JPH0543355B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
本発明は遺伝子工学の手法を用いて育種した微
生物を用いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸
を製造する方法に関するもである。 本発明は特に広範な２−オキソ酸を基質とする
ラツトのセリン：ピルピン酸アミノトランスフエ
ラーゼ遺伝子を含むDNA塩基配列を有する組換
え体DNAを用いて形質転換された微生物により
アンモニア或はアンモニウム塩存在下に２−オキ
ソ酸からＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。 アミノ酸は輪液等の医薬、栄養強化剤としての
食品添加物および飼料添加物、或は医農薬の中間
体、更に調味料またはその中間体等広範な用途を
有する物質であり現在醗酵法、化学合成法、酵素
法等によつて製造されている。 醗酵法は安価な原料からアミノ酸を製造出来る
方法であるが、この方法で多量に蓄積出来るアミ
ノ酸の種類が限定されること、および副生物が多
く精製工程が繁雑になることが知られていた。ま
た化学合成法ではＤ、Ｌ−体が生成し、Ｌ−体を
必要とする場合はラセミ分割が必要なことが大き
な欠点である。酵素法は化学合成を基質を酵素的
にＬ−アミノ酸にすることが出来るが所望のアミ
ノ酸を合成する酵素を自由に入手することは不可
能で従来本法に依つて製造されたアミノ酸はアス
パラギン酸、トリプトフアン等限られたものでし
かなかつた。 この様な状況から単一の酵素が化学合成された
基質を、その基質に応じて対応する所望のＬ−ア
ミノ酸に変換する系の確立が待たれていた。本発
明者らはこの点に鑑み検討の結果広い基質特異性
を有するラツトセリン：ピルビン酸アミノトラン
スフエラーゼの遺伝子を含むDNA塩基配列を有
する組換え体DNAにより形質転換された微生物
が種々の２−オキソ酸をアンモニア或はアンモニ
ウム塩の存在下で対応するＬ−アミノ酸に変換す
ることを見出し本発明を完成した。即ち本発明の
方法を用いれば２−オキソ酸をアミノ基受容体と
しアンモニア或はアンモニウム塩存在下で２−オ
キソ酸に対応するＬ−アミノ酸が得られるもので
ある。その場合反応系内にグルタミン酸或はその
塩、またはアラニン或はその塩またはエタノール
が存在すると所望するアミノ酸が好収率で得られ
ることを見出した。更に上記いずれかのアミノ酸
またはその塩およびエタノールが共存する場合に
は所望するアミノ酸が極めて高い収率で得られる
ことも見出した。 これらのことから本発明の方法ではクローン化
されたセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼによるアミノ基転移反応のアミノ基供与体と
してグルタミン酸或はその塩、またはアラニン或
はその塩が有効であることまた、それらのアミノ
酸或はその塩から、アミノ基転移の結果生じた２
−オキソ酸はアンモニア或はアンモニウム塩の存
在により再び対応するアミノ酸となり再びアミノ
供与体として働くことが判明した。この際エタノ
ールの存在により反応が好ましい方向に進むこと
からアルコールデヒドロゲナーゼによるNADH
或はNADPHの生成とグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ或はアラニンデヒドロゲナーゼによるアン
モニウムイオン、NADH（またはNADPH）存在
下グルタミン酸或はアラニンの生成とセリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼによる２−オ
キソ酸のアミノ酸への転換が効果的に連動してい
ることが判断されるものである。従つて本発明の
方法では通常のアミノトランスフエラーゼ反応と
異なり平衡が所望するアミノ酸生成の方向に傾き
添加した２−オキソ酸（所望するアミノ酸に対応
する）を極めて高い転換率で所望するアミノ酸に
することが出来かつ、そのアミノ基原として安価
なアンモニア或はアンモニウム塩を用いることが
出来るものである。 以下本発明を詳細に説明する。 ラツト由来セリン：ピルビン酸アミノトランス
フエラーゼはセリンおよびピルビン酸をそれぞれ
ヒドロキシピルビン酸およびアラニンに変換する
活性を有する酵素であるが広い基質特異性を有し
種々の２−オキソ酸、Ｌ−アミノ酸を基質するこ
とが出来る（M.Yanagawaら”Biochemistry of
Metabolic Processes”413pp Elsevier1983）。 該酵素の遺伝子を含むDNA塩基配列は通常の
遺伝子工学の技術で調製可能であるがグルカゴン
を投与後の肝では該酵素のmRNA含量が著しく
増加するので、このmRNAを出発材料とするの
が便利である。 mRNAからのcDNAの調製はオリゴ（dT）を
プライマーとして逆転写酵素、DNAポリメラー
ゼＩを用いる通常の方法（T.Manitasら
Molecular Cloning211pp Cold Spring Harbor
Laboratory）或はOkayamam−Berg法（H.
