WO2024024966A1 - ペプチド合成酵素ライブラリー構築法 - Google Patents

Abstract

本開示は、新規のＮＲＰＳを作製する。本開示において、目的のＮＲＰを生産する機能を維持したままＮＲＰＳをコードする核酸に制限酵素認識配列を導入することに成功した。導入された制限酵素認識配列を利用して種々のＮＲＰＳが作製可能となる。一つの局面において、本開示は、非天然の制限酵素認識配列を含む、ＮＲＰＳをコードする核酸を提供する。別の局面において、本開示は、非天然の制限酵素認識配列を利用して、新規のＮＲＰＳをコードする核酸を効率的に作製する方法を提供する。また、本開示は新規のＮＲＰＳおよび新規のＮＲＰも提供する。

Description

ペプチド合成酵素ライブラリー構築法

　本開示は、改変型非リボソーム型ペプチド合成酵素（Ｎｏｎ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：　ＮＲＰＳ）およびその利用を提供する。本開示は、また改変型ＮＲＰＳをコードするプラスミドまたはプラスミドライブラリー、あるいはこれらを利用または作製する方法を提供する。本開示はまた、ＮＲＰＳから生産された非リボソーム型ペプチド（ＮＲＰ）も提供する。

　ＮＲＰＳは、特定の構造を有するペプチドを合成する酵素として知られる（非特許文献１）。ＮＲＰＳによるペプチド合成はリボソームに依らないので、非タンパク質性アミノ酸（オルニチン、Ｄ体のアミノ酸など）を含むペプチドの合成が可能であり、ＮＲＰに含まれ得るアミノ酸は８００種類以上存在することが知られている。ＮＲＰＳによって合成されるＮＲＰは、抗生物質や農薬など種々の分野において使用されている。新規のＮＲＰＳを開発し、効率的なＮＲＰ生産や、新規のＮＲＰの提供が望まれる。

Angew　Chem　Int　Ed　Engl.　2017　Mar　27;56(14):3770-3821.

　本発明者らは、目的のＮＲＰを生産する機能を維持したままＮＲＰＳをコードする核酸に制限酵素認識配列を導入することに成功した。導入された制限酵素認識配列を利用して種々のＮＲＰＳが作製可能となる。一つの局面において、本開示は、非天然の制限酵素認識配列を含む、ＮＲＰＳをコードする核酸を提供する。別の局面において、本開示は、非天然の制限酵素認識配列を利用して、新規のＮＲＰＳをコードする核酸を効率的に作製する方法を提供する。また、本開示は新規のＮＲＰＳおよび新規のＮＲＰも提供する。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物プラスミドを作製する方法であって、
　開始プラスミドのセットを準備する工程であって、前記開始プラスミドのセットの各々は、少なくとも１つのＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列および少なくとも１つの制限酵素認識配列を含む、工程と、
　前記開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、得られた切断核酸断片を複数含む混合物を調製する工程と、
　前記複数の切断核酸断片をライゲーションして連結核酸を形成する工程と、
　前記連結核酸を形質転換生物に接触させて生成物プラスミドを形成する工程と
を含む方法。
（項目２）
　前記複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む、前述の項目の方法。
（項目３）
　前記複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のアミノ酸を捕捉する前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目４）
　前記切断核酸断片の各々は、３～５塩基長の突出配列を有する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目５）
　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、隣接するＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列の間に位置する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目６）
　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間に位置する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目７）
　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間の領域であって、前記Ｃドメインコード領域および前記Ａドメインコード領域を含まない領域に位置する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目８）
　前記制限酵素認識配列の少なくとも１つが、前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列内に存在する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目９）
　前記制限酵素認識配列の少なくとも１つが、前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列外に存在する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１０）
　前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールにおいて非天然の配列である、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１１）
　前記切断核酸断片の各々が、最大１つのＮＲＰＳモジュールを含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１２）
　前記制限酵素認識配列は、制限酵素特異的認識部位とは異なる部位で切断される、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１３）
　前記制限酵素認識配列は、ＳｆｉＩ、ＢｇｌＩ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩまたはＢｓｐＱＩの認識配列を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１４）
　前記開始プラスミドの各々は、４～１２のＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１５）
　前記切断核酸断片を含む混合物を調製する工程において、前記開始プラスミドの各々は、互いに異なる突出配列を有する切断核酸断片を生じる、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１６）
　前記切断核酸断片を含む混合物が溶液である、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１７）
　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、選択マーカー配列を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１８）
　前記選択マーカー配列が、薬剤耐性マーカー配列を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１９）
　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、枯草菌において作動可能な複製起点を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目２０）
　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、前記ＮＲＰＳをコードする塩基配列の上流にプロモーター領域を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目２１）
　前述の項目のいずれかの方法によって作製された生成物プラスミドまたはプラスミドライブラリー。
（項目２２）
　前述の項目のいずれかの生成物プラスミドまたはプラスミドライブラリーから生産されるＮＲＰＳ。
（項目２３）
　前述の項目のいずれかのＮＲＰＳから生産されるＮＲＰ。
（項目２４）
　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸であって、
　少なくとも１つのＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列、および
　前記ＮＲＰＳモジュールにとって非天然の制限酵素認識配列
を含む、核酸。
（項目２５）
　前記制限酵素認識配列は、隣接する前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列の間に位置する、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目２６）
　前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間に位置する、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目２７）
　前記制限酵素認識配列は、ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間の領域であって、前記Ｃドメインコード領域および前記Ａドメインコード領域を含まない領域に位置する、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目２８）
　前記制限酵素認識配列は、任意の種類の塩基が存在し得る領域を内部に含む配列を認識する制限酵素の認識配列である、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目２９）
　前記制限酵素認識配列は、ＳｆｉＩの認識配列である、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目３０）
　前記核酸にコードされる前記ＮＲＰＳモジュールの数が、４～１２である、前述の項目のいずれかの核酸。
（項目３１）
　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物核酸を作製する方法であって、
　前述の項目のいずれかの核酸を開始核酸として準備する工程と、
　前記制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記核酸を処理して、切断核酸断片を調製する工程と、
　前記切断核酸断片をライゲーションして、前記開始核酸とは異なる生成物核酸を形成する工程と
を含む方法。
（項目３２）
　前述の項目のいずれかに記載の方法によって生産される生成物核酸。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　本開示によれば、効率的に新規ＮＲＰＳを作製でき、そうすることで効率的なＮＲＰ生産を可能とするＮＲＰＳや、新規のＮＲＰを提供するＮＲＰＳの提供が可能になる。

