JPS61185194A - アミノ酸の生産法 - Google Patents
アミノ酸の生産法Info
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- JPS61185194A JPS61185194A JP2429885A JP2429885A JPS61185194A JP S61185194 A JPS61185194 A JP S61185194A JP 2429885 A JP2429885 A JP 2429885A JP 2429885 A JP2429885 A JP 2429885A JP S61185194 A JPS61185194 A JP S61185194A
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- oxo
- salt
- amino
- amino acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子工学の手法を用いて育種した微生物を用
いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸を製造する方法
に関するものである。
いて２−オキソ酸から対応するアミノ酸を製造する方法
に関するものである。
本発明は特に広範な２−オキソ酸を基質とするラットの
セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡを用いて形
質転換された微生物によりアンモニア或はアンモニウム
塩存在下に２−オキソ酸からし−アミノ酸を製造する方
法に関する。
セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡを用いて形
質転換された微生物によりアンモニア或はアンモニウム
塩存在下に２−オキソ酸からし−アミノ酸を製造する方
法に関する。
アミノ酸は輸液等の医薬、栄養強化剤としての食品添加
物および飼料添加物、或は医農薬の中間体、更に調味料
またはその中間体等広範な用途を有する物質であり現在
醗酵法、化学合成法、酵素法等によって製造されている
。
物および飼料添加物、或は医農薬の中間体、更に調味料
またはその中間体等広範な用途を有する物質であり現在
醗酵法、化学合成法、酵素法等によって製造されている
。
醗酵法は安価な原料からアミノ酸を製造出来る方法であ
るが、この方法で多量に蓄積出来るアミノ酸の種類が限
定されること、および副生物が多く精製工程が繁雑にな
ることが知られていた。また化学合成法ではり、Ｌ一体
が生成しＬ一体を必要とする場合はラセミ分割が必要な
ことが大きな欠点である。
るが、この方法で多量に蓄積出来るアミノ酸の種類が限
定されること、および副生物が多く精製工程が繁雑にな
ることが知られていた。また化学合成法ではり、Ｌ一体
が生成しＬ一体を必要とする場合はラセミ分割が必要な
ことが大きな欠点である。
酵素法は化学合成した基質を酵素的にＬ−アミノ酸にす
ることが出来るが所望のアミノ酸を合成する酵素を自由
に入手することは不可能で従来本法に依って製造された
アミノ酸はアスノミラギン酸、トリプトファン等限られ
たものでしかなかった。
ることが出来るが所望のアミノ酸を合成する酵素を自由
に入手することは不可能で従来本法に依って製造された
アミノ酸はアスノミラギン酸、トリプトファン等限られ
たものでしかなかった。
この様な状況から単一の酵素が化学合成された基質を、
その基質に応じて対応する所望のし一アミノ酸に変換す
る系の確立が待たれていた。本発明者らはこの点く鑑み
検討の結果広い基質特異性を有するラットセリン：ピル
ビン酸アミントランスフェラーゼの遺伝子を含むＤＮＡ
塩基配列を有する組換え体ＤＮＡにより形質転換された
微生物が種々の２−オキソ酸をアンモニア或はアンモニ
ウム塩の存在下で対応するＬ−アミノ酸に変換すること
を見出し本発明を完成した。即ち本発明の方法を用いれ
ば２−オキソ酸をアミノ基受容体としアンモニア或はア
ンモニウム塩存在下で２−オキソ酸に対応するＬ−アミ
ノ酸が得られるものである。その場合反応系内にグルタ
ミン酸或はその塩、またはアラニン或はその塩またはエ
タノールが存在すると所望するアミノ酸が好収率で得ら
れることを見出した。更に上記いずれかのアミノ酸また
はその塩およびエタノールが共存する場合には所望する
アミノ酸が極めて高い収率で得られることも見出した。
その基質に応じて対応する所望のし一アミノ酸に変換す
る系の確立が待たれていた。本発明者らはこの点く鑑み
検討の結果広い基質特異性を有するラットセリン：ピル
ビン酸アミントランスフェラーゼの遺伝子を含むＤＮＡ
塩基配列を有する組換え体ＤＮＡにより形質転換された
微生物が種々の２−オキソ酸をアンモニア或はアンモニ
ウム塩の存在下で対応するＬ−アミノ酸に変換すること
を見出し本発明を完成した。即ち本発明の方法を用いれ
ば２−オキソ酸をアミノ基受容体としアンモニア或はア
ンモニウム塩存在下で２−オキソ酸に対応するＬ−アミ
ノ酸が得られるものである。その場合反応系内にグルタ
ミン酸或はその塩、またはアラニン或はその塩またはエ
タノールが存在すると所望するアミノ酸が好収率で得ら
れることを見出した。更に上記いずれかのアミノ酸また
はその塩およびエタノールが共存する場合には所望する
アミノ酸が極めて高い収率で得られることも見出した。
これらのことから本発明の方法ではクローン化されたセ
