JP6755515B2 - 糖質原料からの共重合ポリヒドロキシアルカン酸の製造法 - Google Patents
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Description
[1]ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えCupriavidus necator(クプリアヴィダス・ネカトール)株の染色体に、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として糖質及び/又はグリセロールを含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法。
[2]ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えC.necator株の染色体上のアセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子を欠失させた組換え株の染色体に、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として糖質及び/又はグリセロールを含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法。
[3]前記形質転換体において、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターの導入によって形質転換することをさらに含む、上記[2]に記載の方法。
[4]前記形質転換体において、エチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターの導入によって形質転換することをさらに含む、上記[2]及び[3]に記載の方法。
[5]C.necatorが、JMP134株(DSM4058)又はH16株(DSM428)である、上記[1]〜[4]に記載の方法。
[6]組換えC.necator株が、MF01株、NSDG株、又はNSDGΔA株である、上記[1]〜[5]に記載の方法。
[7]クロトニル−CoA還元酵素遺伝子が放線菌Streptomyces cinnamonensis(ストレプトミセス・シナモネンシス)由来である、上記[1]〜[6]に記載の方法。
[8]クロトニル−CoA還元酵素遺伝子が、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクロトニル−CoAからブチリル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記[7]に記載の方法。
[9]クロトニル−CoA還元酵素遺伝子がメタノール資化性菌Methylobacterium extorquens(メチロバクテリウム・エクストークエンス)由来である、上記[1]〜[6]に記載の方法。
[10]クロトニル−CoA還元酵素遺伝子が、
(a)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクロトニル−CoAからブチリル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記[9]に記載の方法。
[11](R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子が、C.necator由来であり、
(a)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化経路中間体である2−エノイル−CoAを(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記[1]〜[10]に記載の方法。
[12]エチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子が、
(a)配列番号4で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号4で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエチルマロニル−CoAを脱炭酸し、ブチリル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記[1]〜[11]に記載の方法。
上記の通り、本発明者らは、アセチル−CoAから3HBユニットと3HHxユニットを生成し、共重合する新規な代謝経路を開拓することによって、従来の植物油とは異なり、広く糖質やグリセロールを出発原料として上記課題を解決することに成功した。より具体的には、本発明は、P(3HH−co−3HHx)生産能を付与した組換えC.necator株の染色体に、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として糖質やグリセロールを含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、P(3HH−co−3HHx)を製造する方法、並びに該共重合体の生産量及び/又は該共重合体中の3HHxユニットの分率を向上させる方法に関する。なお、ここで、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子は、そのすべてが相同性組換えによって形質転換されているか、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターとして導入されていてもよいし、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子のうち、1つ又は2つの遺伝子が相同性組換えによって形質転換されていて、残りの遺伝子が前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターとして導入されている形態であってもかまわない。さらに、本態様において、C.necator株の染色体上のアセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子が欠失されていてもよい。