プリパスタチン（Ａ）およびそれを生産するＮＲＰＳ（Ｂ）の構造の概要を示す。Ａ：アデニル化ドメイン、Ｔ：チオール化ドメイン、Ｃ：縮合ドメイン、ＴＥ：チオエステラーゼドメイン、Ｅ：エピマー化ドメイン。 プリパスタチンＮＲＰＳモジュール間のＣ―Ａリンカー領域のアライメントおよびＳｆｉＩ認識配列導入サイト（四角囲み部分）を示す。 ＳｆｉＩ認識配列の導入の概要を示す。 ＯＧＡＢ法による単位ＤＮＡの集積の概要を示す。 プラスミドｐｐｓＷ０３およびｐｐｓＷ１０を各種制限酵素で処理した場合のゲル電気泳動バンドの比較を示す。 各株の培養液の抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示す。それぞれ（ａ）ＢＥＳＴ８６２８、（ｂ）ｐｐｓＷ０３／ＢＵＳＹ９２６１、（ｃ）ｐｐｓＷ１０／ＢＵＳＹ９２６１、（ｄ）ＢＵＳＹ９２６１の株の結果を示す。縦軸は、２０５ｎｍでの吸光度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。 ｐｐｓＷ０３／ＢＵＳＹ９６２１株の生産する物質の質量分析計による測定結果を示す。a～ｄがプリパスタチンのピークを示す。 各株のプリパスタチン生産量を示す。左からＢＥＳＴ８６２８、ｐｐｓＷ１０／ＢＵＳＹ９２６１、ｐｐｓＷ０３／ＢＵＳＹ９２６１の株の結果を示す。縦軸はプリパスタチン生産量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は培養時間（時間）を示す。 キメラＮＲＰＳ遺伝子の概要を示す。 ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ１から見出された新規キメラペプチドのＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。キメラペプチド１の結果である。 ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ２から見出された新規キメラペプチドのＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。キメラペプチド２の結果である。 ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ３から見出された新規キメラペプチドのＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。キメラペプチド３の結果である。 サーファクチン合成酵素へのＳｆｉＩ認識配列の導入の概要を示す。 Ｃｏｍｂｉ－ＯＧＡＢ法による多様なＮＲＰＳの構築の概要を示す。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「非リボソーム型ペプチド合成酵素」（本明細書においてＮＲＰＳとも称される）とは、ｍＲＮＡを必要とせずにアミノ酸を基質として使用してペプチド（これは非リボソーム型ペプチド（ＮＲＰ）と称され得る）を合成するタンパク質を指す。通常、複数分子のＮＲＰＳタンパク質が複合体を形成してペプチドを生産するが、本明細書では、ＮＲＰＳはタンパク質複合体を形成しなくてもよい。ＮＲＰＳ分子は端部に位置するＣＯＭドメインを介して他のＮＲＰＳに結合して、ＮＲＰＳタンパク質複合体を形成し得る。２０種類の必須アミノ酸以外に、オルニチンなどの非タンパク質性アミノ酸がＮＲＰＳの基質として使用される。ＮＲＰＳにより、脂肪酸または糖鎖などの非アミノ酸の修飾を有するペプチドおよび環状または分枝鎖ペプチドも合成され得る。ＮＲＰＳは、微生物においてシクロスポリンおよびバンコマイシンなどのペプチドの合成を担っていることが知られる。代表的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属（例えば、Ｘ．　ｂｏｖｉｅｎｉｉ、Ｘ．　ｂｕｄａｐｅｓｔｅｎｓｉｓ、Ｘ．　ｄｏｕｃｅｔｉａｅ、Ｘ．　ｉｎｄｉｃａ、Ｘ．　ｍｉｒａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｘ．　ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｘ．　ｓｔｏｃｋｉａｅ、Ｘ．　ｓｚｅｎｔｉｒｍａｉｉ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属（例えば、Ｔ．ｉｎｆｌａｔｕｍ、Ｔ．ｎｉｖｅｕｍ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属などの生物におけるＮＲＰＳが知られる。

　一つの実施形態において、あるタンパク質がＮＲＰＳであることは、あるタンパク質が、Ａ１コアモチーフ配列（Ｌ（ＴＳ）ＹｘＥＬ：配列番号４４）、Ａ２コアモチーフ配列（ＬＫＡＧｘＡＹＬ（ＶＬ）Ｐ（ＬＩ）Ｄ：配列番号４５）、Ａ３コアモチーフ配列（ＬＡＹｘｘＹＴＳＧ（ＳＴ）ＴＧｘＰＫＧ：配列番号４６）、Ａ４コアモチーフ配列（ＦＤｘＳ）、Ａ５コアモチーフ配列（ＮｘＹＧＰＴＥ：配列番号４７）、Ａ６コアモチーフ配列（ＧＥＬｘＩｘＧｘＧ（ＶＬ）ＡＲＧＹＬ：配列番号４８）、Ａ７コアモチーフ配列（Ｙ（ＲＫ）ＴＧＤＬ：配列番号４９）、Ａ８コアモチーフ配列（ＧＲｘＤｘＱＶＫＩＲＧｘＲＩＥＬＧＥＩＥ：配列番号５０）、Ａ９コアモチーフ配列（ＬＰｘＹＭ（ＩＶ）Ｐ：配列番号５１）、Ａ１０コアモチーフ配列（ＮＧＫ（ＶＬ）ＤＲ：配列番号５２）、Ｔコアモチーフ配列（ＤｘＦＦｘｘＬＧＧ（ＨＤ）Ｓ（ＬＩ）：配列番号５３）、Ｃ１コアモチーフ配列（ＳｘＡＱｘＲ（ＬＭ）（ＷＹ）ｘＬ：配列番号５４）、Ｃ２コアモチーフ配列（ＲＨＥｘＬＲＴｘＦ：配列番号５５）、Ｃ３コアモチーフ配列（ＭＨＨｘＩＳＤＧ（ＷＶ）Ｓ：配列番号５６）、Ｃ４コアモチーフ配列（ＹｘＤ（ＦＹ）ＡＶＷ：配列番号５７）、Ｃ５コアモチーフ配列（（ＩＶ）ＧｘＦＶＮＴ（ＱＬ）（ＣＡ）ｘＲ：配列番号５８）、Ｃ６コアモチーフ配列（（ＨＮ）ＱＤ（ＹＶ）ＰＦＥ：配列番号５９）、およびＣ７コアモチーフ配列（ＲＤｘＳＲＮＰＬ：配列番号６０）からなる群から選択されるモチーフを１つまたは複数含むことで判定され得る。好ましくは、ＮＲＰＳは、Ａ１～Ａ１０コアモチーフ配列、Ｔコアモチーフ配列、Ｃ１～Ｃ７コアモチーフ配列のうち連続する（例えば、Ａ８～Ａ１０コアモチーフ配列）モチーフ配列を同じ順番で含み得る。複数のモチーフ配列が含まれる場合、モチーフ配列全体の中に１～３の変異（例えば、保存的アミノ酸置換）が含まれていてもよい。

　本明細書において「非リボソーム型ペプチド（ＮＲＰ）」とは、ＮＲＰＳによって生産され得るまたは生産されたペプチドを指し、リボソームで合成できる（天然の２０種のアミノ酸からなる）ペプチドも含む。典型的には、ＮＲＰは、リボソームでは合成できないペプチドである。

　本明細書において、「ＮＲＰＳモジュール」とは、ＮＲＰＳの部分構造であり、原則としてＮＲＰＳにおいて１つのＮＲＰＳモジュールが１つのアミノ酸の結合に関与するが、アミノ酸以外の基質（βアミノ脂肪酸、βヒドロキシ脂肪酸、ポリケチドなど）の結合に関与する場合もある。典型的には、１つのＮＲＰＳモジュールは、１つのＡドメイン、１つのＴドメインおよび１つのＣドメインを含み、ＴＥなど他のドメインが含まれてもよい。Ａ、ＴおよびＣのいずれかのドメインをコードする領域の途中の部分が核酸分子断片の端に位置する場合、Ａ、ＴおよびＣのドメインのそれぞれの少なくとも一部をコードする領域が１つの核酸分子断片上に存在すれば、その核酸分子断片は１つのＮＲＰＳモジュールを含む。例えば、１つのＮＲＰＳモジュールは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（Ａ、ＴおよびＣ）、（Ｔ、ＣおよびＡ）、または（Ｃ、ＡおよびＴ）のドメインを含む。典型的には、１分子の核酸上に複数のＮＲＰＳモジュールがコードされる場合、同じ順番でＮ末端からＣ末端に向かってＡ、ＴおよびＣドメインを含む領域を１つのＮＲＰＳモジュールとして数えて最大の数が考慮される（例えば、Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｃのドメインをコードする核酸について、Ｔ－Ｃ－ＡまたはＣ－Ａ－Ｔを１つのＮＲＰＳモジュールとして数えた場合にはＮＲＰＳモジュールは２つとなるが、Ａ－Ｔ－Ｃを１つのＮＲＰＳモジュールとして数えた場合にはＮＲＰＳモジュールは３つとなるので、この場合のＮＲＰＳモジュール数は３つとなる）。本明細書において、典型的には、２つの制限酵素認識領域の間に１つのＮＲＰＳモジュールが配置される。Ａ、ＴおよびＣのうち１つまたは２つのドメインのみを有する領域は、不完全ＮＲＰＳモジュールと称され得る。

　本明細書において、「Ａドメイン」とは、ＮＲＰＳのアデニル化ドメインであり、特定のアミノ酸を捕捉し、このアミノ酸をＡＴＰなどにより活性化すると考えられている。Ａドメインは、約５００～５５０アミノ酸のサイズを有し、特定のアミノ酸に対する基質特異性を有すると考えられる。Ａドメインは、アミノ酸の結合ポケットを有する約４００アミノ酸のＡ_コアサブドメインと、触媒活性に関与するリジンを有するＡ_サブサブドメインの特定のアミノ酸に対する基質特異性を有すると考えられる。一つの実施形態において、Ａドメインは、Ａ１コアモチーフ配列（Ｌ（ＴＳ）ＹｘＥＬ）の上流７０アミノ酸から、Ａ１０コアモチーフ配列（ＮＧＫ（ＶＬ）ＤＲ）の下流４０アミノ酸までの領域を指し得る。