リン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼによるアミ
ノ基転移反応のアミノ基供与体としてグルタミン酸或は
その塩、またはアラニン或はその塩が有効であることま
た、それらのアミノ酸或はその塩から、アミノ基転移の
結果生じた２−オキソ酸はアンモニア或はアンモニウム
塩の存在により再び対応するアミノ酸となり再びアミノ
供与体として働くことが判明した。この際エタノールの
存在により反応がより好ましい方向く進むことからアル
コールデヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ或けＮＡＤＰＨ
の生成とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ或はアシツブヒ
ドロゲナーゼによるアンモニウムイオン、ＮＡＤＨ（ま
たはＮＡＤＰＨ）存在下グルタミン酸或はアラニンの生
成とセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼによ
る２−オキソ酸のアミノ酸への転換が効果的に連動して
いることが判断されるものである。
リン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼによるアミ
ノ基転移反応のアミノ基供与体としてグルタミン酸或は
その塩、またはアラニン或はその塩が有効であることま
た、それらのアミノ酸或はその塩から、アミノ基転移の
結果生じた２−オキソ酸はアンモニア或はアンモニウム
塩の存在により再び対応するアミノ酸となり再びアミノ
供与体として働くことが判明した。この際エタノールの
存在により反応がより好ましい方向く進むことからアル
コールデヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ或けＮＡＤＰＨ
の生成とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ或はアシツブヒ
ドロゲナーゼによるアンモニウムイオン、ＮＡＤＨ（ま
たはＮＡＤＰＨ）存在下グルタミン酸或はアラニンの生
成とセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼによ
る２−オキソ酸のアミノ酸への転換が効果的に連動して
いることが判断されるものである。
従って本発明の方法では通常のアミノトランスフェラー
ゼ反応と異な９平衡が所望するアミノ酸生成の方向に傾
き添加した２−オキソ酸（所望するアミノ酸に対応する
）を極めて高い転換率で所望するアミノ酸にすることが
出来かつ、そのアミノ基原として安価なアンモニア或は
アンモニウム塩を用いることが出来るものである。
ゼ反応と異な９平衡が所望するアミノ酸生成の方向に傾
き添加した２−オキソ酸（所望するアミノ酸に対応する
）を極めて高い転換率で所望するアミノ酸にすることが
出来かつ、そのアミノ基原として安価なアンモニア或は
アンモニウム塩を用いることが出来るものである。
以下本発明の詳細な説明する。
ラット由来セリン：ピルビン酸アミノトランスフェラー
ゼはセリンおよびピルビン酸をそれぞれヒドロキシピル
ビン酸およびアラニンに変換する活性を有する酵素であ
るが広い基質特異性を有し種々の２−オキソ酸、Ｌ−ア
ミノ酸を基質とすることが出来る（ Ｍ、 Ｙａｎｉｇ
ａｗａら“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｃＰｒｏｃｅｓｓｅｓ″４１５ ｐｐ ｇｌｓ
ｅｖｉｅｒ １９８５ ）。
ゼはセリンおよびピルビン酸をそれぞれヒドロキシピル
ビン酸およびアラニンに変換する活性を有する酵素であ
るが広い基質特異性を有し種々の２−オキソ酸、Ｌ−ア
ミノ酸を基質とすることが出来る（ Ｍ、 Ｙａｎｉｇ
ａｗａら“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｃＰｒｏｃｅｓｓｅｓ″４１５ ｐｐ ｇｌｓ
ｅｖｉｅｒ １９８５ ）。
該酵素の遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列は通常の遺伝子工
学の技術で調製可能であるがグルカゴンを投与後の肝で
は該酵素のｍＲＮＡ含量が著しく増加するので、このｍ
ＲＮＡを出発材料とするのが便利である。
学の技術で調製可能であるがグルカゴンを投与後の肝で
は該酵素のｍＲＮＡ含量が著しく増加するので、このｍ
ＲＮＡを出発材料とするのが便利である。
ｍＲＮＡからのｃ Ｄ Ｎ Ａの調製はオリゴ（ｄｔ）
をプライマーとして逆転写酵素、ＤＮＡポリメラー
ゼ■を用いる通常の方法（Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ２１１ ｐｐ Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
）或はＯｋａｙａｍｓ−Ｂｅｒｇ法（Ｈ，Ｏｋａｙａ
ｍａ。
をプライマーとして逆転写酵素、ＤＮＡポリメラー
ゼ■を用いる通常の方法（Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ２１１ ｐｐ Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
）或はＯｋａｙａｍｓ−Ｂｅｒｇ法（Ｈ，Ｏｋａｙａ
ｍａ。