本発明の生産方法に使用される宿主は、PHA生産菌であるC.necatorである。特に、本発明の生産方法に使用されるC.necatorとしては、限定されないが、JMP134株(DSM4058)及びH16株(DSM428)が挙げられる。より具体的には、本発明においては、P(3HB−co−3HHx)生産能を付与した組換えC.necator株を用いることが好ましく、例えば、NSDG株、MF01株、及びNSDGΔA株を使用してもよい。
本発明によれば、P(3HB−co−3HHx)の生産量の向上、及び/又は3HHx分率の向上には、該共重合体の生産能を付与した組換えC.necator株に形質転換によってクロトニル−CoA還元酵素をコードする遺伝子(ccr)を導入させることが必要である。ここで、本明細書において使用される「クロトニル−CoA還元酵素」とは、脂肪酸β−酸化経路の中間体である炭素数4のクロトニル−CoAを還元し、β−ケトチオラーゼ(BktB)の基質となるブチリル−CoAを生成する酵素である。ブチリル−CoAがβ−ケトチオラーゼの作用によりもう1分子のアセチル−CoAと縮合し、さらに変換されることにより炭素数6の(R)−3HHx−CoAが供給され、広基質特異性を示すポリエステル重合酵素により(R)−3HB−CoAとともに共重合される。本発明において使用され得るccrは、翻訳後の該還元酵素が上記の活性を有する限り、生物種の由来は特に限定されないが、好ましくは、放線菌S.cinnamonensis由来のクロトニル−CoA還元酵素をコードする遺伝子(以下「ccrSc」と称することがある)又はメタノール資化性菌M.extorquens由来のクロトニル−CoA還元酵素をコードする遺伝子(以下「ccrMe」と称することがある)である。
本発明による共重合体の生産方法において、上記のクロトニル−CoA還元酵素をコード遺伝子が導入された宿主に、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼをコードする遺伝子(phaJ)をさらに導入してもよい。ここで、本発明に使用される「(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ」とは、脂肪酸β−酸化系中間体である2−エノイル−CoAをPHAモノマーである(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する酵素を意味し、この活性を有する限りにおいては、生物種の由来は特に限定されないが、好ましくは、C.necator株由来である。
本発明による共重合体の生産方法において、上記のクロトニル−CoA還元酵素をコード遺伝子が導入された宿主に、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼをコードする遺伝子(phaJ)に代えて又は該遺伝子に加えて、エチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子(emd)を導入してもよい。ここで、本発明に使用される「エチルマロニル−CoA脱炭酸酵素」とは、動物細胞においてプロピオニル−CoAカルボキシラーゼなどによる副反応で生じたエチルマロニル−CoAのブチリル−CoAへの脱炭酸反応を触媒する酵素を意味し、この活性を有する限りにおいては、生物種の由来は特に限定されない。
本発明の一態様によれば、アセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子を欠失させた組換えC.necator株を用いることが好ましい。「アセトアセチル−CoA還元酵素」とは、アセトアセチル−CoAを基質として(R)−3HB−CoAを生成する触媒機能を有する酵素であり、C.necatorにおいては、「PhaB1」、「PhaB2」、及び「PhaB3」が知られ、フルクトースでの増殖条件における上記の反応においては、PhaB1が主体となって機能するが、パラログであるPhaB3も機能することが報告されている(Budde,C.F.,et al.,J.Bacteriol.,192:5319−5328(2010))。上記の通り、本発明の一態様の生産方法に使用される組換えC.necator株として、アセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子を欠失させた株を使用することが好ましく、欠失させるアセトアセチル−CoA還元酵素をコード遺伝子としては、好ましくはphaB1又はphaB1及びphaB3であり、より好ましくはphaB1である。ここで、欠失させる遺伝子(phaB1とphaB3)の塩基配列は公知であり、例えば、それぞれNCBI−GeneID:4249784、NCBI−GeneID:4250155を参照することによって、これらの遺伝子のいずれか又はその両方を欠失させた組換えC.necator株を得るため利用することができる。本明細書において使用するとき、「欠失」とは、対象とする遺伝子の一部又は全部が、遺伝子操作によって存在しなくなった状態を意味し、その結果として、該遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の一部又は全部が失われることを意図する。なお、欠失の変異は、公知の部位突然変異誘発方法(Current Protocols in Molecular Biology 1巻,8.1.1頁,1994年)により、あるいは市販のキット(Takara社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット)を用いて誘発することができる。
