DE10145585A1 - Für die Gene hemD und hemB kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Für die Gene hemD und hemB kodierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält, DOLLAR A c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3, DOLLAR A e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und DOLLAR A f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e), DOLLAR A und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das hemD-Gen und/oder das hemB-Gen verstärkt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für die Gene hemD und/oder
hemB kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen
Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen
das endogene hemD-Gen und/oder das endogene hemB-Gen
verstärkt wird.
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel
Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die
Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die
Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von
L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die
Aminosäure-Produktion untersucht.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren bereitzustellen.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-
Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-
Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-
Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind
damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B.
Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung sind isolierte Polynukleotide aus
coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das
hemD-Gen und/oder das hemB-Gen kodierende
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d),
wobei die Polypeptide bevorzugt die Aktivität der
Uroporphyrinogen-III-Synthase und/oder der Delta-
Aminolaevulinsäure-Dehydratase aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die oben genannten
Polynukleotide, wobei es sich bevorzugt um replizierbare
DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb der Degeneriertheit des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht verändern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind schließlich
Polynukleotide ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1 und 243,
- b) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 244 und 2322,
- c) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 2323 und 2858,
- d) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 2859 und 3875,
- e) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 3876 und 4070.
Weitere Gegenstände sind
replizierbare Polynukleotide, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
Polynukleotide, die für Polypeptide kodieren, die die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 beziehungsweise SEQ ID No. 3 dargestellt, enthalten;
ein Vektor, enthaltend eines oder beide der erfindungsgemäßen Polynukleotide, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das endogene hemD-Gen und/oder das endogene hemB- Gen verstärkt ist/sind.
replizierbare Polynukleotide, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
Polynukleotide, die für Polypeptide kodieren, die die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 beziehungsweise SEQ ID No. 3 dargestellt, enthalten;
ein Vektor, enthaltend eines oder beide der erfindungsgemäßen Polynukleotide, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das endogene hemD-Gen und/oder das endogene hemB- Gen verstärkt ist/sind.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums,
die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit
einer Sonde, die die Sequenz der erfindungsgemäßen
Polynukleotide gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA
und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für die Uroporphyrinogen-III-Synthase und/oder die Delta-
Aminolaevulinsäure-Dehydratase kodieren, oder um solche
Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der
des hemD-Gens und/oder des hemB-Gens aufweisen. Sie können
ebenso als Sonde auf sogenannte "arrays", "micro arrays"
oder "DNA chips" aufgebracht werden, um die entsprechenden
Polynukleotide oder hiervon abgeleitete Sequenzen wie z. B.
RNA oder cDNA zu detektieren und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren
Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen
hergestellt werden kann, die für die Uroporphyrinogen-III-
Synthase und/oder die Delta-Aminolaevulinsäure-Dehydratase
kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide,
enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt
mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24 ganz besonders bevorzugt
mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch
Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150,
200, 250 oder 300 aufeinanderfolgenden Nukleotiden
geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein
Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu
wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis
85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz
besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder
99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1
oder einem daraus hergestellten Fragment.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen die Polypeptide
gemäß SEQ ID No. 2, und SEQ ID No. 3, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität der Uroporphyrinogen-III-
Synthase und der Delta-Aminolaevulinsäure-Dehydratase und
auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt
zu wenigstens 81% bis 85% und besonders zu wenigstens 86%
bis 90% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%,
93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit den Polypeptiden
gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 und die genannten
Aktivitäten aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-
Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-
Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-
Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-
Arginin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die
insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen
die für das hemD-Gen und/oder das hemB-Gen kodierenden
Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken
Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein
entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere
Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des
entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens
10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%,
maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-
Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose,
Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann
sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der
Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung
Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre
Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind
besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.
Die neuen, für die Enzyme Uroporphyrinogen-III-Synthase (EC
4.2.1.75) und der Delta-Aminolaevulinsäure-Dehydratase (EC
4.2.1.24) kodierenden Gene hemD und hemB von C. glutamicum
wurden isoliert.
Zur Isolierung des hemD-Gens, des hemB-Gens oder auch
anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank
dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli)
angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein
bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben.
Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und
Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag
Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von
Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes
W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in
λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and
General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine
Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des
Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E.
coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids
Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences,
25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene,
19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der
Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)
beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten
langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in
gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren
subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es
z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467,
1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder
dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical
Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Die neuen, für die Gene hemD und hemB kodierenden DNA-
Sequenzen von C. glutamicum wurden gefunden, die als SEQ ID
No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind.
Weiterhin wurde aus den vorliegenden DNA-Sequenzen mit den
oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der
entsprechenden Proteine abgeleitet. In SEQ ID No. 2 und SEQ
ID No. 3 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen der
hemD- und hemB-Genprodukte dargestellt. Es ist bekannt, daß
wirtseigende Enzyme die N-terminale Aminosäure Methionin
bzw. Formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten
können.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Derartige Mutationen
werden unter anderem auch als neutrale Substitutionen
bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N-
und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht
wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-
Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)),
bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth
et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et
al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus
SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 ergeben, sind ebenfalls
Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 ×
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C - 68°C
eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System Users
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingestellt wird. Es ist
gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 ×
SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1°C - 2°C
von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert
werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens
80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99%
Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es
ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren,
die eine vollständige Identität zur Sequenz der
eingesetzten Sande besitzen. Weitere Anleitungen zur
Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt
erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.
1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Überexpression des hemD-Gens und/oder des hemB-Gens in
verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der
entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im
Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu
steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer
der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des
Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die
Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit
unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom
integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin
eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht
werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der EP 0 472 869, in
US 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9,
84-87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental
Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al.
(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)),
in JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Verstärkung wurden die erfindungsgemäßen Gene hemD und
hemB beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden
überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in
coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche
bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al.,
Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1
(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere
Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4
(US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1
(US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise
verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe
derer man das Verfahren der Genamplifikation durch
Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es
beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons
beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt
(typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum
replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise
pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73
(1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA),
pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry
269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma
Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf
et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder
pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der
Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-
Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei
Kopien des betreffenden Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben dem hemD-Gen und/oder dem hemB-Gen
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und
gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken,
insbesondere überzuexprimieren.
So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich
zur Verstärkung des hemD-Gen und/oder des hemB-Gens eines
oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A- 198 31 609),
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
- - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),
- - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)) oder das für eine "feed back resistente" Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),
- - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979)
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des hemD-Gens
und/oder des hemB-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1; DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478; DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 1995 1975.7; DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im
allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%
oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-
Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Überexpression des hemD-Gens
und/oder des hemB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch
von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B.
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische
Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen
phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das
Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie
z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben
genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des
gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so
wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit
anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie
kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren.
Folgender Mikroorganismus wurde als Reinkultur am 18. Juli
2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli DH5alphamcr/pEC-XK99EhemBa2ex (= DH5αmcr/pEC-XK99EhemBa2ex) als DSM 14408.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia
coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-
Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al.
entnommen werden.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wird wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der
behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe
des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract,
Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) werden die
Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
werden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-
0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No.
1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgt die Isolierung der Cosmidfragmente im
Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel
Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden,
Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der
Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande,
Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product
No. K2500-01), wird mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy-
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18: 1067). Es wird der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems
(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der
Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Product No. A124.1,
Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377"
Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate werden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt zwei
offene Leseraster von 2082 Basenpaaren und 1020
Basenpaaren, welche als hemD-Gen und hemB-Gen bezeichnet
werden. Das hemD-Gen kodiert für ein Protein von 693
Aminosäuren und das hemB-Gen kodiert für ein Protein von
339 Aminosäuren.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von
Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994))
chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für
C. glutamicum bekannten Sequenz des hemB-Gens wurden die
folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion
ausgewählt (siehe auch SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 5):
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG-Biotech
AG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der
Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)
mit Pwo-Polymerase der Firma Roche Diagnostics GmbH
(Mannheim, Deutschland) die PCR-Reaktion durchgeführt. Mit
Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer
die Amplifikation eines 1201 bp großen DNA-Fragmentes,
welches das hemB-Gen trägt. Außerdem enthalten beide Primer
die Sequenz für die Schnittstelle der
Restriktionsendonuklease XbaI, die in der oben
dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen
markiert ist.
