JP2775948B2 - Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株 - Google Patents
Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は一般に微生物学産業に関し、より詳しくは、
Ｌ−トレオニンの生産者としての新規エシェリキア・コ
リ（Escherichia coli）BKIIM B−3996菌株に関する。
Ｌ−トレオニンの生産者としての新規エシェリキア・コ
リ（Escherichia coli）BKIIM B−3996菌株に関する。
Ｌ−トレオニンは、医学用途の様々な栄養混合物の成
分として利用可能な必須アミノ酸であることが知られて
いる。一方、Ｌ−トレオニンは動物飼料への添加物とし
て、医薬および化学工業用試薬として、並びに幾つかの
他のアミノ酸、例えばＬ−リジンおよびＬ−ホモセリン
を産生する微生物の増殖因子として、利用することがで
きる。
分として利用可能な必須アミノ酸であることが知られて
いる。一方、Ｌ−トレオニンは動物飼料への添加物とし
て、医薬および化学工業用試薬として、並びに幾つかの
他のアミノ酸、例えばＬ−リジンおよびＬ−ホモセリン
を産生する微生物の増殖因子として、利用することがで
きる。
背景技術 技術の現状において、様々な種の微生物〔例えば、ブ
レビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m〕、セレイシア・マルセッセンス（Serratia marcesc
ens）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）等〕
のＬ−トレオニン産生株が知られている。最も効率的な
Ｌ−トレオニン生産者であることが証明されているの
は、細胞中にトレオニンオペロンの遺伝子を有するハイ
ブリッドプラスミドを含むE.コリの変異株であり（US,
4,278,785;4,321,325）、その中で最も生産性であるの
はエシェリキア・コリ（Eschrichia coli）VNIIgeneti
ka M−１株である（US,4,321,325）。この株は、pBR322
ベクターを基にして得られそしてトレオニン類似体であ
るα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に対して耐性なE.
コリK12株のトレオニンオペロンを組み込んだマルチコ
ピープラスミドpYN7を含んでいる。
レビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m〕、セレイシア・マルセッセンス（Serratia marcesc
ens）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）等〕
のＬ−トレオニン産生株が知られている。最も効率的な
Ｌ−トレオニン生産者であることが証明されているの
は、細胞中にトレオニンオペロンの遺伝子を有するハイ
ブリッドプラスミドを含むE.コリの変異株であり（US,
4,278,785;4,321,325）、その中で最も生産性であるの
はエシェリキア・コリ（Eschrichia coli）VNIIgeneti
ka M−１株である（US,4,321,325）。この株は、pBR322
ベクターを基にして得られそしてトレオニン類似体であ
るα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に対して耐性なE.
コリK12株のトレオニンオペロンを組み込んだマルチコ
ピープラスミドpYN7を含んでいる。
プラスミドpYN7のトレオニンオペロン遺伝子は、二価
性酵素、即ちアスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードし、これはＬ−トレオニンでの阻
害に対して非感受性である。前記Ｍ−１株は、pHセンサ
ーにより送られるシグナルに応じて栄養寒天培地に糖−
アンモニア添加剤を供給する条件下で培養した時、実験
室用発酵槽中で40時間の培養期間の間の30g/lの濃度ま
でＬ−トレオニンを蓄積することができる。
性酵素、即ちアスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードし、これはＬ−トレオニンでの阻
害に対して非感受性である。前記Ｍ−１株は、pHセンサ
ーにより送られるシグナルに応じて栄養寒天培地に糖−
アンモニア添加剤を供給する条件下で培養した時、実験
室用発酵槽中で40時間の培養期間の間の30g/lの濃度ま
