WO2003000913A2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von pyruvat - Google Patents

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WO2003000913A2
WO2003000913A2 PCT/DE2002/002144 DE0202144W WO03000913A2 WO 2003000913 A2 WO2003000913 A2 WO 2003000913A2 DE 0202144 W DE0202144 W DE 0202144W WO 03000913 A2 WO03000913 A2 WO 03000913A2
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Michael Bott
Tanja Gerharz
Ralf Takors
Bruno Zelic
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative production of pyruvate.
  • a classic method of producing pyruvate is the pyrolysis (ie the burning) of grape acid. Heavy metals and temperatures of around 200 ° C are required (Römp Chemie Lexikon, 1995).
  • the following microbial processes for pyruvate synthesis from lactate are also known: Production of pyruvate from lactate with permeabilized cells of the methylotrophic yeasts Hansenula polymorpha or Pichia pastoris, which express the gene for the (S) -hydroxy acid oxidase from spinach (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, JE; Gavagan J.E.; Payne, M.S.; Anton DL (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst.
  • Another method is the conversion of lactate to pyruvate with resting, anaerobically grown cells from Proteus mirabilis or Proteus vulgaris (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R) - lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). With this system, a 0.65 M lactate solution could be converted to pyruvate to 94% in 1 h.
  • glucose is used as a substrate for pyruvate production by means of full-line biotransformation by yeasts or bacteria, pyruvate being formed primarily by the reactions of glycolysis.
  • Torulopsis glabrata strains with multiple vitamin auxotrophy have been described which produced 1.17 mol pyruvate / mol glucose (Yonehara, T .; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159).
  • the maximum pyruvate concentration achieved with these strains in fed-batch fermentations was 67.8 g / L (0.77 M).
  • a comparable method for pyruvate production from glucose was also used for lipoic acid auxotrophic strains of Snterojbac er aerogenes (Yokota A.
  • the Enterohacter aerogenes strains When grown on glucose under conditions of deficiency in lipoic acid, the Enterohacter aerogenes strains produced a maximum of 0.8 moles of pyruvate per mole of glucose, the Escherichia coli Strains up to 1.2 moles pyruvate / mole glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y .; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an Fl-ATPase-defective mutant of Escherichia coli W1485lip2.Biosci.Biotechnol.Biochem.
  • the disadvantage of the microbial production of pyruvate from lactate is that the substrate must first be produced, e.g. B. with the help of lactic acid bacteria from glucose.
  • the decisive disadvantage of the processes for microbial pyruvate formation from glucose is that the yields achieved are significantly below the maximum theoretically achievable yield.
  • the microorganisms used in the process according to the invention can, for example, pyruvate from carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose, or from organic acids such as lactate or from alcohols such as z. B. produce glycerin. These substances can be used individually or as a mixture. It can be gram-negative bacteria, such as. B. Escherichia coli act. The strain Escherichia coli YYC202, deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under DSM number 14335, has proven to be particularly suitable.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • the term "less expressed” used in the following includes the weakening of the synthesis or the complete deletion of those for the pyruvate dehydro- genäse complex, the pyruvate formate lyase, the phosphoenolpyruvate synthetase and / or the pyruvate oxidase encoding genes or the reduction or elimination of the intracellular activity of said enzymes.
  • microorganism was on 01.06. 2001 deposited with the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) in accordance with the Budapest Treaty: Escherichia coli YYC202 as DSM 14335
  • the figures show an overview of the pyruvate metabolic pathway and experimental results of the method according to the invention.
  • Fig. 1 Overview of pyruvate pathway in E. coli
  • Fig. 5 C0 2 formation rate (CTR) and acetate uptake rate (ACR) during an aerobic fed-batch fermentation to obtain pyruvate with E. coli YYC202
  • PTS phosphotransferase system
  • Glucose-6-P glucose-6-phosphate
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • pps gene sequence coding for
  • PPS Phosphoenolpyruvate synthetase
  • aceEF gene sequence coding for the subunits El and E2 of the pyruvate dehydrogenase complex
  • pfB gene sequence coding for pyruvate formate lyase (PFL)
  • poxB gene sequence coding for pyruvate oxidase (POX)
  • the glucose is transported via the phosphotransferase system (PTS) through the cytoplasmic membrane (1) into the interior of the cell and then converted into pyruvate via glucose-6-phosphate and phosphoenolpyruvate (PEP).
