KR20030075902A - Ｌ―쓰레오닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산함에 있어서, 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 유전자의 일부를 재조합 방법에 의하여 불활성화시킨 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 미생물, 특히 쓰레오닌 오페론에 함유된 효소들의 활성과 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자 활성이 강화된 균주에서, 쓰레오닌 분해와 관련된 4개의 경로 중 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc유전자)를 타겟으로 하여 특이적으로 불활성시켰고, 그 결과 L-쓰레오닌의 생산량을 획기적으로 향상시킬 수가 있었다.

Description

Ｌ―쓰레오닌의 제조방법{Process for producing L-threonine}

본 발명은 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 유전자의 일부를 재조합 방법에 의하여 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 획기적으로 향상시키는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. L-쓰레오닌은 발효법으로 제조하는데 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주를 사용하고 있다. 이러한 변이 균주들로는 아미노산 유사체 및 약제 변이 내성주 또는 이들 내성주에 디아미노피메릭산, 메티오닌, 라이신, 이소루이신 영양요구성을 부여한 인공변이주가 공지되어 있다. 이러한 변이주들은, 일본국 공개특허출원 평2-219582호, Appl. Microbiol. Biotechnol., 29. 550-553(1988), 한국 특허공고 제92-8365호 등에 공지되어 있으며, 또한 특허출원 제90-22965호에 공지된 L-쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC10718)는 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체(AHV: α-아미노-β-하이드록시 발레릭산)에 대한 내성, 라이신 유사체(AEC: S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(α-아미노부티릭에시드) 대한 내성, 메티오닌의 유사체(에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다.

일반적으로 특정 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로는, 1개의 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법이 있는데, 이러한 목적을 위해서는 통상 1개의 미생물당 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드(plasmid)를 사용한다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2판, 1989, 1.3~1.5). 즉 플라스미드에 원하는 유전자를 삽입하고 이러한 재조합 플라스미드를 다시 미생물에 형질전환시킴으로써 1개의 미생물당 그 플라스미드의 카피 수 만큼 유전자를 늘려주는 효과를 기대할 수 있다. 이러한 방법으로 쓰레오닌의 생산성 향상을 시도하여 부분적인 성공이 보고된 바 있다 (미국특허: 5,538,873). 그러나 이러한 플라스미드를 이용한 기술은 대부분의 경우에 있어서 특정 유전자만을 지나치게 발현시킴으로써 숙주 미생물에 큰부담으로 작용하며 재조합 균주의 배양 중에 플라스미드를 소실하게되는 플라스미드 안정성 등의 문제를 야기시킨다.

따라서 이러한 문제를 해결하고자 배양액 중에 항생제를 첨가해 주거나 발현의 조절이 가능한 플라스미드를 사용하는 방법들이 개발되었다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2판, 1989, 1.5~1.6, 1.9~1.11). 발현조절이 가능한 플라스미드를 사용하는 경우는 생장기에는 유전자의 발현이 일어나지 않는 조건에서 배양하여 숙주 미생물에 부담을 덜어주다가 미생물이 충분히 자란 후에 일시적으로 발현을 유도함으로써 목적물을 얻는 방법이다. 그러나 이러한 플라스미드들 대부분은 최종 목적물이 단백질인 경우에만 해당된다. 목적물이 1차 대사산물인 경우는 미생물의 생장과 밀접한 관련이 있기 때문에 생장기에 목적 유전자의 발현의 효과를 보지 못하면 유전자 발현에 의한 1차 대사산물의 증가 효과를 기대하기 힘들다. 1차 대사산물의 일종인 쓰레오닌도 동일한 경우에 해당한다고 할 수 있다.

따라서 이러한 단점을 보완하기 위한 노력으로 쓰레오닌 생산을 위하여 쓰레오닌 생합성 관련 특정유전자를 염색체 DNA중에 삽입 방법이 이용된 사례가 있었다(미국특허: 5,939,307). 그러나, 이 경우는 프로모터를 인듀서블(inducible) 프로모터로 교환해 준 유전자를 염색체 중에 존재하는 동일한 유전자와 치환하는 방법을 이용하기 때문에 쓰레오닌 오페론 유전자들의 획기적인 발현 증가를 기대하기 어려웠다.

