JPS61185195A - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法Info
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- JPS61185195A JPS61185195A JP2429785A JP2429785A JPS61185195A JP S61185195 A JPS61185195 A JP S61185195A JP 2429785 A JP2429785 A JP 2429785A JP 2429785 A JP2429785 A JP 2429785A JP S61185195 A JPS61185195 A JP S61185195A
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- Japan
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- acid
- oxo
- amino
- producing
- transformed
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子工学の手法を用いて育種した微生物を用
いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸を製造する方法
に関するものである。
いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸を製造する方法
に関するものである。
本発明は特に広範な２−オキソ酸を基質とするラットの
セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡを用いて形
質転換され九微生物によシフ−オキソ酸からＬ−アミノ
酸を製造する方法に関する。
セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡを用いて形
質転換され九微生物によシフ−オキソ酸からＬ−アミノ
酸を製造する方法に関する。
アミノ酸は輸液等の医薬、栄養強化剤としての食品添加
物および飼料添加物、或は医農薬の中間体、更に調味料
またはその中間体等広範な用途を有する物質であり、現
在醗酵法、化学合成法、酵素法等によって製造されてい
る。
物および飼料添加物、或は医農薬の中間体、更に調味料
またはその中間体等広範な用途を有する物質であり、現
在醗酵法、化学合成法、酵素法等によって製造されてい
る。
醗酵法は安価な原料からアミノ酸を製造出来る方法であ
るがこの方法で多量に蓄積出来るアミノ酸の種類が限定
されることおよび副生物が多く精製工程が繁雑になるこ
とが知られていた。また化学合成法ではり、Ｌ一体が出
来ることが大きな欠点である。酵素法は化学合成した基
質を酵素的にＬ−アミノ酸にすることが出来るが所望の
アミノ酸を合成する酵素を自由に入手することは不可能
で従来本法に依って製造されたアミノ酸はアスノソラギ
ン酸、トリプトファン等限られたものでしかなかった。
るがこの方法で多量に蓄積出来るアミノ酸の種類が限定
されることおよび副生物が多く精製工程が繁雑になるこ
とが知られていた。また化学合成法ではり、Ｌ一体が出
来ることが大きな欠点である。酵素法は化学合成した基
質を酵素的にＬ−アミノ酸にすることが出来るが所望の
アミノ酸を合成する酵素を自由に入手することは不可能
で従来本法に依って製造されたアミノ酸はアスノソラギ
ン酸、トリプトファン等限られたものでしかなかった。
この様な状況から単一の酵素が化学合成された基質を、
その基質に応じて対応する所望のＬ−アミノ酸に変換す
る系の確立が待たれていた。本発明者らはこの点に鑑み
検討の結果広い基質特異性を有するラットセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフェラーゼの遺伝子をクローニン
グすることに成功し、＃遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで
形質転換した微生物が種々の２−オキソ酸を対応するＬ
−アミノ酸に変換することを見出し本発明を完成した。
その基質に応じて対応する所望のＬ−アミノ酸に変換す
る系の確立が待たれていた。本発明者らはこの点に鑑み
検討の結果広い基質特異性を有するラットセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフェラーゼの遺伝子をクローニン
グすることに成功し、＃遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで
形質転換した微生物が種々の２−オキソ酸を対応するＬ
−アミノ酸に変換することを見出し本発明を完成した。
即ち本発明の方法を用いればピルビン酸からはＬ−アラ
ニンが、フェニルピルビン酸からはＬ−フェニルアラニ
ンが、２−オキソグルタル酸からはＬ−グルタミン酸が
、２−オキソ−５−メチル−ｎ−吉草酸からはインロイ
シンがｉられる。
ニンが、フェニルピルビン酸からはＬ−フェニルアラニ