でＬ−トレオニンを蓄積することができる。
前記株は、プラスミドの低生産性および不適当な安定
性を特徴としており、発酵中にプラスミドを保持してお
くために抗生物質を使用しなければならない。
性を特徴としており、発酵中にプラスミドを保持してお
くために抗生物質を使用しなければならない。
発明の要約 本明細書中で提案される株は新規であり、今までに文
献中に記載されていない。
献中に記載されていない。
従って、本発明の主たる本質的な目的は、短い発酵期
間の間で、前記期間中に全く抗生物質を添加することな
く高収量のＬ−トレオニンを獲得することを可能にし、
且つプラスミドの高安定性を特徴とする新規細菌株を提
供することである。
間の間で、前記期間中に全く抗生物質を添加することな
く高収量のＬ−トレオニンを獲得することを可能にし、
且つプラスミドの高安定性を特徴とする新規細菌株を提
供することである。
上記の目的は、本発明によれば、Ｌ−トレオニン生産
者としてここで提案されるものがエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）BKIIM B−3996であるという事実
により達成される。前記株は組換えプラスミドpVIC40を
含んでおり、そしてUSSRアンチバイオティクス・リサー
チ・インスティテュート（the USSR Antibiotics Resea
rch Institute）の微生物培養寄託機関に1987年11月19
日登録番号1867のもとに寄託された。
者としてここで提案されるものがエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）BKIIM B−3996であるという事実
により達成される。前記株は組換えプラスミドpVIC40を
含んでおり、そしてUSSRアンチバイオティクス・リサー
チ・インスティテュート（the USSR Antibiotics Resea
rch Institute）の微生物培養寄託機関に1987年11月19
日登録番号1867のもとに寄託された。
本明細書中で提案される株は、36時間の発酵機関で85
g/lのＬ−トレオニンを産生する手段である。提案され
る株は、Ｌ−トレオニン生合成の遺伝子をコードする今
までに公知のE.コリVNIIgenetika M−１株のpYN7プラス
ミドと同じE.コリ染色体断片を有しそして抗生物質スト
レプトマイシンに対する耐性を該細胞に付与する組換え
プラスミドpVIC40を含む。pYN7と異り、この新規プラス
ミドは、非選択的条件下で増殖させた時に細胞中にずっ
と保持されている。
g/lのＬ−トレオニンを産生する手段である。提案され
る株は、Ｌ−トレオニン生合成の遺伝子をコードする今
までに公知のE.コリVNIIgenetika M−１株のpYN7プラス
ミドと同じE.コリ染色体断片を有しそして抗生物質スト
レプトマイシンに対する耐性を該細胞に付与する組換え
プラスミドpVIC40を含む。pYN7と異り、この新規プラス
ミドは、非選択的条件下で増殖させた時に細胞中にずっ
と保持されている。
発明を実施するための最良の形態 本発明のトレオニン生産株は、今まで周知の出発株E.
コリVNIIgenetika M−１株（サッカロース同化性なし、
トレオニン耐性なし、トレオニン分解性あり、トレオニ
ン生産性プラスミドpYN7含有、プラスミドの維持のため
に選択圧必要）から幾つかの段階を経て製造された。
コリVNIIgenetika M−１株（サッカロース同化性なし、
トレオニン耐性なし、トレオニン分解性あり、トレオニ
ン生産性プラスミドpYN7含有、プラスミドの維持のため
に選択圧必要）から幾つかの段階を経て製造された。
本発明のトレノイン生産株の作製の第一段階におい
て、サッカロース同化の遺伝的決定因子を、サッカロー
ス同化株上で増殖させたバクテリオファージP1による形
質導入によって前記株に移入せしめる。こうして得られ
た形質転換体（サッカロース同化性あり、トレオニン耐
性なし、トレオニン分解性あり、プラスミドpYN7含有、
プラスミドの維持のために選択圧必要）は、サッカロー
スおよびサッカロース担持物質、例えば糖みつを炭素源
として利用することができる。
て、サッカロース同化の遺伝的決定因子を、サッカロー
ス同化株上で増殖させたバクテリオファージP1による形
質導入によって前記株に移入せしめる。こうして得られ
た形質転換体（サッカロース同化性あり、トレオニン耐
性なし、トレオニン分解性あり、プラスミドpYN7含有、
プラスミドの維持のために選択圧必要）は、サッカロー
スおよびサッカロース担持物質、例えば糖みつを炭素源
として利用することができる。