Okayama、P.Berg Molec.Cell.Biol.1982 ２
161）或はHeidecker−Messing法（The Mole.
Biol.Catalog 1983 Pharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicais）等で実施可能である。 この様な方法で得られたcDNAはクローニング
宿主として用いる微生物で使用可能なベクターに
結合し、その結果得られた組換え体DNAは該宿
主微生物の形質転換に用いられる。ここで用いる
宿主微生物は如何なるものでも良いが分子生物学
的・微生物学的・遺伝学的によく検討されている
ものが使用に便利であり、その様なものとして大
腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus
subtilis）または酵母（Saccharomyces
cerevisiae）等が挙げられる。ベクターとしては
用いる宿主微生物で複製可能なプラスミド、フア
ージ或はそれらの誘導体であれば使用可能である
が本発明の実施に当つては目的とするセリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼが宿主菌体内
で発現出来る型のもであることが必要である。こ
のようなベクターとcDNAを結合して得られた組
換え体DNAは宿主菌の形質転換に用いられる。
かくして得られた形質転換株からのセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフエラーゼクローンの選択
は抗体を用いた免疫的な方法と該酵素の活性を指
標とする方法によつて実施可能である。この様な
方法で選択された形質転換株からの組み換え体
DNAの調製は通常のプラスミド調製法に依つて
実施可能である。 かくして得られたラツトセリン：ピルビン酸ア
ミノトランスフエラーゼ遺伝子を含むDNA塩基
配列を有する組換え体DNAは本発明の実施様態
からアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ或はアラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性の強い宿主に導入されるのが好まし
い。 この様にして造成したラツトセリン：ピルビン
酸アミノトランスイフエラーゼ遺伝子を含む
DNA塩基配列を有する組換え体DNAによつて形
質転換した微生物を用いてアミノ酸を製造するに
は通常の酵素的方法或は前駆体を添加する醗酵法
で実施可能である。 酵素的方法の場合は該形質転換微生物を緩衝液
中に懸濁し該懸濁液中に２−オキソ酸とアンモニ
ア或はアンモニウム塩を共存させれば良い。その
際所望するアミノ酸に対応する２−オキソ酸或は
その塩の他にピルビン酸或はその塩または２−オ
キソグルタル酸或はその塩を添加するかまたはア
ラニン或はその塩またはグルタミン酸またはその
塩を添加すると所望のアミノ酸の生産が高まる。
またアルコールが共存する場合も所望のアミノ産
の生成量が改善される。更にアルコールとピンピ
ル酸或はα−ケトグルタル酸或はそのいずれかの
塩、またはグルタミン酸或はアラニン或はそのい
ずれかの塩が共存する条件下では２−オキソ酸か
らの所望のアミノ酸への転換率は頻著に高まるこ
とを見出した。 反応系への２−オキソ酸またはその塩の添加は
一括法、分割法いずれでも良いが一般に２−オキ
ソ酸濃度が高い系内では基質阻害を生じる可能性
があるので、高濃度添加の場合は分割添加が望ま
しい。アンモニア或はアンモニウム塩の濃度は２
−オキソ酸と同じモル濃度からその10倍濃度の間
に入る様に添加するのが望ましいが何らそれに限
定されるものではない。アルコールも２−オキソ
酸と同じモル濃度からその20倍濃度の範囲で添加
するのが好ましい。またグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼの基質である２−オキソグルタル酸または
グルタミン酸或はそのいずれかの塩の添加は所望
するアミノ酸に対応する２−オキソ酸と同じモル
濃度以下で有効であり好ましくは２−オキソ酸の
500分の１から２分の１の範囲のモル濃度で添加
すれば良い。同様にアラニンデヒドロゲナーゼの
基質であるピルビン酸またはアラニン或はそのい
ずれかの塩も２−オキソ酸の500分の１から２分
の１の範囲のモル濃度で添加するのが好ましいが
何らこれらに限定されるものではない。 反応温度は本発明に於て用いられる当該酵素が
失活しない温度範囲であればいずれの温度でも良
いが通常０℃〜70℃、好ましくは20℃〜50℃の範
囲が良い。 尚、反応時菌体をそのまま懸濁する方法のみな
らずトルエン等有機溶媒処理をした菌体、界面活
性剤処理をした菌体、或は固定化をした菌体を用
いた場合も当然本発明の範囲に入るものである。 また前駆体である２−オキソ酸を添加する醗酵
法によつて所望するアミノ酸を得るにはセリン：
ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ遺伝子を含
むDNA塩基配列を有する組換え体DNAによつて
形質転換された微生物の塔養時に２−オキソ酸を