ンが、２−オキソグルタル酸からはＬ−グルタミン酸が
、２−オキソ−５−メチル−ｎ−吉草酸からはインロイ
シンがｉられる。
尚、上述した例は一例であシ本発明の方法ではこれ以外
の２−オキソ酸からも対応するＬ−アミノ酸が得られる
ものである。
の２−オキソ酸からも対応するＬ−アミノ酸が得られる
ものである。
以下本発明の詳細な説明する。
ラット由来セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラー
ゼはセリンおよびピルビン酸をそれツレヒドロキシピル
ビン酸およびアラニンに変換する活性を有する酵素であ
るが広い基質特異性を有し種々の２−オキソ酸、Ｌ−ア
ミノ酸を基質とすることが出来る（ Ｍ、 Ｙａｎａｇ
ａｗａら“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ” ４１３ｐｐ Ｆｌ
ｌｓｅｖｉｅｒ１９８５）。
ゼはセリンおよびピルビン酸をそれツレヒドロキシピル
ビン酸およびアラニンに変換する活性を有する酵素であ
るが広い基質特異性を有し種々の２−オキソ酸、Ｌ−ア
ミノ酸を基質とすることが出来る（ Ｍ、 Ｙａｎａｇ
ａｗａら“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ” ４１３ｐｐ Ｆｌ
ｌｓｅｖｉｅｒ１９８５）。
該酵素の遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列は通常の遺伝子工
学の技術で調製可能であるがグルカゴンを投与後の肝で
は該酵素のｍ１ＷＡ含量が著しく増加するのでこのｍＲ
Ｎ人を出発材料とするのが便利である。
学の技術で調製可能であるがグルカゴンを投与後の肝で
は該酵素のｍ１ＷＡ含量が著しく増加するのでこのｍＲ
Ｎ人を出発材料とするのが便利である。
ｍｌｌ大人らのｃ ＤＮＡの調製はオリゴ（ｄＴ）をプ
ライマーとして逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼエを用
いる通常の方法（Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＭｏ！ｅｃｕ
１４−ｒＣｌｏｎｉｎｇ ２１１ｐｐ Ｃｏ１ｄ ８ｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）或は
Ｏｋｉｙａｍｍ −Ｂｅｒｇ法（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａｙ
Ｐ、 ＢｅｒｇＭｏＪｅｃ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
１９８２２１６１ ）或はＨｅｉｄｅｃｋｅｒ−Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ法（Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃａ
ｔａｌｏｇ １９８３Ｐｈａｒｍｍｃｉａ Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ ）等で実施可能である。
ライマーとして逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼエを用
いる通常の方法（Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＭｏ！ｅｃｕ
１４−ｒＣｌｏｎｉｎｇ ２１１ｐｐ Ｃｏ１ｄ ８ｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）或は
Ｏｋｉｙａｍｍ −Ｂｅｒｇ法（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａｙ
Ｐ、 ＢｅｒｇＭｏＪｅｃ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
１９８２２１６１ ）或はＨｅｉｄｅｃｋｅｒ−Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ法（Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃａ
ｔａｌｏｇ １９８３Ｐｈａｒｍｍｃｉａ Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ ）等で実施可能である。
この様な方法で得られたｃＤＮＡはクローニング宿主と
して用いる微生物で使用可能なベクターに結合し、その
結果得られた組換え体ＤＮＡは該宿主微生物の形質転換
に用いられる。ここで用いる宿主微生物は如何なるもの
でも良いが分子生物学的・微生物学的・遺伝学的によく
検討されているものが使用に便利であシ、その様なもの
として大腸菌（Ｅ、 ｃｏ目）、枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂ
ｔｔｌｉｓ ） 、酵母等が挙げられるが何らそれに限
定されるものではない。ベクターとしては用いる宿主微
生物で複製可能表プラスミド、７アージ或はそれらの誘
