KR20000020629A - L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 cj31-0210및 그를 이용한 l-라이신의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0210(기탁번호 제 KFCC-11043 호) 및 그를 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, L-라이신의 발효농도 및 대당수율을 향상시켜 L-라이신의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｌ-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 ＣＪ31-0210 및 그를 이용한 Ｌ-라이신의 생산방법
본 발명은 L-라이신을 생산하는 신규한 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) CJ31-0210에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대한민국 특허출원 제 97-68670 호(1997년 12월 15일 출원)에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001로부터 유래되고, L-라이신의 발효농도 및 대당수율을 획기적으로 증가시킨 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210(기탁번호 제 KFCC-11043 호) 및 그를 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 가축의 사료첨가제, 식품첨가제, 의약원료 등으로 사용되고 있다. 특히 L-라이신의 사료첨가제로서의 시장규모는 1997년에 약 40여만톤에 이르고 있어 L-라이신은 그야말로 거대한 생물공학 제품이라 할 수 있다. 사료첨가제로서의 L-라이신은 현재까지 년 8∼10%의 수요 증대를 나타내어 왔을 뿐 아니라, 가축배설물에 대한 규제가 강화됨에 따라 향후 더욱 급격한 시장 확대가 예상되고 있다. 따라서 L-라이신 생산 균주의 개발 또는 발효공정의 개선에 의한 L-라이신의 생산성의 향상은 더욱 절실한 과제라 할 수 있을 것이다.
현재까지 미생물을 이용한 L-라이신의 생산방법으로는 야생균주를 사용하는 직접발효법(direct fermentation), 생합성 전구물질(예: α-아미노아디프산, α-케토아디프산)을 가하여 대사시키는 방법, 변이주를 사용하는 2단법(디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)을 통한 생산법), 효소에 의한 생산법(DL-α-아미노카프로락탐의 전환) 및 변이주를 사용하는 직접발효법이 알려져 있으며, 그 중에서도 변이주를 사용하는 직접발효법이 주축을 이루고 있다.
L-라이신은 세균, 방선균에서는 하기하는 바와 같은 디아미노피멜릭산 경로(DAP pathway)를 통하여 합성되며, 또한 코리네박테리움 글루타미컴에서는 하기와 같은 조절하에 있게 된다.
즉 아스파토키나제(aspartokinase)는 라이신과 트레오닌에 의한 피드백 저해(feedback inhibition)를 받으며, 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase)는 메티오틴에 의한 억제(repression) 및 트레오닌에 의한 피드백 저해를 받는다.
따라서 변이주를 사용하는 직접발효법에서는 L-라이신 생산 균주로서 일반적으로 대사 제어 물질의 균체내 농도를 인위적으로 조절하기 위한 영양요구성 변이주(auxotroph), 예를 들면, 호모세린 영양요구성, 트레오닌 및 메티오닌 영양요구성 균주나, 최소배지에서는 야생균주와 같이 왕성하게 생육하나 트레오닌, 메티오닌을 소량 첨가하면 생육이 저해되는 성질을 갖는 트레오닌 피드백 저해에 과민성인 호모세린 디하이드로게나제를 갖는 트레오닌 및 메티오닌 감수성 변이주(threonine-methionine sensitive mutant)나, L-라이신과 L-트레오닌의 피드백 저해가 해제되고 호모세린 디하이드로게나제에 대한 트레오닌의 저해만 지속되는 라이신 유사체(예: S(β-아미노에틸)-L-시스테인(AEC))내성 변이주 등을 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 바와 같은 원리로 직접발효법에 의하여 L-라이신을 생산하기 위한 종래의 방법으로는 예를 들면, 일본공개특허 제 평4-88991, 평4-91794, 평5-111386, 평5-30985, 평6-7182 및 평7-155184 호, 및 국제공개특허 제 WO96-17930 및 95-23864 호 등이 공지되어 있다.
한편 본 출원인은 L-루이신(L-leucine) 비영양요구성 및 초산(acetic acid) 자화성의 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001을 대한민국 특허출원 제 97-68670 호로 출원한 바 있다.
그러나 상기 방법들은 미생물에 의한 L-라이신의 발효농도 및 대당수율에 있어서 개선의 여지를 여전히 갖고 있는 방법들이다.
이에 본 발명자들은 대한민국 특허출원 제 97-68670 호에 공지된 바 있는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001을 모균주로 하여 이로부터 보다 우수한 L-라이신 발효농도 및 대당수율을 얻을 수 있는 신균주를 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 초산 비자화성을 갖는 본 발명의 균주가 상기 목적에 부합할 뿐 아니라 기존에 전혀 공지된 바 없는 신규한 균주임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210(기탁번호 제 KFCC-11043 호)을 제공한다.