本発明によれば、ccr、phaJ、及びemdを宿主の染色体に導入するための、これらの遺伝子の各々若しくはいずれかの組み合わせを相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクター、又は該遺伝子の各々若しくはいずれかの組み合わせを自律複製ベクターに組み込んだ発現ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Sambrook,J.ら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,1.1(2001)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、トーヨーボー社製等)を用いることもできる。
本発明によれば、P(3HB−co−3HHx)共重合体の合成は、該共重合体生産能を付与した組換えC.necator株の染色体にクロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を導入することによって、又は該共重合体生産能を付与した組換えC.necator株のアセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子を欠失させた組換え株の染色体にクロトニル−CoA還元酵素遺伝子を導入し、さらには(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子又はエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を導入することによって、該組換え株内又は培養物(例えば、培地)中に該共重合体を生成及び蓄積させ、組換え株又は培養物から目的とする該共重合体を採取することにより行われる。なお、当業者にも理解されるように、該共重合体を合成させるために、上記組換え株を適切な培養条件下に置くことが好ましい。このような組換え株の培養、遺伝子組換えを行う前の親株の培養条件に従ってもよい。また、本発明の特定の一実施形態において、炭素源として糖質及び/又はグリセロールを含有する培地中で組換え株を増殖させてもよい。
本発明において、共重合体は、下記の通り精製することができる:培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合体を抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合体を沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合体を得ることができる。その後、限定されないが、NMR(核磁気共鳴)、ガスクロマトグラフィーを用いて、得られた共重合体のモノマーユニットの組成比を確認することができる。
(1)宿主
C.necator野生株であるH16株は、P(3HB)生合成経路を構成するPHA重合酵素(PhaC)、β−ケトチオラーゼ(PhaA)、アセトアセチル−CoA還元酵素(PhaB1)をコードするphaCAB1オペロンを染色体上に有する。以前に作製したC.necator MF01株は、H16株のphaCAB1オペロン中のphaCをA.caviae由来のPHA重合酵素の変異遺伝子phaCNSDGに、phaAをC.necator由来の広基質特異性β−ケトチオラーゼの遺伝子bktBに置換した組換え株であり(図1)、大豆油を炭素源として2.6mol%の3HHxユニットを含むP(3HB−co−3HHx)を生合成可能である(国際公開WO2011/105379、Mifune,J.,et al.,Polym.Degrad.Stab.,95:1305−1312(2010))。以下、これらの株を用いて、P(3HB−co−3HHx)の生産量及び3HHx分率について検討した。なお、以下の実施例において、PCRは基本的にKOD Plus DNAポリメラーゼ(トーヨーボー社製)を用い、98℃で20秒、60℃で20秒、68℃で2分30秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行い、必要に応じて温度条件を適宜、調節した。
C.necator MF01株の染色体上でアセトアセチル−CoA還元酵素PhaB1をコードする遺伝子(phaB1)を欠失させるための相同性組換え用プラスミドpK18msbktBRは以下のように作製した。まず、C.necator H16株のゲノムDNA断片を鋳型として下記の配列1と配列2のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、C.necator由来のβ−ケトチオラーゼ(BktB)を増幅した。
配列1:TACATGGATCCAAGGGAGGCAAAGTCATGACGCGTGAAGTGGTAGTG(配列番号5)
配列2:GGATCATATGCTTCCTCAGATACGCTCGAAGATGGC(配列番号6)
増幅したbktB断片を制限酵素BamHIとNdeIで処理した。この制限酵素処理断片を、以前に作製された相同性組換え用プラスミドpK18msNSDG−R(phaCNSDGとphaB1下流領域が連結されたDNA断片を含む)(Mifune,J.,et al.,Polym.Degrad.Stab.,95:1305−1312(2010))を制限酵素BamHIとNdeIで処理した断片と連結することによりphaB1欠失用プラスミドpK18msbktBRを得た。