一括または分割添加すれば良い。この場合アンモ
ニア或はアンモニウム塩は微生物の生育の為のＮ
源として供給されたものも利用可能である。また
グルタミン酸或はその塩、アラニン或はその塩、
ピルビン酸或はその塩、２−オキソグルタル酸或
はその塩は酵素法の場合と同様に添加すれば良い
が、塔地を適当に選ぶことにより塔地成分として
供給することも可能である。アルコールを添加す
る場合も酵素法と同様に添加すれば良いが高濃度
の一括添加により生育阻害をおこす可能性が有る
ので分割添加が望ましい。 以下本発明を具体例によつて説明するが、何ら
これに限定されるものではない。 実施例 １ cDNAの調製 24時間絶食した体重150ｇの雄ウイスター種ラ
ツトに体重100ｇ当り300μｇの量のグルカゴンを
腹腔内注射し、該ラツトから肝を調製した。肝か
らの全RNの調製はNaDodSO4−フエノール法
（M.MoriらProc.Natl.Aca d.Sci.USA1979 76
5071）に従つた。得られた全RNAから
Molecular Cloning（T.ManitasらCold Spring
Harbor Laboratory1982）198頁に記載のオリゴ
（dT）−セルロースカラムを用いる方法でポリ
（A+）RNA画分を得た。このポリ（A+）RNA
を鋳型にして常法に依りオリゴ（dT）12-18をプラ
イマーとし逆転写酵素（BRL社製 AMV リバ
ーストランスクリプターゼ）を用いて1stストラ
ンドを合成した。次に常法に従いアルカリ処理に
よりmRNAを分解除去後、逆転写酵素、DNAポ
リメラーゼＩ Klenow フラグメント（BRL社
製）を用いて2ndストランドの合成を行つた。か
くして得られた2ndストランどのmRNAの5′末端
に相当する側にEcoRIリンカーを3′末端側にPatI
リンカーを結合させるため、2ndストランド内の
該制限酵素切断部位をPatIメチラーゼ、EcoRIメ
チラーゼによりメチル化して保護した。次に常法
に従いmRNAの3′末端に相当する2ndストランド
末端にPstIリンカーを結合した。更にmRNA5′未
満に相当する部分に形成されているヘアピン構造
をヌクレアーゼS1で切断し、DNAポリメラーゼ
IKlenow フラグメントで平滑末端とした。かく
して得られたcDNAのmRNAの5′末端に相当す
る部分に常法に従いEcoRIリンカーを結合し、次
にEcoRIおよびPstIを用い末端を完全に分解し粘
着末端を露出させた。以上の行程は「Molecular
Cloning」に従つて実施した。 実施例 ２ 形質転換 クローニング部位の上流にβ−ガラクトシダー
ゼの発現に必要な部位を含む発現ベクターpUC8
（J.Vieira，J.Messing Gene1982 19 259）を
BRL社から購入し、該ベクターをEcoRI、PstIで
分解し低融点アガロースゲル電気泳動により大フ
ラグメントを回収した後0.5μｇの該ベクター大フ
ラグメントと実施例１で得られたcDNA0.5μｇを
T4リガーゼを用い、常法により結合した。この
リガーゼ反応混液を用いてMandel−Higaの方法
に従い大腸菌DH−１を形質転換した。形質転換
後該大腸菌はイソプロピル−β−チオガラクトピ
ラノシドおよび５−プロモ−チオクロロ−３−イ
ンドリル−β−ガラクトシド含有YTプレート
（50μｇ／mlアンピリン添加）にプレーテイング
した。この条件は「M13クローニング／ジデオキ
シシーケンシング」（丸善バイオケミカル）に従
つた。プレーテイング後のプレートは37℃で一夜
塔養し生じた白色コロニーをニトロセルロースフ
イルター上に移しＬ−ブロス寒天培地上で一夜培
養し生じたコロニーをクロロホルム蒸気の充満し
た容器中に室温で20分間入れ溶菌した。次にフイ
ルターをTS緩衝液（50ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）、0.15M NaCl）に５ｍＭ MgCl2、1μ
ｇ／mlDNaseI、３％（ｗ／ｖ）に牛血清アルブ
ミン、1μｇ／mlリゾチームに一夜室温で浸漬し
菌体蛋白の固定とフイルターの前処理を実施し
た。 前処理後のフイルターは次に３％（ｗ／ｖ）牛
血清アルブミン、10μｇ／ml抗セリン：ピルビン
酸アミノトランスフエラーゼウサギIgGを含む
TS緩衝液中に室温で１時間浸漬した。その後
TSTS（0.1％ToritonX−100、0.1％SbS含有TS
緩衝液）で室温15分洗浄した。該洗浄は５回繰り
返した。 次にフイルターは３％（ｗ／ｖ）牛血清アルブ
ミン、125I−標識１×106cpm／mlロバ抗サギIgG
−Ｆ（ab′）２添加TSTSで１時間温室にて処理し
た。該処理後TSTSによる室温15分での洗浄を５
回行つた。 かくして得られた第１抗体、第２抗体処理後の
フイターは風乾し−70℃で増感紙を用いて露光
後、現象した。 以上の操作により33000のライブラリーより19
個のポジテイブコロニーを得た。このうちのひと
つMT−SP10株（FERM BP−695）はSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフエラーゼと同一の移動度
