CN118126972A - 一种羰基还原酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其制备方法和应用；所述羰基还原酶突变体包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位、第45位、第66位、第178位和第205位中的至少一个氨基酸处的突变；相比野生型羰基还原酶，羰基还原酶突变体具有更优良的比酶活、耐酸性；其中羰基还原酶突变体H45D/P66A/V178P的比酶活相对野生型提升了2.6倍，且最适pH值从6.0下调到了5.0，耐酸性得到显著提升；将突变体与葡萄糖脱氢酶偶联，6h内转化底物浓度高达350g/L，转化率达99％，终产物的e e值达99.4％；而且羰基还原酶突变体的制备过程简单，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)又称(S)-1-叔丁氧羰基-3-哌啶醇，是一种可用于合成多种重要化学品以及药物的手性中间体，例如，非天然药物卡普瑞林，天然生物活性物质异白刺啉淋胺和小果白刺碱。另外，(S)-NBHP是许多药物分子的生物活性结构，如FDA批准抗癌新药依鲁替尼、抗高血压药物贝尼地平以及新型广谱抗球虫药常山酮。因此，该化合物具广阔的应用市场以及重要研发价值。
化学法合成手性(S)-NBHP是最直接的方式，大多使用化学催化剂或手性试剂和潜手性物质作用得到手性产品，存在反应成本高，催化效率低，反应条件苛刻等问题。而由生物催化剂介导的底物不对称还原生产手性醇是一种更环保和可持续的工艺，具有高立体选择性、适中的反应条件且反应步骤简单等优点。
目前以生物法制备(S)-NBHP的相关研究主要是以羰基还原酶作为生物催化剂不对称还原N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)，此过程需要辅酶(NAD+，NADH)的参与作为氢的供体。必需辅酶的再生循环是于生物催化氧化还原反应中一个不可避免的问题，它能直接关系到整个反应系统的催化效果，目前不对称还原NBPO的辅酶再生方式包括主要有两种：底物偶联和酶偶联法(如图1所示)。
底物偶联法是在体系中添加辅助底物，用同一种酶催化两个不同的氧化还原反应，采用的辅底物有机试剂还可以促进部分催化主底物的溶解，另外反应过程中无需繁琐的对pH调控。但是辅底物和底物会同时竞争酶的活性中心，降低了酶对主底物的催化活性，且辅底物为有机试剂对酶活力有较大程度的损害，同时辅底物的分离也增加了生产的成本和难度。已报道的相关文献例如：
(1)2014年Xin Ju等人，通过筛选商业酮还原酶KRED，利用酮还原酶氧化异丙醇的能力构建底物偶联辅酶再生的方法合成(S)-NBHP，实现底物浓度100g/L的生物转化。(Organic Process Rese arch&Development,2014,18(6):827 -830.)；
(2)2018年Xiangxian Ying等人通过基因组挖掘获得来源于红平红球菌WZ010(Rhodococcuserythropolis WZ010)的还原酶ReCR，利用ReCR突变体Y54F，以异辛醇为共底物构建辅酶循环，在异辛醇两相体系中实现了底物浓度300g/L的生物转化。(Molecules,2018,23(3117):2-13.)；
(3)专利CN201310054684.9公开了一种利用醇脱氢酶PAR来不对称合成(S)-NBHP，利用了有机试剂异丙醇来进行辅酶循环。
酶偶联法的原理与底物偶联法类似，利用了两种酶催化两个不同的化学反应，一个酶用于底物的不对称催化还原反应，另一个酶借助辅底物负责催化辅酶循环再生。该方法的优点是两个酶催化的底物相对独立，可以避免两个底物竞争同一酶的活性中心，实验设计和操作灵活多变，适用范围更加广泛。酶偶联法中常用的酶主要为葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GDH)，作为一种高活力的酶，其优势异常明显：来源广泛，作用的底物葡萄糖成本较低廉，且其均适用于NADH和NADPH的再生。因此，这种利用葡萄糖脱氢酶进行双酶耦联的方式已成为生物催化法制备(S)-NBHP中应用最广的辅酶循环系统，已报道的相关文献例如：
(1)2016年Zhong-Liu Wu等人从Chryseobacterium SP.CA49基因组中筛选获得CHKRED03与GDH偶联，加入甲醇助溶的反应体系中实现了底物浓度200g/L的生物转化。CHKRED03在30℃磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中酶活性最高，反应过程通过添加1MNaOH监测pH值，使其维持在7.0-8.0(Process Biochemistry,2016,51(7):881-885.)；
(2)2017年Jingjing Chen等人通过使用来源Candida Parapsilosis念珠菌醇脱氢酶CpRCR与葡糖糖脱氢酶BmGDH在大肠杆菌中共表达，实现了底物浓度100g/L的生物转化。反应过程中适当时间点加入适量的2.0M NaOH，使pH值保持在7.0左右(World Journalof Microbiology and Biotechnology,2017,33(61):2-12.)；
