ES2252422T3 - Procedimiento de produccion de l-treonina. - Google Patents
Procedimiento de produccion de l-treonina.Info
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Abstract
Un procedimiento para producir L-treonina usando un microorganismo, en el que se integran una o más copias de cada uno de los genes de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y del operón de treonina en un sitio particular del ADN cromosómico del microorganismo, mientras que se mantienen sus propios genes de fosfoenolpiruvato carboxilasa y del operón de treonina.
Description
Procedimiento de producción de
L-treonina.
La presente invención se refiere a la producción
de L-treonina que involucra microorganismos. La
presente invención, más particularmente, se refiere a un
procedimiento para producir L-treonina con un alto
rendimiento, en el que se insertan una o más copias adicionales del
gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) y el operón de treonina
en un sitio particular del ADN cromosómico de un microorganismo,
mientras su gen inherente ppc y el operón de treonina permanecen,
para aumentar la expresión del gen ppc que codifica una enzima para
convertir fosfoenolpirvato en oxaloacetato, el que es un precursor
biosintético de la treonina, y la expresión de genes que codifican
la enzima comprometida en la ruta sintética de la treonina a partir
del oxaloacetato, tal como la aspartoquinasa
l-homoserina dehidrogenasa (thrA), quinasa de
homoserina (thrB) y sintetasa de treonina (thrC).
La L-treonina, un aminoácido
esencial, se usa ampliamente como un aditivo en piensos para
animales y alimentos y como fluidos y materiales sintéticos para uso
médico y farmacéutico. La L-treonina se produce por
fermentación usando mutantes sintéticos derivados de cepas salvajes
de Escherichia coli, Corynebacterium, Serratia y
Providencia. Se sabe que estas cepas incluyen análogos de
aminoácidos, mutantes resistentes a productos farmacéuticos y
mutantes sintéticos resistentes a productos farmacéuticos que se
convierten en auxotróficos para el ácido diaminopimélico,
metionina, lisina o isoleucina (Solicitud de Patente Japonesa en
Trámite Nº hei 2-219582, Appl., Microbiol.
Biotechnol., 29, 550-553 (1988) y Publicación de
Patente Coreana Nº 92-8365).
Un enfoque común para aumentar el nivel de
expresión de un gen particular usa un plásmido que da un mayor
número de copias a un microorganismo para aumentar el número de
genes en el microorganismo (Sambrook y col. Molecular cloning,
Second edition, 1989, 1.3-1.5). Un gen blanco se
integra a un plásmido, y el microorganismo huésped se transforma con
el plásmido recombinante para provocar un aumento en el número de
genes en el microorganismo huésped de acuerdo con el número de
copias en el plásmido. Se reporta un éxito parcial en este tipo de
acercamiento para mejorar la productividad de treonina en la
Patente de EEUU Nº 5.538.873. Sin embargo, la mayoría de las
tecnologías que usan tales plásmidos recombinantes sobreexpresan un
gen particular, lo que es indeseable para el microorganismo huésped
y causa un problema de inestabilidad en el plásmido de modo que el
plásmido se pierde durante el cultivo de la cepa recombinante.
Para tratar el problema, se sugirieron
acercamientos para agregar antibióticos al medio de cultivo o para
usar un plásmido regulatorio de la expresión (Sambrook y col.
Molecular Cloning, Second Edition, 1989, 1.5-1.6
& 1.9-1.11). Usando el plásmido regulatorio de
la expresión para producir un producto en particular, el cultivo
celular se efectúa bajo condiciones de no expresión en la etapa de
crecimiento para reducir una carga en el microorganismo huésped y se
induce una expresión temporal, tras el crecimiento completo del
microorganismo. Sin embargo, la mayoría de los plásmidos reguladores
de la expresión apuntan a la síntesis de la proteína. La producción
de los metabolitos primarios está estrechamente asociada con el
crecimiento de los microorganismos, de modo que resulta difícil
aumentar el rendimiento de los metabolitos primarios a menos que los
genes blanco se expresen en la etapa de crecimiento. La producción
de treonina, que es un metabolito primario, es uno de esos
casos.