　本明細書において、「Ｔドメイン」（ＰＣＰドメインとも称される）とは、ＮＲＰＳのチオール化ドメインであり、このドメイン（のシステイン残基のチオール部分）は、Ａドメインから受け取ったアミノ酸を捕捉すると考えられる。Ｔドメインは、約７０～９０アミノ酸のサイズを有すると考えられる。一つの実施形態において、Ｔドメインは、Ｔコアモチーフ配列（ＤｘＦＦｘｘＬＧＧ（ＨＤ）Ｓ（ＬＩ））の上流２０アミノ酸から下流８０アミノ酸までの領域を指し得る。

　本明細書において、「Ｃドメイン」とは、ＮＲＰＳの縮合ドメインであり、Ｔドメインに捕捉されているアミノ酸に、前のＮＲＰＳモジュールに結合されたペプチドまたはアミノ酸を結合させる機能を有すると考えられる。Ｃドメインは、約４５０アミノ酸のサイズを有すると考えられる。一つの実施形態において、Ｃドメインは、Ｃ１コアモチーフ配列（ＳｘＡＱｘＲ（ＬＭ）（ＷＹ）ｘＬ）の上流２０アミノ酸からＣ７コアモチーフ配列（ＲＤｘＳＲＮＰＬ）の下流７０アミノ酸までの領域を指し得る。

　本明細書において、「ＴＥドメイン」とは、ＮＲＰＳのチオエステラーゼドメインであり、ＮＲＰＳからＮＰＲを放出させる機能を有すると考えられる。ＴＥドメインは、ＮＰＲを環状化させる機能を有する場合もある。

　本明細書において、「リンカー領域」とは、ＮＲＰＳのモジュール間やＮＲＰＳのドメイン間に存在する短い（例えば、２０アミノ酸長以下）領域を指す。リンカー領域は、モジュールおよびドメインの外延同士の間に存在するものであることから、これらのモジュールおよびドメイン等の外延を確定することにより確定することができる。

　本明細書において、２つの領域（例えば、ドメインをコードする核酸領域）の「間」(英語では”ｂｅｔｗｅｅｎ”という。）という記載は、その２つの領域自体も含む。典型的には、２つの領域の間は、一方の領域を構成するアミノ酸またはヌクレオチド残基の数（Ｎ）を２分する結合（Ｎが偶数の場合）またはアミノ酸もしくはヌクレオチド残基（Ｎが奇数の場合）から、他方の領域を構成するアミノ酸またはヌクレオチド残基の数（Ｍ）を２分する結合（Ｍが偶数の場合）またはアミノ酸もしくはヌクレオチド残基（Ｍが奇数の場合）までの領域を指す。

　本明細書において、２つの領域（例えば、ドメインをコードする核酸領域）の「境界」（英語では”ｂｏｕｎｄａｒｙ”という。）という記載は、ペプチドにおいて互いに隣接する２つのアミノ酸残基の間の結合またはポリヌクレオチドにおいて互いに隣接する２つのヌクレオチド間の結合であって、その２つの領域の間に存在するものを指す。一つの実施形態において、２つの領域の「境界」は、その２つの領域の間に存在し、その２つの領域の内部には存在しない。

　「非天然の」塩基配列とは、当該塩基配列にコードされるペプチド（ＮＲＰＳモジュールなど）を、それと最も高い同一性を示す天然の対応するペプチド（ＮＲＰＳモジュールなど）と比較した場合に異なるアミノ酸領域をコードする塩基配列を含む領域を指す。

　「制限酵素認識配列」とは、制限酵素の種類ごとに特異的な、制限酵素による核酸の切断のために必要な塩基配列を指す。制限酵素認識配列は任意の塩基（通常、モチーフにおいて「Ｎ」と表記される）を指定する部分を含んでもよい。特に、制限酵素認識配列のうちＧ、Ｃ、ＴまたはＡのどれか１つであることが必要である部分を、制限酵素認識特異的部位と称する場合がある。例えば、ＳｆｉＩ（モチーフ５’－ＧＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣＣ－３’）は２つの制限酵素特異的認識部位に挟まれた部位を切断し、ＡａｒＩ（モチーフ５’－ＣＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ／ＮＮＮＮ－３’）は制限酵素特異的認識部位から離れた部位を切断する。

　本明細書において使用する場合、「プラスミド」とは、細胞中で染色体とは別個に存在するか、または細胞に導入した場合に染色体とは別個に存在する環状ＤＮＡを指す。

　本明細書において「プラスミド複製を促進する核酸配列」とは、宿主細胞（例えば、枯草菌）に導入されたときに、宿主細胞内に存在するプラスミドの複製（この文脈においては、増幅と同じである。）を促進する任意の核酸配列をいう。好ましくは、このプラスミド複製を促進する核酸配列は、対象となるプラスミドをコードする核酸配列と作動可能に連結されているがこれに限定されない。プラスミド複製を促進する核酸配列、対象となるプラスミド、それらの関係などの詳細は、本明細書の別の箇所に記載される。プラスミド複製を促進する核酸配列としては、対象となる宿主細胞（例えば、枯草菌）において作動する複製起点を含む核酸配列などをあげることができる。例えば、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌におけるプラスミド複製の促進を可能にする能力を有するが、枯草菌以外の微生物（例えば、大腸菌）においてプラスミド複製の促進を可能にする能力をさらに有してもよい。枯草菌および他の生物（例えば、大腸菌）においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌および他の生物（例えば、大腸菌）の両方において同じ領域がプラスミド複製の促進のために利用される核酸配列でもよいし、離れた箇所に位置付けられる配列であってもよい。例えば、プラスミドｐＳＴＫ１（Issay　Narumtら、BIOTECHNOLOGY　LETTERS、Volume　17　No.5　(May　1995)　pp.475-480）、およびプラスミドｐＢＳ１９５（Molekuliarnaia　Genetikaら、01　May　1991,　(5):26-29、PMID:1896058）は、枯草菌および大腸菌の両方において同じ複製開始領域で複製可能であることが示されており、このような核酸配列は、枯草菌および大腸菌の両方においてプラスミド複製を促進する核酸配列として使用され得る。また、ＢＲ３２２（大腸菌プラスミド）およびｐＣ１９４（枯草菌プラスミド）を連結して作製されたシャトルプラスミド（P　Trieu-Cuotら、EMBO　J.　1985　Dec　16;4(13A):3583-3587.）、およびタカラバイオ（滋賀県）から提供されるｐＵＢｏｒｉおよびＣｏｌＥ１　ｏｒｉを含むＢ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍのプラスミドは、大腸菌および枯草菌の両方において複製可能であり、このような離れて位置付けられる核酸配列も、枯草菌および大腸菌の両方においてプラスミド複製を促進する核酸配列として使用され得る。

　枯草菌における核酸（プラスミド）の複製機構としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージによるものなどが挙げられ、枯草菌内で複製される配列としていずれの機構を利用するものでも使用することができる。ローリングサークル型の複製機構は、二本鎖ＤＮＡの片側の一本鎖の複製を行ったのち、もう一方の鎖の複製を行う機構であり、核酸が一本鎖ＤＮＡとして存在する時間が長いためプラスミドが不安定化になる傾向がある。シータ型の複製機構は、細菌染色体の複製の場合と同じように複製起点から２方向に同時に二本鎖ＤＮＡ（プラスミド）の複製が開始される機構であり、本開示のように長いＤＮＡ（例えば、１０ｋｂ以上）の複製の際には好ましく使用され得る（Janniere,　L.,　A.　Gruss,　and　S.　D.　Ehrlich.　1993.　Plasmids,　p.　625-644.　InA.　L.　Sonenshein,　J.　A.　Hoch,　and　R.　Losick　(ed.),　Bacillus　subtilis　and　othergram-positive　bacteria:　biochemistry,　physiology　and　molecular　genetics.American　Society　for　Microbiology,　Washington,　D.C.）。ｏｒｉＣの複製機構は、宿主細菌（例えば、枯草菌）染色体の複製の場合と同じように作動する。枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージなどによる複製機構を作動させることが公知である、プラスミドもしくはその部分または複製起点あるいはそれらの改変体などが挙げられる。ローリングサークル型プラスミドとして、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴ１８１などが公知であり、シータ型プラスミドとして、ｐＡＭβ１、ｐＴＢ１９、ｐＬＳ３２、ｐＬＳ２０などが公知である。

　枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列は、公知の複製開始点と同一または類似の配列（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の配列同一性）を有し得る。例えば、候補ＤＮＡ断片と、薬剤耐性遺伝子などの枯草菌で有効な選択マーカー遺伝子とを連結したＤＮＡ断片を枯草菌に導入した後、（薬剤などを添加して）培養した後に、これが染色体外で複製される場合、この候補ＤＮＡ断片は枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列を有すると判定できる。プラスミド増幅を促進する核酸配列は、複製開始点を有するＤＮＡ断片であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製可能なＤＮＡ断片を指す。これらのＤＮＡ断片が複製可能かどうかは、これらのＤＮＡ断片に薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を連結し、薬剤などの選択条件で培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、電気泳動によりそのＤＮＡのバンドを観察するなどの手法により確認することが出来る。プラスミドは、複製開始点の他に、プラスミドの娘細胞への分配を確実に行うための分配機構遺伝子、選択マーカー遺伝子などを含んでもよい。

　本明細書において使用する場合、「複製起点」は、その核酸配列を認識するタンパク質（例えば、イニシエーターＤｎａＡタンパク質など）が結合することや、ＲＮＡが合成されることで部分的にＤＮＡ二重らせんが解かれ、複製が開始される核酸配列のセグメントを指す。

　本明細書において、「形質転換生物」は、ＯＧＡＢ法において使用でき、非環状の長鎖核酸を取り込み、プラスミドを生成できる生物を指す。形質転換生物としては、自発的に核酸を取り込む微生物が使用できる。代表的な形質転換生物は、枯草菌である。

　本明細書において「枯草菌」とは、土壌や植物に普遍的に存在し、反芻動物やヒトの胃腸管に存在する、好気性のグラム陽性のカタラーゼ陽性の細菌であり、０．７～０．８×２～３μｍの大きさであり、中温性で、最適生育温度は２５～４０℃であり、芽胞を形成するとされ、学名Bacillus　subtilisまたはこれと近縁なBacillus属細菌であるBacillus　amyloliquefaciens、Bacillus　licheniformis、Bacillus　pumilusなどを含む、病原性を有せず、自然形質転換能を有する任意の細菌をさす。好ましい実施形態では、枯草菌は、Bacillus　subtilisの中で高い自然形質転換能を有する株であるMarburg　168株またはその派生株のRM125株である。168株は、遺伝的に最も研究されたグラム陽性菌であり、RM125株とともにATCC（American　Type　Culture　Collection）などから入手可能であり、それ自体は人畜無害であること、ＯＧＡＢ法が適応可能であることが判っていることなどからも、本開示において好適に使用され得る。

　本明細書において「反復配列」または「タンデムリピート」（な核酸配列）とは、生物ゲノムの核酸配列で、同じ配列が反復して（特に数回以上）見られるものの総称である。当該分野で使用される任意の反復配列を本開示において使用することができる。典型的には、プロモーター配列が反復して出現する。

　本明細書において使用する場合、「宿主細胞」とは、外来性の核酸またはタンパク質またはウイルスが導入される細胞（そのような細胞の子孫を含む）をさす。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、天然または人工的に改変されたポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。

　本明細書において「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。核酸の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡが挙げられる。この用語はまた、「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチド誘導体を含むか、またはヌクレオチド間結合が通常とは異なるポリヌクレオチドをいう。「ヌクレオチド誘導体」とは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて使用される通常のヌクレオチドとは異なる構造を有するヌクレオチドをいい、例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸(2'-O,4'-C-ethylene　bridged　nucleic　acid、ENA)などのエチレン核酸、その他の架橋核酸（bridged　nucleic　acid、BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol　nucleic　acid、HNA）、アミド架橋核酸（Amido-bridged　nucleic　acid、AmNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（例えば、米国特許第5,908,845号参照）、シクロヘキセン核酸（CeNA）などが挙げられる。ヌクレオチド間結合が通常とは異なる例として、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合などが挙げられる。

　他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る。例えば、特定のＮＲＰＳのＡドメインなど具体的な野生型配列に基づく改変体には、元となる配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸も含まれる。

　本明細書において「遺伝子」とは、一定の生物学的機能を果たす核酸部分を指す。この生物学的機能として、ポリペプチドまたはタンパク質をコードすること、タンパク質非コード機能性ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡなど）をコードすること、特定のタンパク質に特異的に結合されること、核酸の切断または複製を制御することが挙げられる。そのため、本明細書における遺伝子には、タンパク質またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡをコードする核酸部分以外にも、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、複製起点が含まれる。本明細書において「遺伝子産物」とは、遺伝子にコードされるポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡを指し得る。

　本明細書において使用する場合、遺伝子を「欠損する」とは、核酸がその遺伝子を含まないか、またはその遺伝子の正常な機能（例えば、機能的なタンパク質を生産する機能）を発揮しないように改変された遺伝子を含むことを指す。

　本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。

　本明細書において核酸の「相同性」とは、２以上の核酸配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの核酸の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。「類似性」は、同一性に加え、類似の塩基についても計算に入れた数値であり、ここで類似の塩基とは、混合塩基（例えば、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｂ＝Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｄ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）において、一部が一致する場合をいう。２種類の核酸が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの核酸配列を直接比較する場合、その核酸配列間で、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC－IUB　Biochemical　Nomenclature　Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST　2．10.1＋（2020.6.18発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。

　本明細書において「保存的アミノ酸置換」とは、ペプチドにおけるアミノ酸を別の性質の類似したアミノ酸に置き換えることを指し、ペプチドの性質は保存的置換の前後で類似であることが予測され得る。一つの実施形態において、保存的アミノ酸置換は、以下のアミノ酸の群におけるアミノ酸を同じ群内の別のアミノ酸で置き換えることである。
　・群１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン
　・群２：セリンおよびスレオニン
　・群３：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン
　・群４：リジン、ヒドロキシリジン、アルギニンおよびヒスチジン
　・群５：システイン、メチオニン、メチオニンスルホキシドおよびホモシステイン
　・群６：プロリンおよびヒドロキシプロリン
　・群７：グルタミン酸およびアスパラギン酸
　・群８：グルタミンおよびアスパラギン

　本明細書において、特に断らない限り、ある生物学的物質（例えば、タンパク質、核酸、遺伝子）についての言及は、その生物学的物質の生物学的機能と同様の機能（同じ程度でなくてもよい）を発揮するその生物学的物質のバリアント（例えば、アミノ酸配列に修飾を有するバリアント）についての言及でもあることが理解される。このようなバリアントには、元の分子のフラグメント、同一サイズの元の生物学的物質のアミノ酸配列または核酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる元の分子の配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である分子が含まれ得る。バリアントには、改変されたアミノ酸（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化またはリン酸化による改変）または改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化による改変）を有する分子が含まれ得る。

　本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。ストリンジェントな条件は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel　et　al.,　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Wiley　Interscience　Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular　Cloning　2nd　ed.,Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Supplement　1-38,　DNA　Cloning　1:Core　Techniques,　A　Practical　Approach,　Second　Edition,　Oxford　University　Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular　Cloning:A　Laboratory　Manual、第３番、Vol．１、７．４２－７．４５　Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press，2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。

　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。２つの配列の間でアライメントを行った結果、同じ位置に位置付けられる核酸またはアミノ酸は対応する核酸またはアミノ酸であり得る。

　本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。例えば、ある細菌における特定のアミノ酸の結合に関するＮＲＰＳモジュールに対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となるＮＲＰＳモジュールの遺伝子配列をクエリ配列として用いて目的の細菌の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

　本開示に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。

　本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な細胞表面構造認識能、酵素活性、特定のタンパク質との結合能等を挙げることができるがそれらに限定されない。本開示においては、例えば、あるプロモーターが特定の宿主細胞において認識される機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドの対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、宿主細胞における上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。

　本明細書において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入（必要に応じてウイルスまたはウイルス由来構築物を介した）を意味する。形質転換方法としては、宿主細胞に核酸を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、コンピテント化細胞の使用、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。

　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。

　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）であってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子およびこれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。

　本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、基材、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。

　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、ＮＲＰＳ由来構築物、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、プラスミド等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。

　用語「約」は、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。「約」が、温度について使用される場合、示された温度プラスまたはマイナス５℃を指し、「約」が、ｐＨについて使用される場合、示されたｐＨプラスまたはマイナス０．５を指す。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。