導体であれば使用可能であるが本発明の実施に当っては
目的とするセリン：ピルビン酸アミノトラ／ス７エラー
ゼが宿主菌体内で発現出来る型のものであることが必要
である・。ベクターと結合されたｃＤＮＡは次に宿主菌
の形質転換に用いられる。形質転換の方法は通常の方法
で実施可能である。例えば大腸菌を宿主とした場合はＭ
ａｎｄｅｌ −Ｈｉｇａの方法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏｌ、 １９７０５３１５９ ）或はその変法であるル
ビジウム法（Ｆ、 Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｋ、 Ｂａｃｋ
ｍａｎ“Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｉｉｎｘｙｍｏｌｏｇ
ｙ″ｖｏｌ ６８２５３ｐｐλａｓ 、ｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ １９７９ ）等で実施可能である。
して用いる微生物で使用可能なベクターに結合し、その
結果得られた組換え体ＤＮＡは該宿主微生物の形質転換
に用いられる。ここで用いる宿主微生物は如何なるもの
でも良いが分子生物学的・微生物学的・遺伝学的によく
検討されているものが使用に便利であシ、その様なもの
として大腸菌（Ｅ、 ｃｏ目）、枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂ
ｔｔｌｉｓ ） 、酵母等が挙げられるが何らそれに限
定されるものではない。ベクターとしては用いる宿主微
生物で複製可能表プラスミド、７アージ或はそれらの誘
導体であれば使用可能であるが本発明の実施に当っては
目的とするセリン：ピルビン酸アミノトラ／ス７エラー
ゼが宿主菌体内で発現出来る型のものであることが必要
である・。ベクターと結合されたｃＤＮＡは次に宿主菌
の形質転換に用いられる。形質転換の方法は通常の方法
で実施可能である。例えば大腸菌を宿主とした場合はＭ
ａｎｄｅｌ −Ｈｉｇａの方法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏｌ、 １９７０５３１５９ ）或はその変法であるル
ビジウム法（Ｆ、 Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｋ、 Ｂａｃｋ
ｍａｎ“Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｉｉｎｘｙｍｏｌｏｇ
ｙ″ｖｏｌ ６８２５３ｐｐλａｓ 、ｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ １９７９ ）等で実施可能である。
また枯草菌を宿主とした場合はプロトプラスト法（８，
０ｈａｎｇ＋ ８．Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ １９７９１６８１１１ ’）および
コンピテント法（ＣｌＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ
、 Ｔ、 ８ｐｉｚｉｘｅｎ Ｊ−Ｂａｔｆｅｒｉｏｌ
。
０ｈａｎｇ＋ ８．Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ １９７９１６８１１１ ’）および
コンピテント法（ＣｌＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ
、 Ｔ、 ８ｐｉｚｉｘｅｎ Ｊ−Ｂａｔｆｅｒｉｏｌ
。
１９６１８１７４１ ）等で実施可能である。酵母を宿
主とした場合はＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ。
主とした場合はＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ。
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 ＵＳＡ １９７８７５１９２９
）或はＩｔｏらの方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ 、
Ｃｈｅｍ１９８５４７１９６１ ）等で実施可能であ
る。このようにして実施した形質転換の結果得られた形
質転換株からのセリン：ピルビン酸アミノトランス７エ
ラーゼクローンの選択も通常の方法で実施可能である。
）或はＩｔｏらの方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ 、
Ｃｈｅｍ１９８５４７１９６１ ）等で実施可能であ
る。このようにして実施した形質転換の結果得られた形
質転換株からのセリン：ピルビン酸アミノトランス７エ
ラーゼクローンの選択も通常の方法で実施可能である。
即ち該活性を指標とする方法或は免疫的特性を利用する
方法等で実施可能である。本発明の酵素の場合はラット
肝から該酵素を調製出来るので抗体を調製して免疫的な
一次選択を行うのが便利である。この様な方法として例
えば酵素免疫測定法を用い九Ｂｒｏｏｍｓの方法（Ｐｒ