(3)2017年Mengyanh等人通过筛选酮还原酶库，获得来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的耐高温酮还原酶AKR-43，也是利用GDH进行辅酶再生循环，在加入异丙醇助溶剂的水相体系中实现了底物浓度200g/L的生物转化。GDH的最佳pH为6.5，而AKR-43在pH为6.5时仅保持25％的相对活性，选择了7.5的折中pH值进行反应。通过pH控制器向反应混合物中加入HCl/NaOH使反应液的pH维持在7.5(Applied Biochemistry andBiotechnology,2017,181(4):1304-1313.)；
(4)2017年Li-Feng Chen从酿酒酵母中分离出一种NADPH依赖性还原酶YDR541C，其在pH 8.0时活性最高，因此生物转化在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行，并使用2.0M Na2CO3的自动化系统监测反应混合物的pH将其维持在8.0。优化反应后，在6h内，转化NBPO浓度240g/L，收率为99％，光学纯度99.5％ee(Tetrahedron Letters，2017，58：1644-1650)；
(5)2019年Yitong Chen等人将来自热厌氧杆菌的TBADH(Thermoanaerobacterbrockii)和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中共表达，在添加甲醇助溶剂的体系中实现了底物浓度100g/L的生物转化。该反应在pH为8.0的PBS缓冲液中，转化率最高。在酸或碱溶液中，催化效率较低。当底物浓度增加到500mM时，加入Na2CO3溶液(1M)或氨溶液(5M)来中和反应中生成的葡萄糖酸(Rsc Advances,2019,9(4):2325-2331.)；
(6)2022年Yanfei Wu等人获得来自多孢克卢维菌(Kluyveromyces polyspora)的醇脱氢酶KpADH的优良突变体Y127W，使用GDH进行辅酶循环，在10h内催化底物600g/L的100％转化。反应过程中使用自动电位滴定1M Na2CO3，将pH维持在7.0(Advanced.Synthesis.Catalysis.2022,364:332 -340)；
(7)2022年Lin Yang等人发现FsADH对N-Boc-3-哌啶酮有较高的催化活力，FsADH的最适pH值为8.0，且表现出相当窄的pH稳定性。当与葡萄糖脱氢酶共表达反应24h后能够催化597g/L的底物获得99％的转化率和99％ee的(S)-NBHP，反应过程中滴定1M Na2CO3，将pH维持在7.0(Biochemical Engineering Journal,2022,178:108300)；
(8)专利CN202310623945公开了一种羰基还原酶最优突变体可在4h转化100g/L的底物，转化率达到99％，S构型光学纯度大于99％ee。反应过程中通过滴加Na2C03来控制pH，将其保持在6.0左右。
以上利用葡萄糖脱氢酶进行双酶耦联还原反应时，除了添加辅酶GDH，还需要添加大量辅底物葡萄糖保证辅酶循环反应的正常进行，在NBPO被还原成(S)-NBHP的同时，葡萄糖则被氧化成葡萄糖酸，因此反应体系的pH会随着葡萄糖酸的积累逐渐降低，进而影响到还原酶的活性。以上报道的还原酶虽然均可以催化较高浓度的N-Boc-3-哌啶酮，但是还原酶的最适pH值均偏中性在6.0-8.0之间，反应过程均需要添加额外的碱性溶液NaOH或Na2C03来调控pH稳定在6.0-8.0之间。繁琐的pH调控，不仅增加了反应成本，也不利于实际工业中的放大应用。
因此探索挖掘具有优异催化活性以及耐酸性pH的羰基还原酶，对于(S)-NBHP的工业化生物不对称合成至关重要。
发明内容
本发明的目的在于在羰基还原酶的大量筛选过程中，首次挖掘到了来自梅奇酵母属的Metschnikowia persimmonesis菌的羰基还原酶MpCR，并通过对蛋白质结构进行理性设计，获得了比酶活及耐酸性提高的羰基还原酶突变体H45D/P66A/V178P，使用该突变体作为催化剂，可高效催化合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，同时拓展了其在手性醇方面的工业化生产。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位、第45位、第66位、第178位和第205位中的至少一个氨基酸处的突变。
优选地，所述如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位突变为甘氨酸；所述如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第45位突变为天冬氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第66位突变为丙氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第178位突变为脯氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第205位突变为丙氨酸。
优选地，所述羰基还原突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含：
(I)编码本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体的核苷酸序列；或
(II)与(I)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第三方面，提供一种重组载体，所述载体可表达本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体或含有本发明第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体。
