produce ácido L(+) láctico; D(-) LDH produce ácido D(-) láctico. El término "transportador de lactato" se refiere a una proteína que permite el transporte de lactado del interior al exterior de la célula. "Mutación" se refiere a cualquier cambio o alteración en una secuencia de ácido nucleico. Existen varios tipos, incluyendo mutaciones de punto, cambio de marco y empalme. La mutación puede ser producida específicamente (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio) o aleatoriamente (por ejemplo, mediante agentes químicos, paso a través de cepas bacterianas de reparación negativa).

Códigos de ácido nucleico: A = adenosina; C = citosina; G = guanosina; T= timidina; N = A, C, G y T equimolares; I = desoxiinosina; K = G y T equimolares; R = A y G equimolares; S = C y G equimolares; W = A y T equimolares; Y = C y T equimolares. "Marco de lectura abierto (ORF)" se refiere a una región de ADN o ARN que codifica para un péptido, polipéptido o proteína. "Piruvato descarboxilasa" (PDC) se refiere a una proteína que cataliza la conversión de piruvato a acetaldehído. "Piruvato deshidrogenasa" (PDH) se refiere a un complejo de proteína que cataliza la conversión de piruvato a acetil-CoA. "Plásmido" se refiere a una pieza de ADN circular, extracromosómico y de replicación autónoma. "Mutación de punto" se refiere a una alteración de un nucleótido individual en una secuencia de ácido nucleico. "Reacción en cadena de polimerasa (PCR)" se refiere a una técnica enzímática para crear copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico. Se preparan copias de la secuencia de ADN, haciendo ir y venir a una ADN polimerasa entre dos amplímeros. La base de este método de amplificación son ciclos múltiples de cambios de temperatura para desnaturalizar, y después volver a unir los amplímeros, seguido de extensión para sintetizar nuevas cadenas de ADN en la región localizada entre los amplímeros de flanqueo. iíííi^ítst^S^ÉS ^tá El término "promotor" o "región de promotor" se refiere a una secuencia de ADN que incluye elementos que controlan la producción de ARN mensajero, proveyendo el sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa y/o otros factores necesarios para el inicio de la transcripción en el sitio correcto. Una "célula recombinante" o "célula transformada" es una célula cuyo ADN ha sido alterado por la introducción de una molécula exógena de ácido nucleico en esa célula. El término "construcción de ADN recombinante" o "vector recombinante" se refiere a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia de replicación autónoma, fago o secuencia de nucleótidos de ADN o ARN de cadena sencilla o de cadena doble lineal o circular, derivado de cualquier fuente, capaz de sufrir integración genómica o replicación autónoma, y que comprende una molécula de ADN en la cual una o más secuencias de ADN han sido ligadas en una forma funcionalmente operativa. Dichas construcciones o vectores de ADN recombinante son capaces de introducir una secuencia reguladora 5' o región de promotor y una secuencia de ADN para un producto géníco seleccionado en una célula, de tal manera que la secuencia de ADN es transcrita en una molécula de ARN mensajero funcional la cual es traducida y por lo tanto expresada. Se pueden construir alternativamente construcciones de ADN recombinante o vectores recombinantes que sean capaces de expresar moléculas de ARN antisentido, para inhibir la traducción de un ARN específico de interés.

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"Actividad (enzimática) reducida" se refiere a actividad enzimática reducida medida aislada de una cepa transformada o mutagenizada, comparativamente con la actividad enzimática medida aislada de una cepa de tipo silvestre de la misma especie. La actividad enzimática reducida puede ser el resultado de concentraciones reducidas de la enzima, actividad específica reducida de la enzima, o una combinación de las mismas. Cepas de "reparación negativa" o de "reparación deficiente" se refieren a organismos que tienen vías de reparación de ADN reducidas o eliminadas. Dichas cepas muestran índices de mutación incrementados comparativamente con los índices de las cepas de tipo silvestre de la misma especie. La propagación de una secuencia de ácido nucleico a través de una cepa de reparación negativa, da como resultado la incorporación de mutaciones aleatorias en toda la secuencia de ácido nucleico. "Enzima de restricción" se refiere a una enzima que reconoce una secuencia palindrómica específica de nucleótidos en ADN de doble cadena y que corta ambas cadenas; denominada también endonucleasa de restricción. El corte ocurre típicamente dentro del sitio de restricción. "Marcador seleccionable" se refiere a una secuencia de ácido nucleico cuya expresión confiere un fenotipo que facilita la identificación de células que contienen la secuencia de ácido nucleico. Marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a agentes químicos tóxicos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a kanamicina), complementan una deficiencia nutricional (por ejemplo, uracilo, histidina, leucina), o imparten una característica visualmente distinguible (por ejemplo, cambios de color, fluorescencia). "Transcripción" se refiere al procedimiento para producir una copia de ARN a partir de un molde de ADN. 5 "Transformación" se refiere a un procedimiento para introducir una secuencia de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un vector, plásmido, molécula de ácido nucleico recombinante) en una célula, en la cual dicho ácido nucleico exógeno es incorporado en un cromosoma o es capaz de replicarse en forma autónoma. 10 "Traducción" se refiere a la producción de proteínas a partir de ARN mensajero. El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de ácido láctico producido (g/l) dividida entre la cantidad de glucosa consumida (g/l). "Unidad" de enzima se refiere a la actividad enzimática, e indica 15 la cantidad de micromoles de substrato convertidos por mg de proteínas totales de la célula por minuto. "Vector" se refiere a un plásmido, cósmido, bacteriófago o virus que posee secuencias de ácido nucleico en un organismo hospedero.

Mutaqénesis dirigida a sitio del gen para lactato deshidroqenasa de bovino (LDH-A) Para aislar del ADNc de longitud total la secuencia de codificación de la enzima LDH-A de bovino (EC 1.1.1.27), se llevó a cabo una mutagénesis clásica dirigida a sitio (J. Biol. Chem. 253:6551 , 1978, Meth. Enzymol. 154:329, 1987). La mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos se basa en la hibridación in vitro de un fragmento de ADN de cadena sencilla con un oligonucleótido sintético, el cual es complementario al 5 fragmento de ADN, excepto por una región de no apareamiento central en correspondencia con la secuencia de ADN que debe ser mutagenizada. Para introducir un sitio de enzima de restricción Xba I de 11 pb antes del codón ATG, el ADNc para LDH de bovino de 1743 pb fue clonado del plásmido pLDH12 (Ishiguro et al., Gene, 91 281-285, 1991 ) mediante digestión con las enzimas de restricción Eco Rl y Hind lll (New England Biolabs, Beverly, MA). El fragmento de ADN aislado fue insertado entonces en el vector de expresión pALTER-1 (Promega, No. de cat. 96210; lote # 48645, 1996). Dicho vector contiene el origen de replicación de los bacteriófagos M13 y R408, y dos genes para resistencia a antibióticos. Uno de estos genes para resistencia a tetraciclina, es funcional. El otro (es decir, para resistencia a ampicilina), ha sido inactivado. Se provee un oligonucleótido que restaura la resistencia a ampicilina a la cadena mutante durante la reacción de mutagénesis (oligoAMP; Promega, Madison, Wl, cuadro 1 ). Este oligonucleótido es unido al molde de ADN de cadena sencilla (ADNss). Al mismo tiempo, el oligonucleótido mutagénico (oligoLDH, Madison Wl) ha sido unido también. Después de síntesis y ligación del ADN, el ADN es transformado en una cepa de reparación negativa de E. coli (BMH 71-18 ^^^¿^^Mj^^Mt i^^»M^^^a^^»tof^^ mutS; equipo Promega). La selección se llevó a cabo en LB+ampicilina (Molecular Cloning, a laboratory manual, editado por Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Un segundo ciclo de transformación en la cepa JM 109 (equipo Promega) de E. coli aseguró la segregación adecuada de los plásmidos de tipo mutante y silvestre.