（改変ＮＲＰＳ）
　一つの局面において、本開示は、１つまたは複数の非天然の制限酵素認識配列を含む、改変ＮＲＰＳをコードする核酸を提供する。一つの実施形態において、本開示は、そのような核酸にコードされる改変ＮＲＰＳを提供する。発明者らは、ＮＲＰＳをコードする核酸に制限酵素認識配列を導入して、改変ＮＲＰＳを作製したが、この改変ＮＲＰＳは元のＮＲＰＳと同様に目的のＮＲＰを生産可能であることが見いだされた。制限酵素認識配列が導入されたことにより、ＮＲＰＳの改変が容易になり、種々のＮＲＰＳを作製することが可能になる。

　改変ＮＲＰＳは、１つまたは複数のＮＲＰＳモジュールを含み得る。各ＮＲＰＳモジュールは、独立して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属（例えば、Ｘ．　ｂｏｖｉｅｎｉｉ、Ｘ．　ｂｕｄａｐｅｓｔｅｎｓｉｓ、Ｘ．　ｄｏｕｃｅｔｉａｅ、Ｘ．　ｉｎｄｉｃａ、Ｘ．　ｍｉｒａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｘ．　ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｘ．　ｓｔｏｃｋｉａｅ、Ｘ．　ｓｚｅｎｔｉｒｍａｉｉ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属（例えば、Ｔ．ｉｎｆｌａｔｕｍ、Ｔ．ｎｉｖｅｕｍ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属などの生物に由来するＮＲＰＳモジュールであり得る。例えば、改変ＮＲＰＳにおける１つまたは複数のＮＲＰＳモジュールは、天然の（特定の生物種または株の）ＮＲＰＳモジュールと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。

　１つの生物種または株は、複数のＮＲＰＳモジュールを有し得るので、本開示の改変ＮＲＰＳは、１つの生物種または株に由来する複数のＮＲＰＳモジュールを特定の順番で組み合わせて含んでもよい。

　一つの実施形態において、ＮＲＰＳモジュールの各ドメイン（Ａドメイン、Ｔドメイン、Ｃドメインなど）は、同じ種類のアミノ酸の連結に関与する別の生物（種または株）に由来するＮＲＰＳモジュールの対応するドメインと置き換えてもよい。

　一つの実施形態において、本開示の改変ＮＲＰＳは、ＮＲＰＳモジュールのＡドメイン、ＴドメインおよびＣドメインの他に、ＣＯＭドメイン、ＴＥドメイン、Ｅ（エピマー化）ドメイン、Ｍ（メチル化）ドメイン、Ｒ（還元）ドメイン、Ｆ（ホルミル化）ドメイン、Ｃｙ（環状化）ドメイン、Ｏｘ（酸化）ドメイン、ＫＲ（ケトアシルレダクターゼ）ドメイン、ＭＯｘ（モノオキシゲナーゼ）ドメイン（例えば、Angew　Chem　Int　Ed　Engl.　2017　Mar　27;56(14):3770-3821.を参照のこと）などの他のドメインを含んでもよい。

　一つの実施形態において、本開示の改変ＮＲＰＳは、所望の数のＮＲＰＳモジュールを含んでもよく、例えば、３～１００、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００のＮＲＰＳモジュールを含み得る。

　一つの実施形態において、本開示の改変ＮＲＰＳをコードする核酸は、異なる生物（種または株）に由来するＮＲＰＳモジュールをコードする核酸配列の間に非天然の制限酵素認識配列を含み得る。一つの実施形態において、本開示の改変ＮＲＰＳをコードする核酸は、天然で隣接しないＮＲＰＳモジュールをコードする核酸配列の間に非天然の制限酵素認識配列を含み得る。

（制限酵素認識配列）
　一つの局面において、本開示のＮＲＰＳをコードする核酸は、１つまたは複数の非天然の制限酵素認識配列を含み得る。非天然の制限酵素認識配列の導入においては、塩基の挿入、欠失および置換が任意の組み合わせで使用され得る。非天然の制限酵素認識配列は、終止コドンが形成されないように導入され、コドンの読み枠がずれないように導入される。一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、嵩高くないアミノ酸（アラニン、グリシンなど）をコードするように設計されている。

　一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、ＮＲＰＳモジュールのアライメントにおいて、相同性が高いコンセンサス配列部分以外に導入するように設計されている。一つの実施形態において、ある生物株の有するＮＲＰＳモジュールのＡドメインからＣドメインまでの領域のアミノ酸配列を全て取得し、アライメントした場合に、対応するアミノ酸位置に同じアミノ酸が存在する割合が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えるアミノ酸位置を含まない３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長の領域に非天然の制限酵素認識配列が導入される。

　一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、Ａ１コアモチーフ配列（Ｌ（ＴＳ）ＹｘＥＬ）、Ａ２コアモチーフ配列（ＬＫＡＧｘＡＹＬ（ＶＬ）Ｐ（ＬＩ）Ｄ）、Ａ３コアモチーフ配列（ＬＡＹｘｘＹＴＳＧ（ＳＴ）ＴＧｘＰＫＧ）、Ａ４コアモチーフ配列（ＦＤｘＳ）、Ａ５コアモチーフ配列（ＮｘＹＧＰＴＥ）、Ａ６コアモチーフ配列（ＧＥＬｘＩｘＧｘＧ（ＶＬ）ＡＲＧＹＬ）、Ａ７コアモチーフ配列（Ｙ（ＲＫ）ＴＧＤＬ）、Ａ８コアモチーフ配列（ＧＲｘＤｘＱＶＫＩＲＧｘＲＩＥＬＧＥＩＥ）、Ａ９コアモチーフ配列（ＬＰｘＹＭ（ＩＶ）Ｐ）、Ａ１０コアモチーフ配列（ＮＧＫ（ＶＬ）ＤＲ）、Ｔコアモチーフ配列（ＤｘＦＦｘｘＬＧＧ（ＨＤ）Ｓ（ＬＩ））、Ｃ１コアモチーフ配列（ＳｘＡＱｘＲ（ＬＭ）（ＷＹ）ｘＬ）、Ｃ２コアモチーフ配列（ＲＨＥｘＬＲＴｘＦ）、Ｃ３コアモチーフ配列（ＭＨＨｘＩＳＤＧ（ＷＶ）Ｓ）、Ｃ４コアモチーフ配列（ＹｘＤ（ＦＹ）ＡＶＷ）、Ｃ５コアモチーフ配列（（ＩＶ）ＧｘＦＶＮＴ（ＱＬ）（ＣＡ）ｘＲ）、Ｃ６コアモチーフ配列（（ＨＮ）ＱＤ（ＹＶ）ＰＦＥ）、Ｃ７コアモチーフ配列（ＲＤｘＳＲＮＰＬ）の各アミノ酸配列中の大文字のアミノ酸で特定されるアミノ酸を変更することなく制限酵素認識配列を導入できる部位、あるいはこれらコアモチーフ配列のいずれにも該当しない部位に導入され得る。

　一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、隣接するＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列の間に位置する。一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間に位置する。一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、ＮＲＰＳモジュールのＡ、ＴおよびＣのうちの２つのドメインコード領域（例えば、Ｃドメインコード領域とＡドメインコード領域）の間の領域であって、これら２つのドメインコード領域を含まない領域に位置する。

　一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、２つの制限酵素特異的認識部位に挟まれた部位が切断される配列であり、例えば、ＴｙｐｅＩＩ制限酵素のＳｆｉＩ（５’－ＧＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣＣ－３’）、ＢｇｌＩ（５’－ＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣ－３’）、ＡｌｗＮＩ（５’－ＣＡＧＮＮ／ＣＴＧ－３’）、ＤｒａＩＩＩ（５’－ＣＡＣＮＮＮ／ＧＴＧ－３’）、ＰｆｌＭＩ（５’－ＣＣＡＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ－３’）、ＢｓｔＡＰＩ（５’－ＧＣＡＮＮＮＮ／ＮＴＧＣ－３’）などの認識配列である。一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、制限酵素特異的認識部位から離れた部位が切断される配列であり、例えば、ＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素のＡａｒＩ（５’－ＣＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ／ＮＮＮＮ－３’）、ＢｂｓＩ（５’－ＧＡＡＧＡＣＮＮ／ＮＮＮＮ－３’）、ＢｓａＩ（５’－ＧＧＴＣＴＣＮ／ＮＮＮＮ－３’）、ＢｓｍＢＩ（５’－ＣＧＴＣＴＣＮ／ＮＮＮＮ－３’）、ＢｓｐＱＩ（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＮ／ＮＮＮ－３’）などの認識配列である。制限酵素特異的認識部位が切断部位と異なることで、制限酵素処理により生じる核酸断片の突出配列が可変となるので、１種類の制限酵素による処理で複数種類の突出配列を形成できるため、ＴｙｐｅＩＩまたはＴｙｐｅＩＩＳの制限酵素は、複数種類の突出配列を利用する方法（ＯＧＡＢ法など）において好適に使用され得る。