优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。
优选地，所述非病毒性载体包括：质粒载体、阳离子多聚物载体、壳聚糖、聚乙烯亚胺、纳米颗粒载体、脂质体中的至少一种。
优选地，所述的重组表达载体以pET-28a或PMA5作为原始表达载体。
本发明的第四方面，提供一种转化子，所述转化子含有本发明第三方面所述的重组载体。
优选地，所述转化子为表达如本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体的细胞；
优选地，所述细胞包括原核细胞、真核细胞；所述细胞非植物或动物新品种。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的细菌。
优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。
本发明第五方面，提供本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体和/或本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的重组载体和/或本发明第四方面所述的转化子在以下任一项中的应用：
(I)合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶；
(II)制备合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的产品。
本发明的第六方面，提供一种产品，包含本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体和/或本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的重组载体和/或本发明第四方面所述的转化子。
优选地，所述产品包括食品、药品、催化剂等。
本发明的第七方面，提供一种羰基还原酶突变体的制备方法，通过培养本发明第四方面所述的转化子获得羰基还原酶突变体。
优选地，在分离出羰基还原酶突变体的粗酶液后，可以对其进行进一步的纯化以获得更高纯度的羰基还原酶突变体。
优选地，所述纯化方法包括但不限于亲和层析。
优选地，所述亲和层析包括但不限于镍柱亲和层析。
本发明的第八方面，提供一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的制备方法，包括使用本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体和/或本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的重组载体和/或本发明第四方面所述的转化子和/或本发明第六方面所述的产品制备(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
所述羰基还原酶催化N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原反应是在辅酶NAD+/NADH的存在下进行的。
优选地，所述辅酶NAD+/NADH可以通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖产生。
优选地，所述制备方法具体包括：将N-Boc-3-哌啶酮、葡萄糖、羰基还原酶突变体、葡萄糖脱氢酶混合反应，合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
优选地，所述N-Boc-3-哌啶酮、葡萄糖、羰基还原酶突变体、葡萄糖脱氢酶的质量比为：300～400:450～550:6～10:6～10。
优选地，所述反应的体系中还包括助溶剂。
优选地，所述助溶剂的添加量为25～40％(v/v)。
优选地，所述反应的温度为30-40℃、时间为6～10。
优选地，所述反应过程每隔1.5～2.5h加pH调节剂。
优选地，所述pH调节剂保持反应体系pH为6.5～7.5。
本发明的有益效果是：
本发明提供了羰基还原酶突变体、编码羰基还原酶突变体的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体和转化子；其中所述羰基还原酶突变体包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位、第45位、第66位、第178位和第205位中的至少一个氨基酸处的突变。与现有技术中的羰基还原酶突变体相比，具有更优良的比酶活、耐酸性，可高效催化合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
本发明提供的羰基还原酶突变体H45D/P66A/V178P的比酶活相对野生型提升了2.6倍，且最适pH值从6.0下调到了5.0，当在pH3.0-6.0的酸性环境下保存2h后，残余酶活仍然保持85％以上，耐酸性得到显著提升。将突变体H45D/P66A/V178P与葡萄糖脱氢酶(BmGDH)偶联，在最优条件下，仅需2次pH调控，6h内转化底物浓度高达350g/L，转化率达99％，终产物(S)-NBHP的光学纯度e e值达99.4％。而且羰基还原酶突变体的制备过程简单，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不对称还原NBPO的辅酶再生方式，底物偶联②和酶偶联法①；
