CN1446914A - L－苏氨酸生产方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种使用一种微生物生产L－苏氨酸的方法。在该方法中，通过重组技术将微生物基因组DNA中存在的苏氨酸脱水酶(tdc)基因部分失活。对于一种有增强的含苏氨酸操纵子的酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的活性的微生物，参与四种苏氨酸代谢途径中的一个的tdc基因专一性地被失活，从而显著提高L－苏氨酸产量。

Description

L-苏氨酸生产方法
发明领域
本发明涉及与微生物有关的L-苏氨酸的生产。更具体地，本发明涉及使用微生物高产率地生产L-苏氨酸的方法，其中通过重组技术将微生物的基因组DNA的苏氨酸脱水酶(tdc)基因部分失活，从而显著增加了L-苏氨酸的产量。
背景技术
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛用作动物饲料和食品添加剂，以及用作医学或药物学用途的流体和合成材料。L-苏氨酸是使用衍生自野生型大肠杆菌，棒状杆菌属，杀雷氏菌(Serratia)，普罗威登斯菌(Providencia)等的合成突变体通过发酵产生的。已知这些突变体包括氨基酸类似物-和药物-抗性突变体以及它们的造成二氨基庚二酸，甲硫氨酸，赖氨酸或异亮氨酸营养缺陷的合成突变体(日本专利申请公开号平2-219582，Appl.，Microbiolo.Biotechnol.，29，550-553(1988)，以及韩国专利公开号92-8365)。韩国专利申请号90-22965公开了L-苏氨酸生产菌株TF4076(KFCC10718)，它是甲硫氨酸营养缺陷型并且抗苏氨酸类似物(AHV：α-氨基-β-羟基戊酸)、赖氨酸类似物(AEC：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)和甲硫氨酸类似物(乙硫氨酸)。
提高特定基因的表达水平的常用方法是使用在微生物中有高拷贝数的质粒从而增加在微生物中的基因数目(Sambrook等，分子克隆，第二版，1989，1.3-1.5)。将靶基因整合到质粒中，并且用重组的质粒转化宿主微生物，使宿主微生物中的基因的数目根据质粒拷贝数增多而增多。美国专利No.5,538,873报道了这种方法在增加苏氨酸产量方面的部分成功。然而，多数使用这类重组质粒的技术过量表达宿主微生物不需要的特定基因，并且造成质粒的不稳定的问题，使得质粒可能在重组菌株培养过程中丢失。
针对这一问题，据建议使用向培养基中添加抗生素或使用表达调节质粒的方法(Sambrook等，分子克隆，第二版，1989，1.5-1.6 & 1.9-1.11)。在使用表达调节质粒生产特定产品的方法中，在生长期中，细胞培养是在非-表达条件下进行的以降低对宿主菌微生物的不利并在微生物完全生长后，诱导瞬时表达。但是，多数这种表达调节质粒可能只适用于最终产物是蛋白质的情形。
生产初级代谢产物与微生物的生长密切相关，因此除非在生长期表达靶基因，否则难以增加初级代谢产物的产量。初级代谢产物苏氨酸的生产即是如此。
为了补偿这种缺点，将一种特定的苏氨酸生物合成基因掺入到染色体DNA来产生苏氨酸(美国专利5,939,307)。然而，这种方法将染色体基因替换为一种可诱导的启动子-取代的基因，很难期望它可以显著增加苏氨酸操纵子基因的表达。
因此，本发明人通过失活染色体中的苏氨酸脱水酶(tdc)基因，其涉及一种苏氨酸降解途径，以便抑制苏氨酸的降解而保留宿主微生物的其它的固有的普通功能并且因此增加了苏氨酸的产量，从而完成了本发明。
现在多数用于增加苏氨酸产量的基因工程技术集中在从草酰乙酸(oxaloacetate)开始的生物合成途径。但是，本发明还涉及苏氨酸降解途径中的苏氨酸脱水酶(tdc)基因活性以有效和显著的增加L-苏氨酸产量。
发明概述
为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供高产率的L-苏氨酸的生产方法，它消除了含有重组质粒的菌株造成的质粒不稳定和微生物生长抑制的问题并可通过抑制苏氨酸脱水酶活性显著增加L-苏氨酸产量。
为了达到本发明目的，提供了一种掺入了失活的tdc(苏氨酸脱水酶)基因的重组质粒。
在为达此目的的本发明的一个实施方案中，可以通过切割tdc操纵子的tdc B和tdc C中的一个位点并向切割位点插入有抗生素标记的盒来失活生产苏氨酸的微生物的tdc操纵子。优选地，苏氨酸生产微生物是大肠杆菌菌株。