　一つの実施形態において、非天然の制限酵素認識配列は、それを含むＮＲＰＳをコードする核酸を当該制限酵素認識配列を認識する制限酵素で処理した場合に、複数種類の切断核酸断片が同じ突出配列を有することがないように導入され得る。

　任意の種類の制限酵素認識配列が、任意の上記の非天然の制限酵素認識配列の導入部位に導入され得る。

（制限酵素認識配列を使用した新規ＮＲＰＳ作製）
　一つの局面において、本開示は、非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物核酸を作製する方法であって、非天然の制限酵素認識配列を含む核酸を開始核酸として準備する工程と、前記制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記核酸を処理して、切断核酸断片を調製する工程と、前記切断核酸断片をライゲーションして、前記開始核酸とは異なる生成物核酸を形成する工程とを含む方法を提供する。

　一つの実施形態において、切断核酸断片をライゲーションする工程において、ライゲーション反応を生じさせる混合物（溶液など）は複数種類の切断核酸断片を含み、複数種類の切断核酸断片は、複数種類の突出配列を有し、少なくとも一部の突出配列は非天然の制限酵素認識配列の切断によって生じる。複数種類の突出配列の中に相補的な突出配列の対があれば、相補的な突出配列を有する切断核酸断片同士が優先的にライゲーションされ得る。そのため、同じ種類の突出配列を有する複数種類の切断核酸断片が存在した場合、突出配列の種類により指定される位置にどの切断核酸断片が組み込まれるかはランダムとなり、ＮＲＰＳの特定の領域（例えば、１つのＮＲＰＳモジュール）を置き換えた改変ＮＲＰＳが容易に得られ得る。

　一つの実施形態において、複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む。一つの実施形態において、複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のアミノ酸を捕捉するＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む。一つの実施形態において、切断核酸断片の各々は、３～５塩基長の突出配列を有する。

　ＮＲＰＳにおいては１つのＮＲＰＳモジュールが１つのアミノ酸の連結に関与し得るので、切断核酸断片が整数個のＮＲＰＳモジュール（同数のＡドメイン、ＴドメインおよびＣドメイン）を含むことで、作製された改変ＮＲＰＳにより生産されるＮＲＰの設計が容易になり得る。一つの実施形態において、切断核酸断片の各々は、独立に、０～５（０、１、２、３、４または５）のＮＲＰＳモジュールを含む。一つの実施形態において、切断核酸断片の各々は、最大１つのＮＲＰＳモジュールを含む。

　一つの実施形態において、ライゲーション反応を生じさせる混合物において、同じ突出配列を有し、ＮＲＰＳモジュールの少なくとも一部をコードする切断核酸断片のセットは、ＮＲＰＳモジュールの対応する部位で切断されていることが好ましい。対応する部位とは、例えば、それぞれのＮＲＰＳモジュールのＡ－Ｔ間リンカー領域、Ａドメインの特定領域など、ＮＲＰＳモジュールのアミノ酸配列同士をアライメントした場合に２０アミノ酸以内（例えば、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸以内）だけ離れた位置であり得る。例えば、同じ突出配列を有する切断核酸断片にＡドメインコード領域で切断されたものとＴドメインコード領域で切断されたものが存在した場合、ライゲーションにより得られるＮＲＰＳコード核酸において、Ａドメインコード領域の連続した出現や、Ａドメインコード領域の欠失が生じ得るので、ＮＲＰの生産に失敗し得る。

　一つの実施形態において、切断核酸断片は、ＮＲＰＳモジュールのＣＯＭドメイン、ＴＥドメイン、Ｅ（エピマー化）ドメイン、Ｍ（メチル化）ドメイン、Ｒ（還元）ドメイン、Ｆ（ホルミル化）ドメイン、Ｃｙ（環状化）ドメイン、Ｏｘ（酸化）ドメイン、ＫＲ（ケトアシルレダクターゼ）ドメイン、ＭＯｘ（モノオキシゲナーゼ）ドメイン（例えば、Angew　Chem　Int　Ed　Engl.　2017　Mar　27;56(14):3770-3821.を参照のこと）などのドメインを含んでもよい。これらのドメインは、例えば組み込みたいアミノ酸の種類に応じて適宜当業者が選択できる。

　一つの実施形態において、ＮＲＰＳモジュールをコードする核酸を制限酵素で処理する場合に、当該核酸は当該制限酵素による天然の制限酵素認識配列を含んでもよく、この場合、当該核酸を当該制限酵素で処理することで生じる核酸断片の突出配列は、当該核酸断片と混合する他の核酸断片のいずれとも異なることが好ましい。同じ突出配列を有する核酸断片が他になければ、天然の制限酵素認識配列の切断により生じた核酸断片はライゲーションにより切断前の状態に戻り得る。

　一つの実施形態において、天然では隣接しないＮＲＰＳモジュール同士を連結させる場合は、各ＮＲＰＳモジュールが有するペプチド鎖を伸長する機能を害さない形で連結する必要があり、例えば、Ｃドメインは連結するアミノ酸を指定するのでこの機能を破壊しないようにする必要がある。

　一つの実施形態において、本開示は、非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物プラスミドを作製する方法であって、開始プラスミドのセットを準備する工程であって、前記開始プラスミドのセットの各々は、少なくとも１つのＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列および少なくとも１つの制限酵素認識配列を含む、工程と、前記開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、得られた切断核酸断片を複数含む混合物を調製する工程と、前記複数の切断核酸断片をライゲーションして連結核酸を形成する工程と、前記連結核酸を形質転換生物に接触させて生成物プラスミドを形成する工程を含む方法を提供する。一つの実施形態において、切断核酸断片を含む混合物が溶液である。

　一つの実施形態において、開始核酸の各々は、独立して同じまたは異なる、選択マーカー配列を含む。一つの実施形態において、選択マーカー配列は、薬剤耐性マーカー配列を含む。一つの実施形態において、開始核酸の各々は、独立して同じまたは異なる、枯草菌において作動可能な複製起点を含む。一つの実施形態において、開始核酸の各々は、独立して同じまたは異なる、ＮＲＰＳをコードする塩基配列の上流にプロモーター領域を含む。

　一つの実施形態において、開始プラスミドは、形質転換生物（枯草菌など）においてプラスミド複製を促進する核酸配列を含む。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌において作動する複製起点、例えば、ｏｒｉＣ、およびｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．　１３０，　１３９９－１４０８．　（１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ，　Ｔ　ａｎｄ　Ｏｇｒａ，　Ｍ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４２２，　２４３－２４６．　（１９９８））、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，　Ｔ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　８７，　７９－９０．　（１９９０））等のプラスミドに含まれる複製起点を含み得る。枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージなどによる複製機構を作動させることが公知である、プラスミドもしくはその部分または複製起点あるいはそれらの改変体などが挙げられる。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、公知の複製開始点と同一または類似の配列（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の配列同一性）を有し得る。

　一つの実施形態において、開始プラスミドは、枯草菌において作動するプロモーターおよび／またはエンハンサーを有し得る。例えば、枯草菌のプロモーターとして、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Ｙａｎｓｕｒａ，　Ｄ．　ａｎｄ　Ｈｅｎｎｅｒ，　Ｄ．　Ｊ．　Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ　８１，　４３９－４４３．（１９８４．））、あるいはＰｒプロモーター（Ｉｔａｙａ，　Ｍ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６３，　６０２－６０４．　（１９９９））等が挙げられる。枯草菌において作動する核酸エレメントは枯草菌に由来する必要はなく、高効率に作動するものなどが選択され得る。