CUADRO I OLIGONUCLEOTIDOS SECUENCIA OligoAMP 5'-GTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG-3' (Seq. Id. No. 1) OligoLDH 5 '-CCTTTAGGGTCTAGATCCAAGATGGCAAC-3 ' (Seq. Id. No. 2) Secuencia de nucleótidos de los oligonucleótidos sintéticos usados para la mutagénesis dirigida a sitio. La secuencia subrayada en oligoLDH muestra el sitio de restricción Xba I introducido mediante mutagénesis.

Mayores detalles sobre la técnica y los materiales usados (con excepción de oligoLDH), se pueden encontrar en la hoja de datos del equipo. El plásmido obtenido, que contiene el ADNc mutado para LDH de bovino, fue denominado pVC1 (fig. 2).

Mutagénesis mediante PCR del gen para lactato deshidrogenasa (LDH) de Lactobacillus casei, Bacillus megaterium y Bacillus stearothermoph ylus El codón de partida original (GTG) del gen LDH de Lactobacillus casei (GTG) (la secuencia de LDH está disponible en el número de acceso M76708 de la base de datos de secuencias del banco de genes provista por el sitio en la red del National Center of Biotechnology -NCBI-: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), no es reconocido correctamente por S. cerevisiae. Se obtuvo el plásmido pST2 y la secuencia de LDH de Hutkins Robert, Universidad de Nebraska, Estados Unidos). PST2 se basa en el vector pUC19 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania, cat. 885827), y contiene un fragmento de ADNc para LDH BamHI-Sphl amplificado de la cepa 686 de L. casei (Colección de Cultivos de la Universidad de Nebraska). Para obtener una secuencia de codificación que parte con el primer codón eucariótico usual (es decir, ATG), la secuencia de LDH ha sido mutagenizada mediante PCR. La introducción de un sitio de enzima de restricción Neo I en la posición 163 de la secuencia de LDH (número de acceso M76708 de la base de datos de secuencias del banco de genes, citada anteriormente), permite el cambio concomitante del codón GTG original en ATG. La reacción de PCR (Mastercycler 5330, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) se llevó a cabo partiendo del plásmido pLC1 , con base en el vector pGEM7Z f(+) (Promega Corporation, Madison, Wl, USA, cat. P2251 ), y conteniendo el gen de L. casei (fragmento BamHI-Sphl separado de pST2). Las secuencias de los oligonucleótidos usados como iniciadores de la reacción, se reportan en el cuadro 2. Ciclos de amplificación: 94°; V (paso de desnaturalización) 94° 30" (paso de desnaturalización) 56° 30" 4 veces (paso de unión del iniciador) 68° 3' (paso de extensión) 94° 30" (paso de desnaturalización) 60° 30" 23 veces (paso de unión del iniciador) 68° 3' (paso de extensión) 68° 3' (paso de extensión final). Al término de la reacción, se aisló una banda individual, que corresponde al gen amplificado y mutado. El fragmento de ADN fue insertado entonces en el sitio EcoRV del vector de clonación pMOSBlue (Amersham Life Science, Buckingamshire, Inglaterra; cod. RPN5110) con una ligación de extremos rasurados, dando lugar al plásmido pLC3. Cualquier otro protocolo de mutagénesis se puede usar en forma análoga.

CUADRO 2 Secuencia de nucleótidos de los oligonucleótidos sintéticos usados para la amplificación mediante PCR. Las secuencias subrayadas en oligoATG muestran el sitio de restricción Ncol introducido mediante mutagénesis, y el codón de partida ATG resultante obtenido. Siguiendo un procedimiento clásico de PCR, se pudieron clonar también los genes para L(+)LDH de las bacterias Bacillus megaterium y Bacillus stearothermophylus (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391 ) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368:1167) (la secuencia de ADN está disponible también en los números de acceso M22305 y M 19396 de la base de datos de secuencias del banco de genes provista por el sitio en la red del National Center of Biotechnology -NCBI-: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) en vectores de expresión de la levadura S. cerevisiae (es decir, pBME2 y pBST2, respectivamente - véase más adelante).

Construcción del vector replicativo pEPL2 que contiene el promotor KIPDCA y el ADNc para LDH de bovino El promotor KIPDCA y la secuencia de codificación fueron subclonados como un fragmento Hindlll de 4 Kpb de un clon de la genoteca genómica de K lactis que complementa la mutación rag 6 de K. lactis (Bianchi et al., Mol. Microbiol., 19: 27-36, 1996). La región de promotor fue subclonada en los sitios Sal I y Xba I del vector pBluescript II KS (Stratagene, LaJolla, No. de cat. 212205) con ADN ligasa T4 usando procedimientos estándar de clonación molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning, citado anteriormente). La secuencia de LDH de bovino, aislada como un fragmento Xba I - Hind lll de 1675 pb del vector pVC1 , fue clonada en los sitios de clonación correspondientes del vector pBluescript II KS. La cepa GM82 de E. coli (dam'dcm ) (disponible de colecciones de ATCC o CGSC), fue transformada con los dos nuevos vectores, denominados respectivamente pKSMD8/7 y pKSEXH/16 (figuras 3A y 3B). El promotor KIPDCA y la secuencia de LDH de bovino, aislados como fragmentos Sal I - Xba I, respectivamente de pKSMD8/7 y pKSEXH/16, fueron ligados in vitro con ADN ligasa T4 a temperatura ambiente en presencia de endonucleasa Sal I para permitir la ligación en los extremos de Xba I. El producto de ligación fue clonado en el sitio de clonación Sal I del vector pE1 (Bianchi M. et al., Curr. Genet. 12: 185-192, 1987; Chen X. J. et al., Curr. Genet. 16: 95-98, 1989 y US # 5166070). Este plásmido se basa en el plásmido integrativo Ylp5 que contiene el marcador genético URA3 de Saccharomyces cerevisiae, y en el plásmido pKD1 (US # 5166070), aislado de Kluyveromyces drosophilarum. El plásmido pE1 tiene una organización funcional similar al ADN de 2µ de S. Cerevisiae, y es capaz de replicarse en forma estable en células de Kluyveromyces lactis (Chen X. J. et al., citado anteriormente). El marcador URA3 en el plásmido permite la complementación de la mutación uraA1-1 de K lactis (de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154: 737-742 (1982)), y por lo tanto el crecimiento de células transformadas en medios selectivos sin uracilo. El vector obtenido se denominó pEPL2 (fig. 4) y se usó para transformar la cepa DH5-alfa de E. coli (Life Technologies Inc., Gaitherburg, MA).

Construcción del vector replicativo pEPL4 que contiene el promotor K1 PDCA y el gen para LDH bacteriano El gen para LDH de bovino descrito para el plásmido pEPL2 fue sustituido con la secuencia de ADN para LDH del gen de Lactobacillus casei (véase anteriormente), siguiendo procedimientos moleculares clásicos descritos a lo largo del texto, produciendo el plásmido pEPL4. Las células transformadas de la levadura K. lactis que poseen moléculas de LDH de bovino o bacterianas, dieron resultados similares.

Construcción del vector replicativo pLAZIO que contiene el promotor K1 PDCA v el ADNc para LDH de bovino El vector pLAZIO se obtuvo clonando el fragmento Sal I de pEPL2, que posee el promotor K1PDC1 y la secuencia de codificación de LDH de bovino, en el sitio Sal I único del vector p3K31. El vector p3K31 está formado del vector comercial pUC19 y el cassette para resistencia a G418 del vector pKan707 (Fleer et al., Bio/technology 9: 968-974, 1991 ), insertado en el sitio Sph I único del plásmido pKD1.