Ｐ、 Ｂｅｒｇ Ｍｏ１ｅｅ、Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
１９８２ ２ １６１ ）或はＨｅｉｄｅｃｋｅｒ−
Ｍｅｓｓｉｎｇ法（Ｔｈｅ Ｍｏｌ＠、 Ｂｉｏｌ。
１９８２ ２ １６１ ）或はＨｅｉｄｅｃｋｅｒ−
Ｍｅｓｓｉｎｇ法（Ｔｈｅ Ｍｏｌ＠、 Ｂｉｏｌ。
Ｃａｔａｌｏｇ ’Ｉ ９８５ Ｐｈａｒｍａａｉａ
Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｅｈｅｍｉｅａｌｇ ３等で実施可能で
ある。
Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｅｈｅｍｉｅａｌｇ ３等で実施可能で
ある。
この様な方法で得られたｃＤＮＡはクローニング宿主と
して用いる微生物で使用可能なベクターに結合し、その
結果得られた組換え体ＤＮＡは該宿主微生物の形質転換
に用いられる。ここで用いる宿主微生物は如何なるもの
でも良いが分子生物学的・微生物学的・遺伝学的によく
検討されているものが使用に便利であり、その様なもの
として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ）
、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ１１ｉｓ）ま
たは酵母（力士力Ｍ呪ム↓ｃｅｒｅｖ＋５ｉａｅ ）
等が挙げられる。ベクターとしては用いる宿主微生物
で複製可能なプラスミド、ファージ或はそれらの誘導体
であれば使用可能であるが本発明の実施に当っては目的
とするセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼが
宿主菌体内で発現出来る型のものであることが必要であ
る。このようなベクターとｃ ＤＮＡを結合して得られ
た組換え体ＤＮＡは宿主菌の形質転換に用いられる。か
くして得られた形質転換株からのセリン：ピルビン酸ア
ミントランスフェラーゼクローンの選択は抗体を用いた
免疫的な方法と該酵素の活性を指標とする方法によって
実施可能である。
して用いる微生物で使用可能なベクターに結合し、その
結果得られた組換え体ＤＮＡは該宿主微生物の形質転換
に用いられる。ここで用いる宿主微生物は如何なるもの
でも良いが分子生物学的・微生物学的・遺伝学的によく
検討されているものが使用に便利であり、その様なもの
として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ）
、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ１１ｉｓ）ま
たは酵母（力士力Ｍ呪ム↓ｃｅｒｅｖ＋５ｉａｅ ）
等が挙げられる。ベクターとしては用いる宿主微生物
で複製可能なプラスミド、ファージ或はそれらの誘導体
であれば使用可能であるが本発明の実施に当っては目的
とするセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼが
宿主菌体内で発現出来る型のものであることが必要であ
る。このようなベクターとｃ ＤＮＡを結合して得られ
た組換え体ＤＮＡは宿主菌の形質転換に用いられる。か
くして得られた形質転換株からのセリン：ピルビン酸ア
ミントランスフェラーゼクローンの選択は抗体を用いた
免疫的な方法と該酵素の活性を指標とする方法によって
実施可能である。
この様な方法で選択された形質転換株からの組み換え体
ＤＮＡの調製は通常のプラスミド１１Ｍ１＃！法に依っ
て実施可能である。
ＤＮＡの調製は通常のプラスミド１１Ｍ１＃！法に依っ
て実施可能である。
かくして得られたラットセリン：ピルビン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有する組
換え体ＤＮＡは本発明の実施様態からアルコールデヒド
ロゲナーゼ活性およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ或
はアラニンデヒドロゲナーゼ活性の強い宿主に導入され
るのが好ましい。
ンスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有する組
換え体ＤＮＡは本発明の実施様態からアルコールデヒド
ロゲナーゼ活性およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ或
はアラニンデヒドロゲナーゼ活性の強い宿主に導入され
るのが好ましい。
この様にして造成したラットセリン：ピルビン酸アミン
トランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有す
る組換え体ＤＮＡＫよって形質転換した微生物を用いて
アミノ酸を製造するには通常の酵素的方法或は前駆体を
添加する醗酵法で実施可能である。
トランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有す
る組換え体ＤＮＡＫよって形質転換した微生物を用いて
アミノ酸を製造するには通常の酵素的方法或は前駆体を
添加する醗酵法で実施可能である。
酵素的方法の場合は該形質転換微生物を緩衝液中に！濁
し該懸濁液中に２−オキソ酸とアンモニア或はアンモニ
ウム塩を共存させれば良い。その際所望するアミノ酸に
対応する２−オキソ酸或はその塩の他にピルビン酸或は
その塩または２−オキソグルタル酸或はその塩を添加す
るかまたはアラニン或はその塩またはグルタミン酸また