C.necator MF01株の染色体上でアセトアセチル−CoA還元酵素PhaB3をコードする遺伝子(phaB3)を欠失させるための相同性組換え用プラスミドpK18msΔphaB3は以下のように作製した。まず、C.necator H16株のゲノムDNA断片を鋳型として下記の配列3と配列4、及び配列5と配列6のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、C.necator株由来のphaB3の上流領域と下流領域をそれぞれ増幅した。
配列3:TTTGGAATTCTACCTAGGGATCAAATTAGAGGAAA(配列番号7)
配列4:CCTTACTGCATGTGCCTGCTTCATTCTCGTAAAGTTGAAAG(配列番号8)
配列5:GAATGAAGCAGGCACATGCAGTAAGGGTGCTGGG(配列番号9)
配列6:TCCTAAGCTTGCTGACCGTGATCGTCGACAACTTTGAAGACCTGA(配列番号10)
ここで、配列4と配列5には互いにオーバーラップする領域を付加してある。次に、増幅したphaB3の上流断片と下流断片を精製して混合し、配列3と配列6のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたフュージョンPCR法によってphaB3の上下流が連結された断片を増幅した。増幅したphaB3の上下流連結断片をEcoRIとHindIIIで処理した。この制限酵素処理断片を、EcoRIとHindIIIで処理したベクタープラスミドpK18mobsacBと連結することによりphaB3欠失用プラスミドpK18msΔphaB3を得た。
実施例1(2)で得られた組換えプラスミドpK18msbktBR、(3)で得られたpK18msΔphaB3を、C.necator MF01株に接合伝達により導入し、相同性組換えによって遺伝子が破壊された株を取得した。まず、塩化カルシウム法によって、作製したベクターを大腸菌S17−1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地(1%トリプトン、1%塩化ナトリウム、0.5%イーストエキス、pH7.2)3.0ml中で37℃終夜培養した。これと並行して、C.necator MF01株をNR培地(1%魚肉エキス、1%ポリペプトン、0.2%イーストエキス)3.0ml中で30℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液0.2mlに対して、C.necator MF01株の培養液0.1mlを混合し、30℃で6時間培養した。この菌体混合液を0.2mg/mlカナマイシンを添加したSimmons Citrate寒天培地(ディフコ社製)に塗布し、30℃で3日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドが、C.necatorに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmons Citrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からベクターが染色体に取り込まれたC.necator形質転換体(ポップイン株)である。さらに、ポップイン株をNR培地で30℃終夜培養した後、10%スクロースを添加したNR培地に塗布し、30℃で3日間培養した。pK18mobsacB由来ベクター上のsacBにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、10%スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株(ポップアウト株)のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上において標的部位での相同性組換えが生じた株をPCR法によって選抜した。pK18msbktBRを用いてMF01株を形質転換することでphaB1が欠失したMF01ΔB1株を、pK18msΔphaB3を用いてMF01株を形質転換することでphaB3が欠失したMF01ΔB3株を取得した。さらにpK18msΔphaB3を用いてMF01ΔB1株を形質転換することでphaB1とphaB3が二重欠失したMF01ΔΔB1B3株を取得した(図1)。
放線菌S.cinnamonensis由来クロトニル−CoA還元酵素遺伝子(ccrSc)を、C.necator細胞内で自律複製可能なプラスミドpBBR1−MCS2のlacプロモーター下流に配した発現ベクター、pBBR−ccrScを作製した。また、メタノール資化性菌M.extorquens由来クロトニル−CoA還元酵素遺伝子(ccrMe)をC.necator細胞内で自律複製可能なプラスミドpBBR1−MCS2のlacプロモーター下流に配した発現ベクター、pBBR−ccrMe、及びpBPPのphaP1プロモーター下流に廃した発現ベクター、pBPP−ccrMeを作製した。より具体的には、以下の通りである。
ccrScがすでに組み込まれたpJBccrEE32d13(Fukui,T.,et al.,Biomacromolecules,3:618−624(2002))を鋳型として下記の配列7と配列8のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、ccrScを増幅した。なお、ccrSc(配列番号1)はGTGを開始コドンとするが、配列7を用いたPCRによって開始コドンはATGに変換される。