Construcción de los vectores inteqrativos pLC5, pLC7, pB1 , pBM2, pBST2. pLC5-KanMX y pJEN1 El gen LDH de L. casei, fue separado de pLC3 (descrito anteriormente) con una digestión con Ncol-Sall, y ligado en los vectores integrativos PYX012 o pYX022 (R&D System Europe Ltd, Abingdon, Inglaterra). Los dos plásmidos obtenidos, que contienen el ADN mutado para el gen para LDH bacteriana bajo el control del promotor TPI, y que posee los marcadores auxotróficos URA3 o HIS3, fueron denominados, respectivamente, pLC5 (figura 5) y pLC7. Para la construcción de pB1 , pBM2 y pBST2, se usó un procedimiento similar al descrito para la construcción de pLC5; sin embargo, se usó LDH de bovino, LDH de B. megaterium y LDH de B. stearothermophylus (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391 ) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167), respectivamente. Finalmente, el plásmido pFA6a-KanMX (Wach et al, Yeast, 1994, 10: 1793-1808) fue digerido con Sacl y Smal, y el fragmento resultante fue ligado en pLC5 cortado con las mismas enzimas, produciendo el plásmido pLC5-kanMX. En los plásmidos, el gen LDH está bajo en control del promotor TPI. La secuencia de ADN de JEN1 (la secuencia de ADN está disponible en el número de acceso U24155 de la base de datos de secuencias del banco de genes provista por el sitio en la red del National Center of Biotechnology -NCBI-: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), que codifica para el transportador de lactato de S. cerevisiae (Davis E. S., Tesis, 1994 - Laboratory of Eukaryotic Gene Expression, Advanced Bioscience Laboratories) (Davis, E. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89 (23), 11169, 1992) (Andre, B. Yeast (11 ), 1575, 1995), se ha obtenido de E. S. Davis (Universidad de Maryland, Estados Unidos). La secuencia de codificación de JEN1 ha sido amplificada mediante procedimientos clásicos de PCR descritos a lo largo del texto, y ha sido clonada en el plásmido pYX022 (véase anteriormente). En el plásmido integrativo, la sobreexpresión de JEN1 está bajo el control del promotor TPI.

Construcción del vector replicativo pLAT-ADH que contiene el promotor ADH1 y el ADNc para LDH de bovino En primer término, se construyó el plásmido pLDH-Kan, clonando en el sitio EcoRV del vector de clonación pBluescript II KS (Promega Corporation, Madison Wl, USA, cat. 212208) el gen APT1, que confiere resistencia a geneticina (G418), derivado de una digestión del vector PFA6- KanMX4 por Smal/EcoRV (Wach et al. Yeast 10:1793-1808 (1994)). En segundo término, la región de codificación del gen LDH de bovino fue clonada bajo el control del promotor ADH1 de S. cerevisiae y secuencias del terminador, subclonando un fragmento Xbal/Hindlll del plásmido pVC1 descrito anteriormente, en el vector pVT102-U (Vernet et al., Gene 52:225-233 (1987)). Por último, el cassette de expresión completo (promotor ADH1- gen D -/-terminador ADH1 ), fue cortado con una digestión con Sphl y ligado con PLDH-Kan, linealizado con Sphl, obteniendo el vector pLAT-ADH (fig. 6).

Aislamiento de la cepa PMI/C1 de K lactis La deleción del gen K1 PDCA en la cepa de levaduras PM6-7A (MAT a, adeT-600, uraA1-1 )(Wesolowski et al., Yeast 1992, 8: 711 ), produjo la cepa PMI. La deleción ha sido llevada a cabo mediante inserción del marcador URA3 de S. cerevisiae. La cepa PMI crece en medios que contienen glucosa; la actividad de PDC no es detectable, y la cepa no produce etanol (Bianchi M.

M., et al. (1996), citado anteriormente). Es importante subrayar que las células de S. cerevisiae sin actividad de PDC detectable alguna, no crecen en medios minerales de glucosa (Flikweert M. T. et al., Yeast, 12: 247-257, 1996). 1x107-3x107 células de un cultivo estacionario de células de levadura PMI, fueron sembradas en medio sintético conteniendo ácido 5-fluoroorótico. El crecimiento de las células de levadura en medios que contienen ácido 5-fluoroorótico, permite la selección de células deterioradas en la síntesis de uracilo (McCusker y Davis, Yeast 7: 607-608 (1991 )).

Después de 5 días de incubación a 28°C, se aislaron algunos mutantes ura-.

Uno de estos mutantes obtenido, denominado PMI/C1 , resultó mutado en el gen URA3 introducido previamente mediante transformación integrativa, tal como resultó de una prueba de complementación mediante transformación con un plásmido que contiene el gen URA3 (vector Kep6; Chen et al., J. Basic Microbiol. 28: 211-220 (1988)). El genotipo de PMI/C1 es el siguiente: MATa, adeT-600, uraA1-1 , pdcA:: ura3.

Aislamiento de la cepa CENPK113?PDC1?PDC5?PDC6 CENPK113?PDC2 y GRF18U?PDC2 La estrategia general fue obtener primero mutantes de deleción individuales de cada uno de los genes PDC (PDC1, PDC2, PDC5 y PDC6). ^^^tá g Las deleciones de genes se llevaron a cabo mediante integración de un cassette loxP-KanSRD-loxP mediante recombinación homologa en el locus del gen PDC correspondiente, usando el método de PCR de homología de flanqueo corta (SFH) descrito por Wach et al. (1994; Yeast 10, 1793-1808) y 5 Güidener et al. (1996; Nucleic Acids Res. 24, 2519-2524). Subsecuentemente, el cassette de deleción fue removido expresando la cre-recombinasa, que va al frente detrás de una sola copia del sitio loxP en el locus de deleción. El mutante de deleción triple pdd pdcd pdcß fue creado cruzando subsecuentemente las cepas de deleción haploides individuales. 10 La reacción de PCR se llevó a cabo en un molde de ADN que contenía el gen para resistencia a kanamicina (marco de lectura abierto del transposón Tn903 de E coli) fusionado a secuencias de control (promotor/terminador) de un cierto gen de Schwanniomyces occidentalis (información confidencial). Este cassette de selección es flanqueado en ambos extremos por una secuencia loxP (loxP-KanSRD-loxP), y fue desarrollado mediante SRD (Scientific Research and Development GmbH). El iniciador usado para amplificar el cassette loxP-KanSRD-loxP es designado, de modo que la secuencia de ADN del iniciador sentido es homologa al extremo 5' de la secuencia del cassette de selección, y de modo que el iniciador presenta además en su extremo 5' una región de 40 nucleótidos, que corresponde a la secuencia 5' terminal de cierto gen PDC de Saccharomyces cerevisiae. El iniciador antisentido es construido en forma análoga, y es complementario al extremo 3' del cassette de selección, en donde este ^^^tó&¿gg^g ^^jgtógta»^^?^asgstó^g ^g^ iniciador contiene en su extremo 5' una región de también preferiblemente 40 nucleótidos, que corresponde a la secuencia 31 terminal de cierto gen PDC de Saccharomyces cerevisiae. El siguiente cuadro muestra los iniciadores usados para la deleción de genes de los genes PDC correspondientes mediante el método de PCR SFH. Las secuencias subrayadas son homologas al gen PDC correspondiente, y las secuencias complementarias al cassette loxP-KanSRD- loxP, están en negritas.