はその塩を添加すると所望のアミノ酸の生産が高まる。
し該懸濁液中に２−オキソ酸とアンモニア或はアンモニ
ウム塩を共存させれば良い。その際所望するアミノ酸に
対応する２−オキソ酸或はその塩の他にピルビン酸或は
その塩または２−オキソグルタル酸或はその塩を添加す
るかまたはアラニン或はその塩またはグルタミン酸また
はその塩を添加すると所望のアミノ酸の生産が高まる。
またアルコールが共存する場合も所望のアミノ産の生成
量が改善される。更にアルコールとピルビン酸或はα−
ケトグルタル酸或はそのいずれかの塩、またはグルタミ
ン酸或はアラニン或はそのいずれかの塩が共存する条件
下では２−オキソ酸からの所望のアミノ酸への転換率は
顕著に高まることを見出した。
量が改善される。更にアルコールとピルビン酸或はα−
ケトグルタル酸或はそのいずれかの塩、またはグルタミ
ン酸或はアラニン或はそのいずれかの塩が共存する条件
下では２−オキソ酸からの所望のアミノ酸への転換率は
顕著に高まることを見出した。
反応系への２−オキソ酸またはその塩の添加は一括法、
分割法いずれでも良いが一般に２−オキソ酸濃度が高い
系内では基質阻害を生じる可能性があるので、高横度添
加の場合は分割添加が望ましい。アンモニア或はアンモ
ニウム塩の濃度は２−オキソ酸と同じモル濃度からその
１０倍濃度の間に入る様に添加するのが望ましいが何ら
それに限定されるものではない。アルコールも２−オキ
ソ酸と同じモル濃度からその２０倍濃度の範囲で添加す
るのが好ましい。またグルタミン酸デヒドロゲナーゼの
基質である２−オキソグルタル酸またはグルタミン酸或
はそのいずれかの塩の添加は所望するアミノ酸に対応す
る２−オキソ酸と同じモル濃度以下で有効であり好まし
くは２−オキソ酸の５００分の１から２分の１の範囲の
モル濃度で添加すれば良い。同様にアラニンデヒドロケ
゛ナーゼの基質であるピルビン酸またはアラニン或はそ
のいずれかの塩も２−オキソ酸の５００分の１から２分
の１の範囲のモル磯度で添加するのが好ましいが何らど
れらに限定されるものではない。
分割法いずれでも良いが一般に２−オキソ酸濃度が高い
系内では基質阻害を生じる可能性があるので、高横度添
加の場合は分割添加が望ましい。アンモニア或はアンモ
ニウム塩の濃度は２−オキソ酸と同じモル濃度からその
１０倍濃度の間に入る様に添加するのが望ましいが何ら
それに限定されるものではない。アルコールも２−オキ
ソ酸と同じモル濃度からその２０倍濃度の範囲で添加す
るのが好ましい。またグルタミン酸デヒドロゲナーゼの
基質である２−オキソグルタル酸またはグルタミン酸或
はそのいずれかの塩の添加は所望するアミノ酸に対応す
る２−オキソ酸と同じモル濃度以下で有効であり好まし
くは２−オキソ酸の５００分の１から２分の１の範囲の
モル濃度で添加すれば良い。同様にアラニンデヒドロケ
゛ナーゼの基質であるピルビン酸またはアラニン或はそ
のいずれかの塩も２−オキソ酸の５００分の１から２分
の１の範囲のモル磯度で添加するのが好ましいが何らど
れらに限定されるものではない。
反応温度は本発明に於て用いられる当該酵素が失活しな
い温度範囲であればいずれの温度でも良いが通常０゛Ｃ
〜７０°Ｃ１好ましくは２０°Ｃ〜５０℃の範囲が良い
。
い温度範囲であればいずれの温度でも良いが通常０゛Ｃ
〜７０°Ｃ１好ましくは２０°Ｃ〜５０℃の範囲が良い
。
尚、反応時附体をそのまｉ懸濁する方法のみならずトル
エン等有機溶媒処理をした菌体、界面活性剤処理をし死
菌体、或は固定化をした菌体を用いた場合も当然本発明
の範囲に入るものである。
エン等有機溶媒処理をした菌体、界面活性剤処理をし死
菌体、或は固定化をした菌体を用いた場合も当然本発明
の範囲に入るものである。
また前駆体である２−オキソ酸を添加する醗酵法によっ
て所望するアミノ酸を得るＫはセリン：ピルビン酸アミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ４基配列を有
する組換え体ＤＮＡによって形質転換され九微生物の培
養時に２−オキソ酸を一括または分割添加すれば良い。
て所望するアミノ酸を得るＫはセリン：ピルビン酸アミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ４基配列を有
する組換え体ＤＮＡによって形質転換され九微生物の培
養時に２−オキソ酸を一括または分割添加すれば良い。
この場合アンモニア或はアンモニウム塩Ｆｉ微生物の生
育の為のＮ源として供給されたものも利用可能である。
育の為のＮ源として供給されたものも利用可能である。
、またグルタミン酸或はその塩、アラニン或はその塩、
ピルビン酸或はその塩、２−オキソグルタル酸或はその
塩は酵素法の場合と同様に添加すれば良いが、培地を適
当に選ぶことにより培地成分として供給することも可能
である。アルコールを添加する場合も酵素法と同様に添
加すれば良いが高濃度の場合は一括添加により生育阻害
をおこす可能性が有るので分割添加が望ましい。
ピルビン酸或はその塩、２−オキソグルタル酸或はその
塩は酵素法の場合と同様に添加すれば良いが、培地を適
当に選ぶことにより培地成分として供給することも可能
である。アルコールを添加する場合も酵素法と同様に添
加すれば良いが高濃度の場合は一括添加により生育阻害
をおこす可能性が有るので分割添加が望ましい。
以下本発明を具体例によって説明するが、何らこれに限
定される屯のではない。
定される屯のではない。