이에 본 발명자들은 종래의 치환 방법과는 달리 미생물의 염색체에 존재하는 쓰레오닌 분해효소 중 하나인 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 유전자를 불활성화시키는 방법을 사용함으로써, 원래 숙주 미생물이 가지고 있는 유전자의 효능을 그대로 활용하면서 쓰레오닌 분해를 억제함으로써, 쓰레오닌의 수율을 높이는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

지금까지의 유전공학적인 방법으로 쓰레오닌 수율 향상을 위한 연구로서는 주로 옥살로아세테이트로부터 쓰레오닌에 이르는 생합성 경로에만 집중하였지만, 본 발명에서는 그러한 효소 외에 쓰레오닌 분해 경로 중 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 활성 부분까지 관여시킴으로써, 쓰레오닌 생산량을 더욱 안전하게 획기적으로 높이고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 플라스미드를 사용한 유전자 재조합 균주의 단점으로 지적되고 있는 플라스미드의 불안정성과 생육저해 등을 해결함과 동시에 쓰레오닌 분해 효소의 억제를 통해 획기적인 쓰레오닌 생산성 향상을 달성할 수 있는 L-쓰레오닌이 제조방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 재조합 플라스미드 pT7Blue/tdc 제작 과정을 도시한 것이고,

도 2는 재조합 플라스미드 pT7Δtdc::loxpKan 제작 과정과 Δtdc::loxpKan DNA 절편 제작 과정을 도시한 것이고,

도 3은 FLA-5000 imaging system (FUJIFILM)을 이용하여 이미지 스캐닝한 서던 블랏 분석 결과로서, 레인 1, 4는 사이즈 마커이고, 레인 2는 TRN212(KCCM-10353), 레인 3은 모균주인 pGmTN-PPC12를 나타낸다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 유전자가 불활성화된 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 재조합 플라스미드는 쓰레오닌 생산성 미생물의tdc오페론 중에tdcB 와tdcC의 일부를 절단하고 절단 부위 사이에 항생제 마커가 들어간 카세트를 삽입하여tdc오페론 작용을 불활성화시킬 수 있으며, 이 때 쓰레오닌 생산성 미생물은 대장균인 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 대장균은 쓰레오닌 유사체, 라이신 유사체, 이소루이신 유사체와 메티오닌 유사체에 대해 내성을 보일 수 있으며, 또한 본 발명의 또다른 일실시예에 의하면, 상기 대장균은 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 쓰레오닌 오페론이 추가로 1 카피 이상 염색체 DNA 중에 삽입될 수 있다.

바람직하게는, 상기 대장균은E.colipGmTN-PPC12(KCCM-10236)일 수 있다.

또한, 상기 재조합 플라스미드는 도 1에 도시된 pT7Blue/tdc를 이용하여tdc오페론 작용을 불활성화시킨 것일 수 있으며, 이것은 도 2의 pT7Δtdc::loxpKan로 나타내어지는 재조합 플라스미드일 수 있다.

본 발명은 더 나아가, 상기 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 제공한다. 상기 대장균은 상기 재조합 플라스미드로부터 추출된, 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편이 다시 염색체로 삽입된 것일 수 있으며, 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편은 도 2에 도시된 Δtdc::loxpKan일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 대장균은E. coliTRN212(KCCM-10353)로 명명된 대장균이다.

본 발명은 더 나아가, 상기 대장균을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다. 이 때, 대장균은 바람직하게는E. coliTRN212(KCCM-10353)일 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명한다.