El cassette de deleción amplificado mediante PCR se usó para la transformación de la cepa CEN.PK122 prototrófica diploide de Saccharomyces cerevisiae desarrollada mediante SRD. ¿«j-asá-i CEN.PK 122 (Mata, alfa, URA3, URA3, HIS3, HIS3, LEU2, LEU2, TRP1 , TRP1 , MAL2-8C, MAL2-8C, SUC2, SUC2). Para la selección de los transformantes, se añadió geneticina (sulfato de G-418, Life Technologies) a una concentración final de 200 mg/l. Después del análisis de las tetradas, las esporas resistentes a G418 fueron analizadas subsecuentemente mediante PCR de diagnóstico para confirmar la deleción correcta del gen PDC correspondiente y para determinar el tipo de apareamiento de la cepa haploide. Para obtener una cepa que perdió los tres genes PDC, a saber, PCD1, PDC5 y PDC6, las cepas de deleción haploides fueron cruzadas subsecuentemente. Para obtener las dos cepas de deleción doble, pdd ::KanSRD pdc6::KanSRD y pdc5::KanSRD pdc6::KanSRD, las cepas haploides correspondientes fueron cruzadas. Después del análisis de las tetradas, las esporas que muestran el tipo doble no parental para el marcador KanSRD, fueron analizadas subsecuentemente mediante PCR de diagnóstico para confirmar la deleción correcta de ambos genes, y para determinar el tipo de apareamiento. Las cepas de delecíón doble resultantes fueron cruzadas para obtener la cepa de deleción triple. Después del análisis de las tetradas, se observaron mediante PCR de diagnóstico esporas las cuales perdieron los tres genes PDC. Para eliminar el marcador KanSRD del gen desorganizado con éxito, las cepas de deleción haploides (mutantes sencillos, dobles y triples) fueron transformadas con el plásmido de cre-recombinasa, pPK-ILV2SMR (desarrollado mediante SRD). El plásmido pPK-ILV2SMR contiene la cre- recombinasa bajo el control del promotor GAL1, y como marcador de selección dominante el gen de resistencia ILV2, el cual permite que las células de levadura transformadas con el plásmido pPK-ILV2SMR crezcan en presencia 5 de sulfometurón metilo (30 mg/l). La separación correcta del marcador KanSRD fue analizada subsecuentemente mediante PCR de diagnóstico con células de levadura intactas. Para remover el plásmido pPK-ILV2SMR, las células de levadura fueron incubadas durante un tiempo apropiado sin sulfometurón metilo en el medio, y se buscaron subsecuentemente células sensibles a sulfometurón metilo. El siguiente cuadro muestra las cepas de levadura resultantes. Los números entre paréntesis indican los nucleótidos eliminados (ATG=1 ) de los genes correspondientes. En el caso de números negativos, el primer número significa los nucleótidos eliminados hacia el extremo 5' de ATG, y el segundo número los nucleótidos eliminados hacia el extremo 3' del codón de detención.

CUADRO Se usaron principalmente las cepas CEN.PK211 y CEN.PK182 que, en los cuadros que resumen los datos obtenidos, se denominan también como CENPK113?PDC2 y CENPK113?PDC1 ?PDC5?PDC6. Usando un procedimiento similar, se obtuvo la cepa GRF18U de S. cerevisiae (Mat alfa, his3, Ieu2, ura3), que posee una deleción en el gen PDC2 (GRF18U?PDC2; Mat alfa, his3, Ieu2, ura3, pdc2: :APT1 ). Se usó el gen APT1 , que confiere resistencia a G418, como marcador de la integración, aislado del plásmido pFA6a-KanMX (Wach et al, citado anteriormente); para la cepa que pose deleciones en los genes PDC1, PDC5 y PDC6, la actividad de PDC es de cero. Para las cepas que poseen una deleción en el gen PDC2, la actividad de PDC es aproximadamente 20 a 40% del nivel determinado en las cepas de tipo silvestre.

Aislamiento de la cepa BM3-12D de K. lactis ÍpLAZIOI Se seleccionó una cepa de eliminación doble, K1pdc1?JK1pda1A, de la población segregante haploide de una cepa diploide obtenida cruzando la cepa MW341 -d/ pdcí? (MATa, lac4-8, Ieu2, lysA1-1, uraA1-1, K1pdc1: :URA3, obtenida como se describió anteriormente en Bianchi et. al, 1996, Mol. Microbiol. 19 (1), 27-36; Destrulle et al, referida) con la cepa CBS2359/K7pdaf? (MATa, URA3-48, K1pda1: :Tn5BLE). La deleción del gen PDA? , que codifica para la subunidad E1-alfa del complejo de piruvato deshidrogenasa (EC.1.2.4.1 ) (la secuencia de ADN ha sido obtenida por Steensma H. Y., Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Clusius Laboratory, Leiden, Los Países Bajos- la secuencia de ADN está también disponible en el número de acceso AF023920 de la base de datos de secuencias del banco de genes provista por el sitio en la red del National Center of Biotechnology -NCBI-: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), en la cepa de levaduras CBS2359, se ha obtenido siguiendo el procedimiento clásico de PCR y la transformación de levaduras descrita a lo largo del texto. Se usó el marcador TndBle (Gatignol et al, Gene, 91 : 35, 1990), que confiere resistencia a fleomicina, como marcador de la integración. La cepa de eliminación doble, denominada BM1-3C (MATa, Ieu2, K1pdc1: :URA3; K1pda1: :Tn5BLE), se seleccionó como una cepa segregante resistente a fleomicina/sensíble a antimicina. El vector pLAZIO fue transferido entonces genéticamente a la cepa de eliminación doble como se indica a continuación. Un transformante pLAZIO de la cepa K1pdc1: :URA3 PMI/8 (MATa, adeT-600, uraA1-1, K1pdc1: :URA3; Bianchi et al., Mol. Microbiol. 19:27-36, 1996), fue cruzado con la cepa MW109-8C (MATa, lysA1-1, trpA1-1). Después de la esporulación de la cepa diploida resultante, se seleccionó una cepa resistente a geneticina/sensible a antimicina, denominada cepa 7C (MATa, adeT-600, lysA1-1, K1pdc1: :URA3, pLAZ10+). La cepa BM1-3C y la cepa 7C fueron cruzadas, y se seleccionaron cepas segregantes haploides resistentes a fleomicina/resistentes a geneticina después de la esporulación de la cepa diploide obtenida. Todos los segregantes haploides fueron sensibles a antimicina. La cepa protótrofa BM3-12D (K1pdc1: : URA3; K1pda1::Tn5BLE, pLAZ10+), fue seleccionada para experimentos adicionales.

Transformación de las levaduras PM6-7A y PMI/C1 de Kluyveromyces con los vectores pEPL2 y pEPL4 Se desarrollaron células PM6-7A y PMI/C1 en medio YPD, hasta una concentración de 0.5x108 células/ml, y se cosecharon, se lavaron una vez en agua, dos veces en sorbitol a 1 M, y se resuspendieron en sorbitol a 1 M a una concentración de 2x109 células/ml. Las células fueron electroporadas (7.5 KV/cm, 25 µF, 200 O: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) en presencia de 5 a 10 microgramos de pEPL2 o pEPL4. La selección de transformantes URA+ se llevó a cabo en medio sólido sintético sin uracilo (0.7 % en p/v de base de nitrógeno para levaduras, 2% en p/v de glucosa, 200 mg/l de adenina y 2% en p/v de agar).

Transformación de la levadura Torulaspora con el vector pLAT- ADH Se desarrollaron células CBS817 en medio YPD, hasta una concentración de 6x107 células/ml, y se cosecharon, se lavaron una vez en agua, dos veces en sorbitol a 1 M, y se resuspendieron en sorbitol a 1 M a una concentración de 2x109 células/ml. Las células fueron electroporadas (1.5 KV, 7.5 KV/cm, 25 µF, 200 O: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) en presencia de 1 µg de pLAT-ADH. Las células fueron cultivadas durante la noche en tubos microbiológicos estériles conteniendo 5 ml de YEPD y sorbitol a 1 M. La selección de los transformantes G418r se llevó a cabo en medio sólido (2% en p/v de glucosa, 2% en p/v de peptona, 1% en p/v de extracto de levadura, 2% en p/v de agar y 200 µg/ml de G418 (Gibco VBRL, cat. 11811 -031 ).

Transformación de la levadura Zvaosaccharomyces con el vector pLAT-ADH Se desarrollaron células ATTC3647 y ATTC60483 en medio YPD, hasta una concentración de 2x108 células/ml, y se cosecharon y se resuspendieron a una concentración de 4x108 células/ml en acetato de litio a 0.1 M, ditiotreitol a 10 mM, tris-HCI a 10 mM, pH 7.5 a temperatura ambiente durante una hora. Las células fueron lavadas una vez en agua, dos veces en sorbitol a 1 M, y se resuspendieron en sorbitol a 1 M a una concentración de 5x109 células/ml. Las células fueron electroporadas (1.5 KV, 7.5 KV/cm, 25 µF, 200 O: GenePulser, Biorad, He?fes, Ca) en presencia de 3 µg de pLAT- ADH. Las células se cultivaron durante la noche en tubos microbiológicos estériles conteniendo 5 ml de YEPD y sorbitol a 1 M. La selección de los transformantes G418r se llevó a cabo en medio sólido (2% en p/v de glucosa, 2% en p/v de peptona, 1 % en p/v de extracto de levadura, 2% en p/v de agar y 200 µg/ml de G418 (Gibco BRL, cat. 11811 -031 ).