在本发明的另一实施方案中，大肠杆菌菌株可以是抗苏氨酸类似物、赖氨酸类似物、异亮氨酸类似物和甲硫氨酸类似物的。在本发明的又一个实施方案中，将附加的一个或多个拷贝的各个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和苏氨酸操纵子整合到大肠杆菌菌株的染色体DNA。优选地，该大肠杆菌名字是pGmTN-PPC12，保藏号是KCCM-10236。
本发明还提供了用上述重组质粒转化的大肠杆菌菌株。来自重组质粒的含有抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段可以插入到大肠杆菌菌株的基因组。优选地，包含抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段是图2的Δtdc∷loxpKan。最优选地，该大肠杆菌名字是TRN212，保藏号是KCCM-10353。
现在更详细地描述本发明。
已知一些L-苏氨酸代谢途径(Neihardt FC等(eds)Escherichia coli andSalmonella：Cellular and Molecular Biology，2nd edn.ASM Press.，WashingtonD.C.，pp 369-370)，包括三种主要途径：第一个途径涉及苏氨酸脱水酶，其催化苏氨酸分解为α-氨基-β-酮丁酸，然后它又转化为乙酰-辅酶A和甘氨酸，或进一步分解形成氨基丙酮并转化为丙酮酸；第二个途径涉及苏氨酸脱水酶，其产生α-酮丁酸，然后代谢生成丙酰-辅酶A并最终代谢为琥珀酰-辅酶A，TCA循环的中间体；并且第三种途径涉及苏氨酸醛缩酶。
本发明的特征是抑制了L-苏氨酸代谢途径中的苏氨酸脱水酶的活性导致L-苏氨酸的最大积累。
在本发明的L-苏氨酸生产方法中，使用来自大肠杆菌TF4076(KFCC10718，韩国专利申请号90-22965)的pGmTN-PPC12(KCCM-10236，本申请人申请的韩国专利申请号01-6976)作为L-苏氨酸生产菌株。pGmTN-PPC12菌株(KCCM-10236)是通过聚合酶链式反应(PCR)将来自产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，TF4076(KFCC 10718)的染色体的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因以及将克隆自同一染色体的苏氨酸操纵子插入到宿主大肠杆菌菌株TF4076的染色体而得到的，因此在染色体DNA上有两倍于TF4076菌株的ppc基因和苏氨酸操纵子。pGmTN-PPC12菌株可以增加涉及将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为苏氨酸生物合成前体，草酰乙酸的ppc基因，以及编码涉及从草酰乙酸的苏氨酸的合成途径的酶，包括thrA(天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶)，thrB(高丝氨酸激酶)，和thrC(苏氨酸合酶)的基因的表达，从而增加L-苏氨酸的产量。PGmTN-PPC12菌株于2001年1月5日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism)(KCCM)，并且保藏号是KCCM10236。
本发明中，失活了参加pGmTN-PPC12(KCCM-10236)的苏氨酸代谢途径的苏氨酸脱水酶(tdc)基因，从而增加了L-苏氨酸的产率。
已知苏氨酸脱水酶是一种在低水平氧和高水平苏氨酸浓度条件下表达的操纵子。tdc操纵子的表达还受到发酵后半期低-葡萄糖含量的诱导。因此，需要失活苏氨酸脱水酶来发现高产率苏氨酸生产菌株。
附图的简要说明
本发明的上述目的和优点将通过参照附图的详细描述其优选的实施方案而变得更加明显，其中，
图1描述构建重组质粒pT7Blue/tdc的流程；
图2描述构建重组质粒pT7Δtdc∷loxpKan和DNA片段Δtdc∷loxpKan的过程；以及
图3图示使用FLA-5000成像系统(FUJIFILM)通过扫描成像获得的Southern印迹的结果，其中泳道1和4表示分子量标记，泳道2和4表示TRN212(KCCM-10353)和宿主菌株pGmTN-PPC12。
发明详述
在下文中，本发明的L-苏氨酸生产方法将会被更加详细地描述。
1.构建重组质粒
从苏氨酸生产菌株分离染色体DNA。使用该染色体DNA作为模板，获得包含tdc操纵子的tdc B和tdc C的重组质粒pT7Blue/tdc。不限制使用任何克隆载体，但优选的是pT7Blue克隆载体。
通过将包含lox p位点的卡那霉素抗性基因片段整合到重组质粒pT7Blue/tdc，获得含有缺陷的tdc基因的重组质粒pT7Δtdc∷loxpKan。
2.整合重组质粒和筛选