Das 1201 bp große hemB-Fragment wurde mit der
Restriktionsendonuklease XbaI gespalten und anschließend
aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit
(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) isoliert.
Nach dem Stand der Technik wurde der E. coli-C.
glutamicum Shuttle-Vektor pEC-XK99E konstruiert. Der
Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1
einschließlich des Replikationseffectors per (US-A-
5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179,
1525-1532 (1997)), das Kanamycin-Resistenzgen aph(3')-IIa
aus Escherichia coli (Beck et al. (1982), Gene 19: 327-
336), den Replikationsursprung, den trc-Promotor, die
Terminationsregionen T1 und T2, das lacIq-Gen (Repressor
des lac-Operons von E.coli) und eine
Mehrfachklonierschnittstelle (multiple cloning site, mcs)
(Norrander, J.M. et al. Gene 26, 101-106 (1983)) des
Plasmids pTRC99A (Amann et al. (1988), Gene 69: 301-315).
Der trc-Promotor kann durch Zugabe des Lactose-Derivates
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert werden.
Der konstruierte E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor
pEC-XK99E wurde mittels Elektroporation (Liebl et al.,
1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) in C.
glutamicum DSM5715 transferiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgte auf LBHTS Agar bestehend aus
18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten und das
Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
überprüft.
Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XK99E
(Fig. 1) bezeichnet. Der durch Elektroporation des
Plasmides pEC-XK99E in den C. glutamicum-Stamm DSM5715
erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-XK99E genannt und als
DSM13455 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt.
Als Vektor wurde der in Beispiel 3.2 beschriebene E. coli-
C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-XK99E verwendet. DNA
dieses Plasmids wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI
vollständig gespalten und anschließend mit shrimp
alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert.
Das in Beispiel 3.1 beschriebene, mittels PCR gewonnene und
mit der Restriktionsenonuklease XbaI gespaltene ca. 1190 bp
große hemB-Fragment wurde mit dem vorbereiteten Vektor pEC-
XK99E gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-
DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Der
Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5αmcr
(Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I,
IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die
Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach
Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante
Einzelklone selektioniert. Plasmid DNA wurde aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und jeweils einmal mit dem Restriktionsenzym XbaI
und BamHI gespalten, um das Plasmid durch anschließende
Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Das erhaltene
Plasmid wurde pEC-XK99EhemBa2ex genannt. Es ist in Fig. 2
dargestellt.
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pEC-XK99EhemBa2ex
unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology
Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen
Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus
18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten und das Plasmid
durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
Der so erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-XK99EhemBa2ex
genannt.
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715/pEC-XK99EhemBa2ex wurde in einem zur Produktion von
Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt
im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin
(25 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft
(10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium Cg III verwendet.
Medium Cg III | |
NaCl | 2,5 g/l |
Bacto-Pepton | 10 g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
AL=L<Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt |
Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur
angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur
0,05 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM
verwendet.
Medium MM | |
CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 20 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 100 g/l |
(NH4)2SO4 | 25 g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4.7 H2O | 1,0 g/l |
CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4.7 H2O | 10 mg/l |
MnSO4.H2O | 5,0 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
Thiamin.HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
L-Leucin (sterilfiltriert) | 0,1 g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin
(25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80%
Luftfeuchte.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 Karte des Plasmids pEC-XK99E
Fig. 2 Karte des Plasmids pEC-XK99EhemBa2ex
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
Kan: Kanamycin Resistenz-Gen aph(3')-IIa aus Escherichia coli
BamHI Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
HindIII Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
XbaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
Ptrc trc-Promotor
T1 Terminationsregion T1
T2 Terminationsregion T2
per Replikationseffektor per
rep Replikationregion rep des Plasmides pGA1
lacIq lacIq-Repressor des lac-Operons von Escherichia coli
hemB kloniertes hemB-Gen
Kan: Kanamycin Resistenz-Gen aph(3')-IIa aus Escherichia coli
BamHI Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
HindIII Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
XbaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
Ptrc trc-Promotor
T1 Terminationsregion T1
T2 Terminationsregion T2
per Replikationseffektor per
rep Replikationregion rep des Plasmides pGA1
lacIq lacIq-Repressor des lac-Operons von Escherichia coli
hemB kloniertes hemB-Gen
Claims (22)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine für das hemD-Gen und/oder das hemB-Gen
kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und
- f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e);
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt
rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Hybridisierung
unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2 × SSC
durchgeführt wird.