  • PTS phosphotransferase system
  • PEP glucose-6-phosphate and phosphoenolpyruvate
  • Pyruvate can be made using pyruvate oxidase
  • POX encoded by the gene sequence poxB
  • pyruvate dehydrogenase complex which is a multienzyme complex consisting of several subunits (E1, E2), which are encoded by the gene sequence aceEF
  • E1, E2 subunits
  • pyruvate can be converted to acetyl-CoA using pyruvate formate lyase (PFL), encoded by the gene sequence pfB.
  • PFL pyruvate formate lyase
  • Pyruvate can also be converted back to phosphoenolpyruvate (PEP) with the help of phosphoenolpyruvate synthetase (PPS), encoded by the gene sequence poxB.
  • Figure 2 shows experimentally obtained results of an aerobic batch fermentation with E. coli YYC202.
  • the abscissa X indicates the time of the fermentation in hours (h).
  • the ordinate Yi shows the optical density (OD 6 oo) •
  • the ordinate Y 2 indicates the concentration of glucose or pyruvate in mM.
  • the time course of the biomass concentration, measured as optical density OD 6 oo /, is represented by the symbols ( ⁇ ).
  • the time course of the glucose concentration is represented by the symbol (•).
  • the time course of the pyruvate concentration is represented by the symbol ( ⁇ ).
  • Figure 3 shows experimentally obtained results of an aerobic batch fermentation with resting cells of E. coli YYC202.
  • the abscissa X indicates the time of the fermentation in hours (h).
  • the ordinate Y x shows the optical density (OD 600).
  • the ordinate Y 2 indicates the concentration of glucose or pyruvate in mM.
  • the time course of the biomass concentration, measured as optical density OD 6 oo, is represented by the symbols ( ⁇ ).
  • the time course of the glucose concentration is represented by the symbol (•).
  • the time course of the pyruvate concentration is represented by the symbol (T).
  • FIG. 4 shows experimentally obtained results of an aerobic fed-batch fermentation with E. coli YYC202 as a function of time (X).
  • the abscissa X indicates the time of the fermentation in hours (h).
  • the ordinate Yi shows the optical density (OD 6 oo).
  • the ordinate Y 2 gives that Concentration of glucose or pyruvate in mM.
  • the course of the biomass concentration, measured as optical density OD 6 o o is represented by the symbol ( ⁇ ).
  • the time course of the glucose concentration is represented by the symbol (T).
  • the time course of the pyruvate concentration is represented by the symbol (•).
  • Figure 5 shows experimentally obtained results of an aerobic fed-batch fermentation with E. coli YYC202 as a function of time.
  • the abscissa X indicates the time of the fermentation in hours (h).
  • the ordinate Yi or Y 2 indicates the C0 2 formation rate CTR (mmol / L * h) or the acetate uptake rate ACR (mmol / L * h).
  • the time course of the C0 2 formation rate CTR is represented by the symbol (o).
  • the time course of the acetate uptake rate ACR is represented by the symbol ( ⁇ ).
  • microorganisms whose activity of the enzymes converting pyruvate was reduced or completely inactivated by changing the nucleotide sequences coding for these enzymes, increased pyruvate production could be achieved.
  • These enzymes can be the pyruvate dehydrogenase complex, the pyruvate decarboxylase (especially in yeasts), the pyruvate formate lyase, the phosphoenolpyruvate synthetase and the pyruvate oxidase, the pyruvate: ferredoxin oxidore ductase (e.g.
  • doxin oxidoreductase Both yeasts and bacteria can be used as microorganisms. Microorganisms from the group of Enterobacteriaceae, especially from the genus Escherichia, have proven to be particularly suitable. The organism Escherichia coli YYC202 has proven to be very suitable. This bacterial strain has some genetic changes compared to the wild type strain (WT).