Como un intento para compensar este
inconveniente, se incorporó un gen biosintético de treonina
particular en un ADN cromosómico para producir treonina (Patente de
EEUU Nº 5.939.307). Sin embargo, esta aproximación reemplaza un gen
cromosómico por un gen inducible sustituido con un promotor, del
cual casi no se espera que aumente de manera marcada la expresión
del gen de operón de treonina.
Por lo tanto, a diferencia del procedimiento de
sustitución convencional, los presentes inventores insertaron un gen
ppc adicional y un operón de treonina en un sitio particular de ADN
cromosómico (gen lacZ), mientras que permanece el gen cromosómico
original del microorganismo huésped y se encontró que provee un
efecto doble como resultado del gen cromosómico original y el gen
ppc insertado y el operón de treonina. La mayoría de las técnicas
actuales de ingeniería genética que se aplican para aumentar el
rendimiento de la treonina están enfocadas en la ruta biosintética,
comenzando con oxaloacetato. Sin embargo, la presente invención
incluye también ppc, que es una enzima inductora de oxaloacetato
que actúa en la etapa precedente, así como las enzimas biosintéticas
de treonina para dirigir intencionalmente el flujo de carbonos
desde el fosfoenolpiruvato hacia la ruta de síntesis de
oxaloacetato. La presente invención permite también la inserción de
dos o más copias del gen, si fuera necesario.
Para solucionar los problemas descritos
anteriormente, un objetivo de la presente invención es proveer un
procedimiento de producción de L-treonina de alto
rendimiento que elimina los problemas de inestabilidad del plásmido
y la inhibición del crecimiento microbiano que se origina en las
cepas que contienen plásmidos recombinantes y al mismo tiempo
aumenta la expresión del gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc)
y el operón de treonina.
El objetivo de la presente invención se logra
mediante un procedimiento para producir L-treonina
usando un microorganismo, se integran adicionalmente una o más
copias de cada uno de los genes de fosfoenolpiruvato carboxilasa y
del operón de treonina en un sitio particular del ADN cromosómico
del microorganismo, mientras permanece su propio gen de
fosfoenolpiruvato carboxilasa y el operón de treonina.
De acuerdo con la presente invención, mediante la
incorporación de una o más copias del gen ppc y el operón de
treonina en el ADN cromosómico, los niveles de expresión del gen
ppc, que codifica una enzima para convertir el fosfoenolpiruvato en
un precursor de la síntesis de treonina, oxaloacetato y los genes de
enzimas involucradas en la síntesis de treonina desde oxaloacetato,
tales como thrA (aspartoquinasa l-homoserina
dehidrogenasa), thrB (quinasa de homoserina) y thrC (sintetasa de
treonina).
De acuerdo con la presente invención, se puede
usar cualquier microorganismo capaz de producir
L-treonina, incluyendo Escherichia coli,
Corynebacterium, Serratia y Providencia, pero de
preferencia Escherichia coli.
Resulta de preferencia que el gen ppc y el operón
de treonina insertados adicionalmente en el microorganismo derive de
un microorganismo (mutante sintético) resistente a los análogos de
treonina, análogos de lisina, análogos de isoleucina y análogos de
metionina.
De acuerdo con la presente invención, el gen ppc
y el operón de treonina pueden ser insertados adicionalmente en
cualquier sitio del ADN cromosómico, excepto para el operón de
treonina original, pero de preferencia dentro del sitio del gen
lacZ.
En el procedimiento de producción de
L-treonina de acuerdo con la presente invención,
resulta de preferencia que se inserten un gen ppc obtenido a partir
del cromosoma de una cepa de E. coli que produce
L-treonina, por reacción en cadena de polimerasa
(PCR) y un operón de treonina clonado del mismo cromosoma TF4076
(KFCC 10718), en el cromosoma de la cepa de E. coli huésped
TF4076.