第二段階において、前記サッカロース同化形質転換体
の中から、阻害濃度（5mg/ml）のＬ−トレオニンを含む
最少培地M9上で増殖することができる自然発生変異体を
取り出す。そのような変異体の１つ、即ちE.コリVNIIge
netika−472T23〔これはUSSRアンチバイオティクス・リ
サーチ・インスティテュートのUSSRコレクション・オブ
・コマーシャル・ミクロオルガニズムス（the USSR Col
lection of Commercial Micro−organisms）に登録番号
BKIIM B−2307のもとに寄託された〕（サッカロース同
化性であり、トレオニン耐性あり、トレオニン分解性あ
り、プラスミドpYN7含有、プラスミドの維持のために選
択圧必要）は、Ｌ−トレオニンだけでなくＬ−ホモセリ
ンに対しても耐性であり、これを更なる選択に使用す
る。
の中から、阻害濃度（5mg/ml）のＬ−トレオニンを含む
最少培地M9上で増殖することができる自然発生変異体を
取り出す。そのような変異体の１つ、即ちE.コリVNIIge
netika−472T23〔これはUSSRアンチバイオティクス・リ
サーチ・インスティテュートのUSSRコレクション・オブ
・コマーシャル・ミクロオルガニズムス（the USSR Col
lection of Commercial Micro−organisms）に登録番号
BKIIM B−2307のもとに寄託された〕（サッカロース同
化性であり、トレオニン耐性あり、トレオニン分解性あ
り、プラスミドpYN7含有、プラスミドの維持のために選
択圧必要）は、Ｌ−トレオニンだけでなくＬ−ホモセリ
ンに対しても耐性であり、これを更なる選択に使用す
る。
第三段階において、前記E.コリ VNIIgenetika 472T2
3株において、Ｌ−トレオニンの分解に関与するトレオ
ニンデヒドロゲナーゼ酵素をコードするtdh遺伝子中
に、トランスポゾンTn5が挿入されているE.コリK12株の
変異体上で増殖させたバクテリオファージP1を形質導入
することによって、形質導入体を得る。この形質導入体
は、前記酵素の活性を完全に欠いている。このようにし
て得られた形質導入体 〔USSR Research Institute of Genetics and Selectio
n of Commercial MicroorganismsのUSSR工業用微生物寄
託機関に登録番号BKIIM B−3420のもとに寄託された〕
（サッカロース同化性あり、トレオニン耐性あり、トレ
オニン分解性なし、トレオニン生産性プラスミド欠落）
は、生産されているＬ−トレオニンの分解を生じる能力
を失なっている。なお、上記 は、トランスポゾンによる形質導入の間に又はその後に
自然にプラスミドpYN7が欠落したプラスミドフリー変異
株である。
3株において、Ｌ−トレオニンの分解に関与するトレオ
ニンデヒドロゲナーゼ酵素をコードするtdh遺伝子中
に、トランスポゾンTn5が挿入されているE.コリK12株の
変異体上で増殖させたバクテリオファージP1を形質導入
することによって、形質導入体を得る。この形質導入体
は、前記酵素の活性を完全に欠いている。このようにし
て得られた形質導入体 〔USSR Research Institute of Genetics and Selectio
n of Commercial MicroorganismsのUSSR工業用微生物寄
託機関に登録番号BKIIM B−3420のもとに寄託された〕
（サッカロース同化性あり、トレオニン耐性あり、トレ
オニン分解性なし、トレオニン生産性プラスミド欠落）
は、生産されているＬ−トレオニンの分解を生じる能力
を失なっている。なお、上記 は、トランスポゾンによる形質導入の間に又はその後に
自然にプラスミドpYN7が欠落したプラスミドフリー変異
株である。
第四段階として、前記プラスミドフリー株 に、トレオニン生産性の新規なハイブリドプラスミドpV
IC40を導入することにより、本発明の最終トレオニン生
産株が得られる。このプラスミドは、その維持のために
選択を必要としない。
IC40を導入することにより、本発明の最終トレオニン生
産株が得られる。このプラスミドは、その維持のために
選択を必要としない。
すなわち、新規ハイブリッドプラスミドpVIC40は、今
までに既知のプラスミドpYN7（US,4,278,765）；並びに
既知のプラスミドRSF1010およびpBR322の誘導体であり
そしてE.コリ細胞中の高い持続性により特徴づけられる
広域宿主ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov A.