L-쓰레오닌 대사 분해와 관련하여서 몇가지의 경로가 알려져있는데(Neidhardt FC et al. (eds)Escherichia coliandSalmonella: cellular and molecular biology, 2nd edn. ASM Press. Washington DC, pp 369-370), 그 중 대표적인 것은, 첫째, 쓰레오닌 디하이드로게나아제에 의해 α-아미노-β-케토부티레이트로 분해되어 이 것이 아세틸-CoA 및 글리신으로 전환되거나 또는 동시에 아미노아세톤으로 분해되어 피루베이트로 전환되는 경로, 둘째, 쓰레오닌 디하이드라타아제에 의해 α-케토부티레이트가 생성되어 프로피오닐-CoA로 더 대사되고 최종적으로 TCA 사이클의 중간물질인 숙시닐-CoA가 되는 경로, 셋째, 쓰레오닌 알돌라아제를 이용하는 분해 경로 등이 있다.

본 발명에서는 쓰레오닌 디하이드라타아제를 통한 쓰레오닌 분해 경로에 있어서, 상기 효소의 활성을 억제함으로써, 쓰레오닌의 축적량을 최대화시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 사용한 L-쓰레오닌의 생산 균주는, 대장균 TF4076 (KFCC10718, 특허출원 제90-22965호)에서 유래한 것으로, 동 출원인의 특허출원 제01-6976호의 pGmTN-PPC12(KCCM-10236)이다. 이 pGmTN-PPC12 (KCCM-10236)는 L-쓰레오닌의 생산 균주인 대장균 TF4076 KFCC10718, 대한민국 특허출원 제90-22965로)의 염색체로부터 폴리머레이즈 체인 반응(polymerase chain reaction: 이하 PCR)을 통해 얻은 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈 유전자 (phosphoenolpyruvate carboxylase gene: 이하ppc유전자)와 쓰레오닌 오페론(operon)을 다시 모균주인 TF4076의 염색체에 삽입시킴으로써 TF4076의 염색체 DNA 중에ppc유전자와 쓰레오닌 오페론의 수를 2개로 증가시켰다. 따라서 pGmTN-PPC12 균주는 PEP로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인ppc유전자의 발현량과 옥살로아세테이트로부터 쓰레오닌을 합성하는 경로에 관련된 유전자들(thrA: aspartokinase I-homoserine dehydrogenase,thrB:homoserine kinase,thrC: threonine synthase)의 발현량이 증가됨으로써 L-쓰레오닌의 생산량이 향상된 특징을 가지고 있다. 이 pGmTN-PPC12 균주는 2001년 1월 5일자로 한국 미생물보존센타에 기탁하여, 기탁번호 KCCM-10236을 부여받았다.

본 발명에서는 위의 pGmTN-PPC12(KCCM-10236) 균주를 모균주로 하여 대장균에 쓰레오닌 분해와 관련된 경로 중에서 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc유전자)을 타겟으로 하여 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

이 쓰레오닌 디하이드라타아제는 저산소 조건과 쓰레오닌 농도가 높을 때 발현되는 오페론으로 알려져 있다. 또한 발효 후반부에 나타나는 현상인 낮은 글루코스 농도에서도 발현이 유도되는 것으로 알려져 있어서 고농도의 쓰레오닌 생산 균주를 개발하기 위해서 필수적으로 불활성화시켜야 하는 효소인 것이다.

본 발명의 방법을 예를 들어서 더욱 상세히 살펴보면 다음과 같다.

1. 재조합 플라스미드의 제작

쓰레오닌 생산균주로부터 염색체 DNA를 추출하고 이 염색체 DNA 주형을 이용하여tdc오페론 중에tdcB 와tdcC 부분이 포함되는 절편을 포함하는 재조합 플라스미드 pT7Blue/tdc를 얻는다. 사용할 수 있는 클로닝 벡터는 특별히 한정되지는 않지만 pT7Blue 클로닝 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.

재조합 플라스미드 pT7Blue/tdc에 lox p부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편을 삽입하여 재조합 플라스미드 pT7Δtdc::loxpKan를 만듦으로써,tdc유전자가 불활성화된 재조합 플라스미드를 만든다.