图2为羰基还原酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达，泳道说明:M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1号泳道为突变体H45D/P66A/V178P上清粗酶；2-6号泳道为初筛酶活提高的5个突变体的上清粗酶；
图3为野生型MpCR及突变体H45D/P66A/V178P的最适反应温度；
图4为野生型MpCR及突变体H45D/P66A/V178P的最适pH值；
图5为野生型MpCR及突变体H45D/P66A/V178P的pH耐受性；
图6为突变体H45D/P66A/V178P酶催化合成(S)-NBHP。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明中氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义:A:Ala(丙氨酸)；R:Arg(精氨酸)；N:Asn(天冬酰胺)；D:Asp(天冬氨酸)；C:Cys(半胱氨酸)；Q:Gln(谷氨酰胺)；E:Glu(谷氨酸)；G:Gly(甘氨酸)；H:His(组氨酸)；I:Ile(异亮氨酸)；L:Leu(亮氨酸)；K:Lys(赖氨酸)；M:Met(甲硫氨酸)；F:Phe(苯丙氨酸)；P:Pro(脯氨酸)；S:Ser(丝氨酸)；T:Thr(苏氨酸)；W:Trp(色氨酸)；Y:Tyr(酪氨酸)；V:Val(缬氨酸)。
本发明当中，所述变体根据它们在特定残基上的突变来描述，其位置通过与野生型酶序列SEQ ID NO:1比对或参考酶序列SEQ ID NO:1来确定。在本发明的上下文中，还涉及在功能等同的残基上携带这些相同突变的任何变体。
在本发明中，术语"引物"和"引物链"可以互换使用，是指初始的核酸片段，通常是与由目标核酸分子全部或部分的引物结合位点互补的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物链可包含天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下可以形成稳定双链体所需的最小长度。
在本文中，术语"野生(型)"、“野生酶”、"野生型酶"表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的羰基还原酶SEQ ID NO:1。
在本发明中，术语"突变体"和"变体"可以互换使用，"修饰"或"突变"可以互换使用，这些表达是指相对于野生型蛋白的氨基酸，例如野生型的序列SEQ ID NO:1的来源于梅奇酵母属的Metschnikowia persimmonesis的羰基还原酶MpCR，或来源于此类酶的基础上，包含在一个或更多个位置处的改变，即取代、插入和/或缺失，并仍然保留其活性。突变体可以通过本领域己知的各种技术获得。用于修饰编码野生型蛋白的DNA序列的示例性技术包括但不限于，定向诱变、随机诱变和合成寡核苷酸的构建，进而将修饰得到的DNA序列在宿主菌中进行表达，得到氨基酸序列发生取代、插入和/或缺失的突变体。本发明当中，表述为"所述突变体包括……位点的突变"或者"所述突变体的氨基酸序列包括…位点的突变"具有相同含义，均表示该突变蛋白的氨基酸序列的特定位点发生取代、插入和/或缺失。关于氨基酸位置或残基的术语"取代"是指在特定位置处的氨基酸己被其他的氨基酸代替。取代可以是保守的或非保守的。
本文中通过突变位点的位置编号和该位点的氨基酸种类表达突变位点及其取代，例如H45D表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第45位置的组氨酸被天冬氨酸所取代。本发明当中，采用"/"表示突变位点的组合，例如"H45D/P66A"表示第45位的组氨酸和第66位的脯氨酸均发生突变，包含两个突变位点，为双突变体。依次类推，"H45D/P66A/V178P"表示相应的三个位点同时发生突变，为三突变体。
当作为生物催化剂用于合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶时，本发明的羰基还原酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等:所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
实施例1：重组表达载体pET-28a-MpCR的转化
野生型MpCR基因是由通用生物(安徽)股份有限公司合成来源于微生物梅奇酵母属的Metschnikowia persimmonesis的羰基还原酶MpCR(NCBI:KAF7999841.1)的多肽的基因(经过密码子优化)获得的。利用限制性内切酶Nde I和BamH I，将获得的野生型MpCR酶基因插入到表达质粒pET-28a(+)中，从而产生重组表达载体28a-MpCR。通过常规转化方法，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，转化得到含有野生型MpCR基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-28a-MpCR并保藏在-80℃的超低温冰箱中。
其中野生型羰基还原酶MpCR的氨基酸序列为：