Transformación de la levadura Saccharomyces con los vectores 10 pLC5. pLC7. pB1 , pBST2. pBME2. pLAT-ADH, pLC5-kanMX y pJEN1 Las cepas GRF18U (descrita anteriormente), GRF18U?PDC2 (descrita anteriormente), GRF18U[pLC5] (Mat alfa, his3, Ieu2, ura3::TPI-LDH), CENPK113 (Mat a; CBS8340), CENPK-1 (Mat a, ura3), CENPK113?PDC1?PDC5?PDC6 (descrita anteriormente) y CENPK113?PDC2 (descrita anteriormente), fueron cultivadas en medio YPD rico y completo (2% en p/v de extracto de levadura, 1 % en p/v de peptona, 2% en p/v de glucosa) hasta una concentración de 2x107 células/ml, y fueron lavadas una vez en acetato de litio a 0.1 M, EDTA a 1 mM, Tris-HCl a 10 mM, pH 8, a una concentración de 2x109 células/ml. 100 µl de la suspensión de 20 células fueron incubados durante 5 minutos con 5 a 10 µg de vector (es decir, linealizadas previamente en el marcador auxotrófico en el caso de pLC5, pLC7, pB1 , pBST2, pBME2, pLC5-kanMX, pJEN1 ). Después de la adición de 280 µl de PEG 4000, las células fueron incubadas durante por lo menos 45 minutos a 30°C. Se añadieron 43 prt de DMSO, y la suspensión se incubó durante 5 minutos a 42°C. Las células fueron lavadas dos veces con agua, y sembradas en medio selectivo. Para el aislamiento de la cepa CENPK-1 (ura3), las células CENPK113 fueron cultivadas en medios que contenían ácido 5-fluoorótico (véase también anteriormente). Se obtuvieron clones transformados individuales con 0.7% en p/v de base de nitrógeno para levaduras, 2% en p/v de glucosa, 2% en p/v de agar, más los complementos apropiados o G418, según se indicó. Para la selección de los transformantes G418R, las células se obtuvieron también con 2% en p/v de glucosa, 2% en p/v de peptona, 1 % en p/v de extracto de levadura, 2% en p/v de agar y 200 µg/ml de G418 (Gibco BRL, cat. 11811-031.

Cepas transformadas: complementos. GRF18U [pLAT-ADH]: 200 mg/l de uracilo, 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina, 200 mg/l de G418. GRF18U [pB1]: 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina. GRF18U [pLC5]: 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina. GRF18U [pLC5] [pLC7]: 200 mg/l de leucina. GRF18U [pBM2]: 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina. GRF18U [pBST2]: 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina. GRF18U [pLC5]: 200 mg/l de leucina.

GRF18U?PDC2 [pLCJff 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina. CENPK-1 [pLC5]: sin complementos. CENPK113 [pLC5-KanMX]: 200 mg/l de G418 CENPK113?PDC1?PDC5?PDC6 [pLC5-KanMX]: 200 mg/l de G418. CENPK113?PDC2 [pLC5-KanMX]: 200 mg/l de G418.

Lista de los vectores de expresión usados: Nombre: Fuente de LDH Promotor Hospedero, marcador selectivo pEPL2 Bovino KLPDCA K. lactis, URA3 (fig. 4) pEPL4 L. casei KLPDCA K. lactis, URA3 pLAZIO Bovino KLPDCA K. lactis, APT1 pLC5 L casei SCTPI S. cerevisiae, URA3 (fig. 5) pLC5-kanMx L. casei SCTPI S. cerevisiae, APT1 pBME2 B. megaterium SCTPI S. cerevisiae, URA3 pBST2 B. stearothermophylus SCTPI S. cerevisiae, URA3 pB1 Bovino SCTPI S. cerevisiae, URA3 pLC7 L. casei SCTPI S. cerevisiae, HIS3 pJEN1 SCTPI S. cerevisiae, HIS3 pLAT-ADH Bovino SCADH1 S. cerevisiae, APT1-URA3 (fig. 6) T. delbrueckii, APT1-URA3; Z. bailii, APT^-?RA3 KL= promotor de K. lactis SC= promotor de S. cerevisiae Se ha usado a pJEN1 para la sobreexpresión del gen JEN1.

Pruebas por lotes Análisis de lotes de células transformadas de las cepas PM6-7A ÍPEPL21, PMI/C1 ÍPEPL21. PM6-7A ÍpEPL41 y PMI/C1 [pEPL41 de Kluyveromyces Los clones obtenidos mediante el procedimiento de transformación descrito anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras - aa (Difco, Detroit, Ml), 200 mg/l de adenina, 50 g/l de glucosa). Los medios usados fueron regulados o no en su pH con regulador de pH de fosfato a 200 mM hasta un pH de 5.6. Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada en puntos de tiempo regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos) (figuras 7 y 8 y cuadro 3).

Análisis de lotes de células transformadas de la cepa BM3-12D ÍpLAZI 01 de Kluyveromyces Los clones obtenidos mediante el procedimiento descrito anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras - aa (Difco, Detroit, Ml), 50 g/l de glucosa, 20 g/l de etanol, 200 mg/l de G418). Los medios usados fueron regulados en su pH con regulador de pH de fosfato a 200 mM hasta un pH de 5.6. Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada a intervalos de tiempo regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res.

Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos). Al principio, las células usaron etanol, y transformaron entonces la glucosa en ácido láctico con rendimiento muy alto (>0.75; g de ácido láctico/g de glucosa consumida) (cuadro 3).

Análisis de lotes de célµlas transformadas de la cepa CBS817 [pLAT-ADHI de Torulaspora Los clones obtenidos mediante el procedimiento de transformación descrito anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras - aa (Difco, Detroit, Ml), 200 mg/l de G418, 20 g/l de glucosa). Los medios usados no fueron regulados en su pH. Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada a intervalos regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos) (figura 10 y cuadro 3).

Análisis de lotes de células transformadas de las cepas ATCC36947 ÍpLAT-ADHl v ATCC60483 ÍPLAT-ADHI de Zvaosaccharomvces Los clones obtenidos mediante el procedimiento de transformación descrito anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras - aa (Di|po, Detroit, Ml), 200 mg/l de G418, 50 g/l de glucosa). Los medios usados no fueron regulados en su pH. Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada a intervalos regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos) (figura 11 y cuadro 3).

Análisis de lotes de células transformadas de las cepas GRF18U fpLAT-ADHI. GRF18U [pB1l. GRF18U fpLC51. GRF18U [pLC51 [pLC71. GRF18U ÍPBM21. GRF18U ,pBST21 y CENPK-1 ,pLC51 de Saccharomvces Los clones obtenidos mediante el procedimiento de transformación descrito anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras - aa (Difco, Detroit, Ml), 50 g/l de glucosa y complementos apropiados (véase anteriormente)). Los medios usados no fueron regulados en su pH.

Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada a intervalos regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos) (cuadro 3).

Análisis de lotes mediante matraz giratorio de células transformadas de las cepas GRF18U?PDC2 ÍpLC51. CENPK113 ÍPIC5-kanMXl. CEN-PK113?PDC2 fp!C5-kanMX1 y CENPK113?PDC1 ? PDC5?PDC6 fplC5-kanMX1 de Saccharomvces Los clones obtenidos mediante los procedimientos descritos anteriormente, fueron puestos a prueba en cultivo por lotes durante su crecimiento en medio rico (1.0% en p/v de extracto de levadura, 2% en p/v de peptona, 100 gramos por litro de glucosa). Los medios no fueron regulados en su pH. Las células fueron preinoculadas en medios de extracto de levadura - peptona + etanol (5g/l). Se inocularon 100 ml en matraces giratorios (volumen de trabajo de 1.5 litros; pH inicial = 5.7). Los matraces giratorios fueron incubados a 30°C con agitación de 55 rpm. La fermentación fue monitoreada a intervalos regulares (cuadros A, B y C y cuadro 3). La actividad específica de LDH de las diferentes cepas transformadas, fue mayor de 5 U/mg del contenido total de proteínas de las células.