2. 재조합 플라스미드의 삽입 및 균주 선별

재조합 플라스미드 pT7Δtdc::loxpKan를 대장균에 형질전환시키고 플라스미드 DNA를 추출하여 제한 효소를 처리한 후 전기 영동하여 DNA 절편(Δtdc::loxpKan)를 얻는다(도 2).

이 얻어진 DNA 절편(Δtdc::loxpKan)을 쓰레오닌 생산균주에 형질전환시키게 되는데, 형질전환시 대장균내 존재하는 상동성 재조합(homologous recombination) 작용기작으로 원래 대장균내에 존재하는tdc유전자 부분과 형질전환시킨 재조합 DNA 절편(Δtdc::loxpKan)사이에 치환(replacement)이 일어나게 된다.

이 형질전환체를 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말하여 콜로니를 선별함으로써, 최종적으로tdc유전자가 불활성화된 재조합 균주를 선별할 수 있다.

이와 같은 재조합 균주는 생장을 거듭해도 계속 쓰레오닌 디하이드라타아제 효소의 불활성화 특성이 영구 보존되며, 모균주에 비해 쓰레오닌 생산능이 20% 이상 월등한 우수한 효과를 보여주는 것으로 나타났다.

상기 형질전환 균주로부터 재조합 플라스미드를 회수하는 방법으로는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 알칼리를 이용한 회수방법(Sambrook et al., Molecular cloning, Vol. 1, 1.25-1.28)을 사용할 수 있다. 즉, 용액1(50mM 글루코스, 25mM 트리스·염산, 10mM E.D.T.A.)을 넣어 형질전환체의 세포막을 약화시킨다음, 용액2(0.2N NaOH, 1% SDS)를 넣어 세포막을 파괴하고 세포의 구성성분인 단백질 및 염색체를 변성시킨 후, 용액3(5M 포타슘 아세테이트, 아세트산)을 넣어 재조합 플라스미드를 제외한 다른 성분을 응집시킨 다음, 원심분리하여 재조합 플라스미드층을 분리한 후, 에탄올을 가하여 재조합 플라스미드만을 침전시킴으로써 재조합 플라스미드를 회수할 수 있다.

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1:재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한tdc유전자 파괴

QIAGEN Genomic-tip 시스템을 이용하여 쓰레오닌 생산균주 pGmTN-PPC12(KCCM-10236)로부터 염색체 DNA를 추출하였고 이 염색체 DNA 주형으로부터 PCR을 이용하여tdc오페론(6295 bp) 중에tdcB 와tdcC 부분이 포함되는 절편 약 3.1 kb를 증폭하였다. 사용된 프라이머들은 5'-agg agg gga tcc ggt atg tct tct gag gcg-3'과 5'-agg agg gaa ttc atc ggc aac agg cac ag-3'이며 변성 스텝은 94℃에서 30초간, 어닐링 스텝은 56℃에서 30초간, 신장 스텝은 72℃에서 3분 30초간 실시하였고 30 사이클을 수행하였다.

이 PCR 결과물을 0.7 % 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었고, pT7Blue 클로닝 벡터(Novagen Co.)와 섭씨 16도에서 밤새 라이게이션을 시켰다(도 1). 이렇게 얻은 재조합 플라스미드 pT7Blue/tdc를 대장균 DH5 α에 형질전환시키고 엠피실린이 든 (50 mg/L) 고체배지에 도말하여 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 투쓰 픽하여 엠피실린이 든 액체배지 3 mL에 접종하여 200 rpm으로 밤새 배양후 QIAGEN mini prep kit을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 크기를 확인하였고 제한효소(Sma I, Pst I)로도 처리한 다음 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 오리엔테이션을 확인하였다(tdc R-A-B-C순). 확인된 플라스미드 DNA (pT7Blue/tdc)를 제한 효소 Bgl II, Hpa I (약 1.1 kb 크기)을 처리한 후 0.7% 아가로스 겔에서 약 4.9 kb 크기의 밴드를 용리하여 Klenow 효소를 처리하여 블런트 엔드로 만들었다. 플라스미드 pUG6(Ulrich et al, A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast, Nucleic Acids Research, 1996, 24, pp 2519-2524)에서 제한효소 Hinc II, EcoR V로 처리하여 얻은 lox p부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편(약 1.7 kb)과 블런트 엔드 라이게이션을 시켜 재조합 플라스미드 pT7Δtdc::loxpKan (약6600 bp)를 얻었다(도 2).