  • a conversion of the substrate into pyruvate could be achieved with resting cells as well as with growing cells, which was considerably higher than the yields achieved with previously known methods. Due to the genotype, the organisms are unable to convert pyruvate to acetyl-CoA, acetate or phosphoenolpyruvate. This acetate auxotrophy allows growth and product formation to be regulated by metering the essential co-substrate acetate. In property Unit of acetate and other nutrients such as. B. Nitrogen in the fermentation medium can take place due to metabolism cell division / growth. However, since part of the carbon source is used for the biosynthesis of new cell material during growth, a maximum pyruvate yield is not to be expected.
  • the process according to the invention can furthermore be used, for example, to produce labeled pyruvate in high yields, for example by B. C ⁇ 3 -marked coal- Substance sources are used.
  • the economy of this process is significantly improved by the high product yields.
  • the method according to the invention can additionally have a positive effect on the further metabolism of the organism, in that a high pyruvate pool is first generated and in the further specifically metabolic pathways are strengthened, such as, for. B. an increased lysine production with Corynebacterium glutamicum.
  • the growth was determined photometrically on the basis of the optical density at 600 nm (OD 6 o o ). 2 shows growth, glucose consumption and pyruvate formation at an initial acetate concentration of 2 mM. Table 1 shows the results of the tests. In the absence of acetate the organism showed no growth. With increasing acetate concentration the maximum growth rate and the maximum OO 6 oo t increased while the pyruvate yield decreased continuously. Nevertheless, yields of pyruvate were achieved which, at 1.3 to 1.7 moles of pyruvate / mole of glucose, were higher than those of the processes previously published.
  • Minimal glucose medium about 50% of the glucose consumed is used for the biosynthesis of new cell material. A maximum pyruvate yield (2 mol pyruvate / mol glucose) is therefore only possible with "resting", non-growing cells.
  • Cells from JE ? coli YYC202, which had been grown in M9 minimal medium with glucose and acetate, were centrifuged off and the cells were washed twice with 1/10 culture volume of 0.9% sodium chloride solution. The cells were then in a buffer (50 mM MES, 50 mM MOPS, and 50 mM TRICINE) with 10 mM glucose, but without acetate and other nutrients, such as. B.
  • the OD 6 oo of the cell suspension was approximately 1.0. Pyruvate formation was examined at pH 6, 6.5, 7, 7.5, and 8. The buffer mixture used was adjusted to the desired pH. After incubation of the cell suspension for 24 h at 37 ° C. on a rotary shaker at 140 rpm (revolutions per minute), the pyruvate concentration accumulated in the culture supernatant was determined using conventional analysis methods such as, for example, B HPLC or enzymatic tests determined. 3 shows the kinetics of glucose consumption and pyruvate formation at a pH of 7. Table 2 shows the results of the pyruvate yield at various pH values. It was found that the yield decreased at a pH above 7.
  • FIG. 4 and 5 illustrate this correlation on the basis of a fed-batch experiment in which an OD were 6 oo reached by 22 and a pyruvate concentration of approximately 330 mM. The glucose concentration was not limiting throughout the experiment.
  • the use of the relationship (1) makes it possible to implement targeted process control via the on-line measurement of the comparatively easily accessible signal CTR (for example via NIR (Near Infra Red) exhaust gas analysis). If a high growth rate is to be set, a non-limiting acetate supply can be adjusted. It is also possible to stop pyruvate production being as selective as possible under acetate-limiting conditions.
  • the use of relationship (1) thus enables the on-line control of the process, for example by using a CO 2 measurement analysis, to high space-time yields or high product / substrate selectivities or high product titles.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat. Die nach dem Stand der Technik bekannten chemischen Verfahren zur Herstellung von Pyruvat sind technisch aufwendig und kostenintensiv. Die bekannten biologischen Verfahren weisen den Nachteil auf, dass die Substrate nicht zu 100% in Pyruvat umgesetzt werden und dadurch die Produktausbeute verschlechtert wird. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich mikrobiell Pyruvat mit einer nahezu 100%igen Umsetzung des Substrates herzustellen. Durch Verwendung von Mikroorganismen, die genetisch verändert wurden, d. h. Deletion bzw. geringere Expression der Nukleotidsequenzen, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Decarboxylase, die Pyruvat:Ferredoxin-Oxido-reductase, die Pyruuvat:Flavodoxin-Oxidoreductase, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase und/oder die Pyruvat-Oxidase kodieren, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat.
Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d.h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995) . Weiterhin sind folgende mikro- bielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabi- lisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula po- lymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S) - Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R. ; Eisenberg, A. ; Seip, J.E.; Gavagan J. E . ; Payne, M. S . ; Anton D. L. (1997) : Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223-232; US-Patent 5538875) . Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H202 wird durch endogene Katalase zu H20 und 02 umgesetzt. Mit diesem Prozeß konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S) -Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B.A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme Systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol . Lett . 9: 253-258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H. ; Schinschel, C. (1993) : Preparation of pyruvate from (R) - lactate with Proteus species . J. Biotechnol . 31: 191- 203) . Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat- Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden. Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzeil-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzier- ten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994) : Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159) . Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed- Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M) . Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Snterojbac er aerogenes (Yokota A. (1989) : Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol . Chem. 53: 705-711) und Escheri - chia coli beschrieben (Yokota A. ; Shimizu, H. ; Terasawa Y. ; Takaoka, N. ; Tomita. F. (1994b) : Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638-643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterohacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/ Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H. ; Terasawa Y.; Takaoka, N. ; Tomita. F. (1994a) : Pyruvic acid production by an Fl-ATPase- defective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci . Biotechnol. Biochem. 58: 2164-2167; Yokota, A. ; Henmi, M. ; Takaoka, N. ; Hayashi, C. ; Takezawa Y. ; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997) : Enhancement of glucose metabo- lism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in Fl-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132-138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der entscheidende Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, mit dem es möglich ist, Pyruvat mit nahezu maximal erreichbaren Produktausbeuten mikrobiell zu gewinnen.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf- gäbe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen mit keiner oder reduzierter Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme: Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, Pyruvat-Decarboxylase, Pyruvat :Feredoxin-Oxidoreductase, Pyruvat :Flavodoxin-Oxidoreductase, Pyruvat-Formiat- Lyase, die Pyruvat-Oxidase und/oder die Phosphoenolpy- ruvat-Synthetase, in verbesserter Weise Pyruvat produziert werden konnte. Diese Reduzierung der Enzymaktivität bzw. komplette Inaktivierung der Enzyme kann beispielsweise durch genetische Veränderungen, z. B. nach Mutation, Deletion oder Reduzierung der Expression der Gene, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die
Pyruvat-Formiat-Lyase, die Pyruvat-Oxidase und/oder die Phosphoenolpyruvat-Synthetase kodieren, erreicht werden. Es konnte eine nahezu stδchiometrische Umsetzung der Kohlenstoffquelle in Pyruvat erreicht werden, d. h. beispielsweise:
CsHι206 (Glucose) + 02 -> 2 C3H403 (Brenztraubensäure) + 2 H20
Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose, Saccha- rose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cel- lulose, oder aus organischen Säuren wie z.B. Lactat oder auch aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Es kann sich um gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli handeln. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14335, erwiesen. Die- ser Organismus ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y. ; Cronan, J.E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon TnlO : location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol . 151: 1279-1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J.E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756-762; Georgiou, D. Gh.; Fang, H. ; Gennis, R.B. (1987): Iden- tification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107- 2112) . Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden. Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen können sowohl aerob als auch anaerob durchgeführt werden.
Der im folgenden verwendete Begriff „geringer expri- miert" beinhaltet die Abschwächung der Synthese bzw. die vollständige Deletion der für den Pyruvat-Dehydro- genäse-Komplex, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase und/oder die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gene oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.
Der im folgenden verwendete Begriff „natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstämmen, isoliert werden können.
Folgender Mikroorganismus wurde am 01.06. 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt : Escherichia coli YYC202 als DSM 14335
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoff- wechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens .
Es zeigt :
Fig. 1: Übersicht Pyruvat-Stoffwechselweg in E. coli
YYC 202
Fig. 2: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202 in M9-Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat .
Fig. 3: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202 bei pH 7
Fig. 4: Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202
Fig. 5: C02-Bildungsrate (CTR) und Acetataufnahmerate (ACR) während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202
Fig. 1 zeigt schematisch die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat im Stoffwechsel von E. coli YYC 202. Dabei be- zeichnet
PTS : Phosphotransferase-System
Glucose-6-P: Glucose-6-Phosphat PEP : Phosphoenolpyruvat pps : Gensequenz codierend für
Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PPS) aceEF: Gensequenz codierend für die Untereinheiten El und E2 des Pyruvat-Dehydroge- nase-Komplexes pflB: Gensequenz codierend für Pyruvat-Formiat- Lyase (PFL) poxB : Gensequenz codierend für Pyruvat-Oxidase (POX)
Die Glucose wird über das Phosphotransferase-System (PTS) durch die Cytoplasmamembran (1) in das Innere der Zelle transportiert und anschließend über Glucose-6- Phosphat und Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat umge- setzt. Pyruvat kann mit Hilfe der Pyruvat-Oxidase
(POX) , kodiert durch die Gensequenz poxB, zu Acetat umgesetzt werden. Mit Hilfe des Pyruvat-Dehydrogenase- Komplexes, welcher ein Multienzymkomplex ist, der aus mehreren Untereinheiten (El, E2) besteht, die durch die Gensequenz aceEF kodiert werden, wird die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert, welches dann zur weiteren Umsetzung in den Citrat-Zyklus eingeschleust werden kann. Unter anaeroben Bedingungen kann Pyruvat mit Hilfe der Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL) , kodiert durch die Gensequenz pflB, zu Acetyl-CoA umgesetzt werden. Weiterhin kann Pyruvat mit Hilfe der Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PPS) , kodiert durch die Gensequenz poxB, wieder zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgesetzt werden. Figur 2 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit E. coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Yi zeigt die optische Dichte (OD6oo) • Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD6oo/ wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkon- zentration wird durch das Symbol (▼) dargestellt.
Figur 3 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Yx zeigt die optische Dichte (OD 600) . Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als opti- sehe Dichte OD6oo, wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol (T) dargestellt.
Figur 4 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit (X) . Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Yi zeigt die optische Dichte (OD6oo) . Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration der Glucose bzw. des Pyruvats in mM an. Der Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD6oo wird durch das Symbol (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (T) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol (•) dargestellt.
Figur 5 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Yi bzw. Y2 gibt die C02-Bildungsrate CTR (mmol/L*h) bzw. die Ace- tat-Aufnahmerate ACR (mmol/L*h) an. Der zeitliche Ver- lauf der C02-Bildungsrate CTR wird durch das Symbol (o) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Acetat-Aufnahme- rate ACR wird durch das Symbol (■) dargestellt.
Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden. Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme durch Veränderung der für diese Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Diese Enzyme können den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat- Decarboxylase (insbesondere bei Hefen) , die Pyruvat- Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase, die Pyruvat : Ferredoxin-oxidore- ductase (z. B. bei Clostridien) oder die Pyruvat : Flavo- doxin-Oxidoreductase umfassen. Als Mikroorganismen können sowohl Hefen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist bekannt, daß folgende Gensequenzen so ver- ändert wurden, daß keine bzw. nur eine geringe Aktivität der von diesen Sequenzen kodierten Enzyme nachweisbar war: aceEF - kodierend für die Untereinheiten El und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, poxB - kodierend für die Pyruvat-Oxidase (POX) ; pps - kodierend für die Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS) ; pflB - kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL) . Die höchste Pyruvat-Ausbeute wird durch die Inaktivie- rung/Hemmung aller genannten Enzyme erreicht . Die Inak- tivierung eines einzelnen Enzyms, z. B. durch Deletion der aceEF-Gene führt jedoch ebenfalls zu einer deutlich erhöhten Pyruvat-Produktion.
