DE102005023829A1

DE102005023829A1 - Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien

Info

Publication number: DE102005023829A1
Application number: DE102005023829A
Authority: DE
Inventors: Natalie Schischka; Brigitte Dr. Bathe; Georg Dr. Thierbach
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2005-05-24
Publication date: 2006-11-30
Also published as: US7700313B2; US20100196959A1; US7915394B2; EP1902067B1; PL1902067T3; WO2006125714A3; ATE530568T1; EP1902067A2; ES2374837T3; CN101180314A; US20080131927A1; DK1902067T3; WO2006125714A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Mutanten und Allele des opcA-Gens coryneformer Bakterien kodierend für Varianten der OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Mutanten und Allele des opcA-Gens kodierend für Varianten der OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.
Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S-(2-Aminoethyl)-L-Cystein (AEC).

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht. Eine zusammenfassende Darstellung über verschiedenste Aspekte der Genetik, des Stoffwechsels und der Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum findet sich bei Pühler (chief ed.) im Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338, 2003.

Moritz et al. (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000)) berichten über physiologische und biochemische Untersuchungen an der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum. Nach Untersuchungen von Moritz et al. besteht die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus einer Zwf-Untereinheit und einer OpcA-Untereinheit.

Eine Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist bei Moritz et al. (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000) beschrieben.

Die Nukleotidsequenz des für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens ist unter anderem in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Nummer AX121828 allgemein verfügbar. Sie kann weiterhin der Patentanmeldung EP 1108790 als Sequenz Nr. 1744 entnommen werden.

Weitere Datenbanken wie beispielsweise die Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder die des Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Geneve, Switzerland) oder die der Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA) können ebenfalls genutzt werden.

Die mikrobielle Biosynthese von L-Aminosäuren in coryneformen Bakterien ist ein komplexes System und vielschichtig mit diversen anderen Stoffwechselwegen in der Zelle vernetzt. Daher kann keine Vorhersage gemacht werden, ob durch Mutation das OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase dergestalt verändert, dass die Produktion von L-Aminosäuren verbessert wird. Der besseren Übersichtlichkeit halber ist die Nukleotidsequenz der für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum kodierenden zwf-Gens („Wildtyp-Gen") gemäß den Angaben der NCBI-Datenbank in SEQ ID NO:1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz der kodierten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in SEQ ID NO:2 und 4 dargestellt. In SEQ ID NO:3 sind stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) gelegene Nukleotidsequenzen zusätzlich angegeben.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, verbesserte Stämme von Mikroorganismen bereitzustellen, die erhöhte Mengen von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, produzieren.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind durch in vitro und/oder in vivo erzeugte, beziehungsweise isolierte Mutanten coryneformer Bakterien, die bevorzugt Aminosäuren ausscheiden, und welche ein Gen bzw. Allel enthalten, das für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe,

a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.

An Position 107 der Aminosäuresequenz wird die Aminosäure L-Histidin, an Position 219 die Aminosäure L-Asparagin, an Position 233 die Aminosäure L-Serin und an Position 261 die Aminosäure L-Histidin bevorzugt.

Das Polypeptid, das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthalten ist, kann ebenfalls als OpcA-Polypeptid, OpcA-Polypeptid der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, als OpcA-Untereinheit der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, oder als OpcA-Polypeptid Untereinheit bezeichnet werden. In der EP 1 108 790 (siehe SEQ ID NO:1744 in Tabelle 1) wird das OpcA-Polypeptid auch als „glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly Protein" bezeichnet.

Bei den coryneformen Bakterien wird die Gattung Corynebacterium bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Aminosäure ausscheidende Stämme, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.

Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeicnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium lilium DSM20137,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Bekannte Vertreter Aminosäure ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien sind beispielsweise
die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940 ,
Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) beschrieben in Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)),
Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in EP 1 108 790 ,
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) beschrieben in US 5,250,423 ,
oder die L-Tryptophan produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum K76 (= FermBP-1847) beschrieben in US 5,563,052 ,
Corynebacterium glutamicum BPS13 (= FermBP-1777) beschrieben in US 5,605,818 , und
Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 beschrieben in US 5,235,940 .

Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) und in der US-A-5,250,434.

Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Die genannten Stämme von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434 beschrieben.

Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Hierzu gehören insbesondere L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin.

Die erfindungsgemäßen Mutanten scheiden bevorzugt die genannten proteinogen Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan aus. Der Begriff Aminosäuren umfasst auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat im Falle der Aminosäure L-Lysin.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminsäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche enthält, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin, ausgetauscht,
b) an Position 219 wird L-Lysin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin, ausgetauscht,
c) an Position 233 wird L-Prolin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin, ausgetauscht, und
d) an Position 261 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene, bevorzugt L-Histidin, Aminosäure ausgetauscht.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,

wobei das Allel eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 ausgewählt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Primerpaar ist das in SEQ ID NO:11 und SEQ ID NO:12 dargestellte Primerpaar opcA-A1 und opcA-E1. Als Ausgangsmaterial („template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit einer Länge entsprechend 319 L-Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid, das an Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO:6 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:6 oder Position 83 bis 285 von SEQ ID NO:6 oder Position 63 bis 305 von SEQ ID NO:6 oder Position 38 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 8 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 317 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 319 von SEQ ID NO:6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 319 Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin

und dessen Aminosäuresequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder 100 identisch ist mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO:6 oder 2.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptid eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe,

und dessen Nukleotidsequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder 100% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 oder 1.

Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines opcA-Allels, das mindestens 99% Identität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt, ist in SEQ ID NO:7 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses opcA-Allels besitzt zusätzlich zu den Nukleotidaustauschen Thymin gegen Cytosin an Position 319, Adenin gegen Cytosin an Position 657, Cytosin gegen Thymin an Position 697 und Thymin gegen Cytosin an Position 781 (Siehe SEQ ID NO:5) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an der Position 402 Thymin gegen Cytosin an der Position 600, und Guanin gegen Cytosin an der Position 648 (Siehe SEQ ID NO:7). Die Formulierung „Guanin gegen Cytosin an der Position 648" – und vergleichbare Formulierungen – bedeutet, dass die in der Wildtypsequenz der Kodierregion an der Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO:1) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID NO:7).

Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend kann das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthaltene opcA-Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthält, zusätzlich zu der in SEQ ID NO:6 gezeigten Aminosäuresequenz einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch(e) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche.

Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 umfasst.

Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, das endständige Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.

Gegenstand der Erfindung sind auch opcA-Allele, die für erfindungsgemäße OpcA-Polypeptide, wie beispielhaft als SEQ ID NO:6 gezeigt, kodieren und die eine oder mehrere Insertion(en) oder Deletion(en) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren.