Dosificación para la actividad de LDH LDH de bovino. Aproximadamente 108 células fueron cosechadas, lavadas en regulador de pH de fosfato a 50 mM, pH 7.5, y resuspendidas en el mismo regulador de pH. Las células fueron usadas con 5 ciclos de acción de remolino vigorosa en presencia de microesferas de vidrio (diámetro de 400 µm, SIGMA, G-8772) a 4°C. Los restos celulares fueron removidos mediante centrifugación (Eppendorf, Hamburg, D 5415 C, 13600 RCF, 10 min), y la concentración de los extractos de proteína se determinó mediante microensayo, Biorad, Hercules, Ca (cat. 500-0006). Se pusieron a prueba aproximadamente 0.2 mg de extracto para determinar la actividad de LDH usando el equipo DG1340-UV, SIGMA (St. Louis, MO), de conformidad con las instrucciones del fabricante. LDH de bacterias. Aproximadamente 108 células fueron cosechadas, lavadas en regulador de pH de fosfato a 50 mM, pH 7.5, y resuspendidas en el mismo regulador de pH. Las células fueron usadas con 5 ciclos de acción de remolino vigorosa en presencia de microesferas de vidrio (diámetro de 400 µm, SIGMA, G-8772) a 4°C. Los restos celulares fueron removidos mediante centrifugación (Eppendorf, Hamburg, D 5415 C, 13600 RCF, 10 min), y la concentración de los extractos de proteína se determinó mediante microensayo, Biorad, Hercules, Ca (cat. 500-0006). Se puso a prueba el extracto de células para determinar la actividad de LDH usando: 0.01 mi de NADH a 12.8 mM 0.1 ml de fructosa-1 ,6-difosfato a 2 mM 0.74 ml de regulador de pH de acetato a 50 mM (pH = 5.6) 0.05 ml de extracto de células apropiadamente diluido, y 0.1 ml de piruvato de sodio a 100 mM. La actividad de LDH se puso a prueba como micromoles de NADH oxidasa por minuto, por miligramo de extracto total de células a 340 nm, a 25°C.

Dosificación de metabolitos en el medio de crecimiento Se analizaron muestras del medio de crecimiento, obtenidas después de remover las células mediante centrifugación, para detectar la presencia de glucosa, etanol y ácido L (+) y D (-) láctico, usando equipos de Boehringer Mannheim, Mannheim DE, (#. 716251 , 176290 y 1112821 , respectivamente), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de lotes experimentales correlacionadas con las levaduras transformadas de las cepas PM6-7A [pEPL2] y PMI/C1 [pEPL2] de Kluyveromyces, se muestran en las figuras 7A y 7B y en las figuras 8A y 8B.

Los datos experimentales relacionados con las levaduras transformadas de la cepa CBS817 [pLAT-ADH] de Torulaspora, se muestran en la figura 10. Los datos experimentales relacionados con las levaduras transformadas de la cepa ATCC60483 [pLAT-ADH] de Zygosaccharomyces, se muestran en la figura 11. Los datos experimentales relacionados con las levaduras transformadas de las cepas CENPK113 [pLC5-kanMX] CENPK113 ?PDC2 [pLC5-kanMX] y CENPK113?PDC1?PDC5?PDC6 [pLC5-kanMX] de Saccharomyces que crecen en matraces giratorios, se muestran en los cuadros A, B y C.

CUADRO A Repaso del cultivo con S. Cerevisiae (CENPK113 fpLC5-KanMXl) Tiempo [h] pH OD '660 glucosa [g.1"1] 1 Etanol [g.1"1] 1 lactato [g.1" 0.0 5.76 0.31 88.4 ± 0.3 0.2 0 19.0 3.01 8.7 ± 0.2 6.5 ± 0.1 25 27.4 ± 0.2 .0 3.05 10.41 ± 0.01 0.4 ± 0.2 27 30.1 ± 0.4 45.25 3.07 13.2 ± 0.2 0.06 ± 0.03 27 31.1 ± 0.2 70.75 3.08 10.6 ± 0.3 0 26 30.7 ± 0.1 92.0 3.08 12.2 ± 0.8 0 26 29.5 ± 0.1 CUADRO B Repaso del cultivo con S. cerevisiae (CENPK113 ?pdC5-KanMXl) Tiempo [h] | pH | OD660 I Glucosa [g.1"1] l etanol [g.1"1] | lactato [g.1"1] 0.0 5.75 0.32 87 ± 0.4 0.2 0 19.0 3.20 2.2 ±0.2 47.8 ±0.1 8 17.3 ±0.1 25.0 3.07 4.45 ±0.1 36.3 ±0.1 11 25.4 ±0.1 45.25 2.96 5.31 ±0.02 24.0 ±0.1 15 38.0 ±0.1 70.75 2.98 4.8 ±0.1 12.9 ±0.1 19 42.4 ± 0.4 92.0 2.95 5.3 ±0.1 8.47 ±0.01 24 43.1 ±0.1 CUADRO C 10 Repaso del cultivo con S. cerevisiae (CENPK113 ?pdd ?pdc5 ?pdcß ÍpLC5-KanMX1) 0.0 5.74 0.82 ±0.01 92 ±1 0.171 ±0.005 10.0 5.16 1.185 ±0.02 93 ±1 0.715 ±0.0 23.5 4.61 1.28 ±0.03 94 ±2 1.76 ±0.1 49.25 4.05 1.36 ±0.03 92.8 ±0.8 3.614 ±0.005 73.0 3.79 15 1.27 ±0.03 89.0 ±0.7 5.17 ±0.01 106.0 3.60 1.25 ±0.02 80 ±2 6.84 ±0.06 122.5 3.57 81.24 ±0.06 1.23 ±0.05 0 7.596 ± 0.006 167.0 3.43 75 ±1 1.17±0.08 8.5 ±0.2 Todos los resultados obtenidos de las levaduras Kluyveromyces, Torulaspora, Zygosaccharomyces y Saccharomyces transformadas, se resumen y comparan en el cuadro 3. El rendimiento es la cantidad de ácido láctico producido (g/l) dividida entre la cantidad de glucosa consumida (g/l). El porcentaje de ácido láctico libre se obtiene de la ecuación de Henderson- Hasselbalch: pH = pKa + log[(% de lactato)/(% de ácido láctico libre)], en donde el pKa para el ácido láctico es de 3.86. La comparación de los datos reportados en el cuadro 3A contra el cuadro 3B, demuestra claramente que en diferentes géneros de levaduras, la producción de ácido láctico con rendimiento mayor sobre la glucosa se puede obtener cambiando la relación relativa - a nivel celular - de las actividades de LDH y PDC. Dicho objetivo se puede lograr siguiendo por lo menos dos procedimientos diferentes: (1 ) reduciendo la actividad de PDC (compárense los datos de hospederos de K. lactis transformados: PM6-7A contra PMI/CI; compárense los datos de hospederos de S. cerevisiae transformados: GRF18U contra GRF18?PDC2 y CENPK113 contra CENPK113?PDC2 y CENPK113?PDC1 ?PDC5?PDC6). (2) incrementando el número de copias del gen LDH, y por lo tanto la actividad de LDH (compárense los datos de hospederos de S. cerevisiae: GRF18U[pLC5] contra GRF18U[pLC5] [pLC7]; la actividad heteróloga de LDH en las dos cepas es de 5-6 y 7-8 U/mg del contenido total de proteínas de la célula, respectivamente). Además, se pueden obtener rendimientos mayores manipulando la composición del medio de crecimiento. También en este caso, se observó una producción reducida de etanol (véase también cuadro 4).