を有する蛋白を産生していた。宿主として用いた
DHIは該移動度の蛋白を産生していなかつた。
MT−SP10株からプラスミドを調製して調べた
ところ該プラスミドはEcoRI、PstI消化により
0.5kbのフラグメントを生ずることが確認された。
このフラグメントを用いてMolecular
Cloning344頁記載のハイブリダイゼーシヨン選
択同定法を用いて調べたことろ得られたクローン
がセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ
に対するものであることを確認した。 またMT−SP10株の有するプラスミドはpUC8
のEcoRI、PstI切断部位に約1.4kbのDNA塩基配
列が挿入結合したものであることを確認し該組換
え体DNAをpRSPT10と命名した。 pRSPT10の特異的産物である蛋白（分子量４万）
は宿主菌を超音波処理することにより上清に回収
することが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノ
トランスフエラーゼ抗体による免疫沈降実験を行
なつた。その結果該抗体によりpRSPT10による特
異的産物は沈降することが認められた。またこの
上清はセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼ活性がpRSPT10を有しない宿主のものに比べ
102以上高く、かつその活性は該酵素の抗体で抑
えられることが認められた。 以上の結果からpRSPT10はラツト肝セリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼ遺伝子を含む
DNA塩基配列を有する組換え体DNAであること
が確認された。またMT−SPT10株は該組換え体
DNAによつて形質転換された微生物である。 比較例 １ ２−オキソ酸とアンモニウム塩からのアミノ酸
の合成 実施例２で得られたpRSPT10を含む大腸菌MT
−SP10（FERM BP−695）を50μｇ／mlのアンピ
シリンを含むペンアツセイ培地（Difco社製）
200mlを用い37℃で15時間培養後遠心により集菌
した。反応系の組成は２−オキソ酸20ｍＭ、塩化
アンモニウム100ｍＭ、含水重量30mgの菌体を含
む５mlの100ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（PH
8.5）である。反応は試験管を用い振盪しながら
37℃で15時間インキユベーシヨンして実施した。
反応後遠心により上清を回収しHPLC、TLC、
バイオアツセイにより分析を行つた。 表１に示すように２−オキソ酸から対応するＬ
−アミノ酸が生成することが認められた。
生物を用いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸
を製造する方法に関するもである。 本発明は特に広範な２−オキソ酸を基質とする
ラツトのセリン：ピルピン酸アミノトランスフエ
ラーゼ遺伝子を含むDNA塩基配列を有する組換
え体DNAを用いて形質転換された微生物により
アンモニア或はアンモニウム塩存在下に２−オキ
ソ酸からＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。 アミノ酸は輪液等の医薬、栄養強化剤としての
食品添加物および飼料添加物、或は医農薬の中間
体、更に調味料またはその中間体等広範な用途を
有する物質であり現在醗酵法、化学合成法、酵素
法等によつて製造されている。 醗酵法は安価な原料からアミノ酸を製造出来る
方法であるが、この方法で多量に蓄積出来るアミ
ノ酸の種類が限定されること、および副生物が多
く精製工程が繁雑になることが知られていた。ま
た化学合成法ではＤ、Ｌ−体が生成し、Ｌ−体を
必要とする場合はラセミ分割が必要なことが大き
な欠点である。酵素法は化学合成を基質を酵素的
にＬ−アミノ酸にすることが出来るが所望のアミ
ノ酸を合成する酵素を自由に入手することは不可
能で従来本法に依つて製造されたアミノ酸はアス
パラギン酸、トリプトフアン等限られたものでし
かなかつた。 この様な状況から単一の酵素が化学合成された
基質を、その基質に応じて対応する所望のＬ−ア
ミノ酸に変換する系の確立が待たれていた。本発
明者らはこの点に鑑み検討の結果広い基質特異性
を有するラツトセリン：ピルビン酸アミノトラン
スフエラーゼの遺伝子を含むDNA塩基配列を有
する組換え体DNAにより形質転換された微生物
が種々の２−オキソ酸をアンモニア或はアンモニ
ウム塩の存在下で対応するＬ−アミノ酸に変換す
ることを見出し本発明を完成した。即ち本発明の
方法を用いれば２−オキソ酸をアミノ基受容体と
しアンモニア或はアンモニウム塩存在下で２−オ
キソ酸に対応するＬ−アミノ酸が得られるもので
ある。その場合反応系内にグルタミン酸或はその
塩、またはアラニン或はその塩またはエタノール
が存在すると所望するアミノ酸が好収率で得られ
ることを見出した。更に上記いずれかのアミノ酸
またはその塩およびエタノールが共存する場合に
は所望するアミノ酸が極めて高い収率で得られる
ことも見出した。 これらのことから本発明の方法ではクローン化
されたセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼによるアミノ基転移反応のアミノ基供与体と
してグルタミン酸或はその塩、またはアラニン或
はその塩が有効であることまた、それらのアミノ
酸或はその塩から、アミノ基転移の結果生じた２
−オキソ酸はアンモニア或はアンモニウム塩の存
在により再び対応するアミノ酸となり再びアミノ
供与体として働くことが判明した。この際エタノ
ールの存在により反応が好ましい方向に進むこと
からアルコールデヒドロゲナーゼによるNADH
或はNADPHの生成とグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ或はアラニンデヒドロゲナーゼによるアン
モニウムイオン、NADH（またはNADPH）存在
下グルタミン酸或はアラニンの生成とセリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼによる２−オ
キソ酸のアミノ酸への転換が効果的に連動してい
ることが判断されるものである。従つて本発明の
方法では通常のアミノトランスフエラーゼ反応と
異なり平衡が所望するアミノ酸生成の方向に傾き
添加した２−オキソ酸（所望するアミノ酸に対応
する）を極めて高い転換率で所望するアミノ酸に
することが出来かつ、そのアミノ基原として安価
なアンモニア或はアンモニウム塩を用いることが
出来るものである。 以下本発明を詳細に説明する。 ラツト由来セリン：ピルビン酸アミノトランス
フエラーゼはセリンおよびピルビン酸をそれぞれ
ヒドロキシピルビン酸およびアラニンに変換する
活性を有する酵素であるが広い基質特異性を有し
種々の２−オキソ酸、Ｌ−アミノ酸を基質するこ
とが出来る（M.Yanagawaら”Biochemistry of
Metabolic Processes”413pp Elsevier1983）。 該酵素の遺伝子を含むDNA塩基配列は通常の
遺伝子工学の技術で調製可能であるがグルカゴン
を投与後の肝では該酵素のmRNA含量が著しく
増加するので、このmRNAを出発材料とするの
が便利である。 mRNAからのcDNAの調製はオリゴ（dT）を
プライマーとして逆転写酵素、DNAポリメラー
ゼＩを用いる通常の方法（T.Manitasら
Molecular Cloning211pp Cold Spring Harbor
Laboratory）或はOkayamam−Berg法（H.
Okayama、P.Berg Molec.Cell.Biol.1982 ２
161）或はHeidecker−Messing法（The Mole.
Biol.Catalog 1983 Pharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicais）等で実施可能である。 この様な方法で得られたcDNAはクローニング
宿主として用いる微生物で使用可能なベクターに
結合し、その結果得られた組換え体DNAは該宿
主微生物の形質転換に用いられる。ここで用いる
宿主微生物は如何なるものでも良いが分子生物学
的・微生物学的・遺伝学的によく検討されている
ものが使用に便利であり、その様なものとして大
腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus
subtilis）または酵母（Saccharomyces
cerevisiae）等が挙げられる。ベクターとしては
用いる宿主微生物で複製可能なプラスミド、フア
ージ或はそれらの誘導体であれば使用可能である
が本発明の実施に当つては目的とするセリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼが宿主菌体内
で発現出来る型のもであることが必要である。こ
のようなベクターとcDNAを結合して得られた組
換え体DNAは宿主菌の形質転換に用いられる。
かくして得られた形質転換株からのセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフエラーゼクローンの選択
は抗体を用いた免疫的な方法と該酵素の活性を指
標とする方法によつて実施可能である。この様な
方法で選択された形質転換株からの組み換え体
DNAの調製は通常のプラスミド調製法に依つて
実施可能である。 かくして得られたラツトセリン：ピルビン酸ア
ミノトランスフエラーゼ遺伝子を含むDNA塩基
配列を有する組換え体DNAは本発明の実施様態
からアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ或はアラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性の強い宿主に導入されるのが好まし
い。 この様にして造成したラツトセリン：ピルビン
酸アミノトランスイフエラーゼ遺伝子を含む
DNA塩基配列を有する組換え体DNAによつて形
質転換した微生物を用いてアミノ酸を製造するに
は通常の酵素的方法或は前駆体を添加する醗酵法
で実施可能である。 酵素的方法の場合は該形質転換微生物を緩衝液