Durch derartige Insertionen und Deletionen oder konservative Aminosäureaustausche wird die enzymatische Aktivität der die entsprechende OpcA-Untereinheit enthaltenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen nicht berührt" bedeutet, dass sich die enzymatische Aktivität der genannten Varianten um maximal 10%, maximal 7,5%, maximal 5%, maximal 2,5% oder maximal 1% von der Aktivität einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase unterscheidet, welche eine OpcA-Polypeptid-Untereinheit mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 enthält, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäuraustausche ausgewählt aus der Gruppe

a) an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin
b) an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin
c) an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin, und
d) an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin

enthält.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanten können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Ethylmethansulfonat (EMS), 5-Bromuracil, oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben. Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen von 50 bis 500 mg/l oder auch höhere Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen um einen Anteil von ca. 50% bis 90% oder ca. 50% bis 99% oder ca. 50% bis 99,9 oder mehr reduziert.

Aus der mutagenisierten Zellpopulation werden Mutanten beziehungsweise Zellen entnommen und vermehrt. Vorzugsweise wird in einem weiteren Schritt deren Fähigkeit untersucht, in einer Satzkultur (batch) unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums Aminosäuren, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, auszuscheiden. Geeignete Nährmedien und Testbedingungen sind unter anderem in der US 6,221,636 , in der US 5,840,551 , in der US 5,770,409 , in der US 5,605,818 , in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben. Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, die im Vergleich zum Elternstamm beziehungsweise nicht mutagenisierten Ausgangsstamm vermehrt Aminosäuren in das Nährmedium oder in das Zellinnere ausscheiden. Dazu gehören beispielsweise solche Mutanten, deren Aminosäuresekretion um mindestens 0,5% erhöht ist.

Anschließend wird aus den Mutanten DNA bereitgestellt, beziehungsweise isoliert und mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primerpaaren, die die Amplifizierung des opcA-Gens beziehungsweise der erfindungsgemäßen opcA-Allele oder der erfindungsgemäßen Mutationen an den Positionen 107, 219, 233 und 261 der Aminosäuresequenz des OpcA-Polypeptides erlauben, das entsprechende Polynukleotid synthetisiert. Vorzugsweise wird die DNA aus solchen Mutanten isoliert, die im Vergleich zum Ausgangsstamm in erhöhtem Maße Aminosäuren ausscheiden oder im Zellinneren anreichern.

Hierzu können beliebige Primerpaare aus der stromaufwärts und stromabwärts der erfindungsgemäßen Mutation gelegenen Nukleotidsequenz und der dazu komplementären Nukleotidsequenz ausgewählt werden. Ein Primer eines Primerpaares umfasst hierbei bevorzugt mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 652 von SEQ ID NO:3. Der dazugehörige zweite Primer eines Primerpaares umfasst mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz von Position 1600 und 1118 von SEQ ID NO:3. Ist die Amplifikation der Kodierregion gewünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 ausgewählt. Ist die Amplifikation eines Teils der Kodierregion, wie beispielsweise in SEQ ID NO:15 und 17 dargestellt, erwünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 335 und 652 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1291 und 1118 von SEQ ID NO:3 ausgewählt.

Geeignete Primerpaare sind beispielsweise das unter SEQ ID NO:11 und SEQ ID NO:12 wiedergegebene Primerpaar opcA-A1 und opcA-E1 und das unter SEQ ID NO:13 und SEQ ID NO:14 wiedergegebene Primerpaar opcA-int1 und opcA-int2. Der Primer kann überdies mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, mit einer Biotin-Gruppe oder weiteren Accessoirs, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, ausgerüstet sein. Die Gesamtlänge des Primers beträgt im Allgemeinen maximal 30, 40, 50 oder 60 Nukleotide.

Für die Herstellung von Polynukleotiden durch Amplifikation ausgewählter Sequenzen, wie dem erfindungsgemäßen opcA-Allel, aus vorgelegter, beispielsweise chromosomaler DNA („template DNA") durch Amplifikation mittels PCR, werden im Allgemeinen thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt. Beispiele derartiger DNA-Polymerasen sind die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, die unter anderem von der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) vertrieben wird, die Vent-Polymerase aus Thermococcus litoralis, die unter anderem von der Firma New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) vertrieben wird oder die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, die unter anderem von der Firma Stratagene (La Jolla, USA) vertrieben wird. Bevorzugt werden Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität. „proof reading"-Aktivität bedeutet, dass diese Polymerasen in der Lage sind, fehlerhaft eingebaute Nukleotide zu erkennen und den Fehler durch erneute Polymerisation zu beheben (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1998)). Beispiele für Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität sind die Vent-Polymerase und die Pfu-Polymerase.

Die Bedingungen im Reaktionsansatz werden nach Angaben des Herstellers eingestellt. Die Polymerasen werden vom Hersteller im Allgemeinen zusammen mit dem gebräuchlichen Puffer geliefert, welcher üblicherweise Konzentrationen von 10-100 mM Tris/HCl und 6-55 mM KCl bei pH 7,5-9,3 aufweist. Magnesiumchlorid wird in einer Konzentration von 0,5-10 mM zugesetzt, falls es nicht in dem vom Hersteller gelieferten Puffer enthalten ist. Dem Reaktionsansatz werden weiterhin Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,1-16,6 mM zugesetzt. Die Primer werden im Reaktionsansatz mit einer Endkonzentration von 0,1-3 μM vorgelegt und die Template-DNA im optimalen Fall mit 10² bis 10⁵ Kopien. Die entsprechende Polymerase wird dem Reaktionsansatz in einer Menge von 2-5 Units zugegeben. Ein typischer Reaktionsansatz hat ein Volumen von 20-100 μl.

Als weitere Zusätze können der Reaktion Rinderserumalbumin, Tween-20, Gelatin, Glycerin, Formamid oder DMSO beigesetzt werden (Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995).

Ein typischer PCR-Verlauf besteht aus drei unterschiedlichen, sich aufeinanderfolgend wiederholenden Temperaturstufen. Vorab wird die Reaktion mit einer Temperaturerhöhung auf 92°C-98°C für 4 bis 10 Minuten gestartet, um die vorgelegte DNA zu denaturieren. Dann folgen sich wiederholend zuerst ein Schritt zur Denaturierung der vorgelegten DNA von 10-60 Sekunden bei ungefähr 92-98°C, dann ein Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA von 10-60 Sekunden bei einer bestimmten, von den Primern abhängigen Temperatur („Annealing-Temperatur"), die erfahrungsgemäß bei 50°C bis 60°C liegt und sich für jedes Primerpaar einzeln berechnen läßt. Genaue Informationen dazu findet der Fachmann bei Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). Anschließend folgt ein Synthese-Schritt zur Verlängerung der vorgelegten Primer („Extension") bei dem jeweils für die Polymerase angegebenen Aktivitätsoptimum, üblicherweise je nach Polymerase im Bereich von 73°C bis 67°C bevorzugt 72°C bis 68°C. Die Dauer dieses Extensionschrittes hängt von der Leistungsfähigkeit der Polymerase und Länge des zu amplifizierenden PCR-Produktes ab. In einer typischen PCR dauert dieser Schritt 0,5-8 Minuten, bevorzugt 2-4 Minuten. Diese drei Schritte werden 30 bis 35 mal, gegebenenfalls bis zu 50 mal wiederholt. Ein abschließender „Extension"-Schritt von 4-10 Minuten beendet die Reaktion. Die auf diese Weise hergestellten Polynukleotide werden auch als Amplifikate bezeichnet; der Begriff Nukleinsäurefragment ist ebenfalls gebräuchlich.