実施例１． ｃＤＮＡの調製
２４時間絶食した体重１５０ｆの堆つィスター橿ラット
に体重１００２当り６００μｆの量のグルカゴンを腹腔
内注射し、該ラットから肝を調製した。肝からの全ＲＮ
Ａの調製はＮａＤｏｄ８０４−フェノール法（Ｍ、 Ｍ
ｏｒｌらＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ ｄ、 Ｓｅ
ｔ、Ｕ Ｓ Ａ １９７９７６ ５０７１）に従った。
に体重１００２当り６００μｆの量のグルカゴンを腹腔
内注射し、該ラットから肝を調製した。肝からの全ＲＮ
Ａの調製はＮａＤｏｄ８０４−フェノール法（Ｍ、 Ｍ
ｏｒｌらＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ ｄ、 Ｓｅ
ｔ、Ｕ Ｓ Ａ １９７９７６ ５０７１）に従った。
得られた全ＲＮＡからＭｏ１ｓｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ （Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＣｏ１ｄ ８ｐｒｌｖ
ｃ［Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２
） １９８頁に記載のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラ
ムを用いる方法でポリ（Ａ’ンＲＮＡ画分を得た。この
ポリ（Ａ”） ＲＮ Ａを鋳型にして常法に依やオリゴ
（ｄＴ）＋□１．をプライマーとし逆転写酵素（ＢＲＬ
社裏ＡＭＶＩＪバースドラ／スクリプターゼ）を用いて
１ｓｔストランドを合成した。次に常法に従いアルカリ
処理によりｍＲＮＡを分解除去後、逆転写酵素、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＢＲＬ社製
）を用いて２ｎｄストランドの合成を行った。かくして
得られた２ｎｄストランドのｍＲＮＡの５′末端忙相当
する側に］；ｃｏＲＩリンカ−を６′末端１ｆｌｌｌＣ
ＰｓｔＩリンカ−を結合させるため、２ ｎｄストラン
ド内の該制限酵素切断部位をｐｓｔ Ｉ メチラーゼ、
ｇｃｏＲＩメチラーゼによりメチル化して保禮した。次
に常法に従いｍ ＲＮ Ａの６′末端に相当する２ｎｄ
ストランド末端にＰｓｔ Ｉリンカ−を結合した。更に
ｍＲＮＡの５′末端に相当する部分く形成されているヘ
アピン構造をヌクレアーゼＳ１で切断しＤＮＡポリメラ
ーゼＩ Ｋｌｓｎｏｗ フラグメントで平滑末端とした
。かくして得られたｃＤＮＡのｍＲＮＡの５′末端に相
当する部分に常法に従いＥｃｏＲＩリンカ−を結合し、
次にＥｃｏＲＩおよびＰａｔ ｒを用い両末端を完全に
分解し粘着末端を露出させた。
ｎｇ （Ｔ、 ＭａｎｉｔａｓらＣｏ１ｄ ８ｐｒｌｖ
ｃ［Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２
） １９８頁に記載のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラ
ムを用いる方法でポリ（Ａ’ンＲＮＡ画分を得た。この
ポリ（Ａ”） ＲＮ Ａを鋳型にして常法に依やオリゴ
（ｄＴ）＋□１．をプライマーとし逆転写酵素（ＢＲＬ
社裏ＡＭＶＩＪバースドラ／スクリプターゼ）を用いて
１ｓｔストランドを合成した。次に常法に従いアルカリ
処理によりｍＲＮＡを分解除去後、逆転写酵素、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＢＲＬ社製
）を用いて２ｎｄストランドの合成を行った。かくして
得られた２ｎｄストランドのｍＲＮＡの５′末端忙相当
する側に］；ｃｏＲＩリンカ−を６′末端１ｆｌｌｌＣ
ＰｓｔＩリンカ−を結合させるため、２ ｎｄストラン
ド内の該制限酵素切断部位をｐｓｔ Ｉ メチラーゼ、
ｇｃｏＲＩメチラーゼによりメチル化して保禮した。次
に常法に従いｍ ＲＮ Ａの６′末端に相当する２ｎｄ
ストランド末端にＰｓｔ Ｉリンカ−を結合した。更に
ｍＲＮＡの５′末端に相当する部分く形成されているヘ
アピン構造をヌクレアーゼＳ１で切断しＤＮＡポリメラ
ーゼＩ Ｋｌｓｎｏｗ フラグメントで平滑末端とした
。かくして得られたｃＤＮＡのｍＲＮＡの５′末端に相
当する部分に常法に従いＥｃｏＲＩリンカ−を結合し、
次にＥｃｏＲＩおよびＰａｔ ｒを用い両末端を完全に
分解し粘着末端を露出させた。
以上の行程はｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｊに従って実施した。
ｊに従って実施した。
実施例２．形質転換
クローニング部位の上流にβ−ガラクトシダーゼの発現
に必要な部位を含む発現ベクターｐＵＣ８（Ｊ、 Ｖｉ
ａｊｒｉ、 Ｊ、 ＭｅｓｊｉｎｇＧｅｎｅ １９Ｂ２
１９２５９）をＢＲＬ社から購入し、該ベクターをＥ
ｅｏＲＩ 、 Ｐｇｔ Ｉで分解し低融点アガロースゲ
ル電気泳動釦より大フラグメントを回収した後０．５μ
りの該ベクター大フラグメントと実施ｆ！ＩＩＪ １で
得られたｃ Ｄ Ｎ Ａ ０．５μｔをＴ、リガーゼを
用い常法によシ結合した。このリガーゼ反応混液を用い
てＭａｎｄｅｌ−Ｈｉｇａ の方法に従い大腸菌ＤＨ−
１を形質転換した。
に必要な部位を含む発現ベクターｐＵＣ８（Ｊ、 Ｖｉ
ａｊｒｉ、 Ｊ、 ＭｅｓｊｉｎｇＧｅｎｅ １９Ｂ２
１９２５９）をＢＲＬ社から購入し、該ベクターをＥ