El operón de treonina y el gen de
fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) usados se clonaron a partir del
cromosoma de TF4075 (Identificador Único: KFCC10718, Solicitud de
Patente Coreana Nº 90-22965). Esta cepa es
auxotrófica para metionina y resistente a los análogos de treonina
(AHV: ácido
alfa-amino-beta-hidroxivalérico),
análogos de lisina (AEC:
S-(2-aminoetil)-L-cisteína),
análogos de isoleucina (ácido alfa-aminobutírico) y
análogos de metionina (etionina).
Se usó pBRINT- TsGm, un vector de plásmido para
uso en la integración cromosómica, (Sylvie Le Beatriz y col., 1998,
pBRINT-Ts: A plasmid family with a
temperature-sensitive replicon, designed for
chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia
coli., Gene., 223, pág. 213-219). Este vector
tiene sensibilidad a la temperatura; integra los genes clonados de
un plásmido en un sitio del gen lacZ del ADN cromosómico cuando se
cultiva a 37ºC, mientras los plásmidos restantes en el plasma se
pierden cuando la temperatura de cultivo se eleva hasta 44ºC.
El gen ppc derivado del cromosoma de TF4076 por
reacción en cadena de polimerasa (PCR) y el operón de treonina
derivado de un vector clonado con el operón de treonina, pAT94
(Solicitud de Patente Coreana Nº 92-24732), se
clonaron en los sitios BamH I y EcoR I de
pBRINT-TsGm para construir un vector de plásmido
recombinante pGmTN-PPC. La cepa TF4076 se transformó
con el vector de plásmido recombinante y luego se cultivó a 37ºC
para inducir la integración del gen clonado ppc y el operón de
treonina en el sitio del gen lacZ del ADN cromosómico.
Posteriormente, se continuó con el cultivo a 44ºC para eliminar los
plásmidos restantes en la cepa huésped.
Se seleccionaron visualmente en busca de cepas
recombinantes las colonias resistentes a gentamicina y sensibles a
carbenicilina, de color blanco, no azul, en un medio sólido que
contiene X-gal e IPTG. Este procedimiento de
selección se basa en el principio que la integración de los genes
ppc y el operón de treonina en el gen lacZ del ADN cromosómico
inactiva el gen lacZ para perder su capacidad para descomponer el
cromóforo X-gal.
Estas cepas recombinantes seleccionadas se
compararon con las cepas huésped con respecto a su productividad de
treonina. Como resultado, la cepa huésped produjo 20 g/l de treonina
en 48 horas mientras que pGmTN-PPC (Identificador
Único: KCCM-10236), una de las cepas recombinantes
con el gen ppc y el operón de treonina integrados en el ADN
cromosómico, mostró una productividad de treonina más alta de 27,0
g/l, con un rendimiento de aproximadamente 35% (ver Ejemplo 4). La
cepa pGmTN-PPC produce 102 g/l de treonina por
fermentación en un fermentador de 5 l con un rendimiento de 35,4%
más alto que la cepa huésped (ver Ejemplo 5).
La Fig. 1 muestra un procedimiento de clonación
del gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc); y
La Fig. 2 muestra la construcción de un plásmido
recombinante pGmTN-PPC clonado con el gen ppc y el
operón de treonina.
La presente invención se describirá en mayor
detalle por medio de los ejemplos presentados a continuación. Los
ejemplos siguientes tienen un propósito ilustrativo y no intentan
limitar el alcance de la invención.
El procedimiento de clonación del gen de
fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) se ilustra en la Fig. 1. El gen
ppc se obtuvo de una cepa que produce treonina, TF 4076. Se aisló el
ADN cromosómico, se digirió con la enzima de restricción Sal I, y se
sometió a electroforesis para aislar selectivamente fragmentos de
ADN de 4-5 kb. Se amplificó el gen ppc usando los
fragmentos aislados de ADN como molde y usando como iniciador 1
(5'-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3')
y como iniciador 2
(5'-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3').