中に懸濁し該懸濁液中に２−オキソ酸とアンモニ
ア或はアンモニウム塩を共存させれば良い。その
際所望するアミノ酸に対応する２−オキソ酸或は
その塩の他にピルビン酸或はその塩または２−オ
キソグルタル酸或はその塩を添加するかまたはア
ラニン或はその塩またはグルタミン酸またはその
塩を添加すると所望のアミノ酸の生産が高まる。
またアルコールが共存する場合も所望のアミノ産
の生成量が改善される。更にアルコールとピンピ
ル酸或はα−ケトグルタル酸或はそのいずれかの
塩、またはグルタミン酸或はアラニン或はそのい
ずれかの塩が共存する条件下では２−オキソ酸か
らの所望のアミノ酸への転換率は頻著に高まるこ
とを見出した。 反応系への２−オキソ酸またはその塩の添加は
一括法、分割法いずれでも良いが一般に２−オキ
ソ酸濃度が高い系内では基質阻害を生じる可能性
があるので、高濃度添加の場合は分割添加が望ま
しい。アンモニア或はアンモニウム塩の濃度は２
−オキソ酸と同じモル濃度からその10倍濃度の間
に入る様に添加するのが望ましいが何らそれに限
定されるものではない。アルコールも２−オキソ
酸と同じモル濃度からその20倍濃度の範囲で添加
するのが好ましい。またグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼの基質である２−オキソグルタル酸または
グルタミン酸或はそのいずれかの塩の添加は所望
するアミノ酸に対応する２−オキソ酸と同じモル
濃度以下で有効であり好ましくは２−オキソ酸の
500分の１から２分の１の範囲のモル濃度で添加
すれば良い。同様にアラニンデヒドロゲナーゼの
基質であるピルビン酸またはアラニン或はそのい
ずれかの塩も２−オキソ酸の500分の１から２分
の１の範囲のモル濃度で添加するのが好ましいが
何らこれらに限定されるものではない。 反応温度は本発明に於て用いられる当該酵素が
失活しない温度範囲であればいずれの温度でも良
いが通常０℃〜70℃、好ましくは20℃〜50℃の範
囲が良い。 尚、反応時菌体をそのまま懸濁する方法のみな
らずトルエン等有機溶媒処理をした菌体、界面活
性剤処理をした菌体、或は固定化をした菌体を用
いた場合も当然本発明の範囲に入るものである。 また前駆体である２−オキソ酸を添加する醗酵
法によつて所望するアミノ酸を得るにはセリン：
ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ遺伝子を含
むDNA塩基配列を有する組換え体DNAによつて
形質転換された微生物の塔養時に２−オキソ酸を
一括または分割添加すれば良い。この場合アンモ
ニア或はアンモニウム塩は微生物の生育の為のＮ
源として供給されたものも利用可能である。また
グルタミン酸或はその塩、アラニン或はその塩、
ピルビン酸或はその塩、２−オキソグルタル酸或
はその塩は酵素法の場合と同様に添加すれば良い
が、塔地を適当に選ぶことにより塔地成分として
供給することも可能である。アルコールを添加す
る場合も酵素法と同様に添加すれば良いが高濃度
の一括添加により生育阻害をおこす可能性が有る
ので分割添加が望ましい。 以下本発明を具体例によつて説明するが、何ら
これに限定されるものではない。 実施例 １ cDNAの調製 24時間絶食した体重150ｇの雄ウイスター種ラ
ツトに体重100ｇ当り300μｇの量のグルカゴンを
腹腔内注射し、該ラツトから肝を調製した。肝か
らの全RNの調製はNaDodSO4−フエノール法
（M.MoriらProc.Natl.Aca d.Sci.USA1979 76
5071）に従つた。得られた全RNAから
Molecular Cloning（T.ManitasらCold Spring
Harbor Laboratory1982）198頁に記載のオリゴ
（dT）−セルロースカラムを用いる方法でポリ
（A+）RNA画分を得た。このポリ（A+）RNA
を鋳型にして常法に依りオリゴ（dT）12-18をプラ
イマーとし逆転写酵素（BRL社製 AMV リバ
ーストランスクリプターゼ）を用いて1stストラ
ンドを合成した。次に常法に従いアルカリ処理に
よりmRNAを分解除去後、逆転写酵素、DNAポ
リメラーゼＩ Klenow フラグメント（BRL社
製）を用いて2ndストランドの合成を行つた。か
くして得られた2ndストランどのmRNAの5′末端
に相当する側にEcoRIリンカーを3′末端側にPatI
リンカーを結合させるため、2ndストランド内の
該制限酵素切断部位をPatIメチラーゼ、EcoRIメ
チラーゼによりメチル化して保護した。次に常法
に従いmRNAの3′末端に相当する2ndストランド
末端にPstIリンカーを結合した。更にmRNA5′未
満に相当する部分に形成されているヘアピン構造
をヌクレアーゼS1で切断し、DNAポリメラーゼ
IKlenow フラグメントで平滑末端とした。かく
して得られたcDNAのmRNAの5′末端に相当す
る部分に常法に従いEcoRIリンカーを結合し、次
にEcoRIおよびPstIを用い末端を完全に分解し粘
着末端を露出させた。以上の行程は「Molecular
Cloning」に従つて実施した。 実施例 ２ 形質転換 クローニング部位の上流にβ−ガラクトシダー