ｅｏＲＩ 、 Ｐｇｔ Ｉで分解し低融点アガロースゲ
ル電気泳動釦より大フラグメントを回収した後０．５μ
りの該ベクター大フラグメントと実施ｆ！ＩＩＪ １で
得られたｃ Ｄ Ｎ Ａ ０．５μｔをＴ、リガーゼを
用い常法によシ結合した。このリガーゼ反応混液を用い
てＭａｎｄｅｌ−Ｈｉｇａ の方法に従い大腸菌ＤＨ−
１を形質転換した。
形質転換後該大腸菌はイノプロピル−β−チオガラクト
ピラノシドおよび５−プロモーチオクロロ−６−インド
リル−β−ガラクトシド含有ＹＴプレート（５０μη−
ア／ピンリン添加）にブレーティングした。この条件は
「Ｍ１３クローニング／ジデオキシシーケ／シング」（
丸善バイオケミカル）に従りた。ブレーティング後のプ
レートは５７℃で一夜培養し生じた白色コロニーをニト
ロセルロースフィルター上に移しＬ−ブロス寒天培地上
で一夜培養し生じたコロニーをクロロホルム蒸気の充満
した容器中に室温で２０分間入れ溶菌した。次にフィル
ターをＴＳ緩衝液（５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）。
ピラノシドおよび５−プロモーチオクロロ−６−インド
リル−β−ガラクトシド含有ＹＴプレート（５０μη−
ア／ピンリン添加）にブレーティングした。この条件は
「Ｍ１３クローニング／ジデオキシシーケ／シング」（
丸善バイオケミカル）に従りた。ブレーティング後のプ
レートは５７℃で一夜培養し生じた白色コロニーをニト
ロセルロースフィルター上に移しＬ−ブロス寒天培地上
で一夜培養し生じたコロニーをクロロホルム蒸気の充満
した容器中に室温で２０分間入れ溶菌した。次にフィル
ターをＴＳ緩衝液（５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）。
０．１５ Ｍ ＮａＣ１） Ｋ５ ｍＭ ＭｇＣｌ、
、 １ μｔ／ｗｔ ＤＮａｓｅＩ 、 ５ ｆｂ
（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、４０μ？鷹リゾチームに
一夜室温で浸漬し菌体蛋白の固定とフィルターの前処理
を実施した。
、 １ μｔ／ｗｔ ＤＮａｓｅＩ 、 ５ ｆｂ
（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、４０μ？鷹リゾチームに
一夜室温で浸漬し菌体蛋白の固定とフィルターの前処理
を実施した。
前処理後のフィルターは次に５％（ｗ／マ）牛血清アル
ブミン、１０μｆ／ｄ抗セリン：ピルビン酸アミノトラ
ンスフェラーゼウサギＩｇＧを含むＴＳ緩衝液中に室温
で１時間浸漬した。その後Ｔ８１’Ｓ（０，１チＴｏｒ
ｌｔｏｎＸ−１００，ｌ１１１ ％ＳＤＳ含有ＴＳ緩衝
液）で室温１５分洗浄した。該洗浄は５回繰り返した。
ブミン、１０μｆ／ｄ抗セリン：ピルビン酸アミノトラ
ンスフェラーゼウサギＩｇＧを含むＴＳ緩衝液中に室温
で１時間浸漬した。その後Ｔ８１’Ｓ（０，１チＴｏｒ
ｌｔｏｎＸ−１００，ｌ１１１ ％ＳＤＳ含有ＴＳ緩衝
液）で室温１５分洗浄した。該洗浄は５回繰り返した。
次にフィルターは５ ％ （ｖ／ｖ）牛血清アルブミン
。
。
ｔ！！ １−標ＲＩ Ｘ １０’ ｅｐｍ／ｄロバ抗ウ
サギＩつＧ−Ｆ（ａｂ’）２添加ＴＳＴＳで１時間室温
にて処理した。
サギＩつＧ−Ｆ（ａｂ’）２添加ＴＳＴＳで１時間室温
にて処理した。
該処理後ＴＳＴＳＫよる室温１５分での洗浄を５回行っ
た。
た。
かくして得られた第１抗体、第２抗体処理後のフィルタ
ーは風乾し一７０℃で増感紙を用いて露光後、現象した
。
ーは風乾し一７０℃で増感紙を用いて露光後、現象した
。
以上の操作により３３０００のライブラリーより１９個
のポジティブコロニーを得た。このうちのひとつＭＴ−
３Ｐ１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９５）は５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン：ピルビン酸
アミノトランスフェラーゼと同一の移動度を有する蛋白
を産生じていた。宿主として用いたＤＨＩは該移動度の
蛋白を産生じていなかった。ＭＴ−８Ｐ１０株からプラ
スミドを調製して調べたところ該プラスミドはＥ ｃｏ
ＲＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ消化により０．５ｋｂの７ラグメ
ントを生ずることが確認された。
のポジティブコロニーを得た。このうちのひとつＭＴ−
３Ｐ１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９５）は５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動的にセリン：ピルビン酸
アミノトランスフェラーゼと同一の移動度を有する蛋白
を産生じていた。宿主として用いたＤＨＩは該移動度の
蛋白を産生じていなかった。ＭＴ−８Ｐ１０株からプラ
スミドを調製して調べたところ該プラスミドはＥ ｃｏ
ＲＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ消化により０．５ｋｂの７ラグメ
ントを生ずることが確認された。
このフラグメントを用いてＭｏｌ＠ｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ５４４頁記載のハイブリダイゼーション選択同
定法を用いて調べたところ得られたクローンがセリン：