ｏｔ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ８人１９７８
７５ ２７４６ ）或はＢｕｃｋｅｌの方法（Ｇｅｎｅ
１９８１１６１４９ ）等の方法が挙げられるが何ら
これに限定されるものではない。
方法等で実施可能である。本発明の酵素の場合はラット
肝から該酵素を調製出来るので抗体を調製して免疫的な
一次選択を行うのが便利である。この様な方法として例
えば酵素免疫測定法を用い九Ｂｒｏｏｍｓの方法（Ｐｒ
ｏｔ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ８人１９７８
７５ ２７４６ ）或はＢｕｃｋｅｌの方法（Ｇｅｎｅ
１９８１１６１４９ ）等の方法が挙げられるが何ら
これに限定されるものではない。
かくして得られた形質転換株は次に該酵素活性が発現し
ているか否かの検討に供試される。該酵素活性が発現し
ていればその１１本発明のアミノ酸製造に使用可能であ
る。発現量を更に改良するには発現Ｒフタ−のプロモー
ター改変成は他のプロモーターを有する発現ベクターへ
の該酵素遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列の入れ換え等の方
法を用いればよい。
ているか否かの検討に供試される。該酵素活性が発現し
ていればその１１本発明のアミノ酸製造に使用可能であ
る。発現量を更に改良するには発現Ｒフタ−のプロモー
ター改変成は他のプロモーターを有する発現ベクターへ
の該酵素遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列の入れ換え等の方
法を用いればよい。
この様にして造成したラットセリン：ピルビン酸アミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有す
る組換え体ＤＮＡＫよって形質転換した微生物を用いて
アミノ酸を製造するには通常の酵素的方法或は前駆体で
ある２−オキソ酸を添加する醗酵法で実施可能である。
トランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有す
る組換え体ＤＮＡＫよって形質転換した微生物を用いて
アミノ酸を製造するには通常の酵素的方法或は前駆体で
ある２−オキソ酸を添加する醗酵法で実施可能である。
後者の場合は前駆体として２−オキソ酸およびアミノ供
与体を培養中に逐次または一括添加するものである。酵
素的方法の場合は該形質転換微生物を緩衝液中に懸濁し
、該懸濁液中に２−オキソ酸或はその塩とアミノ供与体
を存在させれば良い。２−オキソ酸またはその塩および
アミノ供与体の添加の方法はそれぞれ一括または逐次い
ずれでも良いが一般に２−オキソ酸を高濃度に添加する
場合は基質阻害を防ぐために逐次添加にした方が好まし
い。反応温度は該酵素が失活しない温度範囲であればよ
いが通常０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範
囲である。
与体を培養中に逐次または一括添加するものである。酵
素的方法の場合は該形質転換微生物を緩衝液中に懸濁し
、該懸濁液中に２−オキソ酸或はその塩とアミノ供与体
を存在させれば良い。２−オキソ酸またはその塩および
アミノ供与体の添加の方法はそれぞれ一括または逐次い
ずれでも良いが一般に２−オキソ酸を高濃度に添加する
場合は基質阻害を防ぐために逐次添加にした方が好まし
い。反応温度は該酵素が失活しない温度範囲であればよ
いが通常０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範
囲である。
尚１反応時菌体をそのまま懸濁する方法のみ主らずトル
エン等有機溶媒処理をした菌体、界面活性剤処理をした
菌体或は固定化をした菌体を用いた場合も当然本発明の
範躊に入るものである。
エン等有機溶媒処理をした菌体、界面活性剤処理をした
菌体或は固定化をした菌体を用いた場合も当然本発明の
範躊に入るものである。
反応後所望のアミノ酸を回収するには通常の方法で実施
可能である。その様な方法としては等電点沈澱、有機溶
媒沈澱、イオン交換カラムクロマトグラフィー等がある
が何らこれらの方法に限定されるものではない。かくし
て得られた所望のアミノ酸は通常の方法で精製可能であ
る。以下本発明を具体例によって説明するが、何らこれ
に限定されるものではない。
可能である。その様な方法としては等電点沈澱、有機溶
媒沈澱、イオン交換カラムクロマトグラフィー等がある
が何らこれらの方法に限定されるものではない。かくし
て得られた所望のアミノ酸は通常の方法で精製可能であ
る。以下本発明を具体例によって説明するが、何らこれ
に限定されるものではない。
２４時間絶食した体重１５０ｇの雄つィスタ一種ラット
に体重１００ｇ当り５００μｇの量のグルカゴンを腹腔
的注射し、該ラットから肝を調製し九。肝からの全ＲＮ
人の調製はＮａＤｏｄ８０＜ −フェノール法（Ｍ、
ＭｏｒｉらＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、人ｃａｄ、８ｅｉ。
に体重１００ｇ当り５００μｇの量のグルカゴンを腹腔