配列7:ACGAATTCAGGAGGAACCTGGATGAAGGAAATCCTGGACG(配列番号11)
配列8:AGGTCTAGAGTGCGTTCAGACGTTGCGGA(配列番号12)
増幅したccrSc断片を制限酵素EcoRIとXbaIで処理した。この制限酵素処理断片を、pBBR1−MCS2を制限酵素EcoRIとXbaIで処理した断片と連結することによりccrSc発現用プラスミドpBBR−ccrScを得た。
M.extorquens AM1株のゲノムDNAを鋳型として下記の配列9と配列10のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、ccrMeを増幅した。
配列9:ACGAATTCAGGAGGAACCTGGATGGCTGCAAGCGCAGCACC(配列番号13)
配列10:AGGTCTAGATCACATCGCCTTGAGCGG(配列番号14)
増幅したccrMe断片を制限酵素EcoRIとXbaIで処理した。この制限酵素処理断片を、pBBR1−MCS2を制限酵素EcoRIとXbaIで処理した断片と連結することによりccrMe発現用プラスミドpBBR−ccrMeを得た。
M.extorquens AM1株のゲノムDNAを鋳型として下記の配列9と配列10のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、ccrMeを増幅した。
配列11:ATACATATGGCTGCAAGCGCAGCACCGGCCT(配列番号15)
配列12:TATGAATTCTCACATCGCCTTGAGCGGGCC(配列番号16)
増幅したccrMe断片を制限酵素NdeIとEcoRIで処理した。この制限酵素処理断片を、pBPPを制限酵素NdeIとEcoRIで処理した断片と連結することによりccrMe発現用プラスミドpBPP−ccrMe(図2)を得た。
C.necator H161株のゲノムDNAを鋳型として下記の配列11と配列12のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、phaJ4aを増幅した。
配列13:CCCAAGCTTTATCGTCAAGAGGAGACTATCG(配列番号17)
配列14:CCCAAGCTTGGATCCTCACCCGTAGCGGCGCGTGAT(配列番号18)
増幅したphaJ4a断片を制限酵素HindIIIで処理した。この制限酵素処理断片を、pBPP−ccrMeを制限酵素HindIIIで処理した断片と連結することによりccrMe及びphaJ4a共発現用プラスミドpBPP−ccrMeJ4a(図2)を得た。
まず、pBPP−ccrMeJ4aをEcoRIとHindIIIで切断し、末端平滑化後にセルフライゲーションすることで、ベクター上のEcoRIサイトからHindIIIサイトまでに領域が欠失したプラスミドを作製した。人工合成したemdMmが組み込まれたベクター(オペロン社により委託合成)からemdMmをBamHIで切り出し、上述のpBPP−ccrMeJ4a改変ベクターをBamHIで処理した断片と連結することにより、ccrMe、phaJ4a、emdMm共発現用プラスミドpBPP−ccrMeJ4a−emd(図2)を得た。
C.necator MF01株(図1)を宿主とし、pBBR1−ccrSc又はpBBR1−ccrMeを導入した組換え株を0.5%フルクトースを唯一の炭素源とする窒素源制限無機塩培地で培養したところ、いずれの株も蓄積PHAはP(3HB)であり、3HHxユニットは検出されなかった(表1)。
上述のように外来ccrの発現はPHA生産量の減少を伴うため、P(3HB−co−3HHx)生合成経路の改良を行った。(R)−3HB−CoA及び(R)−3HHx−CoAの両方の供給の強化を目的として、C.necator由来(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼの1つをコードする遺伝子(phaJ4a)を使用した。その発現産物であるPhaJ4aは、C4、C6のエノイル−CoAに対して(R)−特異的な水和反応を触媒することで(R)−3HB−CoA、(R)−3HHx−CoAを生成するが、C4よりC6のエノイル−CoAに対して高い活性を示すことが報告されている(国際公開WO2011/105379;Kawashima,Y.,et al.,Appl.Environ.Microbiol.,78:493−502(2012))。pBPP−ccrMeにphaJ4aを挿入した発現ベクターpBPP−ccrMeJ4a(図2)を作製し、C.necator MF01株、MF01ΔB1株、MF01ΔΔB1B3株をそれぞれ形質転換した。なお、本明細書中の「phaJ4a」は国際公開WO2011/105379に記載の(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼをコードする遺伝子「phaJ1Cn」に対応する。
C.necator野生株であるH16株はフルクトースやグルコン酸で良好に増殖しポリエステルを蓄積するが、グルコースでは増殖できず、またグリセロールを炭素源とした際の増殖は極めて遅い。グルコースはデンプンやセルロースを構成する単糖であり、グルコースの利用は植物由来バイオマス資源の利用の観点で重要である。また、グリセロールは近年、植物油からのバイオディーゼルの生産における副成生物として大量に生じており、その有効利用が望まれている。
(1)nagE変異及びnagR欠失用プラスミドベクターの作製