7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein
Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2 und/oder
SEQ ID No. 3 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
8. Coryneforme Bakterien, in denen das hemD-Gen und/oder
das hemB-Gen verstärkt, insbesondere überexprimiert
wird (werden).
9. Escherichia coli Stamm DH5alphamcr/pEC-XK99EhemBa2ex
(=DH5αmcr/pEC-XK99EhemBa2ex) als DSM 14408 hinterlegt
bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Deutschland.
10. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt:
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das endogene hemD-Gen und/oder das endogene hemB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert;
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der L-Aminosäure.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
verstärkt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten L-Aminosäure verringern.
13. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen mit einem
Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der
Plasmidvektor die für das hemD-Gen und/oder das hemB-
Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression
des(der) Polynukleotids(e), das(die) für das hemD-Gen
und/oder das hemB-Gen kodiert(kodieren) verstärkt,
insbesondere überexprimiert.
15. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man die katalytischen
Eigenschaften der Polypeptide (Enzymproteine) erhöht,
für die die Polynukleotide hemD und/oder hemB kodieren.
16. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 16.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
- 2. 16.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
- 3. 16.3 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi,
- 4. 16.4 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
- 5. 16.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
- 6. 16.6 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 7. 7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
- 8. 16.8 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
- 9. 16.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
- 10. 16.10 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
- 11. 16.11 das für die Theonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA oder das für eine feed back resistente Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
- 12. 16.12 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN,
- 13. 16.13 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
- 14. 16.14 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,
17. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 17.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
- 2. 17.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi,
- 3. 17.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,
- 4. 17.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2, abschwächt.
18. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 trägt.
19. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10-17,
dadurch gekennzeichnet, daß
man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum
einsetzt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, daß man den
Corynebacterium glutamicum Stamm Escherichia coli
DH5alphamcr/pEC-XK99EhemBa2ex (= DH5αmcr/pEC-
XK99EhemBa2ex) einsetzt.
21. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um
Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene
zu isolieren, die für die Uroporphyrinogen-III-Synthase
und/oder die Delta-Aminolaevulinsäure-Dehydratase
kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
hemD-Gens und/oder des hemB-Gens aufweisen,
dadurch gekennzeichnet, daß man
das Polynukleotid, enthaltend die
Polynukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3
oder 4 als Hybridisierungssonden einsetzt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß man arrays, micro
arrays oder DNA-chips einsetzt.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10145585A DE10145585A1 (de) | 2000-10-28 | 2001-09-15 | Für die Gene hemD und hemB kodierende Nukleotidsequenzen |
AU2002218223A AU2002218223A1 (en) | 2000-10-28 | 2001-10-10 | Nucleotide sequences encoding the hemd and hemb genes |
PCT/EP2001/011705 WO2002034775A2 (en) | 2000-10-28 | 2001-10-10 | Nucleotide sequences encoding the hemd and hemb genes |
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---|---|---|---|
DE10053708 | 2000-10-28 | ||
DE10145585A DE10145585A1 (de) | 2000-10-28 | 2001-09-15 | Für die Gene hemD und hemB kodierende Nukleotidsequenzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10145585A1 true DE10145585A1 (de) | 2002-05-02 |
Family
ID=7661525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10145585A Withdrawn DE10145585A1 (de) | 2000-10-28 | 2001-09-15 | Für die Gene hemD und hemB kodierende Nukleotidsequenzen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10145585A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101693901B (zh) * | 2009-10-26 | 2011-10-05 | 江南大学 | 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法 |
-
2001
- 2001-09-15 DE DE10145585A patent/DE10145585A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101693901B (zh) * | 2009-10-26 | 2011-10-05 | 江南大学 | 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法 |
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