　一つの実施形態において、本開示は、複数の核酸配列を作動可能に連結する工程を含む、本開示のＮＲＰＳ由来構築物プラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、枯草菌は外部から取り込んだ核酸からプラスミドを形成する能力を有し得るので、この方法において、導入する核酸はプラスミドでなくてもよい。例えば、枯草菌は、核酸（例えば、タンデムリピートな核酸配列を有する非環状核酸）と接触すると、この核酸を取り込み、枯草菌内でプラスミドを形成し得る（例えば、本明細書に記載のＯＧＡＢ法を参照のこと）。

　一つの実施形態において、枯草菌に核酸を導入する方法は、任意の方法であり得るが、例えば、コンピテントな枯草菌の使用、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。「コンピテント」とは、細胞が外来性の物質（例えば、核酸）に対してより透過性になった状態を指す。枯草菌をコンピテントにするためには、任意の公知の方法を使用することができるが、例えば、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，　Ｊ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　８１，　７４１－７４６（１９６１）に記載の方法を使用することができる。一つの実施形態において、本開示のＮＲＰＳ由来構築物プラスミドは、枯草菌において作製され、そのまま同じ枯草菌において増幅されてもよい。

　（ＯＧＡＢ法）
　一つの実施形態において、本開示のＮＲＰＳコードプラスミドまたはプラスミドライブラリーは、ＯＧＡＢ法によって作製され得る。ＯＧＡＢ（Ordered　Gene　Assembly　in　Bacillus　subtilis）法は、集積核酸を形質転換生物に取り込ませることでこの生物において環状のプラスミドを生成する方法である。ＯＧＡＢ法では、大きなサイズの核酸を含むプラスミドが簡便に調製され得る。形質転換生物に取り込ませる核酸を本明細書では「集積核酸」と呼び、典型的には、集積核酸は、同じ方向にプラスミドの１単位と、１セットの単位核酸とが繰り返し現れるようなタンデムリピート状の構造を有し、このような構造の集積核酸を使用することで、形質転換生物におけるプラスミドの生成が促進され得る。本明細書において「単位核酸」とは、集積核酸の配列を構成する一部の配列を有する核酸分子または核酸分子の部分を指し、以下で詳細に説明されるように、複数種類の単位核酸が単位ベクターとして調製され、その後集積核酸が構築される。

　以下で、形質転換生物に取り込ませるための集積核酸の作製手順を説明する。

・単位核酸の調製
　集積核酸に組み込むための単位核酸を調製する。単位核酸は任意の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。単位核酸は、所望のタンパク質（ＮＲＰＳなど）をコードする配列またはその部分、遺伝子を制御する配列（プロモーター、エンハンサーなど）、核酸を操作するための配列（制限酵素認識配列など）など任意の所望の配列を有し得る。集積核酸に組み込んだときに、複数種類の単位核酸が特定の順番および/または特性の方向に並ぶように、それぞれの単位核酸の末端は、特定の突出配列を生じるように構成され得る。

　最終的にプラスミド上に多数の単位核酸が集積され得るので、１つまたは複数の単位核酸は塩基長の長い１つまたは複数の遺伝子をコードするように設計されてもよい。塩基長の長い遺伝子としては、例えば、ＮＲＰＳ複合体を構成する遺伝子群などが挙げられる。

・単位ベクターの調製
　単位核酸と、それとは異なる付加核酸とを連結することで単位ベクターを調製することができる。単位ベクターを使用することで、単位核酸をより容易に取り扱うことが可能になり得る。

　付加核酸は、直鎖状核酸であってもよいし、環状のプラスミドであってもよい。環状のプラスミドを付加核酸として使用する場合、単位ベクターも環状構造を有し得るため、例えば、大腸菌等の形質転換に使用できる。一つの実施形態において、導入された宿主中で単位ベクターが複製されるように、付加核酸は複製開始点を含み得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための全ての単位核酸は、同一種類の付加核酸に連結してもよく、そうすることで単位ベクター間のサイズ差を小さくし、複数種類の単位ベクターの取り扱いが容易になり得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための単位核酸は、異なる種類の付加核酸に連結してもよい。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下または０．５％以下であり得る。付加核酸のサイズが単位核酸より大きいほど、異なる種類の単位ベクターのより均一な取り扱いが可能になり得る。単位核酸と付加核酸との連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション、ＴＡクローニング法など任意の方法で実施できる。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、１％以上、０．３％以上、０．１％以上、０．０３％以上、０．０１％以上、０．００３％以上または０．００１％以上であり得、単位ベクターの操作が容易になり得る。

　一つの実施形態において、単位核酸の長さは、１０ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上または１５００ｂｐ以上、かつ５０００ｂｐ以下、５０００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１２００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下または５００ｂｐ以下であり得る。

　一つの実施形態において、集積核酸は、２種以上、４種以上、６種以上、８種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、３０種以上、４０種以上、５０種以上、６０種以上、７０種以上、８０種以上、９０種以上または１００種以上、かつ１０００種以下、７００種以下、５００種以下、２００種以下、１２０種以下、１００種以下、８０種以下、７０種以下、６０種以下７０種以下または５０種以下の単位核酸から構築され得る。各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数がほぼ同一になるように調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。

　一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長を有してもよい。そうすることで、各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数を揃える操作が容易になり得る。一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長から３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下または５％以下の増大または減少した塩基長を有し得る。

　一つの実施形態において、単位核酸は、単位核酸の端部に非回文配列（パリンドローム配列でない配列）を有するように設計され得る。このように設計された単位核酸は、その非回文配列を突出配列にした場合、集積核酸において単位核酸が互いに順序を保ったまま連結した構造を容易に与え得る。

・集積核酸の作製
　集積核酸は、単位核酸を互いに連結することによって構築され得る。一つの実施形態において、単位核酸は、単位ベクターから制限酵素などによって切り出されることで調製され得る。集積核酸は、反復配列のセットを１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０つ以上含み得る。集積核酸における反復配列は、単位核酸の配列および必要に応じて集積ベクター核酸の配列を含み得る。集積核酸は、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列を有し得る。一つの実施形態において、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列は、形質転換生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌））中で有効な複製開始点を含み得る。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Imanaka,T.,　et　al.　J.Gen.Microbioi.　130,　1399-1408.(1984)）やｐＬＳ３２（Tanaka,　T　and　Ogra,　M.　FEBS　Lett.　422,　243-246.(1998)）、ｐＡＭβ１（Swinfield,　T.J.,　et　al.　Gene　87,　79-90.(1990)）等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。

　集積核酸は、単位核酸の他にも、必要に応じて追加の塩基配列を含んでもよい。一つの実施形態において、集積核酸は、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、ターミネーター等の転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿主とした場合のプロモーターとしては、具体的には、ＩＰＴＧ（isopropyl　s-D-thiogalactopyranoside）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Yansura,　D.　and　Henner,　D.J.　Pro.　Natl.　Acad.　Sci,　USA　81,　439-443.(1984.)）、あるいはＰｒプロモーター（Itaya,　M.　Biosci.　Biotechnol.　Biochem.　63,　602-604.(1999)）等が挙げられる。

　単位核酸は、集積核酸において一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸の突出末端の塩基配列が互いに相補的になるように単位核酸を構築することで、集積核酸における一定の順序および向きを保った繰り返し構造の形成が可能になり得る。一つの実施形態において、異なる単位核酸毎に突出末端の構造をユニークにすることで、効率的に一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、突出末端は、非回分配列を有してもよく、５’末端突出または３’末端突出のいずれであってもよい。

　一つの実施形態において、制限酵素を用いて単位ベクターから突出末端を有する単位核酸が切り出され得る。この実施形態において、単位ベクターは、１つまたは複数の制限酵素認識配列を有し得る。単位ベクターが複数の制限酵素認識配列を有する場合、それぞれの制限酵素認識配列は同じ制限酵素によって認識されてもよいし、異なる制限酵素によって認識されてもよい。一つの実施形態において、単位ベクターは、同じ制限酵素によって認識される１対の領域を、完全な単位核酸領域がこれらの領域の間に含まれるように含み得る。使用される制限酵素は、特に限定されないが、タイプＩＩ制限酵素、例えば、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＦｏｋＩ、ＳｆａＮＩなどが挙げられ、これらの制限酵素は、認識配列から一定距離離れた部位に突出末端を創出可能であり得る。（例えば単独の）タイプＩＩＳ制限酵素を用いると、切り出した単位核酸の突出末端の配列が単位核酸毎に異なり得るので、複数の単位核酸を一定の順序および向きで集積させるのに有利であり得る。タイプＩＩＳ制限酵素を使用する一つの実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域にそのタイプＩＩＳ制限酵素が認識する領域を含まない。認識領域を切断する制限酵素を使用する実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域の末端にその制限酵素が認識する領域を含み得る。