실시예 2:재조합 플라스미드의 염색체 삽입 균주의 선별

이 재조합 플라스미드 pT7Δtdc::loxpKan를 DH5 α에 형질전환시키고 엠피실린과 카나마이신이 (각각 50 mg/L 과 15 mg/L) 포함된 고체배지에 도말하여 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 투쓰픽하여 엠피실린과 카나마이신이 든 액체배지 3 mL에 접종하여 200 rpm으로 밤새 배양후 QIAGEN mini prep kit을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 크기를 확인하였고 제한효소를 처리한 다음 0.7% 아가로스 겔에서 오리엔테이션을 확인하였다. 확인된 플라스미드 DNA를 제한 효소 PVU II 를 처리한 후0.7% 아가로스겔에서 전기 영동하여 약 3840 bp 크기의 DNA 절편(Δtdc::loxpKan)를 용리하였다(도 2). 이 DNA 절편(Δtdc::loxpKan)을 쓰레오닌 생산균주(pGmTN-PPC12)에 형질전환시켜 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말하여 콜로니를 선별함으로써, 최종적으로 tdc 유전자가 불활성환된 재조합 균주를 선별하였다.

실시예 3:선별 군주에 대한 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산 역가 비교 실험

실시예 2에서 항생제 카나마이신이 든 고체배지에 도말하여 선별한 콜로니 30주를 선별하여 표 1에 나타낸 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산성을 비교하였다.

쓰레오닌 역가배지

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
황산암모늄	28 g
KH2PO4	1.0 g
MgSO4.7H2O	0.5 g
FeSO4.7H2O	5 mg
MnSO4.8H2O	5 mg
탄산칼슘	30 g
L-메티오닌	0.15 g
효모엑기스	2 g
pH (7.0)

32℃의 인큐베이터에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니들을 25 ml의 역가배지에 1 루프씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 분석 결과를 표2에 나타내었는데 모균주인 pGmTN-PPC 12는 23 g/L인 반면 신개발 재조합 균주들은 30주 중에서 28주가 모균주에 비해 우수한 성적을 보였으며 특히 26 g/L 이상의 성적을 보인 균주도 8주나 되었으며 가장 높은 성적을 보인 균주의 경우 27 g/L 의 쓰레오닌을 생산함으로써 수율이 모균주 대비 약 17.4 % 정도 향상되었음을 관찰하고 TRN212로 명명하고, 이 변이주를 2002년 2월 19일자로 한국미생물 보존 센터에 기탁하여, 기탁번호 제 KCCM-10353호를 부여받았다.

재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

20-23 g/L	23-24.5 g/L	24.5-26 g/L	26 g/L 이상
2	9	11	8

실시예 4:서던 블랏팅 분석(Southern blotting analysis)을 이용한tdc유전자의 불활성화 확인 실험

실시예 2에서 선별한 균주의tdc유전자가 특정적으로 불활성화되었는지 여부를 확인하기 위해 서던 블랏팅 분석을 수행하였다. 모균주인 pGmTN-PPC12와 위에서 선별된 TRN212(KCCM-10353) 균주를 카나마이신이 들어 있는 3ml 액체 배지에 200 rpm에서 밤새도록 배양한 다음, QIAGEN 염색체 킷트 20을 이용하여 염색체 DNA를 분리하였다. 이 DNA를 제한효소 EcoR I을 이용하여 밤새 절단하고, 0.7% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 DNA 절편의 크기대로 분리하였다. 전기영동이 끝난 겔을 모세관 이동(capillary transfer)(Molecular Cloning vol 1. pp6.31~6.38)법을 이용하여 밤새 DNA를 나일론 멤브레인(YOUNG Sci. Biodyne B Membrane)에 부착시켰다. 멤브레인을 건조시킨 다음, UV (120mJ/cm2, SpectroLinkerTM)를 조사하여 DNA를 멤브레인에 고정시켰다(Molecular Cloning, vol 1. pp6.45). 이 멤브레인을 섭씨 55도에서 2시간 동안 Prehybdization solution I(Roche #1093657)으로 프리하이브리다이징시키고, 변성된 DNA 프로브를 넣은 후 섭씨 55도로 고정된 하이드리다이제이션 오븐(BAMBINO 230300) 안에서 밤새 하이브리다이징시켰다.