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼに対するものであ
ることを確認した。
ｎｉｎｇ５４４頁記載のハイブリダイゼーション選択同
定法を用いて調べたところ得られたクローンがセリン：
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼに対するものであ
ることを確認した。
またＭＴ−８Ｐ１０株の有するプラスミドはｐｕｃａの
ＥｃｏＲＩ 、 ＰｓｔＩ 切断部位に約１．４ｋｂ
のＤＮＡ塩基配列が挿入結合したものであることを確認
し該組換え体ＤＮＡをｐＲｓＰＴｌｏと命名した。
ＥｃｏＲＩ 、 ＰｓｔＩ 切断部位に約１．４ｋｂ
のＤＮＡ塩基配列が挿入結合したものであることを確認
し該組換え体ＤＮＡをｐＲｓＰＴｌｏと命名した。
Ｔ）Ｒ３Ｐ↑１０の特異的産物である蛋白（分子量４万
）は徊主函を超音波処理することＫより上清に回収する
ことが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノトランスフ
ェラーゼ抗体による免疫沈降実験を行なった。
）は徊主函を超音波処理することＫより上清に回収する
ことが出来たのでセリン：ピルビン酸アミノトランスフ
ェラーゼ抗体による免疫沈降実験を行なった。
その結果該抗体によりＰＲ８ＰＴ １０による特異的産
物は沈降することが認められた。またこの上清はセリン
ニピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性がＰＲ５Ｐ
Ｔ１０を有しない宿主のものに比べ１０２以上高く、か
つその活性は該酵素の抗体で抑えられることが認められ
た。
物は沈降することが認められた。またこの上清はセリン
ニピルビン酸アミノトランスフェラーゼ活性がＰＲ５Ｐ
Ｔ１０を有しない宿主のものに比べ１０２以上高く、か
つその活性は該酵素の抗体で抑えられることが認められ
た。
以上の結果からＩ）Ｒ８ＰＴ １０けラット肝セリン：
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡでおることが確認さ
れた。またＭＴ−８ＰＴ１０株は該組換え体ＤＮＡによ
って形質転換された微生物でおる。
ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡでおることが確認さ
れた。またＭＴ−８ＰＴ１０株は該組換え体ＤＮＡによ
って形質転換された微生物でおる。
実施例３．２−オキソ酸とアンモニウム塩からのアミノ
酸の合成 実施例２で得られたｐＲ８ｐｔｌＯを含む大腸菌ＭＴ−
８Ｐ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９５１を５０μ？鷹の
アンピシリンを含むはンアツセイ培地（Ｄｉｆｃｏ社製
）２００ｍを用い３７℃で１５時間培＃後遠心により集
菌した。反応系の組成は２−オキソｆ９２０ ｍＭ。
酸の合成 実施例２で得られたｐＲ８ｐｔｌＯを含む大腸菌ＭＴ−
８Ｐ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９５１を５０μ？鷹の
アンピシリンを含むはンアツセイ培地（Ｄｉｆｃｏ社製
）２００ｍを用い３７℃で１５時間培＃後遠心により集
菌した。反応系の組成は２−オキソｆ９２０ ｍＭ。
塩化アンモニウム１００ ｍＭ、含水型［３０ηの菌体
を含む５−の１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（＋
）８８．５）である。反応は試験管を用い損盪しながら
３７℃で１５時間インキュベーションして実権した。反
応後遠心により上清を回収しＨＰＬＣ，ＴＬ。
を含む５−の１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（＋
）８８．５）である。反応は試験管を用い損盪しながら
３７℃で１５時間インキュベーションして実権した。反
応後遠心により上清を回収しＨＰＬＣ，ＴＬ。
Ｃ，バイオアッセイにより分析を行った。
表ＩＫ示すようＩＣ２−オキソ酸から対応するし一アミ
ノ酸が生成することが認められた。
ノ酸が生成することが認められた。
表 １
フェニルピルビン酸 フェニルアラニン ４５
．。
．。
ナトリウム （９０）２−オキソ−４
−メチ′ メチオ＝” ５７．５チオ酪
酸ナトリウム （Ｚ５）存の効果 実施例６．と同じ反応系を用いてＬ−フェニルアラニン
の生成を調べた。但し表２に示すアミノ酸（塩）。
−メチ′ メチオ＝” ５７．５チオ酪
酸ナトリウム （Ｚ５）存の効果 実施例６．と同じ反応系を用いてＬ−フェニルアラニン
の生成を調べた。但し表２に示すアミノ酸（塩）。
アルコールを添加した。反応温度、時間ともに実施例１
３．と同じである。本結果から反応系へのエタノールお
よびグルタミン蝦（塩）またはアラニンの添加によりフ
ェニルピルビン酸からのＬ−フェニルアラニンへの転換
率が著しく高まることが認められた。
３．と同じである。本結果から反応系へのエタノールお
よびグルタミン蝦（塩）またはアラニンの添加によりフ
ェニルピルビン酸からのＬ−フェニルアラニンへの転換
率が著しく高まることが認められた。
実施例６と同様の方法を用いてＬ−アミノ酸の生成を調
べた。但しグルタミン酸ナトリウムまたはアラニンおよ
びエタノールを反応系に添加した。
べた。但しグルタミン酸ナトリウムまたはアラニンおよ