MPATVLVSGASGFIAQHIVRLLISKGYNVIGTFTYEIVPDISLPHAFDAVVQNHPEATIFLHTASPFHYKASDVEKELLLPALNGTINALSAIKKHGPQLKSVVVTSSYVAMWNYAKFYDPTHTDTETLWNPISWEDGKVDSEQGYYALKTFAEKAAWDFYKREKPTFDLNFVNPVLVFGPQAFDSGVSPELNASSEIINRLLKLGPEAKIPDFSSVFVDVRDVAKALIAAFEKGLSGERLLLYSSKFTNQDIIDIVHENFMELRNKLPVGNPGSGSLAIAKICTIDDSRTRQILVSERIGLKSSVIDTVRQILEKPKHL(SEQ ID NO:1)。
编码该羰基还原酶MpCR的核苷酸序列如下所示：
ATGCCCGCTACAGTTCTAGTATCAGGAGCATCCGGTTTTATTGCTCAGCACATTGTGCGCTTGCTAATTAGCAAGGGTTACAACGTGATCGGCACTTTCACGTACGAAATTGTTCCGGATATCAGCCTGCCGCACGCTTTCGACGCAGTTGTGCAGAATCATCCGGAGGCAACCATTTTTCTGCATACCGCGAGCCCGTTTCATTATAAAGCGTCTGACGTGGAAAAGGAGTTGTTGCTGCCGGCGCTGAACGGCACCATCAACGCTCTGAGCGCGATCAAAAAACACGGCCCTCAGCTGAAGAGCGTCGTGGTTACCAGCAGTTATGTTGCTATGTGGAATTATGCAAAGTTCTACGACCCGACCCACACGGATACCGAAACCCTGTGGAATCCCATCTCCTGGGAAGATGGTAAAGTGGATTCGGAACAAGGCTACTACGCCTTGAAGACCTTTGCAGAAAAGGCGGCCTGGGATTTTTACAAGCGCGAAAAACCGACGTTCGACCTGAACTTTGTGAACCCGGTGCTGGTTTTCGGTCCGCAAGCGTTCGATAGCGGGGTGTCCCCGGAGCTGAACGCGAGCTCCGAGATCATTAACCGTTTACTGAAACTGGGTCCAGAGGCTAAAATCCCGGACTTCAGCTCTGTTTTTGTTGACGTTCGTGATGTGGCGAAGGCCCTGATTGCGGCGTTCGAGAAAGGTCTGAGCGGCGAGCGCCTTCTGTTGTATAGCTCGAAGTTCACCAATCAGGATATCATTGATATCGTTCATGAAAACTTTATGGAGTTACGTAATAAACTCCCAGTTGGCAACCCGGGTAGCGGCTCTCTGGCAATCGCGAAAATCTGCACGATTGACGACAGCCGTACCCGTCAAATCTTGGTCTCCGAGAGAATTGGTCTCAAGTCTTCCGTCATCGACACCGTACGTCAGATCCTGGAAAAGCCGAAGCACCTG(SEQ ID NO:2)。
实施例2：通过定点饱和突变提高MpCR酶活
将野生型羰基还原酶MpCR与Genbank数据库中己报道的羰基还原酶的氨基酸序列进行同源性比对分析：同时对MpCR进行结构预测，利用Swiss-Model、Phyre2、DiscoveryStudio等软件对该酶野生型蛋白进行同源建模，预测野生型酶的催化位点及底物结合位点，并分析这些位点附近氨基酸残基的作用，对羰基还原酶的表面电荷进行改造，从而设计可提升酶活力以及pH耐酸性的突变体。
经上述分析，选择对应于SEQ ID NO.1的第42位、第45位、第66位、第178位、第205位为突变位点进行饱和突变，建立单位点饱和突变文库。
实施例3：突变体高通量初筛选方法的建立
本实施例建立了羰基还原酶MpCR突变库的高通量初筛选策略，该过程具体方法如下：
(1)向96孔深孔板中加入适量含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基，从突变体库中挑取转化子接菌于96孔深孔板，37℃，200rpm培养2h后，加入0.2mM IPTG，30℃继续诱导培养6h；
(2)培养结束，对深孔板低温高速离心弃上清，湿菌体用100mM pH5.0磷酸钠缓冲重悬后加入适量溶菌酶，室温下摇床温育15min，4℃、10000rpm离心15min收集上清粗酶液；
(3)在96孔酶标板上设置200μl应体系包括：1mM NADH，20mM N-Boc-3-哌啶酮，100mM磷酸缓冲液(偏酸性的pH 5.0)，最后加入适量粗酶激活反应。设置酶标仪温度30℃，在波长340nm处检测吸光值变化。以每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量为一个活力单位(U)，计算突变酶粗酶活力，筛选高酶活突变体。
实施例4：突变体转化子发酵培养后的复筛
利用实施例3中的高通量筛选策略对突变体库中转化子进行筛选，从中筛选获得酸性pH5.0下粗酶活提高的突变体5个，对其进行测序。序列分析后，对相应突变体转化子按照下述方法进一步发酵扩大培养，然后利用Ni柱纯化突变体蛋白，进而对酶活提高的突变体进行复筛。
将野生型羰基还原酶的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-28a-MpCR与初次筛选得到的5个突变体转化子分别接种于5ml含卡那霉素(30μg/mL)抗性的LB培养基中，37℃下培养12h后以4％接种量转接至200mL TB发酵培养基中，先于37℃、200rpm恒温培养2h后转至30℃、200rpm进行摇瓶诱导发酵18h。