Weitere Details und Informationen zur PCR findet der Fachmann im Handbuch PCR-Strategies (Innis, Felfand und Sninsky, Academic Press , Inc., 1995), in PCR Primer – a laboratory manual, im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Die Nukleotidsequenz wird anschließend beispielsweise nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)) mit den von Zimmermann et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990)) angegebenen Modifikationen bestimmt und das von dieser Nukleotidsequenz kodierte Polypeptid insbesondere bezüglich der Aminosäuresequenz analysiert. Dazu wird die Nukleotidsequenz in ein Programm zur Übersetzung von DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz eingegeben. Geeignete Programme sind beispielsweise das Programm „Patentin", das bei Patentämtern, beispielsweise dem US-Patentamt (USPTO) erhältlich ist, oder das „Translate Tool", das auf dem ExPASy Proteomics Server im World Wide Web (Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)) verfügbar ist.

Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, deren opcA-Allele für OpcA-Polypeptide kodieren, welche die erfindungsgemäßen Mutationen enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend eine Mutante eines coryneformen Bakteriums, die durch folgende Schritte erhältlich ist:

a) Behandlung eines coryneformen Bakteriums, das die Fähigkeit besitzt Aminosäuren auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz,
b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutante,
c) vorzugsweise Bestimmung der Fähigkeit der Mutante in einem Medium mindestens 0,5% mehr Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern als das in a) eingesetzte coryneforme Bakterium,
d) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen Mutante,
e) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls/Amplifikates/Nukleinsäurefragments unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, der Nukleinsäure aus d), und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und einem zweitem Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3,
f) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in e) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz,
g) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten Aminosäuresesequenz mit SEQ ID NO:6, und
h) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.

Die auf diese Weise erzeugten Mutanten enthalten typischerweise eine (1) Kopie eines der beschriebenen opcA Allele. Das hier beschriebene Verfahren ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

In der SEQ ID NO:5 ist beispielhaft die Kodierregionen eines opcA-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante wiedergegeben. Die Kodierregion des Wildtypgens ist als SEQ ID NO:1 wiedergegeben.

SEQ ID NO:1 enthält an Position 319 bis 321 das für die Aminosäure L-Tyrosin kodierende TAT Kodon. SEQ ID NO:5 enthält an Position 319 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Thymin Cytosin Transition entsteht an Position 319 bis 321 das für die Aminosäure L-Histidin kodierende CAT Kodon.

SEQ ID NO:1 enthält an Position 655 bis 657 das für die Aminosäure L-Lysin kodierende AAA Kodon. SEQ ID NO:5 enthält an Position 657 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Adenin Cytosin Transversion entsteht an Position 655 bis 657 das für die Aminosäure L-Asparagin kodierende AAC Kodon.

SEQ ID NO:1 enthält an Position 697 bis 699 das für die Aminosäure L-Prolin kodierende CCA Kodon. SEQ ID NO:5 enthält an Position 697 die Nukleobase Thymin. Durch diese Cytosin Thymin Transition entsteht an Position 697 bis 699 das für die Aminosäure L-Serin kodierende TCA Kodon.

SEQ ID NO:1 enthält an Position 781 bis 783 das für die Aminosäure L-Tyrosin kodierende TAT Kodon. SEQ ID NO:5 enthält an Position 781 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Thymin Cytosin Transition entsteht an Position 781 bis 783 das für die Aminosäure L-Histidin kodierende CAT Kodon.

Darüber hinaus kann die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Nukleotidsequenz weitere Basenaustausche enthalten, die sich durch die Mutagenesebehandlung ergeben haben, sich jedoch nicht in einer veränderten Aminosäuresequenz äußern. Derartige Mutationen werden in der Fachwelt auch als stille oder neutrale Mutationen bezeichnet. Diese stillen Mutationen können ebenfalls in dem für die Mutagenesebehandlung eingesetzten coryneformen Bakterium bereits enthalten sein. Beispiele für derartige stille Mutationen sind die Cytosin-Thymin Transition an Position 402, die Thymin-Cytosin Transition an Position 600 und die Guanin-Cytosin Transversion an Position 648 wie in SEQ ID NO:7 dargestellt.

Die für die Mutagenese verwendeten coryneformen Bakterien besitzen bevorzugt bereits die Fähigkeit, die gewünschte Aminosäure in das sie umgebende Nährmedium beziehungsweise Fermentationsbrühe auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern.

L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinase. Unter „feed back" resistenten Aspartatkinasen versteht man Aspartatkinasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als lysC^FBR-Allele bezeichnet. Im Stand der Technik (Tabelle 1) sind zahlreiche lysC^FBR-Allele beschrieben, die für Aspartatkinase-Varianten kodieren, welche Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtypprotein besitzen. Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO:19 und das von diesem Gen kodierte Protein in SEQ ID NO:20 dargestellt.

Tabelle 1 lysC^FBR-Allele kodierend für feed back resistente Aspartatkinasen

L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise einen oder mehrere der in Tabelle 1 aufgelisteten Aminosäureaustausche.

Bevorzugt werden folgende lysC^FBR-Allele: lysC A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Threonin), lysC A279V (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Valin), lysC S301F (Austausch von Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Phenylalanin), lysC T308I (Austausch von Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin), lysC S301Y (Austausch von Serin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Tyrosin), lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Asparaginsäure), lysC R320G (Austausch von Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Glycin), lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin), lysC S381F (Austausch von Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Phenylalanin) und lysC S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Alanin).

Besonders bevorzugt werden das lysC^FBR-Allel lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin) und ein lysC^FBR-Allel enthaltend mindestens einen Austausch ausgewählt aus der Gruppe A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Threonin) und S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Alanin).

Das lysC^FBR-Allel lysC T311I ist in dem bei der DSMZ unter der Nummer DSM16833 hinterlegten Stamm DM1797 enthalten. DM1797 ist eine Mutante von Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Stamm Nach der oben beschriebenen Art und Weise wurde, ausgehend von Stamm DM1797, eine als DM1825 bezeichnete Mutante isoliert, die ein opcA-Allel enthält, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, bei dem an Position 107 der Aminosäuresequenz L-Histidin, an Position 219 L-Asparagin, an Position 233 L-Serin und an Position 261 L-Histidin enthalten ist. Die Nukleotidsequenz der Kodierregion des opcA-Allels der Mutante DM1825 ist als SEQ ID NO:7 und die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids als SEQ ID NO:8 beziehungsweise 10 dargestellt. SEQ ID NO:7 enthält an Position 319 Cytosin anstelle Thymin, an Position 402 Thymin anstelle Cytosin, an Position 600 Cytosin anstelle Thymin, an Position 648 Cytosin anstelle Guanin, an Position 657 Cytosin anstelle Adenin, an Position 697 Thymin anstelle Cytosin und an Position 781 Cytosin anstelle Thymin. Die Formulierung „an Position 648 Cytosin anstelle Guanin" – und vergleichbare Formulierungen – bedeutet, dass die in der wildtypsequenz der Kodierregion an Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO:1) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID NO:7).