ゼの発現に必要な部位を含む発現ベクターpUC8
（J.Vieira，J.Messing Gene1982 19 259）を
BRL社から購入し、該ベクターをEcoRI、PstIで
分解し低融点アガロースゲル電気泳動により大フ
ラグメントを回収した後0.5μｇの該ベクター大フ
ラグメントと実施例１で得られたcDNA0.5μｇを
T4リガーゼを用い、常法により結合した。この
リガーゼ反応混液を用いてMandel−Higaの方法
に従い大腸菌DH−１を形質転換した。形質転換
後該大腸菌はイソプロピル−β−チオガラクトピ
ラノシドおよび５−プロモ−チオクロロ−３−イ
ンドリル−β−ガラクトシド含有YTプレート
（50μｇ／mlアンピリン添加）にプレーテイング
した。この条件は「M13クローニング／ジデオキ
シシーケンシング」（丸善バイオケミカル）に従
つた。プレーテイング後のプレートは37℃で一夜
塔養し生じた白色コロニーをニトロセルロースフ
イルター上に移しＬ−ブロス寒天培地上で一夜培
養し生じたコロニーをクロロホルム蒸気の充満し
た容器中に室温で20分間入れ溶菌した。次にフイ
ルターをTS緩衝液（50ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）、0.15M NaCl）に５ｍＭ MgCl2、1μ
ｇ／mlDNaseI、３％（ｗ／ｖ）に牛血清アルブ
ミン、1μｇ／mlリゾチームに一夜室温で浸漬し
菌体蛋白の固定とフイルターの前処理を実施し
た。 前処理後のフイルターは次に３％（ｗ／ｖ）牛
血清アルブミン、10μｇ／ml抗セリン：ピルビン
酸アミノトランスフエラーゼウサギIgGを含む
TS緩衝液中に室温で１時間浸漬した。その後
TSTS（0.1％ToritonX−100、0.1％SbS含有TS
緩衝液）で室温15分洗浄した。該洗浄は５回繰り
返した。 次にフイルターは３％（ｗ／ｖ）牛血清アルブ
ミン、125I−標識１×106cpm／mlロバ抗サギIgG
−Ｆ（ab′）２添加TSTSで１時間温室にて処理し
た。該処理後TSTSによる室温15分での洗浄を５
回行つた。 かくして得られた第１抗体、第２抗体処理後の
フイターは風乾し−70℃で増感紙を用いて露光
後、現象した。 以上の操作により33000のライブラリーより19
個のポジテイブコロニーを得た。このうちのひと
つMT−SP10株（FERM BP−695）はSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン：ピル
ビン酸アミノトランスフエラーゼと同一の移動度
を有する蛋白を産生していた。宿主として用いた
DHIは該移動度の蛋白を産生していなかつた。
MT−SP10株からプラスミドを調製して調べた
ところ該プラスミドはEcoRI、PstI消化により
0.5kbのフラグメントを生ずることが確認された。
このフラグメントを用いてMolecular
Cloning344頁記載のハイブリダイゼーシヨン選
択同定法を用いて調べたことろ得られたクローン
がセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ
に対するものであることを確認した。 またMT−SP10株の有するプラスミドはpUC8
のEcoRI、PstI切断部位に約1.4kbのDNA塩基配
列が挿入結合したものであることを確認し該組換
え体DNAをpRSPT10と命名した。 pRSPT10の特異的産物である蛋白（分子量４万）
は宿主菌を超音波処理することにより上清に回収
することが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノ
トランスフエラーゼ抗体による免疫沈降実験を行
なつた。その結果該抗体によりpRSPT10による特
異的産物は沈降することが認められた。またこの
上清はセリン：ピルビン酸アミノトランスフエラ
ーゼ活性がpRSPT10を有しない宿主のものに比べ
102以上高く、かつその活性は該酵素の抗体で抑
えられることが認められた。 以上の結果からpRSPT10はラツト肝セリン：ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼ遺伝子を含む
DNA塩基配列を有する組換え体DNAであること
が確認された。またMT−SPT10株は該組換え体
DNAによつて形質転換された微生物である。 比較例 １ ２−オキソ酸とアンモニウム塩からのアミノ酸
の合成 実施例２で得られたpRSPT10を含む大腸菌MT
−SP10（FERM BP−695）を50μｇ／mlのアンピ
シリンを含むペンアツセイ培地（Difco社製）
200mlを用い37℃で15時間培養後遠心により集菌
した。反応系の組成は２−オキソ酸20ｍＭ、塩化
アンモニウム100ｍＭ、含水重量30mgの菌体を含
む５mlの100ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（PH
8.5）である。反応は試験管を用い振盪しながら
37℃で15時間インキユベーシヨンして実施した。
反応後遠心により上清を回収しHPLC、TLC、
バイオアツセイにより分析を行つた。 表１に示すように２−オキソ酸から対応するＬ