Y,Tsygankov Y.D,「SF1010 Tn 1由来の広域宿主ベクタ
ー」、Plasmid,1986,16,161−167を参照のこと）を、制
限酵素BamH IおよびPst Iで処理し、次いでポリヌクレ
オチドリガーゼで処理することにより作製された。この
ハイブリド作製の過程を図に模式的に示す。
までに既知のプラスミドpYN7（US,4,278,765）；並びに
既知のプラスミドRSF1010およびpBR322の誘導体であり
そしてE.コリ細胞中の高い持続性により特徴づけられる
広域宿主ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov A.
Y,Tsygankov Y.D,「SF1010 Tn 1由来の広域宿主ベクタ
ー」、Plasmid,1986,16,161−167を参照のこと）を、制
限酵素BamH IおよびPst Iで処理し、次いでポリヌクレ
オチドリガーゼで処理することにより作製された。この
ハイブリド作製の過程を図に模式的に示す。
次に、連結後に生じた混合物を用いて、Ｌ−トレオニ
ン欠損の上記の のプラスミドフリー変異体を形質転換せしめ、Ｌ−トレ
オニンを欠くがストレプトマイシン（100μg/ml）を含
む最少寒天培地M9上で形質転換体のコロニーを取り出
す。このようにして得られた形質転換体の１つをE.コリ
VNIHgenetika BKIIM B−3996と称する。この株は、サッ
カロース同化性を有し、トレオニン耐性を有し、トレオ
ニン分解性を有さず、トレオニン生産性プラスミドpVIC
40を含有し、そしてプラスミドの維持のために選択圧を
必要としない。
ン欠損の上記の のプラスミドフリー変異体を形質転換せしめ、Ｌ−トレ
オニンを欠くがストレプトマイシン（100μg/ml）を含
む最少寒天培地M9上で形質転換体のコロニーを取り出
す。このようにして得られた形質転換体の１つをE.コリ
VNIHgenetika BKIIM B−3996と称する。この株は、サッ
カロース同化性を有し、トレオニン耐性を有し、トレオ
ニン分解性を有さず、トレオニン生産性プラスミドpVIC
40を含有し、そしてプラスミドの維持のために選択圧を
必要としない。
この形質転換体の細胞から、9.7mDの分子量を有するp
VIC40が単離される。
VIC40が単離される。
pVIC40プラスミドは、次の断片を含む： −7600塩基対を有する、広域宿主ベクタープラスミド
pAYC32のBamHI−PstI断片であって、ストレプトマイシ
ン耐性遺伝子を含んで成る断片； −7000塩基対を有するプラスミドpYN7のBamHI−PstI
断片であって、E.コリのトレオニン生合成遺伝子（thr
A,thrB,thrC）を含んで成る断片。
pAYC32のBamHI−PstI断片であって、ストレプトマイシ
ン耐性遺伝子を含んで成る断片； −7000塩基対を有するプラスミドpYN7のBamHI−PstI
断片であって、E.コリのトレオニン生合成遺伝子（thr
A,thrB,thrC）を含んで成る断片。
プラスミドpVYC40は、制限酵素BamHIおよびPstIのた
めのユニークな同定セグメントを含む。
めのユニークな同定セグメントを含む。
提案される株は、次のような形態学的および生化学的
特徴を示す。
特徴を示す。
細胞形態学。グラム陰性、弱運動性、両端が丸い捍
状。縦の長さ1.5〜２μｍ。
状。縦の長さ1.5〜２μｍ。
培養状の特徴。
牛肉エキス−寒天。37℃で24時間増殖後、滑面で整っ
たまたは少しゆがんだ縁を有し、中央がわずかにもり上
がった均質構造で、ペースト状粘度で容易に乳化できる
特徴を有する、直径1.5〜3mmの丸形の白っぽい少し曇っ
たコロニーを生成する。
たまたは少しゆがんだ縁を有し、中央がわずかにもり上
がった均質構造で、ペースト状粘度で容易に乳化できる
特徴を有する、直径1.5〜3mmの丸形の白っぽい少し曇っ
たコロニーを生成する。
Luria寒天。37℃で24時間増殖後、滑面を有し、均質
構造の、ペースト状粘度の容易に乳化できる直径1.5〜
2.5mmの白っぽい少し曇ったコロニーを生成する。
構造の、ペースト状粘度の容易に乳化できる直径1.5〜
2.5mmの白っぽい少し曇ったコロニーを生成する。
最少寒天塗抹M9培地。37℃で40〜48時間増殖後、灰白