发酵结束后，低温4℃、10000rpm离心10min收集菌体，湿菌体用20ml的0.1MpH5.0磷酸钠缓冲重悬后超声破碎(超1s，停2s，全程20min)，再次低温4℃、10000rpm离心25min，上清即为野生型羰基还原酶MpCR以及突变体酶粗酶液。将上清液进行SDS-PAGE电泳。
结果如图2所示，野生型MpCR及5个突变体均可以检测到一条分子量约35KDa的特异性条带，与预测的蛋白大小一致，说明野生型MpCR及筛选的突变体均可以高效正确的表达。
酶的纯化：
为了纯化上述野生型MpCR及其突变体；采用GE公司的AKTA prime层析系统，使用5mL的High Affinity Ni-Charged Resin FF镍柱亲和层析。
层析柱用pH 8.0，0.3M NaCl，0.01mM咪唑，50mM磷酸钠缓冲(缓冲液A)预平衡，洗脱缓冲液为pH 8.0，0.3M NaCl，0.25mM咪唑，50mM磷酸缓冲(缓冲液B)，采用0％－100％缓冲B梯度洗脱，总洗脱时间为60min，然后将收集的活性蛋白过Sephacryl S-300凝胶柱进一步脱盐去除杂蛋白，经紫外检测仪监测，在高数值时收集目的蛋白。纯化后的酶-80℃保存，用于后续测定蛋白浓度和酶活性。
蛋白浓度的测定方法：使用上海碧云天的Bradford蛋白浓度测定试剂盒，按照说明书测定蛋白质浓度，使用牛血清蛋白绘制标准曲线。
酶活性检测：在96孔酶标板上设置200μl应体系包括：1mM NADH，20mM N-Boc-3-哌啶酮，100mM磷酸缓冲液(偏酸性的pH 5.0)，最后加入适量酶激活反应，设置酶标仪温度30℃、在波长340nm处检测吸光值变化。酶活定义:在30℃，pH5.0条件下，每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量为一个活力单位(U)。
比酶活的定义：酶的比活是指在特定条件下，单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数，利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，因此通过酶活U/ml与蛋白浓度mg/ml之比计算出比酶活U/mg，结果如表1所示。
表1
| 催化酶 | 比酶活(U/mg) |
| 野生型MpCR | 43.6 |
| S42G | 63.4 |
| H45D | 69.8 |
| P66A | 61.0 |
| V178P | 66.5 |
| L205A | 56.1 |
实施例5：野生型MpCR的定点突变、多点组合突变
采用定点突变技术获得组合突变体，突变的引物采用诺唯赞公司提供的CEDesign V1.04设计。突变引物见表2。
表2突变引物
定点突变以筛选出的5个突变体的重组质粒为模板，利用Vazyme 2xphantamaster mix进行全质粒扩增，按照表3设置反应体系。
表3定点突变体系
PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸5min，反应30个循环后，再72℃延伸10min，最后4℃保温。PCR反应结束后，加入1μL DpnI消化酶，37℃反应2h消化模板，回收纯化后的PCR产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。
转化方法：取10μL PCR产物与100μL的诺唯赞商用E.coli BL21(DE3)感受态混匀冰浴20min后，42℃热激90s后迅速拿出，冰浴2min，加入600μL的LB液体培养基，37℃，200rpm，复苏50min，取200μl菌液涂布于含有30μg/mL卡那抗性的固体LB平板上，37℃恒温箱过夜培养。
次日从平板中挑选重组大肠杆菌BL21三株，将上述重组菌从平板分别接种到装有5mL含有卡那霉素抗性的液体LB培养基(LB(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5)的50mL的摇管中，加入卡那霉素抗性，在摇床上37℃恒温培养12h，转速200rpm。培养结束后抽提质粒，送通用公司进行测序。最后将测序结果与野生型酶蛋白核酸序列进行比对，确定突变是否成功。
按照上述方法，对上述5个位点进行两两组合，共构建10个双突变体表达菌株。对突变体蛋白进行纯化并进行活性测定，结果显示5个双突变体较第一轮单突变体酶活下降明显，其余5个突变体中H45D/P66A的酶活提升明显，比酶活达91.6U/mg，是野生型的2.1倍，具体结果如表4所示。
表4
选择酶活提升最明显的双突变体H45D/P66A分别与S42G、V178P、L205A进行组合构建三突变体S42G/H45D/P66A、H45D/P66A/V178P、H45D/P66A/L205A，
其中三突变体H45D/P66A/V178P的氨基酸序列为：
MPATVLVSGASGFIAQHIVRLLISKGYNVIGTFTYEIVPDISLPDAFDAVVQNHPEATIFLHTASAFHYKASDVEKELLLPALNGTINALSAIKKHGPQLKSVVVTSSYVAMWNYAKFYDPTHTDTETLWNPISWEDGKVDSEQGYYALKTFAEKAAWDFYKREKPTFDLNFVNPVLPFGPQAFDSGVSPELNASSEIINRLLKLGPEAKIPDFSSVFVDVRDVAKALIAAFEKGLSGERLLLYSSKFTNQDIIDIVHENFMELRNKLPVGNPGSGSLAIAKICTIDDSRTRQILVSERIGLKSSVIDTVRQILEKPKHL(SEQ ID NO.3)；
核苷酸序列为：