的注射し、該ラットから肝を調製し九。肝からの全ＲＮ
人の調製はＮａＤｏｄ８０＜ −フェノール法（Ｍ、
ＭｏｒｉらＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、人ｃａｄ、８ｅｉ。
Ｕ８人１９７９７６５０７１ ）に従った。得られた全
ＲＮ人からＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ（Ｔ、
ＭａｎｉｔａｓらＣｏｌｄＳｐｒｉｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２ ） １９８頁に記
載のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用いる方法で
ボ！ｊ（Ａ”）几ＮＡ画分を得た。このポ！ｊ（Ａ”）
ＲＮ人を鋳型にして常法に依シオリゴ（ｄＴ ）１２−
１８をプライマーとし逆転写酵素（ＢＲＬ社製λＭＹリ
バーストランスクリプターゼ）を用いて１ｓｔストラン
ドを合成した。次に常法に従いアルカリ処理によりｍＲ
ＮＡを分解除去後、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼエ
Ｋｌｅｎｏｗ７ラグメント（ＢＲＬ社製）を用いて２
ｎｄストランドの合成を行った。
ＲＮ人からＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ（Ｔ、
ＭａｎｉｔａｓらＣｏｌｄＳｐｒｉｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２ ） １９８頁に記
載のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用いる方法で
ボ！ｊ（Ａ”）几ＮＡ画分を得た。このポ！ｊ（Ａ”）
ＲＮ人を鋳型にして常法に依シオリゴ（ｄＴ ）１２−
１８をプライマーとし逆転写酵素（ＢＲＬ社製λＭＹリ
バーストランスクリプターゼ）を用いて１ｓｔストラン
ドを合成した。次に常法に従いアルカリ処理によりｍＲ
ＮＡを分解除去後、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼエ
Ｋｌｅｎｏｗ７ラグメント（ＢＲＬ社製）を用いて２
ｎｄストランドの合成を行った。
かくして得られた２ ｎｄストランドのｍ１ＬＮＡの５
′末端に相当する側にＦｉｃｏ几ニリンカーを６′末端
側にＰｓｔＩリンカ−を結合させるため、２ｎｄストラ
ンド内の該制限酵素切断部位をＰｓｔＩメチラーゼ。
′末端に相当する側にＦｉｃｏ几ニリンカーを６′末端
側にＰｓｔＩリンカ−を結合させるため、２ｎｄストラ
ンド内の該制限酵素切断部位をＰｓｔＩメチラーゼ。
ｇｃｏＲＩメチラーゼによジメチル化して保護した。
次に常法に従いｍＲＮＡの６７−末端に相当する２ｎｄ
ストランド末端にＰｓｔＩリンカ−を結合した、更Ｋｍ
ＲＮＡの５′末端に相当する部分に形成されているヘア
ピン構造をヌクレアーゼ８Ｉで切断しＤＮＡポリメラー
ゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端とした。
ストランド末端にＰｓｔＩリンカ−を結合した、更Ｋｍ
ＲＮＡの５′末端に相当する部分に形成されているヘア
ピン構造をヌクレアーゼ８Ｉで切断しＤＮＡポリメラー
ゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端とした。
かくして得られたｃ ＤＮＡのｍ１ＬＮＡの５′末端に
相当する部分に常法に従いＢｃｏＲＩ リンカ−を結合
し１次にＢｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用い両末端を完全
に分解し粘着末端を露出させた。以上の行程は［Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｊに従って実施した。
相当する部分に常法に従いＢｃｏＲＩ リンカ−を結合
し１次にＢｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用い両末端を完全
に分解し粘着末端を露出させた。以上の行程は［Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｊに従って実施した。
実施例２ 形質転換
クローニング部位の上流にβ−ガラクトシダーゼの発現
に必要な部位を含む発現ベクターｐＵＣ８（Ｊ、 Ｖｉ
ｅｉｒａ、 Ｊ、 Ｍｅｓａｉｎｇ Ｇｅｎｅ １９８
２１９２５９ ）をＢＲＬ社から購入し、該ベクターを
ＥｃｏＲＩ＋ ＰｓｔＩで分解し低融点アガロースゲル
電気泳動によυ大フラグメントを回収した後α５μＩの
該ベクター大フラグメントと実施例１で得られたｃＤＮ
Ａ０．５μＩをＴ４ リガーゼを用い常法によシ結合し
た。このリガーゼ反応混液を用いてＭａｎｄｅｌ −Ｈ
ｉｇ の方法に従い大腸菌ＤＨ−１を形質転換した。形
質転換後該大腸薗はインプロピル−β−チオガラクトピ
ラノシドおよび５−プロモーチオクロロ−３−インドリ
ル−β−ガラクトシド含有ＹＴプレート（５０μｍ１／
Ｋｌアンピシリン添加）にブレーティングした。この条