色で少し曇ったわずかに凸状の光沢のある表面を有する
直径0.5〜1.5mmのコロニーを形成する。
色で少し曇ったわずかに凸状の光沢のある表面を有する
直径0.5〜1.5mmのコロニーを形成する。
牛肉エキスブロス中での増殖。37℃/1.3hの比培養速
度。24時間増殖後、臭気を有する強い均一な曇りを生じ
る。
度。24時間増殖後、臭気を有する強い均一な曇りを生じ
る。
物理的および生化学的特徴。
牛肉エキス−寒天中へのスラスト接種による増殖。接
種領域に渡り良好な増殖を示す。該微生物が通性嫌気性
生物であることがわかる。
種領域に渡り良好な増殖を示す。該微生物が通性嫌気性
生物であることがわかる。
ゼラチンを液状化しない。
乳凝固を伴う乳上での良好な増殖の特徴を示す。
インドールを生産しない。
温度条件。43℃およびそれ以下で牛肉エキスブロス上
で増殖。最適温度37〜38℃の範囲内。
で増殖。最適温度37〜38℃の範囲内。
培地のpH値。６〜８のpH値を有する液体培地上で増
殖。最適値は7.0。
殖。最適値は7.0。
炭素源。サッカロース、グルコース、フルクトース、
ラクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、
グリセロール、マンニトール上で良好に増殖し、酸およ
びガスを生成する。
ラクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、
グリセロール、マンニトール上で良好に増殖し、酸およ
びガスを生成する。
窒素源。アンモニウム、硝酸塩の形で並びに幾つかの
有機化合物から窒素を蓄積する。
有機化合物から窒素を蓄積する。
ストレプトマイシン、Ｌ−トレオニンおよびＬ−ホモ
セリンに対して耐性である。
セリンに対して耐性である。
Ｌ−イソロイシンを増殖因子として利用する。
プラスミド含有物。該細胞は、ストレプトマイシンに
対する耐性を保証しそしてトレオニンオペロン遺伝子を
含んでいるマルチコピーハイブリッドプラスミドpVIC40
（分子量9.7メガダルトン）を含有する。
対する耐性を保証しそしてトレオニンオペロン遺伝子を
含んでいるマルチコピーハイブリッドプラスミドpVIC40
（分子量9.7メガダルトン）を含有する。
アミノアセトン形成。Ｌ−トレオニン存在下で増殖さ
せた時にアセトンを全く形成しない。
せた時にアセトンを全く形成しない。
プラスミド安定性。提案される株は、該プラスミドを
維持するための選択的圧力なしで増殖させた時にプラス
ミドを保持する能力の増加により特徴づけられる。
維持するための選択的圧力なしで増殖させた時にプラス
ミドを保持する能力の増加により特徴づけられる。
ここで提案される新規生産株を使ったＬ−トレオニン
の製造方法は、次のようにして実施される。まず、E.コ
リBKIIMB−3996株の培養物を、ストレプトマイシンを含
む寒天塗抹M9培地上で増殖させ、次いで得られた増殖細
胞の懸濁液を液体接種培地に接種する。この培地は、炭
素および窒素源、不可欠の無機塩類、並びにタンパク質
基質の加水分解物の形の栄養添加物を含むが、発酵培地
中のそのような添加物の利用は通性である。接種物を、
連続的な通気および撹拌下で36〜38℃にて一定に調節さ
れた培地のpH値（6.8〜7.2）の条件下で増殖させる。こ
うして調製された接種材料または寒天培地から洗い出さ
れた細胞懸濁液を用いて、炭素および窒素源、無機塩
類、並びにタンパク質基質の加水分解物の形の栄養添加
物を含む発酵培地に接種する。該添加物は、低い接種量
の場合には前記添加物より発酵期間を短縮することが可
能になり、一方高い接種量の場合にはそのような添加物
の利用が条件的であるために加えられている。
の製造方法は、次のようにして実施される。まず、E.コ
リBKIIMB−3996株の培養物を、ストレプトマイシンを含
む寒天塗抹M9培地上で増殖させ、次いで得られた増殖細
胞の懸濁液を液体接種培地に接種する。この培地は、炭
素および窒素源、不可欠の無機塩類、並びにタンパク質
基質の加水分解物の形の栄養添加物を含むが、発酵培地
中のそのような添加物の利用は通性である。接種物を、
連続的な通気および撹拌下で36〜38℃にて一定に調節さ
れた培地のpH値（6.8〜7.2）の条件下で増殖させる。こ