Es konnte sowohl mit ruhenden Zellen als auch mit wachsenden Zellen eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher be- kannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage Pyruvat zu Acetyl-CoA , Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essen- tiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. In Anwesen- heit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthe- se neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. „ruhende" Zellen. Diese Zellen werden zunächst in ein Medium gegeben, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Auf Grund der Stoffwechseleigenschaften der Organismen können sowohl aerobe als auch anaerobe Fermentationen durchgeführt werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate (z. B. Tetrosen, Hexosen, Pentosen, Heptosen) , organische Säuren sowie auch Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. Cι3-markierte Kohlen- Stoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf den weiteren Stoff- Wechsel des Organismus auswirken, indem zunächst ein hoher Pyruvat-Pool erzeugt wird und im weiteren gezielt Stoffwechselwege verstärkt werden, wie z. B. eine erhöhte Lysinproduktion mit Corynebacterium glutamicum.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
1. Einfluß verschiedener Acetatkonzentrationen auf Wachstum und Pyruvat-Bildung Um den Einfluß der Acetatkonzentration auf Wachstum und Pyruvat-Bildung von Escherichia coli YYC202 zu untersuchen wurde der Organismus in M9-Minimalmedium (Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989): Molecular cloning, Second Edition, Vol. 3) mit 10 mM Glucose und Acetatkonzentrationen von 0, 1, 2, 6, und 10 mM kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute (Upm) wurde die im Kulturüberstand vorhandene Pyruvat-Konzentration mittels Hochdruckflüssig- keitschromatographie (HPLC) bestimmt. Das Wachstum wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm (OD6oo) photometrisch bestimmt. In Fig. 2 sind Wachstum, Glucose- Verbrauch und Pyruvat-Bildung bei einer initialen Ace- tat-Konzentration von 2 mM dargestellt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche. In Abwesenheit von Acetat zeigte der Organismus kein Wachstum. Mit steigender Acetatkonzentration stieg die maximale Wachstumsrate und die maximal erreichte OO6oo t während die Pyruvat- Ausbeute kontinuierlich abnahm. Dennoch konnten Pyruvat Ausbeuten erreicht werden, die mit 1,3 bis 1,7 Mol Py- ruvat/Mol Glucose höher waren als die der bisher publizierten Verfahren.
Tab. 1: Pyruvat-Ausbeute bei unterschiedlicher Acetat- Ausgangskonzentration im Medium
Figure imgf000016_0001
2. Pyruvat-Bildung mit „ruhenden" Zellen von Escherichia coli YYC 202 Bei aerobem Wachstum von E. coli Wildtypstämmen auf
Glucose-Minimalmedium werden ca. 50% der verbrauchten Glucose für die Biosynthese von neuem Zellmaterial eingesetzt. Eine maximale Pyruvat-Ausbeute (2 Mol Pyruvat/Mol Glucose) ist daher nur mit „ruhenden", nicht wachsenden Zellen möglich. Zur Charakterisierung der Pyruvat-Bildung durch solche Zellsuspensionen wurden Zellen von JE?, coli YYC202, die in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat gezüchtet worden waren, abzentrifu- giert und die Zellen zweimal mit 1/10 Kulturvolumen 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einem Puffer (50 mM MES, 50 mM MOPS, und 50 mM TRICINE) mit 10 mM Glucose, aber ohne Acetat und weitere Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff- und Schwefelquellen, resuspendiert. Die OD6oo der Zellsuspension betrug ca. 1,0. Die Pyruvat-Bildung wurde bei pH-Werten von 6, 6,5, 7, 7,5, und 8 untersucht. Das verwendete Puffergemisch wurde dabei auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Nach Inkubation der Zellsuspension für 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Upm (Umdrehungen pro Minute) wurde die im Kul- turuberstand akkumulierte Pyruvat-Konzentration mittels üblicher Analyseverfahren wie z . B HPLC oder enzymati- sche Tests bestimmt. In Figur 3 ist die Kinetik des Glucose Verbrauchs und der Pyruvat-Bildung bei einem pH-Wert von 7 dargestellt. In Tabelle 2 sind die Ergeb- nisse der Pyruvat-Ausbeute bei verschiedenen pH-Werten dargestellt. Es zeigte sich, daß die Ausbeute bei einem pH-Wert oberhalb 7 abnahm.