CUADRO 3A Pruebas por lotes: producción de ácido láctico de las levaduras Kluyveromyces lactis, Torulaspora delbrueckii, Zyposaccharomyces bailii y Saccharomyces cerevisiae transformadas que poseen un gen LDH heterólogo Regulador de pH de % de ácido láctico Acido láctico (g/l) Rendimiento (g/g) pH final fosfato libre Kluyveromyces PM6-7A (control 0.0 0.000 2.5 00 negativo) PM6-7A[pEPL2] (Fig. 1.2 0.024 2.0 99 7) PM6-7A[pEPL2] (Fig. 4.3 0.087 3.0 88 7) PM6-7A[pEPL4] 1.1 0.022 2.1 99 PM6-7A[pEPL4] 4 5 0.090 3.0 88 Torulaspora CBS817(control 0.0 0.000 2.9 negativo) 00 CBS817[pLAT-ADH] 1.0 0.058 2.8 (Fig. 10) 92 Zygosaccharomyces ATCC60483 (control 0 0 0.000 2.5 negativo) 00 ATCC60483[pLAT- 1 2 ADH] (Fig. 11) 0 029 2.4 96 ATCC36947(control 0 0 0.000 2.5 negativo) 00 ATCC36947[pLAT- 0.9 ADH] 0.018 2.4 95 Regulador de pH de . , ,. , % de ácido láctico Acido láctico (g/l) Rendimiento (g/g) PH final |¡bre fosfato Saccharomyces GRF18U(control - 0.0 0.000 3.1 00 negativo) GRF18U[pLAT-ADH] - 2.1 0.040 3.0 88 GRF18U[pLC5] - 8.297 0.165 3.0 88 GRF18U[pBME2] - 5.927 0.118 3.0 88 GRF18U[pBST2] - 0.320 0.06 3.1 87 GRF18U[pB1] . 1.5 0.020 3.0 88 CENPK-1[pLC5] - 1.8 0.030 3.0 88 **CENPK113[pLC5- 29.5 0.338 3.0 88 KanMX] (Ti CUADRO 3B 1 1 cultivando las células en un medio sintético (D. Porro et al., Development of a pH controlled fed-batch system for budding yeast. Res. in Microbiol., 142, 353- 539, 1991 ). En el medio sintético usado, la fuente de sales de Mg y Zn son MgSO (5 mM) y ZnS04 x 7H20 (0.02 mM), respectivamente. La producción se puso a prueba en cultivo por lotes aeróbico (concentración de glucosa de 50 g/l) como se describió anteriormente para las otras células transformadas de Saccharomyces. Se ha encontrado que el agotamiento de MgSO4 y ZnSO4 x 7H2O dio rendimiento mayor y productividades mayores de ácido láctico. De hecho, estos minerales podrían ser requeridos como cofactor para las actividades enzimáticas que conducen a la producción de etanol. Los datos se muestran en el cuadro 4.

CUADRO 4 Producción de ácido L(+) L láctico por células transformadas de la cepa GRF18 fpLC51 |pLC71 de Saccharomyces durante su crecimiento intermitente en medios minerales manipulados Control -Mg -Zn Producción de ácido láctico, g/l 9.23 13.74 13.74 Rendimiento, g/g 0.20 0.29 0.29 Productividad, g/l, h 0.38 0.42 0.61 Relación de etanol/ácido láctico, mM/mM 2.78 2.1 1 1.99 x-sa?t&mß Leyenda: Control: medio sintético completo (Res. ¡n Microbiol., 142, 535-539, 1991 ; cita incluida en la presente como referencia). -Mg: idéntico al control, pero sin MgSO4 -Zn: idéntico al control, pero sin ZnSO4 x 7H2O. Para todas las pruebas, el valor final del pH fue menor de 3.0 y, por lo tanto, el % de ácido láctico libre fue mayor de 88%.

Producción de ácido láctico por células de levadura que sobreexpresan el gen JEN1 Se han obtenido mejores producciones de ácido láctico y menores producciones de etanol mediante la sobreexpresión del gen JEN1 que codifica para el transportador de lactato. Se han cultivado las cepas GRF18U[pLC5] (es decir, control negativo) y GRF18U[pLC5] [pJEN1] en medios que contienen 2% de glucosa, 0.67% en p/v de YNB y complementos (es decir, 100 mg/l de leucina -hístidina y 100 mg/l de leucina, respectivamente). Las células fueron preinoculadas en el mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente fueron inoculadas en matraces (volumen de 300 ml) conteniendo 100 ml de medio fresco. Los matraces fueron incubados a 30°C en un baño con agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación fue monitoreada a intervalos regulares. La concentración del número de células se determinó con un contador electrónico Coulter (contador ZBI de Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991 ) 142, 535-539), después de tratar las muestras con sonido para evitar agregados celulares (aparato de tratamiento con sonido Fisher 300, punto medio, potencia 35%, 10 segundos).

CUADRO 5 Comparación de las producciones de lactato y etanol durante cultivos por lotes Cepa Lactato, g/l Etanol, g/l GRF18U[pLC5] 3.33 4.39 GRF18U[pLC5] [pJEN1] 6.06 4.23 Producción continua de ácido láctico Se han obtenido producciones continuas y estables de ácido láctico durante más de dos semanas por medio de cultivos clásicos en quimiostato (el flujo continuo de medio fresco hacia el biorreactor sustentó una velocidad de crecimiento específica variando entre 0.01 y 0.3 hr-1 ) usando las cepas PM6-7A[pEPL2] y PMI/CI[pEPL2] transformadas de K. lactis y la cepa FRF18U[pLC5][pLC7] transformada de S. cerevisiae.

Pruebas de alimentación por lotes Producción de ácido láctico por la cepa PMI/C1 fpEPL2] en un fermentador de tanque agitado La producción de ácido láctico por la cepa PMI/C1[pEPL2] se puso a prueba además mediante cultivo en un fermentador de tanque agitado de 14 litros que contenía 8 litros de medio nutritivo (30 g de sólidos secos/l de agua clara para infusión de maíz, A. E. Staley Manufacturing Co., Decatur, IL; g/l de extracto de levadura Difco, Difco, Detroit, Ml; 200 mg/l de adenina y 50 g/l de glucosa). El fermentador se mantuvo a 30°C, se agitó a 400 rpm y se ventiló a 2 litros/minuto. Se añadió antiespumas (antiespumas 1520, Dow Corning Corp., Midland, Ml) según fuera necesario para controlar la espumación. Se alimentó glucosa según fuera necesario para mantener una concentración residual en el medio de fermentación de aproximadamente 25- 50 g/l. Cuando se mantuvo bajo control, el pH se mantuvo mediante la adición automática de hidróxido de amonio a 14.8 M en agua. La producción de ácido láctico a pH ácido se puso a prueba de la manera siguiente: (1 ) El pH de fermentación se mantuvo bajo control a 4.5 a lo largo de la fermentación. (2) El pH de fermentación inicial se mantuvo bajo control a 4.0 hasta que se añadieron 80 ml de hidróxido de amonio a 14.8 M. Entonces, el control del pH se descontinuó. (3) El pH de fermentación inicial fue de 5.0 y no se añadió agente de neutralización durante la fermentación. Los resultados se muestran en el cuadro 6. El tiempo transcurrido se midió desde el tiempo de la inoculación. Las muestras de la fermentación, obtenidas después de remover las células mediante filtración, se analizaron para detectar la presencia de glucosa y ácido L(+) láctico usando un analizador Select Biochemistry YSI Modelo 2700 (Yellow Springs Instrument Co., Inc., Yellow Springs, OH). No se detectó etanol, medido mediante cromatografía de gases, en ninguna de las fermentaciones. El rendimiento y el por ciento de ácido láctico libre se calcularon como se describió anteriormente. Se prepararon inóculos para las fermentaciones precultivando la cepa PMI/C1 [pEPL2] en 50 ml de medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras -aa (Difco, Detroit, Ml), 200 mg/l de adenina, 5 g/l de sulfato de amonio, 50 g/l de glucosa) en matreces Erlenmeyer de 250 ml con deflector durante 30 horas a 30°C y 300 rpm en un agitador con incubador (modelo G-24, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ). Se obtuvieron resultados similares usando el gen LDH bacteriano (plásmido pEPL4; datos no mostrados).