びエタノールを反応系に添加した。
反応温度、時間ともに実施例３と同じである。本結果（
表５）から高い転換率で２−オキソ酸から対応するし一
アミノ酸が生成することが判明した。
表５）から高い転換率で２−オキソ酸から対応するし一
アミノ酸が生成することが判明した。
尚、反応系の組成は表６に示す。その他の条件は実施例
ろと同じである。
ろと同じである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ラットセリン：ピルビン酸アミノトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を有する組換え体ＤＮＡ
を用いて微生物を形質転換し、得られた形質転換株を用
い２−オキソ酸をアミノ基受容体としアンモニア或はア
ンモニウム塩存在下に該アミノ基受容体にアミノ基を転
移させアミノ酸を生産する方法 ２）微生物が大腸菌であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載するアミノ酸の生産法。 ３）２−オキソ酸が次に示すもの或はその塩から任意に
選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載するアミノ酸の生産法：ピルビン酸、２−オ
キソ−３−イミダゾールプロピオン酸、２−オキソ−３
−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、２−オキソグルタ
ル酸、ヒドロキシピルビン酸、２−オキソイソ吉草酸、
２−オキソイソカプロン酸、２−オキソ−３−メチル−
ｎ−吉草酸、２−オキソ−３−メルカプトプロピオン酸
、２−オキソ−４−メチルチオ酪酸、２−オキソ−３−
ヒドロキシ酪酸、２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸、２
−オキソ−３−（インドール）プロピオン酸、２−オキ
ソコハク酸、２−オキソスクシンアミド酸、２−オキソ
グルタルアミド酸、２−オキソ−６−アミノ−ｎ−カプ
ロン酸、２−オキソ−３−（３’，４’ジヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸。 ４）アンモニア或はアンモニウム塩存在下に２−オキソ
酸にアミノ基を転移させる際にアミノ酸或はその塩が共
存することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
アミノ酸生産法。 ５）アミノ酸或はその塩がグルタミン酸、或はその塩、
またはアラニン或はその塩であることを特徴とする特許
請求の範囲第４項に記載のアミノ酸生産法。 ６）アンモニア或はアンモニウム塩存在下に２−オキソ
酸にアミノ基を転移させる際にアルコールが共存するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のアミノ酸
生産法。 ７）アルコールがエタノールであることを特徴とする特
許請求の範囲第６項に記載のアミノ酸生産法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429885A JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2429885A JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185194A true JPS61185194A (ja) | 1986-08-18 |
| JPH0543355B2 JPH0543355B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=12134259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2429885A Granted JPS61185194A (ja) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | アミノ酸の生産法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61185194A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
-
1985
- 1985-02-13 JP JP2429885A patent/JPS61185194A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2749279A (en) * | 1954-05-27 | 1956-06-05 | Rohm & Haas | Enzymatic production of l-glutamic acid |
| US4304858A (en) * | 1979-07-25 | 1981-12-08 | Degussa Aktiengesellschaft | Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding amino acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0543355B2 (ja) | 1993-07-01 |
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