본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210을 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 모균주로 사용한 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001은 대한민국 특허출원 제 97-68670 호에 개시된 바 있는 균주로서, 하기 표 1과 같은 균학적 성질을 갖는 균주이다.
코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001의 대표적 균학적 성질
1 α-아미노-β-하이드록시발레릭산 내성
2 S-(β-아미노에틸)-L-시스테인 내성
3 메틸라이신 내성
4 L-루이신 누출 특성
5 구아닌 누출 특성
6 초산 자화성
상기 균주는 L-라이신의 생합성 경로에 있어서, L-라이신과 L-트레오닌의 피드백 저해가 해제되고 호모세린 디하이드로게나제에 대한 트레오닌의 저해만 지속되는, 라이신 유사체인 S(β-아미노에틸)-L-시스테인에 내성을 갖는 균주이므로 L-라이신 생산 균주로서 적합한 균주이다.
본 발명에서는 상기 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001을 모균주로 하고 이 균주를 인공돌연변이시켜 초산 자화성에서 초산 비자화성으로 변이된 변이주를 획득하고자 하였다.
인공돌연변이 유발원으로는 알킬화제의 일종인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: NTG)을 107∼108세포/㎖에 대하여 최종농도 1,000㎍/㎖으로 약 5분간 처리하였다. NTG는 생체내에서 분해되어 산성 조건에서는 아질산(nitrous acid)으로, 알칼리성 조건에서는 디아조메탄으로 각각 전환되며 DNA 단편의 부정확한 복제를 일으킴으로써 돌연변이를 유발하게 된다.
그런 후 포도당 함유 배지에서는 세포의 성장이 일어나나 초산 함유 배지에서는 세포의 성장이 일어나지 않는 초산 비자화성 균주를 선별한 후, 그 균주의 L-라이신 발효농도를 시험해 본 결과, A-16 균주(하기 실시예 2 참조)가 모균주인 KFCC 11001에 비하여 그 농도를 획기적으로 증가시킨다는 놀라운 사실을 확인하였다. 이에 상기 A-16 균주 및 모균주인 KFCC 11001를 7ℓ 발효조에서 L-라이신 발효농도에 대하여 재확인 실험을 행하였으며, 그 결과 역시 A-16 균주가 KFCC 11001에 비하여 L-라이신 발효농도를 증가시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 A-16 균주를 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210라 명명하고, 이 균주를 1998년 7월 14일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제 KFCC-11043 호를 부여받았다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210은 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001로부터 유래된 변이주이나, 초산 비자화성 균주라는 점에 있어서 명백히 구별되는 균주이다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210을 창제하기 위한 과정을 상술하면 하기 실시예와 같다.
[실시예]
이하의 실험에서 변이주 선별을 위한 최소배지로는 하기의 한천 최소배지를 사용하였고, 선별된 변이주의 평가를 위한 배지로는 하기의 플라스크 발효배지를 사용하였다. L-라이신의 농도는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 측정하였고, 당량은 필요한 경우 버트란트(Bertrand)법을 사용하여 정량하였다.
한천 최소배지
포도당 10g(필요한 경우 초산 10g 사용), (NH4)2SO42g, 우레아 2g, KH2PO41.0g, K2HPO43.0g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 10mg, MnSO4·5H2O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍, CaCl2·2H2O 0.1g, Na2B4O7·10H2O 80㎍, (NH4)6MoO27·4H2O 40㎍, ZnSO4·7H2O 10㎍, CuSO4·7H2O 300㎍, MnCl2·4H2O 10㎍, FeCl3·6H2O 1mg, 한천 20g, 증류수 1리터당 (pH 7.0(살균전)).
플라스크 발효배지
당밀(환원당으로서) 100g, 효모엑기스 4g, (NH4)2SO440g, 우레아 4g, KH2PO41g, NaCl 2.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 10mg, MnSO4·5H2O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 200㎍, CaCO440g, 공정수 1리터당 (pH 7.0(살균후)).
[실시예 1]
모균주인 KFCC 11001의 초산 자화성을 시험하기 위하여 루리아 버타니(LB) 액체배지에서 16시간 성장시킨 세포를 멸균 생리식염수로 2회 세척한 후 적당히 희석하여 탄소원으로써 포도당과 초산을 각각 첨가한 한천 최소배지에 도말하였다. 30℃ 배양기에서 4일간 배양한 후 그 성장도를 측정한 결과, KFCC 11001의 경우 초산을 자화할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다(표 2).