使用重组质粒pT7Δtdc∷loxpKan转化大肠杆菌。分离质粒DNA并用限制性酶消化，通过电泳从消化物中分离DNA片段(Δtdc∷loxpKan)。此过程图示于图2。
用产生的DNA片段Δtdc∷loxpKan转化苏氨酸生产菌株。这一转化是通过同源重组进行，其使得用重组DNA片段pT7Δtdc∷loxpKan取代了大肠杆菌菌株的固有的tdc基因区域。
将产生的转化子接种到含卡那霉素的固体培养基收集菌落。最后，获得含有失活的tdc基因的靶重组体菌株。
对于重组菌株，虽然该菌株可以增殖，但该tdc基因保持缺陷，具有比宿主菌株高20％的出色的L-苏氨酸产率。
可以使用已知的方法，例如，碱溶液(Sambrook笔分子克隆，第一卷，1.25-1.28)从转化菌株中回收重组质粒。具体地，加入溶液1(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA)消弱转化子的细胞膜，并且加入溶液2(0.2N NaOH，1％SDS)破坏细胞膜并变性细胞的蛋白和染色体成分，并且加入溶液3(5M醋酸钾，乙酸)聚集除了重组质粒之外的成分。通过离心分离重组质粒级分，并且通过加入乙醇只沉淀重组质粒并且回收。
本发明将参照下面的实施例进行描述。下面的实施例是为了举例说明的目的而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：构建重组质粒并使用重组质粒敲除tdc基因
使用QIAGEN Genomic-tip体系分离苏氨酸生产菌株pGmTN-PPC(KCCM-10236)的基因组DNA。以基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增大约3.1kb的含有tdc B和tdc C的tdc操纵子基因片段(5295pb)。使用的引物是5’-agg agg gga tcc ggt atg tct tct gag gcg-3’和5’-agg agg gaa ttc atc ggc aac agg cac ag-3’。PCR是如下进行的，30循环的扩增，每循环包括94℃变性30秒，56℃退火30秒，以及72℃延伸3分钟30秒。
在0.7％的琼脂糖凝胶上将PCR产物电泳，洗脱所需大小的带。将洗脱带与pT7Blue克隆载体(Novagen Co，)在16℃下平端连接过夜以便获得重组质粒pT7Blue/tdc(参看图1)。使用产生的重组质粒pT7Blue/tdc转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的氨苄青霉素的固体培养基上铺平板，在37℃过夜培养。
从培养物上用牙签挑取菌落，接种到3毫升液体培养基，并在200rpm培养过夜。使用QIAGEN微量制备试剂盒从培养物中分离质粒DNA，并鉴定质粒DNA的大小。用限制性酶，Sma I和Pst I消化质粒DNA，并在0.7％的琼脂糖上电泳鉴定其方向是否为tdc R-A-B-C。用限制性酶Bgl II和Hpa I消化鉴定的质粒DNA，pT7Blue/tdc(各大约1.1kb)，将消化物上样到0.7％琼脂糖凝胶，以便洗脱大约4.9kb的带。将洗脱的带与Klenow酶反应产生平端。将含有lox P位点的大约1.7kb的卡那霉素抗性基因片段，其将质粒pUG6(Ulrich等，A new efficient gene disruptioncassette for repeated use in budding yeast，Nucleic Acids Research，1996，24，pp.2519-2524)与限制性酶Hinc II和EcoR V反应而获得，通过平端连接与分离的pT7Blue/tdc片段连接，从而产生重组质粒pT7Δtdc∷loxpKa。
实施例2：筛选整合了重组质粒的菌株
用重组质粒pT7Δtdc∷loxpKan转化大肠杆菌DH5α，铺板到含有50mg/L氨苄青霉素和15mg/L卡那霉素的固体培养基，37℃培养过夜。从培养物上用牙签挑取菌落，接种到含有氨苄青霉素和卡那霉素的3毫升液体培养基，并200rpm培养过夜。使用QIAGEN微量制备试剂盒从培养物中分离质粒DNA，并鉴定质粒DNA的大小。用限制性酶消化质粒DNA并加样到0.7％的琼脂糖上鉴定其方向。用限制性酶PVU II消化鉴定的质粒DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，以便洗脱大约3840kb的DNA片段(Δtdc∷loxpKan)。通过电穿孔法用DNA片段Δtdc∷loxpKan转化苏氨酸产生菌株pGmTN-PPC12，并且铺板到含卡那霉素的固体培养基来筛选菌落，得到有失活的tdc基因的重组菌株。
实施例3：获得的重组菌株的摇瓶培养比较苏氨酸产量