C.necator NSDG株へのグルコース資化能の付与はNagEの265番目グリシンからアルギニンへの置換、及びNagRの欠失により行った。NagEのアミノ酸置換は染色体上のnagE遺伝子793番目の塩基をグアニンからシトシンに置換する変異により導入した。このための相同性組換え用プラスミドpK18msNagE G265Rは以下のように作製した。まず、C.necator H16株のゲノムDNAを鋳型、下記の配列1と配列2のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、nagE遺伝子とその上下流それぞれ約1kbpを含む領域を増幅した。
配列15:GGAATTCTATTGAGGTGGCCGCGAATATCGGCAGCCT(配列番号19)
配列16:GGAATTCAGGTGCGCTTCGACAAGTCATACTTT(配列番号20)
増幅した断片の5’−末端をリン酸化し、汎用プラスミドpUC118のHincII部位に挿入した。このプラスミドを鋳型、下記の配列17と配列18のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースPCR法によって、nagE遺伝子の793番目塩基のグアニンをシトシンに置換する変異を導入した。
配列17:GGCCAACCAGCGCGCGCCCCGCCGGCGGCGTCTCGT(配列番号21)
配列18:GCATGCTGTTCTCGATGGCACTGACCT(配列番号22)
増幅した断片の5’−末端をリン酸化し、セルフライゲーションした。得られたプラスミドを制限酵素BamHIとXbaIで処理し、変異nagE遺伝子を含む断片を得た。この断片を、同じ制限酵素で切断したpK18mobSacBの断片と連結することによりpK18msNagE G265Rを得た。
配列19:TGCAGTTCGTATGCGACCGCATCGA(配列番号23)
配列20:GGAATTCAGGTGCGCTTCGACAAGTCATACTTT(配列番号24)
増幅した断片の5’−末端をリン酸化し、汎用プラスミドpUC118のHincII部位に挿入した。このプラスミドを鋳型、下記の配列21と配列22のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースPCR法によって、nagR遺伝子を含まない領域を増幅した。
配列21:TGCCCGGCACGCCCGGCAACCGGCGGCTCGA(配列番号25)
配列22:TGCGAATCCTCGTAGGTACCAGAGTGTGGA(配列番号26)
増幅した断片の5’−末端をリン酸化し、セルフライゲーションした。得られたプラスミドを制限酵素EcoRIとHindIIIで処理し、nagR遺伝子が欠失して上下流が連結された断片を得た。同じ制限酵素で切断したpK18mobSacBの断片と連結することによりpK18msΔnagRを得た。
C.necator NSDG株のグリセロール資化能の強化は、大腸菌由来のglpF−glpK(以下、glpFKとする)遺伝子をC.necator NSDG株の染色体上の機能未知遺伝子であるh16 A2858の上流に挿入することで行った。このための相同性組換え用プラスミドpK18msglpFK−A2858は以下のように作製した。まず、C.necator H16株のゲノムDNAを鋳型、下記の配列23と配列24のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、h16 A2858遺伝子の開始コドンの上下流それぞれ約750bpを含む領域を増幅した。
配列23:ATACCGTCGACGGTGCTGGCTCCGGAAGGTTT(配列番号27)
配列24:CTGCAGTCGACCCTGCGCGCCCACGCCGCTTT(配列番号28)
増幅した断片を制限酵素SalIで処理し、pK18mobSacBのSalI部位に挿入した。得られたプラスミドを鋳型、下記の配列25と配列26のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースPCR法によって、h16 A2858遺伝子の開始コドンで開環した断片を増幅した
配列25:GCGGGCAACGGATGGAGGTAAGCA(配列番号29)
配列26:CTTACCTCCATCCGTTGCCCGCTTCG(配列番号30)
配列27:ATGAGTCAAACATCAACCTT(配列番号31)
配列28:TTATTCGTCGTGTTCTTCCCAC(配列番号32)
増幅したglpFK遺伝子領域断片の5’−末端をリン酸化し、上記のインバースPCR法によってh16 A2858遺伝子の開始コドンで開環した断片と連結した。h16 A2858遺伝子の上流にglpFK遺伝子がh16 A2858遺伝子と同じ向きに連結されたプラスミドを選抜し、pK18msglpFK−A2858を得た。
C.necator NSDG株染色体上のphaオペロンからアセトアセチル−CoA還元酵素1をコードするphaB1Cn遺伝子を破壊するためのプラスミドpK18msAR2は、以前に作製したpK18msNSDG−AB(WO2011/105379)を基に、以下のように作製した。まずC.necator H16株のゲノムDNAをテンプレート、下記の配列29と配列30のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaB1Cn遺伝子下流の領域約1kbpを増幅した。
配列29:TCGACCGGCGCCGACTTCTC(配列番号33)
配列30:GCATGCCAGTGTCTTACTTCT(配列番号34)