In der SEQ ID NO:9 sind die stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) von SEQ ID NO:7 gelegenen Nukleotidsequenzen mit angegeben.

Darüberhinaus können L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien verwendet werden, die eine abgeschwächte Homoserin-Dehydrogenase oder Homoserinkinase aufweisen oder andere Eigenschaften besitzen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.

L-Tryptophan produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Anthranilatsynthase. Unter „feed back" resistenter Anthranilatsynthase versteht man Anthranilatsynthasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung (5 bis 10%, 10% bis 15% oder 10% bis 20%) durch Tryptophan oder 5-Fluorotryptophan (Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330-5332 (1987)) oder ähnliche Analoga aufweisen. Die für diese desensibilisierten Anthranilatsynthasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als trpE^FBR-Allele bezeichnet. Beispiele für derartige Mutanten beziehungsweise Allele sind beispielsweise in der US 6180373 und EP 0338474 beschrieben.

Die erhaltenen Mutanten zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für ein OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.

Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann aus einer erfindungsgemäßen Mutante isoliert werden.

Weiterhin können für die Mutagenese des opcA-Gens in-vitro Methoden eingesetzt werden. Bei der Verwendung von in-vitro Methoden werden isolierte Polynukleotide, welche ein opcA-Gen eines coryneformen Bakteriums, vorzugsweise das im Stand der Technik beschriebene Wildtyp-Gen von Corynebacterium glutamicum, enthalten, einer mutagenen Behandlung unterzogen.

Bei den isolierten Polynukleotiden kann es sich beispielsweise um isolierte Gesamt-DNA beziehungsweise chromosomale DNA oder auch um Amplifikate des opcA-Gens handeln, die mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt wurden. Derartige Amplifikate werden auch als PCR-Produkte bezeichnet; der Begriff Nukleinsäurefragment ist ebenfalls gebräuchlich. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Es ist ebenfalls möglich, das zu mutagenisierende opcA-Gen zunächst in einen Vektor, beispielsweise in einen Bakteriophagen oder in ein Plasmid einzubauen.

Geeignete Methoden für die in-vitro Mutagenese sind unter anderem die Behandlung mit Hydroxylamin nach Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), die Verwendung mutagener Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 und R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) und der Einsatz einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, die eine hohe Fehlerquote aufweist. Eine derartige DNA-Polymerase ist beispielsweise die Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) der Firma Stratagene (LaJolla, CA, USA).

Weitere Anleitungen und Übersichten zur Erzeugung von Mutationen in-vivo oder in-vitro können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe enthält:

a) Austausch von L-Tyrosin an Position 107 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin,
b) Austausch von L-Lysin an Position 219 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin,
c) Austausch von L-Prolin an Position 233 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin, und
d) Austausch von L-Tyrosin an Position 261 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von 319 Aminoäuren umfasst und diese eine oder mehrere der Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe:

a) an Position 107 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches von Position 107 bis 261 der Aminosäuresquenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO:6 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:6 oder Position 83 bis 285 von SEQ ID NO:6 oder Position 63 bis 305 von SEQ ID NO:6 oder Position 38 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 8 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 315 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 317 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 319 von SEQ ID NO:6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 319 Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

und das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 ausgewählt werden. Ein Beispiel für geeignetes Primerpaar ist in SEQ ID NO:11 und SEQ ID NO:12 dargestellt. Als Ausgangsmaterial („template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das mit einer zu SEQ ID NO:5 oder 7 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein OpcA-Polypeptid kodiert, deren Aminosäuresequenz eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ ID NO:5, 7 oder 9 komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten beziehungsweise identifizierten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C-68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90% Identität zur Nukleotidequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C-68°C, ca. 52°C-68°C, ca. 54°C-68°C, ca. 56°C-68°C, ca. 58°C-68°C, ca. 60°C 68°C, ca. 62°C-68°C, ca. 64°C-68°C, ca. 66°C-68°C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64°C-68°C oder ca. 66°C-68°C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2 × SSC oder 0,1 × SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 90% oder mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz beziehungsweise komplementären Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für ein OpcA-Polypeptid kodieren, welches den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch enthält. Die Nukleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Polynukleotids wird mit bekannten Methoden bestimmt. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen kodieren für OpcA-Polypeptide, die mindestens 90% bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:2 und einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe

und das eine Aminosäuresequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:2.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

und das eine Nukleotidsequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:1.

Ein Beispiel für ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes OpcA-Polypeptid kodiert, und eine Nukleotidsequenz besitzt, die mindestens 99% identisch ist mit der von SEQ ID NO:5, ist in SEQ ID NO:7 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses opcA-Allels besitzt zusätzlich zu den Nukleotidaustauschen Thymin gegen Cytosin an Position 319, Adenin gegen Cytosin an Position 657, Cytosin gegen Thymin an Position 697 und Thymin gegen Cytosin an Position 781 (siehe SEQ ID NO:5) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an Position 402, Thymin gegen Cytosin an Position 600, und Guanin gegen Cytosin an Position 648 (siehe SEQ ID NO:7). Die Formulierung „Guanin gegen Cytosin an der Position 648" – und vergleichbare Formulierungen – bedeutet, dass die in der wildtypsequenz der Kodierregion an der Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO:1) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID NO:7).

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 umfasst. Gegebenenfalls enthält das kodierte Polypeptid einen (1) oder mehrere konservative Aminosäuraustausch(e). Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein opcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 einschließlich einer Verlängerung am N- oder C-Terminus um mindestens eine (1) Aminosäure umfasst. Diese Verlängerung beträgt nicht mehr als 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 oder 2 Aminosäuren beziehungsweise Aminosäurereste.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch opcA-Allele, die für Polypeptid Varianten von SEQ ID NO:6 kodieren, die eine oder mehrere Insertionen oder Deletionen enthalten. Bevorzugt enthalten diese maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:5, 7 oder 9 umfasst.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein isoliertes Polynukleotid enthaltend das opcA-Allel der Mutante DM1825.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein isoliertes Polynukleotid, das einen Teil der Kodierregion eines erfindungsgemäßen opcA-Allels umfasst, wobei das isolierte Polynukleotid in jedem Fall den Teil der Kodierregion umfasst, der einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthält.

Insbesondere ist ein Nukleinsäure-Molekül beziehungsweise DNA-Fragment umfasst, das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 83 bis 285 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 63 bis 305 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 38 bis 315 von SEQ ID NO:2 kodiert, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche umfasst, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Austausch von L-Tyrosin an Position 107 entsprechend SEQ ID NO:2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin,
b) Austausch von an L-Lysin an Position 219 entsprechend SEQ ID NO:2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin,
c) Austausch von L-Prolin an Position 233 entsprechend SEQ ID NO:2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin, und
d) Austausch von L-Tyrosin an Position 261 entsprechend SEQ ID NO:2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin.

Bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend Position 83 bis 285 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend Position 63 bis 305 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend Position 38 bis 315 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend Position 8 bis 315 von SEQ ID NO:6 kodieren.