在Erlenmeyer摇瓶(flask)中使用苏氨酸滴定度培养基筛查实施例2中含卡那霉素的固体培养基中培养的30个单菌落的重组菌株的L-苏氨酸产量比较。各种情况下使用的苏氨酸滴定度培养基的组分示于表1。
表1.苏氨酸滴定度培养基的组分
    组分     每升中含量
    葡萄糖     70g
    (NH4)2SO4     28g
    KH2PO4     1.0g
    MgSO4·7H2O     0.5g
    FeSO4·7H2O     5mg
    MnSO4·8H2O     5mg
    碳酸钙     30g
    L-甲硫氨酸     0.15g
    酵母抽提物     2g
                                            PH7.0
将单菌落在培养箱中的LB固体培养基上在32℃下培养过夜。将一满环各培养物接种到25毫升滴定度培养基并在32℃，250rpm下培养48小时。检测的结果示于表2。与产生23g/L苏氨酸的宿主菌株pGmTN-PPC12相比，重组菌株的30个菌落中的28个菌落显示卓越的生产率，其中包括产生26g/L或更多的苏氨酸的8个菌落。观察到记录有最高苏氨酸生产率27g/L，比宿主菌株产率高17.4％的重组菌株，并且命名为“TRN212”。突变菌株TRN212在2002年2月19日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganism)(KCCM)并给予保藏号KCCM-10353。
表2.重组菌株的摇瓶滴度实验结果
  L-苏氨酸浓度    20-23g/L    23-24.5g/L  24.6-26g/L    26g/L或更高
  菌落数目    2    9  11    8
实施例4：使用Southern印迹检测证实tdc基因的敲除
进行了Southern印迹来确认实施例3中获得的重组菌株的tdc基因的特异性的敲除(knock-out)。将宿主菌株pGmTN-PPC12和重组菌株TRN212(KCCM-10353)在30毫升液体培养基中在200rpm下培养过夜，使用QIAGEN基因组试剂盒20分离基因组DNA。用限制性酶EcoR I消化分离的基因组DNA并在0.7％的琼脂糖凝胶中电泳根据大小分离DNA片段。通过电泳胶的毛细管转移(分子克隆，第一卷，6.31-6.38)过夜将按照大小分离的DNA片段附着到尼龙膜(YOUNG Sci.Biodyne BMembrane)，随后经脱水和UV照射(120mJ/cm2，SpectroLinkerTM)将该DNA片段固定在尼龙膜上(分子克隆，第一卷，6.45)。将粘附到尼龙膜上的DNA片段在预杂交缓冲液I(Roche # 1093657)中在55℃下预杂交2小时，然后，加入预先制备的变性DNA探针在杂交烘箱(BAMBINO230300)中杂交。
变性的探针是如下制备的。用限制性酶，Hinc II和EcoR V消化使用QIAGEN试剂盒分离的质粒pUG6，获得含有lox p位点的大约1.7kb的卡那霉素抗性基因片段。将该基因片段在100℃沸水中加热5分钟并在冰上冷却5分钟，产生单链DNA。使用DIG标记和检测试剂盒(Roche#1093657)将单链DNA在37℃下反应过夜，产生DIG-UDP-整合的DNA探针。
杂交后，使用洗涤溶液I和II(Roche # 1093657)除去非特异性结合到膜的DNA片段。然后，用预杂交缓冲液2(Roche # 1093657)在室温下处理膜30分钟来遮蔽并与特异性结合到DIG-UTP的抗-DIG抗体在室温下反应30分钟。用洗涤溶液III(Roche # 1093657)除去非特异性结合到膜的抗-DIG抗体，然后，使用标记和检测试剂盒(Roche #1093657)将膜进行颜色反应，直到出现条带。结果示于图3。没有卡那霉素基因的宿主菌株pGmTN-PPC12(泳道1)不显示条带。与此对比，本发明的新重组菌株TRN212(KCCM-10353)被期望具有的大约7kb的条带在泳道2中观察到。用限制性酶EcoR I消化产生的大约5.3kb的tdc基因片段和大约1.7kb的卡那霉素-抗性基因共大约7.0kb。泳道1和4表示分子量标记。
实施例5：使用发酵罐的L-苏氨酸产率比较