Tabelle 2: Pyruvat-Ausbeute mit ruhenden Zellen bei verschiedenen pH-Werten
Figure imgf000018_0001
3. Einfluß der Zellkonzentration ruhender Zellen von E. coli YYC202 auf die Pyruvat-Ausbeute
Zur Untersuchung des Einflusses der Zellkonzentration ruhender Zellen auf die Pyruvat-Ausbeute wurden Fermentationen mit ruhenden Zellen durchgeführt, die in unterschiedlichen Konzentrationen mit einer optischen Dichte ODeθo von 0,65 bis 5,77 eingesetzt wurden. Mit steigender Zellkonzentration war eine Zunahme der Pyruvat-Bildungsrate zu verzeichnen.
4. Fed-batch Fermentation zur Herstellung von Pyruvat mit i57. coli YYC202
Fed-batch Fermentationen zur Pyruvat-Produktion wurden im Labormaßstab (7,5 1 Bioreaktor) unter aeroben Bedingungen (p02 ≥ 40%) bei 37°C und pH 7 unter Verwendung des , Pan λ -Mediums (Pan, J.G.; Rhee, J.S.; Lebeault, J.M. (1987) : Physiological Constraints in Increasing Biomass Concentration of Escherichia coli B in Fed- batch Culture, Biotechnol . Letters, Vol 9 (2): 89-94.) durchgeführt. Aufgrund der Acetat-Auxotrophie des eingesetzten Produktionsstammes korreliert die C02- Bildungsrate ( CTR) des Citrat-Zyklus direkt mit der Acetat-Aufnahmerate (ACR) der Zellen. Unter Wachstums- bedingungen auf Glucose mit Acetat konnte die allgemeine Beziehung
CTR = const. (1)
ACR gefunden werden, wobei die Konstante den Wert 1 annimmt. Die Figuren 4 und 5 verdeutlichen diese Korrelation anhand eines fed-batch Experimentes, bei dem eine OD6oo von 22 und eine Pyruvat-Konzentration von ca. 330 mM erreicht wurden. Die Glucose-Konzentration war während des gesamten Experimentes nicht limitierend. Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht es, eine gezielte Prozessführung über die on-line Messung des vergleichsweise einfach zugänglichen Signals CTR (z. B. via NIR (Near Infra-Red) -Abgasanalytik) zu realisieren. Soll eine hohe Wachstumsrate eingestellt werden, so kann eine nicht-limitierende Acetatversorgung eingeregelt werden. Ebenso ist es möglich, eine möglichst hoch selektive Pyruvat-Produktion unter Acetat-limitierenden Bedingungen einzustellen. Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht somit die on-line Regelung des Prozesses über beispielsweise Einsatz eiern C02 Meßanalytik hin zu hohen Raum-Zeit-Ausbeuten oder hohen Produkt/Substrat-Selektivitäten oder hohen Produkttitern.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen, deren Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für den Pyruvat-Dehydrogenase- Komplex kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Pyruvat-Decarboxylase kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer expri- miert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Pyruvat : Ferredoxin- Oxidoreductase kodieren, deletiert werden oder ge- genüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Pyruvat : Flavodoxin- Oxidoreductase kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Pyruvat-Formiat-Lyase kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Phosphoenolpyruvat- Synthetase kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die Pyruvat-Oxidase kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vor- kommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
9. Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die aceE und aceF-Gene kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die poxB-Gene kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommen- den Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die pps-Gene kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Nukle- otidsequenzen, die für die pflB-Gene kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommen- den Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacte- riaceae eingesetzt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia eingesetzt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli YYC 202, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 14335, eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl anaerobe als auch aerobe Fermentationen durchgeführt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat bei der Fermentation Kohlenhydra- te, organische Säuren oder Alkohole eingesetzt werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß Acetat bei der Fermentation mit wachsenden Zellen eingesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 dadurch gekennzeichnet, daß bei Fermentationen mit ruhenden Zellen kein Acetat eingesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Fermentationen eine C02 Meßanalytik eingesetzt wird.
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