여기에서 사용한 프로브는 다음과 같이 준비하였다. QIAGEN 킷트를 이용하여 분리한 플라스미드 pUG6를 제한효소 Hinc II, EcoR V로 처리하여 lox p 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 조각(약 1.7 kb)을 얻는다. 이 DNA 조각을 섭씨 100도의 끓는 물에서 5분 동안 가열한 후, 곧바로 얼음에서 다시 5분간 냉각하여 단일 사슬 DNA로 만든다. 이 DNA를 DIG Labelling and Detection kit (Roche #1093657)을 사용하여 섭씨 37도에서 밤새 반응시켜 DIG-UDP가 끼어 들어간 DNA 프로브를 제조하였다.

하이브리다이제이션이 끝나면 Washing solution I, II(Roche #1093657)를 이용하여 멤브레인에 비특이적으로 부착된 DNA를 제거한다. 프리하이브리다이제이션 2(Roche #1093657)를 이용하여 상온에서 30분 동안 멤브레인을 마스킹한 후, DIG-UTP에 특이적으로 결합하는 anti-DIG 항체를 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킨다. Washing solution III (Roche #1093657)을 이용하여 비특이적으로 멤브레인에 부착되어 있는 anti-DIG 항체를 제거하고, Labeling and Detection kit (Roche #1093657)을 사용하여 밴드가 나타날 때까지 상온에서 발색 반응시킨다. 도 3과 같은 결과를 얻었다. 모균주인 pGmTN-PPC 12 (레인 3) 에서는 카나마이신 유전자가 없기 때문에 아무 밴드도 나타나지 않았다. 반면, 본 연구에서 새롭게 선별된 TRN212(KCCM-10353) 균주 (레인 2)에서는 예상했던 대로 약 7 kb 정도의 밴드를 볼 수 있었다.tdc유전자의 EcoR I 제한 결과로 얻은 절편 약 5.3 kb와 카나마이신내성 유전자 약 1.7 kb을 합쳐서 약 7.0 kb 크기가 얻어졌다. 레인 1, 4는 사이즈 마커이다.

실시예 5:발효조를 이용한 쓰레오닌 비교시험

실시예 2에서 선별되고 실시예 4에서 유전자 파괴가 확인된 균주 TRN212(KCCM-10353)와 모균주 pGmTN-PPC 12을 사용하여 5-L 발효조에서 쓰레오닌 생산성을 비교하여 보았다. 초기 배지 조성은 표 3에 나타내었다. 종균 배양은 LB 배지에 포도당 10 g/L와 L-메티오닌을 0.1 g/L 되게 첨가해 준 배지를 사용하였고 발효조의 초기 접종 부피는 초기 배양 부피의 3 내지 5 %에서 조정하였다. 추가당은 6회에 걸쳐 첨가하였으며 추가한 후의 포도당 농도가 5 % 되게 하였으며 추가시점은 포도당이 고갈된 시점이다. 또한 포도당을 추가할 때 제일인산칼륨(KH₂PO₄)을 중량기준으로 1 % 되게 같이 첨가해주었다. 초기 배양 부피는 1.5 L이고 최종 부피는 3.0 L이며 발효 종료 후 투입된 총 포도당의 농도는 250 g/L이다. 교반속도는 700-1000 rpm으로 해주고 pH와 온도는 각각 7.0과 32℃로 맞추어 주었다. 배양 중 pH의 조절은 25 내지 28 %의 암모니아수를 사용하였다. 또한 통기량은 0.5 vvm으로 조정하였다. 실험 결과를 표 4에 나타내었는데 모균주는 93.5 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 소비한 포도당에 대해 37.4 %의 수율을 보인 반면 재조합 균주 TRN212은 112 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 45.2 %의 수율을 보임으로써 농도와 수율 면에서 모균주에 비해 21 %의 월등한 성적 향상을 보여주었다. 또한 재조합 균주에 흔히 나타나는 생육 저해 현상에 따른 발효시간, 당모 속도 지연 현상도 전혀 나타나지 않고 모균주와 유사한 양상을 보였다.