El producto amplificado se digirió con EcoR I y Hind III y se
sometió nuevamente a electroforesis para aislar finalmente un
fragmento del gen ppc de 2,8 kb. Se usaron un
pBRINT-TsGm de 7,6 kb, un tipo de vectores
pBRINT-Ts, de la Universidad Nacional de México para
la clonación (Sylvie Le Beatriz y col., 1998,
pBRINT-Ts: A plasmid family with a
temperature-sensitive replicon, designed for
chromosomal integration into de lacZ gene of Escherichia
coli., Gene., 223, pág. 213-219). Se sometió el
pBRINT-TsGm a una doble digestión con las mismas
enzimas de restricción, EcoR I y Hind III y se unió con el fragmento
de gen ppc aislado por medio de la Ligasa de ADN T4. La cepa de
E. coli DH5\alpha se transformó con el ADN unido mediante
electroporación y se cultivó en medio sólido LB [extracto de
levadura 5 g/l; bactotriptona 10 g/l; cloruro de sodio 10 g/l;
bactoagar 1,7%; pH 7,0] que contiene antibióticos, 50 mg/l de
carbenicilina y 5 mg/l de gentamicina. A continuación, se juntaron
las colonias únicas. Las colonias únicas se cultivaron en un medio
LB que contenía los mismos antibióticos para aislar los plásmidos de
las cepas crecidas. El tamaño de cada plásmido se identificó
primariamente y se sometió a doble digestión con EcoR I y Hind III
para aislar un fragmento de ADN de 2,8 kb. Los fragmentos de ADN
resultantes se identificaron para completar mediante los mismos la
construcción de un plásmido recombinante pGmPPC (10,7 kb)
conteniendo el gen ppc.
Se usó el vector de plásmido recombinante pA194
(Solicitud de Patente Coreana Nº 92-24732)
construido por clonación con el ADN cromosómico de TF4076 para el
operón de treonina y se usó el plásmido recombinante pGmPPC del
Ejemplo 1 para el gen ppc. Se usó pBRINT-TsGm, un
tipo de los vectores pBRINT-Ts, de la Universidad
Nacional de México como vector de integración del ADN cromosómico
(Sylvie Le Beatriz y col., 1998, pBRINT-Ts: A
plasmid family with a temperature-sensitive
replicon, designed for chromosomal integration into de lacZ gene of
Escherichia coli., Gene., 223, pág. 213-219).
Se ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido
recombinante en la Fig. 2. El pAT94 se sometió a doble digestión con
enzimas de restricción Hind III y BamH I y se aislaron fragmentos de
ADN de operón de treonina de 6,4 kb tras la doble digestión mediante
electroforesis. El pGmPPC se sometió a doble digestión con Hind III
y EcoR I para aislar fragmentos del gen ppc de 2,8kb. El vector de
plásmidos pBRINT-TsGm se digirió con EcoR I y BamH
I, y se aislaron fragmentos completamente digeridos por el mismo
procedimiento. El digerido del vector de plásmido resultante, los
fragmentos aislados el ADN del operón de treonina y los fragmentos
del gen ppc se mezclaron y unieron mediante ligasa de ADN T4. La
cepa de E.coli DH5\alpha se transformó con el producto
ligado mediante electroporación y se cultivó en un medio sólido LB
[extracto de levadura 5 g/l; bactotriptona 10 g/l; cloruro de sodio
10 g/l; bactoagar 1,7%; pH 7,0] conteniendo antibióticos, 50 mg/l de
carbenicilina y 5 mg/l de gentamicina. A continuación, se
recolectaron las colonias únicas. Éstas se cultivaron en un medio LB
conteniendo los mismos antibióticos para aislar los plásmidos de
las cepas desarrolladas. El tamaño de cada plásmido se identificó
primariamente y se los sometió a doble digestión con EcoR I y BamH I
para aislar fragmentos de ADN de 9,2 kb y 7,9 kb. Los fragmentos de
ADN resultantes se identificaron para la construcción completa de
un plásmido recombinante pGmTN-PPC (17,1 kb)
conteniendo el operón de treonina y el gen ppc.