ATGCCCGCTACAGTTCTAGTATCAGGAGCATCCGGTTTTATTGCTCAGCACATTGTGCGCTTGCTAATTAGCAAGGGTTACAACGTGATCGGCACTTTCACGTACGAAATTGTTCCGGATATCAGCCTGCCGGACGCTTTCGACGCAGTTGTGCAGAATCATCCGGAGGCAACCATTTTTCTGCATACCGCGAGCGCGTTTCATTATAAAGCGTCTGACGTGGAAAAGGAGTTGTTGCTGCCGGCGCTGAACGGCACCATCAACGCTCTGAGCGCGATCAAAAAACACGGCCCTCAGCTGAAGAGCGTCGTGGTTACCAGCAGTTATGTTGCTATGTGGAATTATGCAAAGTTCTACGACCCGACCCACACGGATACCGAAACCCTGTGGAATCCCATCTCCTGGGAAGATGGTAAAGTGGATTCGGAACAAGGCTACTACGCCTTGAAGACCTTTGCAGAAAAGGCGGCCTGGGATTTTTACAAGCGCGAAAAACCGACGTTCGACCTGAACTTTGTGAACCCGGTGCTGCCTTTCGGTCCGCAAGCGTTCGATAGCGGGGTGTCCCCGGAGCTGAACGCGAGCTCCGAGATCATTAACCGTTTACTGAAACTGGGTCCAGAGGCTAAAATCCCGGACTTCAGCTCTGTTTTTGTTGACGTTCGTGATGTGGCGAAGGCCCTGATTGCGGCGTTCGAGAAAGGTCTGAGCGGCGAGCGCCTTCTGTTGTATAGCTCGAAGTTCACCAATCAGGATATCATTGATATCGTTCATGAAAACTTTATGGAGTTACGTAATAAACTCCCAGTTGGCAACCCGGGTAGCGGCTCTCTGGCAATCGCGAAAATCTGCACGATTGACGACAGCCGTACCCGTCAAATCTTGGTCTCCGAGAGAATTGGTCTCAAGTCTTCCGTCATCGACACCGTACGTCAGATCCTGGAAAAGCCGAAGCACCTG(SEQ ID NO.4)。
对突变体蛋白进行纯化并进行活性测定，比酶活如表5所示。可见三突变体酶活较野生型提升显著，三突变体H45D/P66A/V178P的酶活提升最明显，比活力达113.3U/mg是野生型的2.6倍。
表5
| 催化酶 | 比酶活(U/mg) |
| 野生型MpCR | 43.6 |
| S42G/H45D/P66A | 106.8 |
| H45D/P66A/V178P | 113.3 |
| H45D/P66A/L205A | 99.0 |
实施例6：纯酶的制备
将野生型MpCR及上述实施例中筛选得到的1株酶活提升最明显的三突变体的重组基因工程菌菌株：E.coli BL21(DE3)-28a-MpCR、E.coli BL21(DE3)-28a-H45D/P66A/V178P按照上述实施例4中描述的方法先进行发酵扩大培养得到粗酶，再进行酶的纯化及蛋白浓度测定。
同样由通用公司合成获得含有来源于巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶BmGDH(GeneBank登录号：WP_097824161.1)的重组表达基因工程菌E.coli BL21-28a-BmGDH，按照上述实施例4中描述的方法先进行发酵扩大培养得到BmGDH粗酶于4℃冰箱保存。
实施例7：温度和pH对野生型MpCR及突变体H45D/P66A/V178P酶活性的影响
7.1测定最适反应温度
使用pH5.0的磷酸钠缓冲配制反应溶液，按照实施例4中酶活检测方法，分别控制反应温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃，在不同温度条件下测定羰基还原酶的活性，将最高活力设定为100％，比较相对酶活。由图3可知，突变体H45D/P66A/V178P酶的最适反应温度为45℃，与野生型相同。最适反应温度也是酶可以耐受最高温度，且在这个高温下活性并不稳定，因此长时间的反应温度要降低，调整为35～40℃。
7.2测定最适pH值
使用不同pH值的缓冲液3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0配制反应溶液，按照实施例4中酶活检测方法，在40℃下测定羰基还原酶的活性，将最高活力设定为100％，比较相对酶活。由图4可知，突变体H45D/P66A/V178P酶的最适反应pH值为pH5.0，而野生型的为6.0。
实施例8：野生型及突变体H45D/P66A/V178P酶的耐酸性
取适量纯酶液，加入到不同pH值3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液中，4℃孵育2h后，按照实施例4中酶活检测方法，加入20mM N-Boc-3-哌啶酮启动催化反应，在40℃下测定羰基还原酶的活性，将未孵育处理的纯酶液的酶活力设定为100％，比较处理后的纯酶液的残余酶活。
结果如图5所示，野生型MpCR在pH3.0下孵育2h后，酶活迅速降低至40％以下，当突变体H45D/P66A/V178P在pH3.0-6.0的酸性环境下孵育2h后，残余酶活仍然保持85％以上，耐酸性得到显著提升。
实施例9：利用突变体H45D/P66A/V178P酶合成(S)-NBHP
使用气相(Agilent 7820A)测定底物及产物