うして調製された接種材料または寒天培地から洗い出さ
れた細胞懸濁液を用いて、炭素および窒素源、無機塩
類、並びにタンパク質基質の加水分解物の形の栄養添加
物を含む発酵培地に接種する。該添加物は、低い接種量
の場合には前記添加物より発酵期間を短縮することが可
能になり、一方高い接種量の場合にはそのような添加物
の利用が条件的であるために加えられている。
発酵工程は、pH値一定調節装置を備えた発酵槽中で、
6.8〜7.2のpH値および36〜38℃の温度において、一定の
通気および撹拌下で行われる。pH値保持剤として使われ
るのは、アンモニア液または炭素および窒素において平
衡化された糖−アンモニア添加剤のいずれかである。発
酵期間は、接種量および増殖因子による発酵培地の富化
の程度に依存し、そして24〜50時間まで異なることがで
きる。発酵工程の終わりでまでに全部で70〜85g/lのＬ
−トレオニンが蓄積される。Ｌ−トレオニン1gの生合成
のための炭素源の比消費量は２〜2.3gに等しい。
6.8〜7.2のpH値および36〜38℃の温度において、一定の
通気および撹拌下で行われる。pH値保持剤として使われ
るのは、アンモニア液または炭素および窒素において平
衡化された糖−アンモニア添加剤のいずれかである。発
酵期間は、接種量および増殖因子による発酵培地の富化
の程度に依存し、そして24〜50時間まで異なることがで
きる。発酵工程の終わりでまでに全部で70〜85g/lのＬ
−トレオニンが蓄積される。Ｌ−トレオニン1gの生合成
のための炭素源の比消費量は２〜2.3gに等しい。
発酵中にプラスミドは全く損失されない。
理解を深めるために、提案される株の培養の幾つかの
特定例と、提案される株中に含まれる新規プラスミドpV
IC40の作製方法を説明する略図を下記に示す。
特定例と、提案される株中に含まれる新規プラスミドpV
IC40の作製方法を説明する略図を下記に示す。
実施例１ エシェリキア・コリ（Escherichia coli）BKIIM B−3
996菌株を、サッカロース（9.2質量％）およびストレプ
トマイシン（100μg/ml）を含む寒天塗抹M9培地上で増
殖させる。２日間以内で増殖された細胞を0.9％塩化ナ
トリウム溶液中に懸濁し、そして108の滴定量を有する
前記懸濁液10mlを用いて、次の組成（質量％）を有する
接種培地500mlに接種する： サッカロース 4.0 (NH4)2SO4 0.5 KH2PO4 0.2 MgSO4・7H2O 0.04 FeSO4・7H2O 0.002 MgSO4・5H2O 0.002 酵母自己消化物 0.2 水 100％にする。
996菌株を、サッカロース（9.2質量％）およびストレプ
トマイシン（100μg/ml）を含む寒天塗抹M9培地上で増
殖させる。２日間以内で増殖された細胞を0.9％塩化ナ
トリウム溶液中に懸濁し、そして108の滴定量を有する
前記懸濁液10mlを用いて、次の組成（質量％）を有する
接種培地500mlに接種する： サッカロース 4.0 (NH4)2SO4 0.5 KH2PO4 0.2 MgSO4・7H2O 0.04 FeSO4・7H2O 0.002 MgSO4・5H2O 0.002 酵母自己消化物 0.2 水 100％にする。
接種材料を、通気（0.5l/分）および1000rpmの速度で
の撹拌下で1.2lの容量を有する実験室用発酵槽中で37℃
にて20時間増殖させる。pH値は、アンモニア溶液を使っ
て6.9±0.2以内に自動的に維持される。次に７〜８×10
9の滴定量を有する増殖された接種材料50mlを用いて、
発酵培地（500ml）に接種する。発酵培地の組成は、サ
ッカロース濃度が３質量％でありそして0.06質量％の塩
化ナトリウムが加えられていること以外は、接種培地と
同じである。
の撹拌下で1.2lの容量を有する実験室用発酵槽中で37℃
にて20時間増殖させる。pH値は、アンモニア溶液を使っ
て6.9±0.2以内に自動的に維持される。次に７〜８×10
9の滴定量を有する増殖された接種材料50mlを用いて、
発酵培地（500ml）に接種する。発酵培地の組成は、サ
ッカロース濃度が３質量％でありそして0.06質量％の塩
化ナトリウムが加えられていること以外は、接種培地と
同じである。
発酵工程は、通気（0.5l/分）および1200rpmの速度で