Das Leseraster kodierend für die Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:6 ist ebenfalls als SEQ ID NO:15 dargestellt. SEQ ID NO:16 zeigt die von diesem Leseraster kodierte Aminosäuresequenz. Die Position 10 in SEQ ID NO:16 entspricht der Position 107 von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 122 in SEQ ID NO:16 entspricht der Position 219 von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 136 in SEQ ID NO:16 entspricht der Position 233 von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 164 in SEQ ID NO:16 entspricht der Position 261 von SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 oder 10.

Ganz besonders bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO:5 oder 7, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 247 bis 855 von SEQ ID NO:5 oder 7, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 187 bis 915 von SEQ ID NO:5 oder 7, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 112 bis 948 von SEQ ID NO:5 oder 7, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 22 bis 948 von SEQ ID NO:5 oder 7 umfassen.

Das Leseraster entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO:5 ist als SEQ ID NO:15 dargestellt. Die dazugehörige kodierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO:16 dargestellt. Das Leseraster entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO:7 ist als SEQ ID NO:17 dargestellt. Die dazugehörige kodierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO:18 dargestellt.

Die erfindungsgemäßen Leseraster können darüberhinaus eine oder mehrere Mutationen enthalten, die zu einem oder mehreren konservativen Aminosäureaustauschen führen. Bevorzugt führen die Mutationen zu maximal 4%, zu maximal 2% oder zu maximal 1% konservativen Aminosäureaustauschen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Leseraster eine oder mehrere stille Mutationen enthalten. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Leseraster höchstens 4% und besonders bevorzugt höchstens 2% bis höchstens 1% stille Mutationen.

Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können dazu verwendet werden, um rekombinante Stämme von Mikroorganismen herzustellen, die im Vergleich zum Ausgangs- beziehungsweise Elternstamm in verbesserter Weise Aminosäuren in das sie umgebende Medium abgeben oder im Zellinneren anhäufen.

Eine verbreitete Methode zum Einbau von Mutationen in Gene coryneformer Bakterien ist die des Allelaustausches, die auch unter der Bezeichnung „gene replacement" bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"-Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.

Von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) wurde diese Methode verwendet um ein lysA-Allel, welches eine Deletion trug, in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens einzubauen. In gleicher Weise wurde ein lysA-Allel welches eine Insertion trug in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens eingebaut. Von Schäfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) wurde diese Methode eingesetzt um eine Deletion in das hom-thrB Operon von C. glutamicum einzubauen. Von Nakagawa et al. ( EP 1108790 ) und Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) wurde diese Methode eingesetzt um verschiedene Mutationen ausgehend von den isolierten Allelen in das Chromosom von C. glutamicum einzubauen. Auf diese Weise gelang es Nakagawa et al. eine als Val59Ala bezeichnete Mutation in das Homoserin-Dehydrogenase Gen (hom), eine als Thr311Ile bezeichnete Mutation in das Aspartatkinase-Gen (lysC bzw. ask), eine als Pro458Ser bezeichnete Mutation in das Pyruvat- Carboxylase-Gen (pyc) und eine als Ala213Thr bezeichnete Mutation in das als Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase Gen bezeichnete zwf-Gen von C. glutamicum Stämmen einzubauen.

Für ein erfindungsgemäßes Verfahren kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid verwendet werden, welches die gesamte Kodierregion umfasst, wie beispielsweise in SEQ ID NO:5 oder 7 gezeigt, oder welches einen Teil der Kodierregion umfasst, wie beispielsweise die Nukleotidsequenz, die für mindestens die Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:6 beziehungsweise 8 kodiert und die als SEQ ID NO:15 und 17 dargestellt sind. Der Teil der Kodierregion entsprechend mindestens SEQ ID NO:15 oder 17 hat eine Länge von ≥ 519 Nukleobasen. Bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion, deren Länge ≥ 747 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 63 bis 305 von SEQ ID NO:6 beziehungsweise 8 kodieren. Ganz besonders bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion, deren Länge ≥ 834 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 38 bis 315 von SEQ ID NO:6 beziehungsweise 8 kodieren.

Das DNA-Fragment enthaltend die interessierende Mutation liegt bei dieser Methode typischerweise in einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, vor, das vorzugsweise von dem mit der Mutation zu versehenden Stamm nicht oder nur begrenzt repliziert wird. Als Hilfs- oder Zwischenwirt, in dem der Vektor replizierbar ist, wird im Allgemeinen ein Bakterium der Gattung Escherichia, bevorzugt der Spezies Escherichia coli, verwendet.

Beispiele für derartige Plasmidvektoren sind die von Schäfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) beschriebenen pK*mob und pK*mobsacB Vektoren, wie beispielsweise pK18mobsacB, und die in der WO 02/070685 und WO 03/014362 beschriebenen Vektoren. Diese sind in Escherichia coli, aber nicht in coryneformen Bakterien replikativ. Besonders geeignet sind Vektoren, die ein konditional negativ dominant wirkendes Gen wie beispielsweise das sacB-Gen (Levansucrase-Gen) von beispielsweise Bacillus oder das galK-Gen (Galaktosekinase-Gen) von beispielsweise Escherichia coli enthalten. (Unter einem konditional negativ dominant wirkenden Gen versteht man ein Gen, das unter bestimmten Bedingungen nachteilig beispielsweise toxisch für den Wirt ist, unter anderen Bedingungen aber keine negativen Auswirkungen auf den das Gen tragenden Wirt hat.) Diese ermöglichen die Selektion auf Rekombinationsereignisse, bei denen der Vektor aus dem Chromosom eliminiert wird. Weiterhin wurde von Nakamura et al. (US-A-6,303,383) ein Temperatur-sensitives Plasmid für coryneforme Bakterien beschrieben, das lediglich bei Temperaturen unterhalb von 31°C replizieren kann.

Der Vektor wird anschließend durch Konjugation beispielsweise nach der Methode von Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) oder Transformation beispielsweise nach der Methode von Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) oder der Methode von Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) in das coryneforme Bakterium überführt. Gegebenenfalls kann die Überführung der DNA auch durch Partikelbeschuss erzielt werden.

Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation und erhält ein rekombinantes Bakterium.

Zur Identifizierung und Charakterisierung der erhaltenen Stämme können unter anderem die Methoden der Southern Blotting Hybridisierung, der Polymerase-Kettenreaktion, der Sequenzbestimmung, die Methode des „Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) (Lay et al. Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) oder Methoden der Enzymologie eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines coryneformen Bakteriums, bei dem man

a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid in ein coryneformes Bakterium überführt,
b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene opcA-Gen, das für eine Aminosäuresequenz mit L-Tyrosin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 kodiert, gegen das Polynukleotid aus a) austauscht, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine oder mehrere der Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe i) an 107 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Histidin, ii) an 219 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin, iii) an 233 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Serin, und iv) an 261 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Serin besitzt, und
c) das gemäß Schritt a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.

Auf diese weise erhält man ein rekombinantes coryneformes Bakterium, welches anstelle des Wildtyp opcA-Gens ein (1) erfindungsgemäßes opcA-Allel enthält.

Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus besteht darin, dass man

a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, das für ein opcA-Polypeptid kodiert, in einen Mikrorganismus überführt,
b) das Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und
c) den gemäß Schritt a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.

Auf diese Weise erhält man einen rekombinanten Mikroorganismus, welcher mindestens eine (1) Kopie oder mehrere Kopien eines erfindungsgemäßen Polynukleotids enthält, das für eine OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:

Weitere Gegenstände der Erfindung sind dementsprechend Wirte beziehungsweise Wirtszellen, bevorzugt Mikroorganismen, besonders bevorzugt coryneforme Bakterien und Bakterien der Gattung Escherichia, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten. Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls Mikrorganismen, die unter Verwendung der isolierten Polynukleotide hergestellt wurden. Derartige Mikroorganismen oder Bakterien werden auch als rekombinante Mikroorganismen oder rekombinante Bakterien bezeichnet. In gleicher Weise sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten, Gegenstand der Erfindung. Schließlich sind Wirte, die diese Vektoren enthalten, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können ebenfalls zur Erzielung einer Überexpression der von ihnen kodierten Polypeptide verwendet werden.

Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms. Im Falle der vorliegenden Erfindung werden opcA-Allele beziehungsweise Polynukleotide überexprimiert, die für OpcA-Polypeptide kodieren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Aminosäuresequenzen des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe:

Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme – sogenannte Aminopeptidasen – N-terminale Aminosäuren, insbesondere das N-terminale Methionin, vom gebildeten Polypeptid abgespalten werden können.

Die genannte Erhöhung der Konzentration oder Aktivität eines Genproduktes lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide um mindestens eine Kopie erhöht.

Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Gen oder Allel in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder die von Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Gens oder Allels in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt.

In einer Ausführungsform, wie sie beispielsweise bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) für das hom-thrB-Operon beschrieben ist, wird ein in C. glutamicum nicht-replikatives Plasmid, welches das interessierende Gen enthält, in ein coryneformes Bakterium überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens beziehungsweise Allels.

In einer anderen Ausführungsform, die in der WO 03/040373 und US-2003-0219881-A1 beschrieben ist, wird eine oder mehrere Kopie(n) des interessierenden Gens mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse in einen gewünschten Ort des Chromosoms von C. glutamicum eingefügt. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine Kopie eines lysC-Allels, das für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, in das gluB-Gen von C. glutamicum eingebaut.

In einer weiteren Ausführungsform, die in der WO 03/014330 und US-2004-0043458-A1 beschrieben ist, wird mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse am natürlichen Ort mindestens eine weitere Kopie, vorzugsweise in tandem-Anordnung zu dem bereits vorhandenen Gen oder Allel, des interessierenden Gens eingebaut. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine tandem-Duplikation eines lysC^FBR-Allels am natürlichen lysC-Genort erzielt.

Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003) beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts der Kodierregion eines erfindungsgemäßen opcA-Allels, typischerweise im Abstand von ungefähr 1-500 oder 1-334 Nukleotiden vom Startkodon, eines rekombinanten coryneformen Bakteriums eingefügt werden. Ein derartiger Promotor kann naturgemäß ebenfalls stromaufwärts des opcA-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante eingefügt werden. Es ist weiterhin möglich ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, das für eine erfindungsgemäße Variante des OpcA-Polypeptides kodiert, mit einem Promotor zu verknüpfen und die erhaltene Expressionseinheit in ein extrachromosomal replizierendes Plasmid oder in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen.

Darüberhinaus kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression des betreffenden Gens oder Allels durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Durch die Maßnahmen der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus beziehungsweise Elternstammes erhöht. Unter einem Ausgangs-Mikroorganismus oder Elternstamm versteht man einen Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.

Die Konzentration des Proteins kann über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^na Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)) bestimmt werden.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Verfahren zur Überexpression der erfindungsgemäßen OpcA-Polypeptide. Ein erfindungsgemässes Verfahren zur Überexpression besteht unter anderem darin, dass man die Kopienzahl eines erfindungsgemässen Polynukleotids, das für eine OpcA-Polypeptid-Variante mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche eine oder mehrere der Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe

um mindestens eine (1) oder um mehrere Kopien erhöht. Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren besteht darin, dass man einen Promotor funktionell mit dem Polynukleotid verknüpft.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mikroorganismen, die eine erhöhte Konzentration eines erfindungsgemäßen OpcA-Polypeptides in ihrem Zellinneren aufweisen. Gegebenenfalls besitzen diese Mikrorganismen eine erhöhte Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in ihrem Zellinneren.

Zusätzlich kann es für die verbesserte Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, in den erfindungsgemäßen Mutanten oder rekombinanten Stämme eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen oder Allele.

So kann für die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• ein für ein Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes Gen dapA, wie beispielsweise das in der EP 0 197 335 beschriebene dapA-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• ein für eine Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes Gen zwf, wie beispielsweise das in der JP-A-09224661 und EP-A-1108790 beschriebene zwf-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• die in der US-2003-0175911-A1 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für ein Protein kodieren, bei dem beispielsweise das L-Alanin an Position 243 der Aminosäuresequenz durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem die L-Asparaginsäure an Position 245 durch L-Serin ersetzt ist,
• ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes Gen pyc, wie beispielsweise das in der DE-A-198 31 609 und EP 1108790 beschriebene pyc-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• das für das in der EP 1 108 790 beschriebene pyc-Allel von Corynebacterium glutamicum, das für ein Protein kodiert, bei dem L-Prolin an Position 458 der Aminosäuresequenz durch L-Serin ersetzt ist,
• die in der WO 02/31158 beschriebene pyc-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für Proteine kodieren, welche gemäß Anspruch 1 einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe L-Glutaminsäure an Position 153 ersetzt durch L-Asparaginsäure, L-Alanin an Position 182 ersetzt durch L-Serin, L-Alanin an Position 206 ersetzt durch L-Serin, L-Histidin an Position 227 ersetzt durch L-Arginin, L-Alanin an Position 452 ersetzt durch Glycin und L-Asparaginsäure an Position 1120 ersetzt durch L-Glutaminsäure tragen (2A von WO 02/31158 gibt zwei verschiedene Startpositionen für die Pyruvat-Carboxylase an, die sich um eine Länge entsprechend 17 Aminosäuren unterscheiden. Dementsprechend entspricht die Position 153 nach Anspruch 1 von WO 02/31158 der Position 170 von 2A von WO 02/31158, die Position 182 nach Anspruch 1 der Position 199 von 2A, die Position 206 nach Anspruch 1 der Position 223 von 2A, die Position 227 nach Anspruch 1 der Position 244 von 2A, die Position 452 nach Anspruch 1 der Position 469 von 2A, die Position 1120 nach Anspruch 1 der Position 1137 von 2B. In 2A von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch A (Alanin) gegen G (Glycin) an Position 472 angegeben. Die Position 472 des Proteins mit der N terminalen Sequenz MTA entspricht der Position 455 des Proteins mit der N-terminalen Sequenz MST gemäß 2A. In 2B von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch D (Asparaginsäure) gegen E (Glutaminsäure) an Position 1133 des Proteins mit dem N-Terminus MTA angegeben.),
• ein für eine Aspartatkinase kodierendes lysC Gen wie beispielsweise das als SEQ ID NO:281 in der EP-A-1108790 (Siehe auch Zugangsnummer AX120085 und 120365) und das als SEQ ID NO:25 in der WO 01/00843 (Siehe Zugangsnummer AX063743) beschriebene von lysC-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• ein für eine feed-back resistente Aspartatkinase Variante kodierendes lysC^FBR Allel, insbesondere entsprechend Tabelle 1,
• ein für ein Lysin-Export-Protein kodierendes Gen lysE, wie beispielsweise das in der DE-A-195 48 222 beschriebene lysE-Gen von des Wildtyps Corynebacterium glutamicum,
• das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum ( US 6,632,644 )

überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des opcA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• ein für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierendes Gen pgi, wie beispielsweise das in der US 6,586,214 und US 6,465,238 beschriebene pgi-Gen von Corynebacterium glutamicum,
• ein für die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes Gen hom, wie beispielsweise das in der EP-A-0131171 beschriebene hom-Gen von Corynebacterium glutamicum,
• ein für die Homoserin-Kinase kodierendes Gen thrB, wie beispielsweise das von Peoples et al. (Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72)) beschriebene thrB-Gen von Corynebacterium glutamicum und
• ein für die Phosphofruktokinase kodierendes Gen pfkB, wie beispielsweise das in der WO 01/00844 (Sequenz Nr. 57) beschriebene pfkB-Gen von Corynebacterium glutamicum,

abzuschwächen oder auszuschalten.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Als Mutationen zur Erzeugung einer Abschwächung kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservativen Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stopp-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stopp-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.

Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Weitere Maßnahmen sind im Stand der Technik beschrieben.

Die durch die Massnahmen der Erfindung erhaltenen isolierten coryneformen Bakterien zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess.

Unter isolierten Bakterien sind die erfindungsgemäßen, isolierten beziehungsweise erzeugten Mutanten und rekombinanten Bakterien, insbesonders coryneformer Bakterien, zu verstehen, welche ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das einen oder mehrere der beschriebenen Aminosäureaustausche an den Position 107, 219, 233 und 261 enthält.

Die Leistung der isolierten Bakterien bzw. des Fermentationsprozesses unter Verwendung derselben bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration (Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert.

Die erfindungsgemäßen, isolierten coryneformen Bakterien können kontinuierlich – wie beispielsweise in der PCT/EP2004/008882 beschrieben – oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.

Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.

Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.

Geeignete Fermentationsmedien sind unter anderem in der US 6,221,636 , in der US 5,840,551 , in der US 5,770,409 , in der US 5,605,818 , in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure bei dem man

a) ein isoliertes coryneformes Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium ein für ein OpcA-Polypeptid kodierendes Gen enthält, welches eines oder mehrere der Aminosäuren besitzt, ausgewählt aus der Gruppe i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und
b) die L-Aminosäure in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des isolierten coryneformen Bakteriums anreichert.

Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend zu einem festen oder flüssigen Produkt weiterverarbeitet.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medium enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte Aminosäure, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des/der eingesetzten Fermentationsmediums/Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben der jeweiligen erwünschten L-Aminosäure erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die im Vergleich zur erwünschten Aminosäure weniger als 30%, 20% oder 10% ausmachen. Hierzu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Typische für industrielle Zwecke geeignete Fermentationsbrühen haben einen Aminosäuregehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.
Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.
Eine Gruppe L-Lysin haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von auf gereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865). Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von auf gereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von > 0%-100%.
Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen die L-Aminosäure aus der Fermentationsbrühe gesammelt, isoliert oder gereinigt wird, um das L-Aminosäure haltige Produkt oder die gereinigte L-Aminosäure herzustellen.
Zur Herstellung von festen, reinen L-Aminosäuren werden im wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Im Falle des Lysin erhält man auf diese Weise die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (Lys₂-H₂SO₄).
Im Falle des Lysin ist in der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin haltiger Lösungen aus Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen.
Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0%) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9 Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100% entfernt.
Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert gestellt werden ( GB 1,439,728 oder EP 1 331 220 ). Es ist gleichfalls möglich die Fermentationsbrühe mit der vollständig enthaltenen Biomasse anzusäuern ( US 6,340,486 oder US 6,465,025 ). Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO₃, GB 1,439,728 ) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert werden.
Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%), bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig das heißt > 95% oder > 98% im Produkt. In diesem Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert.
Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbrühe direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation zu trocknen.
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint.
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50%) einer Korngröße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.
Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.
Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5%) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser enthält.
„Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines L-Aminosäure, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, haltigen Produktes, bevorzugt Tierfuttermittel-Additivs, aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) Kultivierung und Fermentation eines L-Aminosäure ausscheidenden coryneformen Bakteriums, welches mindestens ein opcA-Allel enthält, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere der Aminosäuren besitzt, ausgewählt aus der Gruppe i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und in einem Fermentationsmedium,
b) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%, und
c) Trocknung der gemäß a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Produkt in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten

Vorzugsweise wird im Anschluss an Schritt a) oder b) Wasser aus der L-Aminosäure haltigen Fermentationsbrühe entfernt (Aufkonzentration).
Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten ( EP 0743016 A ) Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, Sojaöl/Lecithingemische. In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.-% besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.
Zur Einstellung einer gewünschten Aminosäurekonzentration im Produkt kann je nach Anforderung die entsprechende Aminosäure während des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
Im Falle des Lysin wird bei der Herstellung Lysin-haltiger Produkte das Verhältnis der Ionen so eingestellt, dass das Ionenverhältnis entsprechend nachstehender Formel 2x[SO₄ ^2–] + [Cl^–] – [NH₄ ⁺] – [Na⁺] – [K⁺] – 2x[Mg⁺] – 2x[Ca²⁺]/[L-Lys] 0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90 ergibt so wie von Kushiki et al. in der US 20030152633 beschrieben.
Im Falle des Lysin hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71 Gew.-%, 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Im Falle einer elektrisch neutralen Aminosäure wie dem L-Tryptophan hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Aminosäuregehalt von mindestens 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 30 Gew.-% und maximal 50 Gew.-%, 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-% oder bis 95 Gew.-%.
Der Wassergehalt des festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum mit der Bezeichnung DM1797, die den Aminosäureaustausch lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, wurde am 28. Oktober 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 16833 hinterlegt.
Die erfindungsgemäße Mutante Corynebacterium glutamicum DM1825, die L-Histidin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 der Aminosäuresequenz des OpcA-Polypeptids enthält, wurde am 05. April 2005 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 17223 hinterlegt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Isolierte Mutanten coryneformer Bakterien, welche ein Gen enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe, a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den coryneformen Bakterien um ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes und Corynebacterium aminogenes handelt.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Corynebacterium glutamicum handelt.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1, 2, oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Aminosäure ausscheidende Bakterien handelt.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Lysin oder um L-Tryptophan ausscheidende Bakterien handelt.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, einzeln oder gemeinsam, ausgewählt sind aus der Gruppe a) L-Histidin an Position 107, b) L-Asparagin an Position 219, c) L-Serin an Position 233, und d) 261 L-Histidin an Position ist.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, der (die) Aminosäuren in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ausgetauscht vorliegen.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass der (die) Aminosäuren in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 ausgetauscht vorliegen.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA gewonnen aus einem coryneformen Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und einem zweitem Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 erhältlich ist.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Länge entsprechend 319 L-Aminosäuren umfasst.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid von Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO:6 enthält.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90%, identisch ist mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Protein eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe a) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6, b) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6, einschließlich eines oder mehrerer konservativer Aminosäureaustausch(e), und c) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6, einschließlich einer oder mehrerer Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, umfasst.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen die Nukleotidsequenz, die zu 100 % identisch ist mit der von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7, umfasst.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 und 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch folgende Schritte erhältlich sind: a) Behandlung coryneformer Bakterien, die die Fähigkeit besitzen Aminosäuren auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz, b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutanten, c) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen Mutanten, d) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, der Nukleinsäure aus c), und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3 und einem zweitem Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3, e) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in d) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz, f) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten Aminosäuresesequenz mit SEQ ID NO:6 und g) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an Schritt b) eine Mutante ausgewählt wird, die die Fähigkeit besitzt in einem Medium mindestens 0,5% mehr der gewünschten L-Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren anzuhäufen als das in Schritt a) von Anspruch 17 eingesetzte coryneforme Bakterium.
Ein isoliertes Polynukleotid, das für ein OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe, a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren des kodierten Proteins, einzeln oder gemeinsam, ausgewählt aus der Gruppe: a) L-Histidin an Position 107, b) L-Asparagin an Position 219, c) L-Serin an Position 233, und d) L-Histidin an Position 261 ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der (die) Aminosären in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 ausgetauscht vorliegen.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von 319 Aminosäuren umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid von Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO:6 enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA gewonnen aus einem coryneformen Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO:3, und einem zweitem Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 erhältlich ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es mit zu SEQ ID NO:5, komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen einen Waschschritt mit einem Puffer entsprechend 2 × SSC bei einer Temperatur von 52°C bis 68°C umfassen.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90%, identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7.
Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Protein eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe a) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6, b) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 einschließlich eines oder mehrerer konservativer Aminosäureaustausch(e), und c) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 einschließlich einer oder mehrerer Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 20 oder 27 dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6 umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 umfasst.
Ein isoliertes Polynukleotid, welches ein Nukleinsäure-Molekül umfasst, das mindestens für ein Leseraster mit einer Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO:2 kodiert, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche umfasst, ausgewählt aus der Gruppe: a) an Position 107 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht, b) an Position 219 wird L-Lysin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht, c) an Position 233 wird L-Prolin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht, und d) an Position 261 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass in der an einer oder mehreren Positionen ausgetauschten Sequenz enthalten sind: a) L-Histidin an Position 107, b) L-Asparagin an Position 219, c) L-Serin an Position 233, und/oder d) L-Histidin an Position 261 ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens für ein Leseraster mit einer Aminosäuresequenz entsprechend den Positionen 98 bis 270 von SEQ ID NO:6 kodiert.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz an einer oder mehrerer Positionen konservative Aminosäureaustausche enthält, ausgenommen an den Positionen 107, 219, 233 und 261.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es eine oder mehrere stille Mutationen enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Nukleotidsequenz entsprechend den Positionen 292 bis 810 von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten coryneformen Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 29 oder 31 bis 35 in ein coryneformes Bakterium überführt, b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene opcA-Gen, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit L-Tyrosin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 kodiert, gegen das Polynukleotid aus a) austauscht, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, in der an einer oder mehreren Positionen Aminosäuren ausgetauscht sind, ausgewählt aus der Gruppe: i) an Position 107, bevorzugt gegen L-Histidin, ii) an Position 219, bevorzugt gegen L-Asparagin, iii) an Position 233, bevorzugt gegen L-Serin, und iv) an Position 261, bevorzugt gegen L-Histidin, und c) das gemäß Schritt a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.
Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man ein isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 29 verwendet.
Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man ein isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 31 bis 35 verwendet.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Anspruch 18 bis 29 oder 31 bis 35 in einen Mikroorganismus überführt, b) das isolierte Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und c) den gemäß Schritt a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.
Ein rekombinanter Mikroorganismus, der das isolierte Polynukleotid den gemäß Ansprüchen 18 bis 29 oder 31 bis 35 enthält.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein coryneformes Bakterium oder um ein Bakterium der Gattung Escherichia handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem coryneformen Bakterium um die Gattung Corynebacterium handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium der Gattung Corynebacterium um die Art Corynebacterium glutamicum handelt.
Ein Vektor, der das isolierte Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 29 oder 31 bis 35 enthält.
Ein rekombinanter Mikroorganismus, der den Vektor gemäß Anspruch 44 enthält.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein coryneformes Bakterium oder um ein Bakterium der Gattung Escherichia handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem coryneformen Bakterium um die Gattung Corynebacterium handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium der Gattung Corynebacterium um die Art Corynebacterium glutamicum handelt.
Verfahren zur Überexpression eines OpcA-Polypeptides in einem Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kopienzahl eines Polynukleotids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 29 oder 31 bis 35 in dem Mikroorganismus um mindestens eine (1) Kopie erhöht.
Verfahren zur Überexpression eines OpcA-Polypeptides in einem Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Promotor oder eine Expressionskassette funktionell mit einem Polynukleotid verknüpft, das für ein OpcA-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche eine oder mehrere der Aminosäuren enthält ausgewählt aus der Gruppe a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein isoliertes coryneformes Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium mindestens eine Kopie eines für ein OpcA-Polypeptid kodierende Polynucleotids enthält, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren besitzt aufweist, ausgewählt aus der Gruppe i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und b) die gewünschte L-Aminosäure in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des Bakteriums anreichert.
Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem isolierten coryneformen Bakterium um eine Mutante gemäß einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17 handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem isolierten coryneformen Bakterium um ein rekombinantes coryneformes Bakterium, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 40 bis 48 handelt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 51 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure isoliert oder sammelt
Verfahren gemäß Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure reinigt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 51 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure gemeinsam mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%) isoliert oder sammelt.
Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus der in Schritt b) von Anspruch 51 erhaltenen Fermentationsbrühe die gebildete Biomasse in einer Menge von 0 bis 100% entfernt, und b) aus der so erhaltenen Brühe ein im wesentlichen trockenes und geformtes Produkt durch eine Methode ausgewählt aus der Gruppe Granulation, Kompaktierung, Sprühtrocknung und Extrusion herstellt.
Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass man der Fermentationsbrühe vor oder nach Schritt a) eine Säure ausgewählt aus der Gruppe Schwefelsäure, Salzsäure und Phosphorsäure hinzufügt.
Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der vor oder nach in Schritt a) erhaltenen Brühe Wasser entfernt.
Verfahren gemäß Schritt 57, dadurch gekennzeichnet, dass man das in oder während Schritt b) erhaltene geformte Produkt mit einem Öl besprüht.