Se transformó TF4076, una cepa que produce
treonina, con el plásmido recombinante pGm TN-PPC
aislado de la cepa de DH5\alpha de E. coli, cultivada en un
medio sólido LB [extracto de levadura 5 g/l; bactotriptona 10 g/l;
cloruro de sodio 10 g/l; bactoagar 1,7%, pH 7,0] conteniendo 5 mg/l
de gentamicina y se cultivó durante 60 horas a 30ºC. Cada colonia
única se inoculó en 0,5 ml de LB y se incubó durante 4 horas a 30ºC.
Una alícuota del cultivo se transfirió a 10 ml de LB, se incubó
durante 6 horas a 30ºC y durante la noche a 37ºC. Se inoculó una
dilución 10^{-3}- 10^{-6} del cultivo en un medio sólido LB
conteniendo 5 mg/l de gentamicina. En este momento, también se
inocularon en el medio sólido LB, 12 \mul de IPTG (0,1 M) y 60
\mul de X-gal (2%). Tras la incubación durante 24
horas a 44ºC, las cepas recombinantes se seleccionaron para buscar
colonias blancas sensibles a la carbenicilina, que no pueden crecer
en el medio sólido LB conteniendo 15 mg/l de carbenicilina. Las
cepas recombinantes seleccionadas confirmaron la presencia de los
plásmidos esperados, en los cuales estaban integrados el gen ppc y
el operón de treonina en el sitio del gen lacZ del ADN cromosómico
de cada cepa.
Se seleccionaron treinta colonias únicas de las
cepas recombinantes con los plásmidos recombinantes integrados en
sus cromosomas para comparar la de productividad de treonina usando
un medio de valoración de treonina en matraces Erlenmeyer. La
composición del medio de valoración de treonina usada en cada caso
se muestra en la Tabla 1. Se cultivaron las colonias en un medio
sólido LB durante toda la noche en una incubadora a 32ºC. Se
inocularon 20 ml del medio de valoración con un ansa cargado de cada
cultivo y se incubó a 32ºC, 250 rpm durante 48 horas. Los resultados
del análisis se muestran en la Tabla 2. En su totalidad, las treinta
colonias de cepas recombinantes mostraron excelente productividad,
incluyendo ocho colonias que produjeron 26 g/l de treonina o más,
comparadas con la cepa huésped, TF4076 que produjo 20 g/l de
treonina. La cepa recombinante, que registró la mayor productividad
de treonina a 27g/l con un rendimiento 35% mayor que la cepa
huésped, se llamó "pGmTN-PPC12". La cepa
pGmTN-PPC12 se presentó el 5 de enero de 2001 en la
Korean Collection for Type Cultures (KCTC) y se le asignó el
Identificador Único KCCM 10236.
Componente | Cantidad por litro |
Glucosa | 70 g |
(NH_{4})_{2}SO_{4} | 28 g |
KH_{2}PO_{4} | 1,0 g |
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O | 0,5 g |
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 5 mg |
MnSO_{4}\cdot8H_{2}O | 5 mg |
Carbonato de calcio | 30 g |
L-metionina | 0,15 g |
Extracto de levadura | 2 g |
pH 7,0 |
Concentración de L-treonina | 20-22 g/l | 22-24 g/l | 24-26 g/l | 26 g/l o mayor |
Recuento de colonias | 7 | 6 | 9 | 8 |
Se comparó la productividad de treonina en un
fermentador entre la cepa recombinante pGmTN-PPC12
seleccionada de su valoración más alta de treonina del Ejemplo 4 y
la cepa huésped TF4076. La composición del medio inicial usada se
muestra en la Tabla 3. Se usó para sembrar el cultivo medio LB que
contenía además 10 g de glucosa y 0,1 g de
L-metionina por litro y se determinó un volumen
inicial de inoculación en un fermentador a 3-5% en
volumen como objetivo del cultivo inicial. Se agregó glucosa a una
concentración final de 5% en peso cada vez, durante 6 veces en
total, junto con KH_{2}PO_{4} al 1% en peso. Aquí, cada agregado
de glucosa se determinó mediante la deleción de glucosa. El volumen
inicial del cultivo fue 1,5 l y el volumen final del cultivo fue 3,0
l. La concentración total de glucosa agregada durante la
fermentación fue de 250 g/l. Durante las fermentaciones, el medio se