比较了宿主菌株pGmTN-PPC12和重组菌株TRN212(KCCM-10353)的L-苏氨酸产率，该重组菌株有失活的tdc基因，其已经在实施例2中被筛选出来，并在实施例4中进行了试验证实了该基因的敲除。表3给出了使用的初始培养基组分。还含有每升10g葡萄糖和0.1g L-甲硫氨酸的LB培养基用于种子培养为，以3-5％体积的目的初始培养物确定接种到发酵罐中的初始体积。每次将葡萄糖加至终浓度5％重量，共超过6次，同时加入1％重量的磷酸二氢钾。此处，每次加入的葡萄糖是通过葡萄糖的缺损确定的。培养物的初体积是1.5L，终体积是3.0L。发酵中加入的葡萄糖的总浓度是250g/L。在发酵过程中，培养基在700-1000rpm下搅拌，温度控制在32℃，pH用25-28％的氨水调节在7.0。气流速率调节在0.5vvm。结果示于表4。如表4所示，宿主菌株TRN212产生93.5g/L的L-苏氨酸，相对于葡萄糖的消耗的产率是37.4％。与此相比，重组菌株TRN212产生112g/L的L-苏氨酸，产率是45.2％，比宿主菌株TRN212高21％。此外，观察到重组菌株与宿主菌株有类似的发酵模式，在发酵中糖消耗不降低，而这种在发酵中糖消耗降低的情况在重组菌株中由于生长抑制是经常出现的。
表3.5-L发酵罐中初始培养基组分
    组分     每升中含量
    葡萄糖     50g
    KH2PO4     4g
    (NH4)2SO4     6g
    酵母抽提物     3g
    MgSO4·7H2O     2g
    L-甲硫氨酸     1g
    FeSO4·7H2O     40mg
    MnSO4·8H2O     10mg
    CaCl2·2H2O     40mg
    CoCl2·6H2O     4mg
    H3BO3     5mg
    Na2MoO4·2H2O     2mg
    ZnSO4·7H2O     2mg
                                           PH7.0
表4.重组菌株的苏氨酸发酵生产的结果
    菌株     苏氨酸(g/L)     发酵时间(小时)     产量(％)
PGmTN-PPC12     93.5      78     37.4
TRN212     112      77     45.2
使用本发明的新的重组菌株生产L-苏氨酸，与宿主菌株相比，数量和产率都增加超过20％，而在发酵过程中的糖的消耗不降低，而这种在发酵中糖消耗降低的情况在重组菌株中由于生长抑制是经常出现的。

Claims (17)

1.具有失活的tdc(苏氨酸脱水酶)基因的重组质粒。
2.权利要求1中的重组质粒，其中苏氨酸生产微生物的tdc操纵子是通过切割tdc操纵子的tdcB和tdcC中的一个位点并向该切割位点插入具有抗生素标记的盒而失活的。
3.权利要求2中的重组质粒，其中的苏氨酸生产微生物是大肠杆菌。
4.权利要求3中的重组质粒，其中的大肠杆菌是对苏氨酸类似物，赖氨酸类似物，异亮氨酸类似物，以及甲硫氨酸类似物抗性的。
5.权利要求3中的重组质粒，其中将另外一个或多个拷贝的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和苏氨酸操纵子整合到大肠杆菌的染色体DNA中。
6.权利要求5中的重组质粒，其中的大肠杆菌名称是pGmTN-PPC12，其保藏号是KCCM-10236。
7.权利要求2中的重组质粒，其中的重组质粒是通过失活图1的pT7Blue/tdc的tdc基因而构建的。
8.权利要求7中的重组质粒，表达为图2的pT7Δtdc∷loxpKan。
9.用权利要求1到8中的任一项的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
10.权利要求9中的大肠杆菌菌株，衍生自保藏号是KCCM-10236的pGmTN-PPC12。
11.权利要求9中的大肠杆菌菌株，其中来自重组质粒的包含抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段被整合到了大肠杆菌菌株的基因组中。
12.权利要求11中的大肠杆菌菌株，其中包含抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段是图2的Δtdc∷loxpKan。
13.权利要求12中的大肠杆菌菌株，其具有名称TRN212，其保藏号是KCCM-10353。
14.一种使用权利要求9中的大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法。
15.权利要求14中的方法，其中来自重组质粒的包含抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段被整合到了大肠杆菌菌株的基因组中。
16.权利要求15中的方法，其中包含抗生素标记的tdc B和tdc C基因片段是图2的Δtdc∷loxpKan。
17.权利要求14中的方法，其中的大肠杆菌菌株名字是TRN212，其保藏号是KCCM-10353。
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