코리네박테리움 글루타미컴 KFCC11001의 초산 자화성 시험결과
포도당 초산
성장도 ++++ ++
+ : 세포 성장 일어남
[실시예 2]
초산을 자화하지 못하는 균을 창제하기 위하여 루리아 버타니 액체배지에서 대수기 중반까지 성장한 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001을 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 107∼108세포/㎖로 현탁시킨 후, NTG의 최종농도가 1,000㎍/㎖이 되도록 한 후 30℃ 진탕기에서 5분간 처리하였다. 이어서 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척하고 포도당이 함유된 한천 최소배지에 도말하였다. 30℃의 항온기에서 7일간 배양시킨 후 성장한 미생물 군락(colony)을 포도당과 초산이 각각 함유된 한천 최소배지에 투스픽킹(toothpicking)하여 포도당이 함유된 배지에서는 세포의 성장이 일어나지만 초산이 함유된 배지에서는 세포의 성장이 일어나지 않는 초산 비자화성 균주를 선별하였다. 그 결과 5개의 초산 비자화성 미생물 군락을 최종적으로 획득할 수 있었다.
그 미생물 군락을 30℃, 230rpm(revolution per minute), 72시간의 배양조건의 진탕배양기에서 배플 플라스크를 사용하여 L-라이신의 발효농도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었으며, A-16 균주만이 KFCC 11001에 비해 L-라이신의 발효농도를 향상시켰음을 알 수 있었다.
코리네박테리움 글루타미컴 KFCC11001 및 초산 비자화성 변이주의 플라스크 실험결과
균주 발효농도(g/ℓ) 대당수율(%) PCV(%)
KFCC 11001 50.3 50.3 8.3
A-03 49.5 49.5 9.0
A-12 50.1 50.1 8.1
A-16 52.8 52.8 8.0
A-35 47.8 47.8 9.1
A-57 49.1 49.1 8.4
* PCV : Packed Cell Volume
[실시예 3]
실시예 2에서 획득한 A-16 균주를 CJ31-0210 균주라 명명하고, CJ31-0210 및 모균주인 KFCC11001를 7ℓ 발효조에서 하기와 같은 방법으로 재확인 실험을 행하였다. 먼저 두 균주 모두 각각의 플라스크 종배지에서 20시간 동안 진탕배양기에서 종배양한 후 7ℓ 발효조에 직접 접종하였다. 추가당 및 추가물을 배양중에 첨가하는 유가식 발효(fed-batch fermentation)로 균주의 평가실험을 행하였으며 사용된 배지 및 배양조건은 다음과 같다.
종배양 배지성분 및 배양조건
원당 50g(멸살), 펩톤 10g, 효모엑기스 10g, KH2PO41.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, 우레아 5g, 바이오틴 50㎍, 공정수 1ℓ(pH 7.0, 멸균전)
30℃, 220 rpm, 20시간 배양
7ℓ 발효조 배지성분 및 배양조건
당밀(환원당으로서) 280g/ℓ, 콘 스팁 리쿼(Corn steep liquor) 100㎖/ℓ, (NH4)2SO435g/ℓ, KH2PO41.0g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.5 g/ℓ, FeSO4·7H2O 10mg/ℓ, 바이오틴 300㎍/ℓ, 티아민·HCl 500㎍/ℓ, 소포제 3㎖/ℓ)
온도 30℃, pH 7.2, 교반속도 600rpm, 통기량 1vvm(air volume/medium volume/minute)
그 발효 결과, CJ31-0210은 모균주 KFCC11001에 비해 발효농도가 2.6% 가량 증가하고 대당수율 또한 증가한 우량 균주임을 확인하였다(표 4).
코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210 및 KFCC 11001의 7ℓ 발효조 실험결과
KFCC 11001 CJ31-0210
발효농도(g/ℓ) 134.5 138.0
발효시간(hr) 64.0 65.0
대당수율(%) 48.0 49.3
총량(g/ℓ) 280 280
PCV(%) 10.3 10.0
본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CJ31-0210은 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11001를 인공돌연변이시켜 초산 자화성을 초산 비자화성 으로 변이시킨 균주로서, 모균주에 비해 L-라이신의 발효농도 및 대당수율을 향상시켜 L-라이신의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

  1. L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0210(기탁번호 제 KFCC-11043 호).
  2. 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0210(기탁번호 제 KFCC-11043 호)을 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법.
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