件は「Ｍ１３クローニング／ジデオキシシーケンシング
」（丸善バイオケミカル）に従った。ブレーティング後
のプレートは３７℃で一夜培養し生じた白色コロニーを
ニトロセルロースフィルター上に移しＬ−プロス寒天培
地上で一夜培養し生じたコロニーをクロロホルム、ｆ気
の充満した容器中に室温で２０分間入れ溶菌した。
に必要な部位を含む発現ベクターｐＵＣ８（Ｊ、 Ｖｉ
ｅｉｒａ、 Ｊ、 Ｍｅｓａｉｎｇ Ｇｅｎｅ １９８
２１９２５９ ）をＢＲＬ社から購入し、該ベクターを
ＥｃｏＲＩ＋ ＰｓｔＩで分解し低融点アガロースゲル
電気泳動によυ大フラグメントを回収した後α５μＩの
該ベクター大フラグメントと実施例１で得られたｃＤＮ
Ａ０．５μＩをＴ４ リガーゼを用い常法によシ結合し
た。このリガーゼ反応混液を用いてＭａｎｄｅｌ −Ｈ
ｉｇ の方法に従い大腸菌ＤＨ−１を形質転換した。形
質転換後該大腸薗はインプロピル−β−チオガラクトピ
ラノシドおよび５−プロモーチオクロロ−３−インドリ
ル−β−ガラクトシド含有ＹＴプレート（５０μｍ１／
Ｋｌアンピシリン添加）にブレーティングした。この条
件は「Ｍ１３クローニング／ジデオキシシーケンシング
」（丸善バイオケミカル）に従った。ブレーティング後
のプレートは３７℃で一夜培養し生じた白色コロニーを
ニトロセルロースフィルター上に移しＬ−プロス寒天培
地上で一夜培養し生じたコロニーをクロロホルム、ｆ気
の充満した容器中に室温で２０分間入れ溶菌した。
次にフィルターをＴ８緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝液（ｐｉ（７，５）、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１）に
５ｍＭＭｇＣ１１，１μｇ／ＩＩ／ＤＮａｓｅＩ 、
５ ％ （ｗ／ ｖ ）牛血清アルブミン、４０μｉ／
ｒｌリゾチームに一夜室温で浸漬し菌体蛋白の固定とフ
ィルターの前処理を実施した。
緩衝液（ｐｉ（７，５）、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１）に
５ｍＭＭｇＣ１１，１μｇ／ＩＩ／ＤＮａｓｅＩ 、
５ ％ （ｗ／ ｖ ）牛血清アルブミン、４０μｉ／
ｒｌリゾチームに一夜室温で浸漬し菌体蛋白の固定とフ
ィルターの前処理を実施した。
前処理後のフィルターは次に３％（ｗ／ｖ）牛血清アル
ブミン、１０μｇ／Ｉｌｌ抗セリン：ピルビン酸アミノ
トランスフェラーゼウサギＩｇＧを含むＴ８緩衝液中に
室温で１時間浸漬した。その後Ｔ８ＴＳ（Ｑ、１ ％Ｔ
ｏｒｉｔｏｎＸ −１００，α１ ｆｉｓＤ８含有ＴＳ
含有液Ｓ緩衝液１５分洗浄した。該洗浄は５回線９返し
た。
ブミン、１０μｇ／Ｉｌｌ抗セリン：ピルビン酸アミノ
トランスフェラーゼウサギＩｇＧを含むＴ８緩衝液中に
室温で１時間浸漬した。その後Ｔ８ＴＳ（Ｑ、１ ％Ｔ
ｏｒｉｔｏｎＸ −１００，α１ ｆｉｓＤ８含有ＴＳ
含有液Ｓ緩衝液１５分洗浄した。該洗浄は５回線９返し
た。
次にフィルターは５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、１
２５Ｉ−標Ｒ１ｘ １０’ ｃｐｍ／ｒｄ ロバ抗ウ
サギＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２添加ＴＳＴ８で１時間室温
にて処理した。該処理後ＴＳＴ８による室温１５分での
洗浄を５回行った。
２５Ｉ−標Ｒ１ｘ １０’ ｃｐｍ／ｒｄ ロバ抗ウ
サギＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２添加ＴＳＴ８で１時間室温
にて処理した。該処理後ＴＳＴ８による室温１５分での
洗浄を５回行った。
かくして得られた第１抗体、第２抗体処理後のフィルタ
ーは風乾し一７０℃で増感紙を用いて露光後、現象した
。
ーは風乾し一７０℃で増感紙を用いて露光後、現象した
。
以上の操作によｆｉ ３１００のライプ２リーより１９
個のポジティブコロニーを得た。このうちのひとつＭＴ
−８Ｐ１０株（ＦＦｆ几ＭＢＰ−６９５＞は８Ｄ１３−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン＝ピルビン
酸アミノトランスフェラーゼと同一の移動度を有する蛋
白を産生じていた。宿主として用いたＤＨＩは該移動度
の蛋白を産生じていなかった。ＭＴ−８Ｐ１０株からプ
ラスミドをｌｌＩ製して調べたところ該プラスミドはＢ
ｃｏＲＩ。
個のポジティブコロニーを得た。このうちのひとつＭＴ
−８Ｐ１０株（ＦＦｆ几ＭＢＰ−６９５＞は８Ｄ１３−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン＝ピルビン
酸アミノトランスフェラーゼと同一の移動度を有する蛋
白を産生じていた。宿主として用いたＤＨＩは該移動度
の蛋白を産生じていなかった。ＭＴ−８Ｐ１０株からプ
ラスミドをｌｌＩ製して調べたところ該プラスミドはＢ
ｃｏＲＩ。
ｐｓｔＩ消化によりα５ ｋｂの７ラグメントを生ずる
ことが確認された。この７ラグメントを用いてＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５４４頁記載のハイプリ