の撹拌下で1.2lの容量を有する実験室用発酵槽中で37℃
の培養温度にて行われる。pH値は、糖−アンモニア溶液
添加剤の自動供給により6.9±0.2以内に維持される。前
記添加剤は、実際は3.6:1の体積比で与えられた70％シ
ョ糖溶液と25％アンモニア溶液の混合物である。発酵工
程を36時間続けると、全部で85g/lのＬ−トレオニンが
得られる。プラスミドを損失してまった細胞の比率は、
１％以下である。
の撹拌下で1.2lの容量を有する実験室用発酵槽中で37℃
の培養温度にて行われる。pH値は、糖−アンモニア溶液
添加剤の自動供給により6.9±0.2以内に維持される。前
記添加剤は、実際は3.6:1の体積比で与えられた70％シ
ョ糖溶液と25％アンモニア溶液の混合物である。発酵工
程を36時間続けると、全部で85g/lのＬ−トレオニンが
得られる。プラスミドを損失してまった細胞の比率は、
１％以下である。
実施例２ 実施例１に記載されたのと同様な方法で、提案される
株の培養工程を行う。ただし、増殖された接種材料を0.
9％塩化ナトリウム溶液で希釈して102の滴定量を得る。
そのような懸濁液1mlを用いて、実施例１に記載のもの
と同様であるが増加された酵母自己消化物（0.5質量％
まで）を有する発酵培地に接種する。発酵工程は実施例
１に記載のものと同様な条件下で50時間行われる。
株の培養工程を行う。ただし、増殖された接種材料を0.
9％塩化ナトリウム溶液で希釈して102の滴定量を得る。
そのような懸濁液1mlを用いて、実施例１に記載のもの
と同様であるが増加された酵母自己消化物（0.5質量％
まで）を有する発酵培地に接種する。発酵工程は実施例
１に記載のものと同様な条件下で50時間行われる。
その結果、79g/lの濃度のＬ−トレオニンが得られ、
プラスミドを失なった細胞の比率は１％以下である。
プラスミドを失なった細胞の比率は１％以下である。
産業上の利用可能性 提案される株は、動物への飼料添加物として、医薬お
よび化学工業用試薬として、並びに他のアミノ酸、例え
ばＬ−リジンを産生する微生物のための増殖因子として
等の医薬用途の栄養混合物の調製に用いられる必須アミ
ノ酸Ｌ−トレオニンの製造に利用できる。
よび化学工業用試薬として、並びに他のアミノ酸、例え
ばＬ−リジンを産生する微生物のための増殖因子として
等の医薬用途の栄養混合物の調製に用いられる必須アミ
ノ酸Ｌ−トレオニンの製造に利用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クルゲス，エフゲニ モイセエビチ ソビエト連邦，109651，モスコー，バル ティイスキ プロエズド，デー．５，ク バルチーラ 271 (72)発明者 リフシッツ，ビタリ アルカディエビチ ソビエト連邦，113208，モスコー，スム スコイ プロエズド，デー．５，コルプ ス １，クバルチーラ 84 (72)発明者 ズダノバ，ネッリ イサアコフナ ソビエト連邦，125445，モスコー，レニ ングラドスコエ ショッセ，デー．112, コルプス ３，クバルチーラ 478 (72)発明者 グシアティネル，ミハイル マルコビチ ソビエト連邦，113535，モスコー，ウリ ツァ ロッソシャンスカヤ，デー．11, コルプス ３，クバルチーラ 59 (72)発明者 ソコロフ，アレクサンドル コンスタン ティノビチ ソビエト連邦，119034，モスコー，マリ レフシンスキ ペレウロク，デー．14 ／９，クバルチーラ 113 (72)発明者 バチナ，タティアナ アレクサンドロフ ナ ソビエト連邦，105215，モスコー，シレ ネビ ブルバール，デー．41，クバルチ ーラ 64 (72)発明者 ヤンコフスキ，ニコライ カジミロビチ ソビエト連邦，109004，モスコー，ウリ ツァ ベルフナヤ ラディスチェフスカ ヤ，デー．13／15，クバルチーラ 59 (72)発明者 ツィガンコフ，ユリ ドミトリエビチ ソビエト連邦，117465，モスコー，ウリ ツァ ゲネララ テュレネバ，デー. 35，クバルチーラ 114 (72)発明者 チストセルドフ，アンドレイ ユリエビ チ ソビエト連邦，141570，モスコフスカヤ オブラスト，ポセロク メンデレエ ボ，ウリツァ インスティテュトスカ ヤ，デー．