agitó a 700-1000 rpm, se controló la temperatura a
32 ºC y se ajustó el pH a 7,0 con 25-28% de agua con
amoníaco. Se ajustó la velocidad del flujo de aire a 0,1 vvm. Los
resultados se muestran en la Tabla 4. Como se muestra en la Tabla 4,
la cepa huésped TF4076 produce 75,3 g/l de treonina con un
rendimiento de 30,1% con respecto al consumo de glucosa. En
contraste, la cepa recombinante pGmTN-PPC12 produce
102 g/l de treonina con un rendimiento de 40,8%, lo que es un 35,4%
mayor que la cepa huésped TF4076. Además, se observó un patrón de
fermentación similar al de la cepa huésped en la cepa recombinante,
sin reducción en el consumo de azúcar durante la fermentación, lo
que aparece a menudo en las cepas recombinantes debido a la
inhibición del crecimiento.
Componente | Cantidad por litro |
Glucosa | 50 g |
KH_{2}PO_{4} | 4 g |
(NH_{4})_{2}SO_{4} | 6 g |
Extracto de levadura | 3 g |
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O | 2 g |
L-metionina | 1 g |
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 40 mg |
MnSO_{4}\cdot8H_{2}O | 10 mg |
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O | 40 mg |
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O | 4 mg |
H_{3}BO_{3} | 5 mg |
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O | 2 mg |
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 2 mg |
pH 7,0 |
Cepa | Treonina (g/l) | Tiempo de Fermentación (h) | Rendimiento (%) |
TF4076 | 75,3 | 78 | 30,1 |
pGmTN-PCC12 | 102 | 77 | 38,0 |
Como se describe anteriormente, de acuerdo con la
presente invención, dos o más genes ppc y operones de treonina se
incluyen en el ADN cromosómico para de esta manera mejorar la
expresión del gen ppc, el que codifica una enzima para convertir
fosfoenolpiruvato en un precursor de la biosíntesis de treonina,
oxaloaceteto y los genes que codifican las enzimas involucradas en
la ruta sintética de treonina a partir de oxaloacetato, incluyendo
thrA (aspartoquinasa l-homoserina dehidrogenasa),
thrB (homoserina quinasa) y thrC (treonina sintetasa). La presente
invención puede mejorar notablemente la productividad de
L-treonina en un 35% más que la cepa huésped.
Claims (7)
1. Un procedimiento para producir
L-treonina usando un microorganismo, en el que se
integran una o más copias de cada uno de los genes de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa y del operón de treonina en un sitio
particular del ADN cromosómico del microorganismo, mientras que se
mantienen sus propios genes de fosfoenolpiruvato carboxilasa y del
operón de treonina.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el microorganismo es Escherichia coli.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y del operón de
treonina que se quieren integrar adicionalmente derivan de un
microorganismo resistente a los análogos de treonina, análogos de
lisina, análogos de isoleucina y análogos de metionina.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y del operón de
treonina se integran adicionalmente en el sitio del gen lacZ del ADN
cromosómico.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa obtenido del
cromosoma de una cepa de E. coli que produce treonina,
TF4076, con Identificador Único KFCC 10718 por reacción en cadena de
polimerasa (PCR) y el operón de treonina clonado a partir de dicha
cepa de E. coli se incorporan dentro del cromosoma de la cepa
huésped de E. coli TF4076.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el microorganismo se construye con el plásmido recombinante
pGmTN-PPC de la Fig. 2.
7. La cepa de Escherichia coli
pGmTN-PPC12 con Identificador Único KCCM 10236 capaz
de producir L-treonina.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR2001006976 | 2001-02-13 | ||
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