得られたDNA断片を制限酵素NdeI及びSphIで処理し、同様に制限酵素NdeI及びSphIで切断したpK18msNSDG−ABのプラスミド骨格を含む断片と連結することでpK18msC’Rを得た。また、C.necator H16株のゲノムDNAをテンプレート、下記の配列31と配列32のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によって、制限酵素NdeIの認識配列を両末端に有するβ−ケトチオラーゼ遺伝子phaACnを増幅した。
配列31:CGCCGCATGACGCTTGCATA(配列番号35)
配列32:CCATATGCGGCCCCGGAAAACCCC(配列番号36)
得られたphaACn断片をNdeIで切断し、pK18msC’RのNdeI部位に挿入することでpK18msC’ARを得た。このプラスミドを制限酵素SbfI及びBamHIで切断することでphaCNSDG遺伝子を除去し、平滑末端化の後にセルフライゲーションを行うことでpK18msAR2を得た。
上記で作製したpK18mobSacBベースの相同性組換え用ベクターのC.necatorへの導入、及び相同性組換え株の選抜は実施例1と同様の方法で行った。NSDG株を初発の宿主とし、pK18msNagE G265R、pK18msΔnagR、pK18msglpFK−A2858、pK18msAR2を順次、接合伝達により導入して目的とする相同性組換え株を選抜することで、グルコース資化能付与・グリセロール資化能強化・PhaB1Cn欠失のC.necator NSDGΔB−GG株を作製した。さらに、P(3HB−co−3HHx)生合成経路を確立するためのプラスミドpBPP−ccrMe−phaJ4a−emdMmを接合伝達によりNSDGΔB−GG株に導入した。
作製した組換え株によるPHA生合成は1.0重量%のフルクトース、グルコース、グリセロールを唯一の炭素源とする窒素源制限無機塩培地で培養することにより行った。培養時間はフルクトース、グルコースの場合は72時間、グリセロールの場合は96時間とした。菌体内に蓄積されたPHAはガスクロマトグラフ法により蓄積率及び組成を決定した。
Claims (5)
- ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)生産能を付与した組換えCupriavidus necator(クプリアヴィダス・ネカトール)株の染色体に、又は前記染色体上のアセトアセチル−CoA還元酵素をコードする遺伝子を欠失させた組換え株の染色体に、クロトニル−CoA還元酵素遺伝子、(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子、及びエチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源としてグルコース若しくはフルクトース、及び/又はグリセロールを含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、ポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシヘキサン酸)を製造する方法であって、
ここで、前記クロトニル−CoA還元酵素遺伝子が、
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクロトニル−CoAからブチリル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり、
ここで、前記(R)−特異的エノイル−CoAヒドラターゼ遺伝子が、C.necator由来であり、
(a)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化経路中間体である2−エノイル−CoAを(R)−3−ヒドロキシアシル−CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり、
ここで、前記エチルマロニル−CoA脱炭酸酵素遺伝子が、
(a)配列番号4で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号4で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエチルマロニル−CoAを脱炭酸し、ブチリル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり、
ここで、前記ストリンジェントな条件が、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)を含む前洗浄溶液中で前洗浄し、40〜50℃で2×SSC〜6×SSC及び50%ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイズし、ならびに68℃で0.2×SSC及び0.1% SDSで洗浄することを含む上記方法。 - C.necatorが、JMP134株(DSM4058)又はH16株(DSM428)である、請求項1に記載の方法。
- 組換えC.necator株が、MF01株、NSDG株、又はNSDGΔA株である、請求項1又は2に記載の方法。
- クロトニル−CoA還元酵素遺伝子が放線菌Streptomyces cinnamonensis(ストレプトミセス・シナモネンシス)由来である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- クロトニル−CoA還元酵素遺伝子がメタノール資化性菌Methylobacterium extorquens(メチロバクテリウム・エクストークエンス)由来である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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