ダイゼーショ／選択同定法を用いて調べたところ得られ
たクローンがセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼに対するものであることを確認した。
ことが確認された。この７ラグメントを用いてＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５４４頁記載のハイプリ
ダイゼーショ／選択同定法を用いて調べたところ得られ
たクローンがセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼに対するものであることを確認した。
またＭＴ−８Ｐ１０株の有するプラスミドはｐＵＣ８の
ｇｃｏＲＩ＋ ＰｓｔＩ切断部位に約ｆ、４ｋｂのＤＮ
Ａ塩基配列が挿入結合したものであることを確認し該組
換え体ＤＮＡをＰＲ８ＰＴ １０と命名した。
ｇｃｏＲＩ＋ ＰｓｔＩ切断部位に約ｆ、４ｋｂのＤＮ
Ａ塩基配列が挿入結合したものであることを確認し該組
換え体ＤＮＡをＰＲ８ＰＴ １０と命名した。
Ｐ几８ＰＴ １０の特異的産物である蛋白（分子量４万
）は宿主菌を超音波処理することによシ上清に回収する
ことが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノトランスフ
ェラーゼ抗体による免疫沈降実験を行なった。その結果
該抗体によＦ） ＰＲ３ＦＴ １０ Ｋよる特異的産物
は沈降することが認められた。またこの上清はセリン：
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性がＰ几ｓｐ丁
１０を有しない宿主のものく比べ１０”以上高く、かつ
その活性は該＃素の抗体で抑えられることが認められた
。
）は宿主菌を超音波処理することによシ上清に回収する
ことが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノトランスフ
ェラーゼ抗体による免疫沈降実験を行なった。その結果
該抗体によＦ） ＰＲ３ＦＴ １０ Ｋよる特異的産物
は沈降することが認められた。またこの上清はセリン：
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性がＰ几ｓｐ丁
１０を有しない宿主のものく比べ１０”以上高く、かつ
その活性は該＃素の抗体で抑えられることが認められた
。
以上の結果からｐＲｓＰテ１０はラット肝セリン：ピル
ビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩
基配列を有する組換え体ＤＮＡであることが確認された
。またＭＴ−８Ｐ’ｒ１０株は該組換え体ＤＮＡによっ
て形質転換された微生物でめる。
ビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩
基配列を有する組換え体ＤＮＡであることが確認された
。またＭＴ−８Ｐ’ｒ１０株は該組換え体ＤＮＡによっ
て形質転換された微生物でめる。
実施例２で得られ九Ｍ’ｒ−８ＰＴ１０株をＤｉ ｆｃ
。
。
社製Ｐｅｎａｓｓａｙ培地（アンピシリン５０μｍ１／
Ｍｌ添加）で５７℃−夜培養した菌体遠心によシ集め表
１に示す条件で２−オキソ酸とアミノ供与体との間でア
ミノ基転移反応を行い（５７℃、１５時間）所望のアミ
ノ酸を得た。尚菌体は各場合とも５０ｍｙ＜湿潤重量）
用いた。反応は試験管（５Ｑｓｌ）に５Ｍｌの反応液を
入れ振盪させて実施した。反応液は１００ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐｉ（８，５＞に２−オキソ酸とアミ
ノ供与体を溶解し菌体を懸濁したものである。分析はＨ
ＰＬＣ（８ｈｏｄｅｙ ＯＨ−ｐａｋ ）およびバイオ
アッセイ法によって行った。
Ｍｌ添加）で５７℃−夜培養した菌体遠心によシ集め表
１に示す条件で２−オキソ酸とアミノ供与体との間でア
ミノ基転移反応を行い（５７℃、１５時間）所望のアミ
ノ酸を得た。尚菌体は各場合とも５０ｍｙ＜湿潤重量）
用いた。反応は試験管（５Ｑｓｌ）に５Ｍｌの反応液を
入れ振盪させて実施した。反応液は１００ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐｉ（８，５＞に２−オキソ酸とアミ
ノ供与体を溶解し菌体を懸濁したものである。分析はＨ
ＰＬＣ（８ｈｏｄｅｙ ＯＨ−ｐａｋ ）およびバイオ
アッセイ法によって行った。
表１に示す様に本発明の方法により種々の２−オキソ酸
から対応するＬ−アミノ酸が製造出来ることが判明した
。
から対応するＬ−アミノ酸が製造出来ることが判明した
。
ｇｇ１図はｍ１ＷＡからのｃＤＮＡの合成およびクロー
ニングを示す図である。 Ｒａマ、Ｔ：逆転写酵素 Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒ、 ： Ｄ Ｎ人ポリメラーゼＩ
Ｋｌｅｎｏｗ７ラグメ／ト 第２図は、第１図で構築した組換え体ＤＮＡによる形質
転換株からのラット肝セリン：ピルビン酸アミノトラン