样品萃取处理：①取600μl经适当稀释后的反应液样品置于1.5ml EP管中，加入等体积乙酸丁酯；②剧烈振荡混匀EP管内溶液；③对EP管离心12000rpm、5min分离有机与水相；④小心吸取中上层的乙酸丁酯过有机膜，进样分析。
N-Boc-3-哌啶酮与(S)-NBHP、(R)-NBHP手性分析条件：色谱柱：HYDRODEXβ-TBDAC毛细管柱(25m×0.25mm；anpel)；FID，220℃；载气，N2；柱温程序：130℃保持20min再10℃/min升至150℃保持8min；柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气0.1MPa，尾吹0.08MPa。进样量，1μl；进口温度220℃。
实验组反应：在500ml三角摇瓶内设置50ml双酶偶联催化体系，含100mM pH7.0磷酸钠缓冲(考虑到辅底物葡萄糖酸会迅速积累并降低反应液pH，反应体系的初始的pH要比最适pH5.0调高一点)，N-Boc-3-哌啶酮350g/L，葡萄糖472g/L，助溶剂乙酸丁酯16.5ml，加入8mg/ml突变体H45D/P66A/V178P粗酶液以及8mg/ml BmGDH粗酶液，在35℃下250rpm恒温摇床中反应8h，反应过程中每隔2h加入2M NaOH调控反应液pH至7.0；
对照组反应：在500ml三角摇瓶内设置50ml双酶偶联催化体系，含100mM pH7.0磷酸钠缓冲，N-Boc-3-哌啶酮350g/L，葡萄糖472g/L，助溶剂乙酸丁酯16.5ml，加入8mg/ml突变体H45D/P66A/V178P粗酶液以及8mg/ml BmGDH粗酶液，在35℃下250rpm恒温摇床中反应8h，反应过程中每隔0.5h加入2M NaOH调控反应液pH至7.0。
每隔1h取样使用气相测定底物及产物，监测反应过程，如图6所示，实验组仅仅只需2次pH调控最终也可以和对照组一样在6h结束反应，且底物N-Boc-3-哌啶酮的转化率为99％，光学纯度e.e.％为99.4％。因此耐酸性提高的突变体减少了pH调控次数以及碱性溶液的用量，简化了反应过程。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位、第45位、第66位、第178位和第205位中的至少一个氨基酸处的突变。
2.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第42位突变为甘氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第45位突变为天冬氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第66位突变为丙氨酸；如SEQID NO:1所示的氨基酸序列在第178位突变为脯氨酸；如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列在第205位突变为丙氨酸；优选地，所述羰基还原突变体的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
3.一种核酸分子，所述核酸分子包含：
(I)编码权利要求1～2任一项所述的羰基还原酶突变体的核苷酸序列；或
(II)与(I)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
4.一种重组载体，所述载体可表达权利要求1～2任一项所述的羰基还原酶突变体或含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种转化子，所述转化子含有权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求1～2任一项所述的羰基还原酶突变体和/或权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4所述的重组载体和/或权利要求5所述的转化子在以下任一项中的应用：
(I)合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶；
(II)制备合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的产品。
7.一种产品，包含权利要求1～2任一项所述的羰基还原酶突变体和/或权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4所述的重组载体和/或权利要求5所述的转化子。
8.一种羰基还原酶突变体的制备方法，通过培养权利要求5所述的转化子获得羰基还原酶突变体。
9.一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的制备方法，包括使用权利要求1～2任一项所述的羰基还原酶突变体和/或权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4所述的重组载体和/或权利要求5所述的转化子和/或权利要求6所述的产品制备(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将N-Boc-3-哌啶酮、葡萄糖、羰基还原酶突变体、葡萄糖脱氢酶混合反应，合成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118126972A true CN118126972A (zh) | 2024-06-04 |
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