5리터 발효조의 초기 배지 조성

조성물	농도 (리터당)
포도당	50 g
KH2PO4	4 g
(NH4)2SO4	6 g
효모엑기스	3 g
MgSO4.7H2O	2 g
L-메티오닌	1 g
FeSO4.7H2O	40 mg
MnSO4.8H2O	10 mg
CaCl2.2H2O	40 mg
CoCl2.6H2O	4 mg
H3BO3	5 mg
Na2MoO4.2H2O	2 mg
ZnSO4.7H2O	2 mg
pH 7.0

재조합 균주의 5리터 발효조에서의 발효 성적

균주명	쓰레오닌 농도 (g/L)	발효시간 (시간)	수율 (%)
pGmTN-PPC12	93.5	78	37.4
TRN212	112	77	45.2

본 발명의 신규한 균주를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 경우에는, 농도와 수율 면에서 모균주에 비해 20 % 이상 월등한 성적 향상을 보여준다. 또한 재조합 균주에 흔히 나타나는 생육 저해 현상에 따른 발효시간, 당소모 속도 지연 현상도 전혀 나타나지 않고 모균주와 유사한 양상을 보이는 잇점을 가졌다.

Claims (17)

1. 쓰레오닌 디하이드라타아제(tdc) 유전자가 불활성화된 재조합 플라스미드.
2. 제 1 항에 있어서, 쓰레오닌 생산성 미생물의tdc오페론 중에tdcB 와tdcC의 일부를 절단하고 절단 부위 사이에 항생제 마커가 들어간 카세트를 삽입하여tdc오페론 작용을 불활성화시킨 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
3. 제 1 항에 있어서, 쓰레오닌 생산성 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 대장균은 쓰레오닌 유사체, 라이신 유사체, 이소루이신 유사체와 메티오닌 유사체에 대해 내성을 보이는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 대장균은 포스포에놀파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 쓰레오닌 오페론이 추가로 1 카피 이상 염색체 DNA 중에 삽입된 것임을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 대장균은E.colipGmTN-PPC12(KCCM-10236)인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
7. 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 도 1에 도시된 pT7Blue/tdc를이용하여tdc오페론 작용을 불활성화시킨 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
8. 제 7 항에 있어서, 도 2의 pT7Δtdc::loxpKan로 나타내어지는 재조합 플라스미드.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균.
10. 제 9 항에 있어서,E.colipGmTN-PPC12(KCCM-10236)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 대장균.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드로부터 추출된, 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편이 다시 염색체로 삽입된 것을 특징으로 하는 대장균.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편은 도 2에 도시된 Δtdc::loxpKan인 것을 특징으로 하는 대장균.
13. 제 12 항에 있어서,E. coliTRN212(KCCM-10353)로 명명된 대장균.
14. 제 9 항의 대장균을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 대장균은 상기 재조합 플라스미드로부터 추출된, 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편이 다시 염색체로 삽입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 생산 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 항생제 마커를 포함하는tdcB와tdcC 유전자 절편은 도 2에 도시된 Δtdc::loxpKan인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 생산 방법.
17. 제 14 항에 있어서, 대장균은E. coliTRN212(KCCM-10353)인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 생산 방법.