９，クバルチーラ 40 (72)発明者 プロトニコバ，タティアナ グリゴリエ フナ ソビエト連邦，129323，モスコー，１ ボタニチェスキ プロエズド，デー. １，クバルチーラ ７ (72)発明者 シャカリス，イリナ オレゴフナ ソビエト連邦，115522，モスコー，ウリ ツァ モスクボレチエ，デー．９，コル プス ２，クバルチーラ 78 (72)発明者 ベラレバ，アッラ バレンティノフナ ソビエト連邦，125167，モスコー，ウリ ツァ コンスタンティナ シモノバ，デ ー．６，クバルチーラ 29 (72)発明者 アルサティアンツ，ライサ アレクサン ドロフナ ソビエト連邦，117465，モスコー，ウリ ツァ ゴルビンスカヤ，デー．７，コル プス ２，クバルチーラ 178 (72)発明者 ショリン，アルベルト フェドロビチ ソビエト連邦，117321，モスコー，ウリ ツァ オストロビティアノバ，デー. 16，コルプス ４，クバルチーラ 100 (72)発明者 ポズドニアコバ，タマラ ミハイロフナ ソビエト連邦，113535，モスコー，ウリ ツァ ドロズナヤ，デー．20，コルプス ３，クバルチーラ 62 (56)参考文献 相田浩ほか４名編「アミノ酸発酵」学 会出版センター（1986−５−30）Ｐ．22 −24．31−32，48−49，82−84
Claims (5)
- 【請求項１】サッカロース資化能を有し、5mg/mlのＬ−
トレオニン存在下で生育し、トレオニン生合成遺伝子を
搭載するプラスミドを有し、Ｌ−トレオニン生産能を有
するエシェリキア・コリ。 - 【請求項２】請求項１記載のエシェリキア・コリVNIIge
netika−472T23。 - 【請求項３】トレオニンデヒドロゲナーゼ活性を失って
いる請求項１又は２記載のエシェリキア・コリ。 - 【請求項４】請求項３記載のエシェリキア・コリBKIIM
B−3996。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか１項記載のエ
シェリキア・コリを培地に培養し、該培地中にＬ−トレ
オニンを生成蓄積せしめ、該Ｌ−トレオニンを回収する
ことを特徴とする発酵法によるＬ−トレオニンの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1502220A JP2775948B2 (ja) | 1988-10-25 | 1988-10-25 | Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR87/02491 | 1987-02-25 | ||
| JP1502220A JP2775948B2 (ja) | 1988-10-25 | 1988-10-25 | Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01502408A JPH01502408A (ja) | 1989-08-24 |
| JP2775948B2 true JP2775948B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=18527170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1502220A Expired - Lifetime JP2775948B2 (ja) | 1988-10-25 | 1988-10-25 | Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2775948B2 (ja) |
-
1988
- 1988-10-25 JP JP1502220A patent/JP2775948B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 相田浩ほか４名編「アミノ酸発酵」学会出版センター（１９８６−５−３０）Ｐ．２２−２４．３１−３２，４８−４９，８２−８４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01502408A (ja) | 1989-08-24 |
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