−アミノ酸が生成することが認められた。
【表】
実施例３ グルタミン酸またはグルタミン酸ナト
リウムまたはアラニンおよびアルコール共存の効
果 比較例１と同じ反応系を用いてＬ−フエニルア
ラニンの生成を調べた。但し表２に示すアミノ酸
（塩）、アルコールを添加した。反応温度、時間と
もに比較例１と同じである。本結果から反応系へ
のエタノールおよびグルタミン酸（塩）またはア
ラニンの添加によりフエニルピルビン酸からのＬ
−フエニルアラニンへの転換率が著しく高まるこ
とが認められた。
リウムまたはアラニンおよびアルコール共存の効
果 比較例１と同じ反応系を用いてＬ−フエニルア
ラニンの生成を調べた。但し表２に示すアミノ酸
（塩）、アルコールを添加した。反応温度、時間と
もに比較例１と同じである。本結果から反応系へ
のエタノールおよびグルタミン酸（塩）またはア
ラニンの添加によりフエニルピルビン酸からのＬ
−フエニルアラニンへの転換率が著しく高まるこ
とが認められた。
【表】
エタノール
(200)
(200)
【表】
実施例 ４
グルタミン酸ナトリウムまたはアラニンとエタ
ノール共存下での種々の２−オキソ酸からのＬ
−アミノ酸の合成 比較例１と同様の方法を用いてＬ−アミノ酸の
生成を調べた。但しグルタミン酸ナトリウムまた
はアラニンおよびエタノールを反応系に添加し
た。反応温度、時間ともに比較例１と同じであ
る。本結果（表３）から高い転換率で２−オキソ
酸から対応するＬ−アミノ酸が生成することが判
明した。尚、反応系の組成は表３に示す。その他
の条件は比較例１と同じである。
ノール共存下での種々の２−オキソ酸からのＬ
−アミノ酸の合成 比較例１と同様の方法を用いてＬ−アミノ酸の
生成を調べた。但しグルタミン酸ナトリウムまた
はアラニンおよびエタノールを反応系に添加し
た。反応温度、時間ともに比較例１と同じであ
る。本結果（表３）から高い転換率で２−オキソ
酸から対応するＬ−アミノ酸が生成することが判
明した。尚、反応系の組成は表３に示す。その他
の条件は比較例１と同じである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ラツト肝セリン：ピルビン酸アミノトランス
フエラーゼ遺伝子を含むDNA塩基配列を有する
組換えDNAを用いて大腸菌を形質転換し、得ら
れた大腸菌形質転換株を用い、グルタミン酸或い
はその塩、またはアラニン或いはその塩をアミノ
基供与体とし２−オキソ酸をアミノ基受容体とし
アンモニア或いはアンモニウム塩及びアルコール
の存在下に該アミノ基受容体にアミノ基を転移さ
せアミノ酸を生産する方法。 ２ ２−オキソ酸が次に示すもの或いはその塩か
ら任意に選ばれたものであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載するアミノ酸の生産
法：ピルビン酸、２−オキソ−３−イミダゾール
プロピオン酸、２−オキソ−３−ヒドロキシフエ
ニルプロピオン酸、２−オキソグルタル酸、ヒド
ロキシピルビン酸、２−オキソイソ吉草酸、２−
オキソイソカプロン酸、２−オキソ−３−メチル
−ｎ−吉草酸、２−オキソ−３−メルカプトプロ
ピオン酸、２−オキソ−４メチルチオ酪酸、２−
オキソ−３−ヒドロキシ酪酸、２−オキソ−４−
ヒドロキシ酪酸、２−オキソ−３−（インドール）
プロピオン酸、２−オキソコハク酸、２−オキソ
スクシンアミド酸、２−オキソグルタルアミド
酸、２−オキソ−６−アミノ−ｎ−カプロン酸、
２−オキソ−３−（3′，4′ジヒドロキシフエニル）
プロピオン酸。 ３ アルコールがエタノールである特許請求の範
囲第１項に記載のアミノ酸の生産法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429885A JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429885A JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185194A JPS61185194A (ja) | 1986-08-18 |
| JPH0543355B2 true JPH0543355B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=12134259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2429885A Granted JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61185194A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
-
1985
- 1985-02-13 JP JP2429885A patent/JPS61185194A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61185194A (ja) | 1986-08-18 |
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