CUADRO 6 Producción de ácido láctico por células de la cepa PMI/CHpEPL21 de Kluvveromvces en un fermentador Tiempo NH4OH Rendimiento de DH final % de ácido transcurrido (h) añadido (M) ácido láctico láctico libre (g/i) (g/g) Caso 1 137 1.31 109 0.59 4.5 19 Caso 2 97 0.14 35 0.44 3.0 88 Caso 3 72 0 29 0.35 2.8 92 Producción de ácido láctico por la cepa BM3-12DfpLAZ10] en un fermentador de tanque agitado La producción de ácido láctico por la cepa BM3-12D[pLAZ10] se puso a prueba además mediante cultivo en un fermentador de tanque agitado de 1 litro que contenía 0.8 litros de medio nutritivo (6.7 g/YNB/base de nitrógeno para levaduras-Difco, Detroit, Ml, 45 g/l de glucosa, 2% en v/v de etanol, 200 mg/l de G418). El fermentador se mantuvo a 30°C, se agitó a 400 rpm y se ventiló a 0.8 litros/minuto. Se añadió antiespumas (antiespumas 1520, Dow Corning Corp., Midland, Ml) según fuera necesario, para controlar la espumación. Las células transformadas usaron primero etanol para la producción de biomasa (primeras 50 horas de crecimiento) y transformaron entonces la glucosa a ácido L (+) láctico. El pH se mantuvo a 4.5 mediante la adición automática de KOH a 2 M. Se alimentó glucosa según fuera necesario para mantener una concentración residual en el medio de fermentación de aproximadamente 35 a 45 g/l. Los resultados se muestran en la figura 9 y en el cuadro 7 (caso 1 ). El tiempo transcurrido se midió desde el tiempo de la inoculación. Las muestras de la fermentación, obtenidas después de remover las células mediante filtración, se analizaron para detectar la presencia de glucosa, etanol y ácido L (+) láctico usando un análisis enzimático estándar como se describe en Porro et al. 1995, citado anteriormente. Después de T = 50 horas, no se detectó etanol en ninguna de las muestras de prueba. El rendimiento y el por ciento de ácido láctico libre se calcularon como se describió anteriormente.

Se prepararon inóculos para las fermentaciones precultivando la cepa BM3-12D[pLAZ10] en 50 ml de medio sintético mínimo (1.3% en p/v de base de nitrógeno para levaduras -aa (Difco, Detroit, Ml), 2% en v/v de etanol, 200 mg/l de G418) en matraces Erlenmeyer de 250 ml con deflector durante 40 horas a 30°C y 300 rpm en un agitador con incubador (modelo G-24, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ). En un experimento diferente (cuadro 7, caso 2), el pH de fermentación inicial fue de 5.4, y no se añadió agente de neutralización durante la fermentación. 10 CUADRO 7 Producción de ácido láctico por células de la cepa BM3-12DÍpLAZ101 de Kluyveromyces en un fermentador Tiempo Producción de pH final % de ácido 15 transcurrido (h) ácido láctico láctico libre (g/i) (g/g) Caso 1 474 60.3 0.854 4.5 19 Caso 2 498 32.3 0.881 3.6 65 ^^ ^^^^^^^H^^^^^^^^^^ ^^^

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una cepa de levadura que carece de la capacidad para producir etanol o que tiene capacidad reducida para producir etanol con respecto a levaduras de tipo silvestre de la misma cepa, y transformada con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica, enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en levaduras, con la condición de que dicho gen que codifica para deshidrogenasa láctica no esté ligado funcionalmente a secuencias de promotor formadas de UASgal/TATAcycl- y la secuencia larga (0.15 Kpb) hacia el extremo 5' del primer codón ATG del ADNc (LDH-A) del gen de bovino.

2.- Una cepa de Saccharomyces cerevisiae transformada con por menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica, enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en levaduras, caracterizada porque dichas cepas de levadura carecen de la capacidad para producir etanol o tienen capacidad reducida para producir el mismo respecto a las levaduras de tipo silvestre de la misma cepa, que ha sido transformada en forma similar con deshidrogenasa láctica, y en donde dicha cepa de levadura tiene la capacidad para producir ácido láctico a un rendimiento igual a, o mayor que, 0.347 g de ácido láctico por g de glucosa.

3.- Una cepa de levadura no convencional transformada con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica, enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en levaduras, caracterizada porque dicha cepa de levadura carece de la capacidad para producir etanol o tiene capacidad reducida para producir el mismo respecto a las levaduras de tipo silvestre de la misma cepa, que ha sido transformada en forma similar con deshidrogenasa láctica.

4.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque tiene una actividad para producir etanol que es menor de aproximadamente 60% comparativamente con las levaduras de tipo silvestre de la misma cepa.

5.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque tiene actividades reducidas de piruvato descarboxilasa y/o piruvato deshidrogenasa, y por lo menos una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína deshídrogenasa láctica.

6.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque tiene actividad reducida de piruvato deshidrogenasa.

7.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque tiene actividad reducida de piruvato descarboxilasa.

8.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque tiene actividad reducida de piruvato deshidrogenasa y actividad reducida de piruvato descarboxilasa.

9.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque el gen o los genes que codifican para piruvato descarboxilasa, para piruvato deshidrogenasa, o ambas, han sido interrumpidos mediante deleción o inserción por medio de marcadores seleccionables.

10.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el marcador seleccionable es un marcador URA3.

11.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el marcador seleccionable es el marcador URA3 de Saccharomyces cerevisiae.

12.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el marcador seleccionable es un marcador dominante que codifica para resistencia a compuestos tóxicos.

13.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque se selecciona de las especies de Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces.

14.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

15.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es una cepa de Kluyveromyces lactis.

16.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es una cepa de Torulaspora delbrueckii.

17.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es una cepa de Zygosaccharomyces bailii.

18.- Una cepa de levadura seleccionada de las especies de Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces transformadas con por lo menos una copia de un gen que codifica para deshidrogenasa láctica, enlazada funcionalmente a secuencias de promotor que permiten la expresión de dicho gen en dichas levaduras.

19.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada además porque es transformada con un gen que codifica para la deshidrogenasa láctica de bovino.

20.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada además porque es transformada con un gen que codifica para una deshidrogenasa láctica bacteriana.

21.- La cepa de levadura de conformidad con las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada además porque el gen que codifica para deshidrogenasa láctica está integrado en el genoma de la levadura.

22.- La cepa de levadura de conformidad con las 5 reivindicaciones 1 a 21 , caracterizada además porque ha sido transformada por un vector de expresión que comprende una secuencia de promotor y una secuencia de ADN que codifica para deshidrogenasa láctica bajo la regulación de dicha secuencia de promotor.

23.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 10 22, caracterizada además porque la secuencia de promotor es un promotor del gen para piruvato descarboxilasa.

24.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la secuencia de promotor es un promotor del gen para piruvato descarboxilasa de Kluyveromyces. 15

25.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque sobreexpresa un transportador de lactato.

26.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el transportador de lactato es JEN1. 20

27.- Un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica para una deshidrogenasa láctica, enlazada funcionalmente a un promotor del gen para piruvato descarboxilasa. fifffWp ífifMi ^^^^^^^^m?

28.- El vector de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la secuencia de promotor es un promotor del gen para piruvato descarboxilasa de Kluyveromyces.

29.- El vector de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la secuencia de promotor es un promotor del gen para piruvato descarboxilasa de Kluyveromyces lactis.

30.- Un procedimiento para la preparación de ácido láctico, caracterizado porque comprende el crecimiento de una cepa de levadura recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 a 26, en un medio de fermentación que contiene una fuente de carbono, y la recuperación de ácido láctico de dicho medio de fermentación.

31.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la fuente de carbono se selecciona de una o más de glucosa, fructosa, galactosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, maltosa, celobiosa, arabinosa y xilosa.

32.- El procedimiento para la preparación de ácido láctico de conformidad con las reivindicaciones 30 ó 31 , caracterizado además porque el medio de fermentación contiene menos de 5 mM de Mg++ y/o menos de 0.02 mM de Zn++.

33.- El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado además porque el medio de fermentación tiene un pH de 7 o menos.

34.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el pH es de 4.5 o menos.

35.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el pH es de 3 o menos.

36.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 30, para la preparación de ácido D- o L- láctico, o una mezcla de los mismos. "*fc"»- - - •-*-,~-J atf i?