ス７エラーゼクローンの免疫的選択法を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 摩 〈
ニングを示す図である。 Ｒａマ、Ｔ：逆転写酵素 Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒ、 ： Ｄ Ｎ人ポリメラーゼＩ
Ｋｌｅｎｏｗ７ラグメ／ト 第２図は、第１図で構築した組換え体ＤＮＡによる形質
転換株からのラット肝セリン：ピルビン酸アミノトラン
ス７エラーゼクローンの免疫的選択法を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 摩 〈
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ラットセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮム
を用いて微生物を形質転換し、得られた形質転換株を用
い２−オキソ酸をアミノ基受容体とし該受容体にアミノ
供与体からアミノ基を転移させてアミノ酸を製造する方
法。 ２）微生物が大腸菌であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載するアミノ酸の製造方法。 ３）２−オキソ酸が次に示すもの或はその塩から任意に
選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載するアミノ酸の製造法：ピルビン酸、フェニ
ルピルビン酸、２−オキソ−３−イミダゾールプロピオ
ン酸、２−オキソ−３−ヒドロキシフェニルプロピオン
酸、２−オキソグルタル酸、ヒドロキシピルビン酸、２
−オキソイソ吉草酸、２−オキソイソカプロン酸、２−
オキソ−３−メチル−ｎ−吉草酸、２−オキソ−３−メ
ルカプトプロピオン酸、２−オキソ−４−メチルチオ酪
酸、２−オキソ−３−ヒドロキシ酪酸、２−オキソ−４
−ヒドロキシ酪酸、２−オキソ−３−（インドール）プ
ロピオン酸、グリオキシル酸、２−オキソコハク酸、２
−オキソスクシンアミド酸、２−オキソグルタルアミド
酸、２−オキソ−６−アミノ−ｎ−カプロン酸、２−オ
キソ−３−（３’，４’−ジヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸。 ４）アミノ供与体が次に示す化合物またはその塩から任
意に選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載するアミノ酸の製造法：アラニン、アス
パラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン
、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイ
ン、メチオニン、ヒスチヂン、スレオニン、ホモセリン
、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アル
ギニン、グリシン、リジン、２−アミノ−ｎ−酪酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429785A JPS61185195A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429785A JPS61185195A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185195A true JPS61185195A (ja) | 1986-08-18 |
Family
ID=12134229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2429785A Pending JPS61185195A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61185195A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006926A1 (fr) * | 1994-08-30 | 1996-03-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
-
1985
- 1985-02-13 JP JP2429785A patent/JPS61185195A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006926A1 (fr) * | 1994-08-30 | 1996-03-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine |
| US6214591B1 (en) | 1994-08-30 | 2001-04-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for producing L-valine and L-leucine |
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