　一つの実施形態において、複数の単位ベクターから単位核酸を切り出すために同じ種類の制限酵素を使用する場合、この複数の単位ベクターを含む溶液中で制限酵素処理を行うことができ、作業の効率が向上し得る。ある集積核酸を作製するために使用する制限酵素の種類は、例えば、５種以下、４種以下、３種以下、２種以下または１種であり得、少ない種類の制限酵素を使用することで、単位核酸間のモル数のばらつきが低減され得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸は、アガロースゲル電気泳動など任意の公知の分画法により容易に精製され得る。

　単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸は、ＤＮＡリガーゼ等を用いて互いに連結（ライゲーション）することができる。これにより、集積核酸を作製できる。例えば、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸の連結は、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００など）および塩（例えば、１価のアルカリ金属、塩化ナトリウムなど）などの成分の存在下で実施することができる。ライゲーション反応液中の各単位核酸の濃度は、特に限定されず、１ｆｍｏｌ／μｌ以上などであり得る。ライゲーションの反応温度および時間は、特に限定されず、３７℃で３０分以上などである。一つの実施形態において、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を連結させる前に、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を含む組成物は、制限酵素を失活させる任意の条件に供されてもよい（例えば、フェノール・クロロフォルム処理）。

　単位核酸は、ＷＯ２０１５／１１１２４８に記載される方法などを使用して、ほぼ同じモル数に調整することができる。単位核酸をほぼ同じモル数に調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。単位ベクターまたは単位核酸の濃度を測定することで、単位核酸のモル数を調整することができる。

・集積核酸からのプラスミドの作製
　集積核酸を形質転換生物と接触させることで、形質転換生物においてプラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、形質転換生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）などが挙げられる。好ましい実施形態において、形質転換生物は枯草菌である。一つの実施形態において、集積核酸を取り込ませる形質転換生物は、コンピテント状態であり、能動的に核酸を取り込むことができる。例えば、コンピテント状態の枯草菌は、基質となる２本鎖核酸を細胞上で切断し、２本鎖の内のいずれかの１本鎖をこの切断点から分解し、他方の１本鎖を菌体内に取り込む。取り込まれた1本鎖は、菌体内で環状の２本鎖核酸に修復され得る。形質転換生物をコンピテント状態にするために、任意の公知の方法を使用できるが、例えば、枯草菌は、Anagnostopoulou,　C.　and　Spizizen,　J.　J.　Bacteriol.,　81,　741-746(1961)に記載の方法を用いてコンピテント状態にすることができる。形質転換の方法は、それぞれの形質転換生物に適した公知の方法を用いることができる。

　形質転換細胞から生産されたプラスミドは任意の公知の方法を用いて精製でき、本開示は、このように精製されたプラスミドも提供する。一つの実施形態において、精製したプラスミドが所望の核酸配列を有することは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンを調べること、ＰＣＲ法、塩基配列決定法などにより確認することができる。一つの実施形態において、本開示のプラスミドを含む枯草菌を提供する。

　一つの実施形態において、本開示は、本開示の方法により作製された種々のＮＲＰＳをコードするプラスミドライブラリーを提供する。一つの実施形態において、本開示は、本開示の方法により作製された種々のＮＲＰＳをコードするプラスミドを含む枯草菌のライブラリーを提供する。

　一つの実施形態において、本開示は、本開示の方法により作製されたＮＲＰＳをコードするプラスミドから生産されるＮＲＰＳを提供する。一つの実施形態において、本開示は、本開示の方法により作製された種々のＮＲＰＳをコードするプラスミドから生産されるＮＲＰＳのライブラリーを提供する。

（組成物）
　本明細書に記載のＮＲＰＳから作製されたペプチド（ＮＲＰ）、またはこれを含む組成物は、ペプチドに応じて治療、公衆衛生、生物工学など、種々の用途で使用することができる。一つの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＮＲＰＳから作製されたペプチド（ＮＲＰ）を含む組成物を提供する。組成物は、種々の形態で提供され得る。組成物の形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、吸入剤等であってもよい。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。

　一つの実施形態では、本開示の組成物は、薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポロキサマー、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E.W.Martin,　Remington’s　Pharmaceutical　Sciences(Mark　Publishing　Company,　Easton,　U.S.A)に記載される。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。本開示の組成物の任意の成分は、薬学的に許容しうる塩として提供することができる。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。

　試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。

　菌株
　遺伝子クローニング用の大腸菌には、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０、ＪＭ１０９を用いた。枯草菌の遺伝子組換えの宿主には１６８株の派生株を用いた。具体的には、プリパスタチンＮＲＰＳのＯＧＡＢ法による集積の際には、ｐｐｓＡＢＣＤＥと、ｓｒｆＡＡ、ＡＢ、ＡＣを欠損したＢＥＳＴ９７３１株を用いた。組換えＮＲＰＳ発現宿主には、ｐｐｓＡＢＣＤＥを欠損し、１６８株のｓｆｐ遺伝子欠損を相補したＢＵＳＹ９６２１株を用いた。ＢＲｅＴ法による、野生型ｐｐｓＡＢＣＤＥ遺伝子のクローニングには、プリパスタチンを生産するＢＥＳＴ８６２８株をそれぞれ用いた。

　培地
　ＬＢ培地は、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ　１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを１Ｌの水に溶解して調製し、寒天プレートの場合は、さらにＢａｃｔｏ　Ａｇａｒ　１５ｇを添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）して調製した。必要に応じて、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）、あるいはテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を加えて用いた。枯草菌形質転換用のＴＦ－Ｉ培地とＴＦ－ＩＩ培地は、以下のように作製した。まず、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（１Ｌあたり、１４０ｇ　Ｋ_２ＨＰＯ_４（無水）、６０ｇ　ＫＨ_２ＰＯ_４（無水）、２０ｇ　（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｇ　Ｎａ_３－クエン酸・_２Ｈ_２Ｏ）、５０％　グルコ－ス、２％　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２％　カザミノ酸、および水を、それぞれオートクレーブにより個別に準備した。またトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸の水溶液（５ｍｇ／ｍＬ）は、フィルター滅菌により準備した。１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎを５０ｍＬ、５０％　グルコ－ス、２％　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２％　カザミノ酸、５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸をそれぞれ５ｍＬずつ、最後に滅菌水４１５ｍＬを混合して、フィルター滅菌することでＴＦ－Ｉ培地（５００ｍＬ）を作製し、使用するまで４℃で保存した。２％　カザミノ酸を２．５ｍＬ、各アミノ酸溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＬ、滅菌水を４３５．５ｍＬにする以外は、ＴＦ－Ｉ培地と同様のものを使用して、フィルター滅菌することでＴＦ－ＩＩ培地（５００ｍＬ）を作製し、使用するまで４℃で保存した。枯草菌によるペプチド生産のためのＡＣＳ培地は、以下の様に作製した。培地１Ｌ当たり、スクロース　１００ｇ、クエン酸　１１．７ｇ、硫酸ナトリウム　４ｇ、酵母エキス　５ｇ、リン酸水素二アンモニウム　４．２ｇ、塩化カリウム　０．７６ｇ、塩化マグネシウム・６水和物　０．４２ｇ、塩化亜鉛　０．０１０４ｇ、塩化第二鉄・６水和物　０．０２４５ｇ、塩化マンガン・４水和物　０．０１８１ｇを溶解し、アンモニア水でｐＨ６．９に調整後、オートクレーブした。

　試験管内遺伝子操作
　他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９））に従って行った。

　枯草菌形質転換法
　Ｆａｌｃｏｎの１４ｍＬ試験管（２０５１）にＬＢ培地２ｍＬを入れ、そこに－７０℃で保存したグリセロールストックの枯草菌を植菌し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１７時間培養した。新しい１４ｍＬ試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５１）にＴＦ－Ｉ培地を９００μＬ分注し、２５μＬの２％　カザミノ酸を添加し、５０μＬの前培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で４時間培養した。その後、新しい１４ｍＬ試験管にＴＦ－ＩＩ培地を９００μＬ分注し、１００μＬのＴＦ－Ｉ培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１．５時間培養した。１．５ｍＬの遠心チューブにＴＦ－ＩＩ培養液を１００μＬ入れ、８μＬのＤＮＡを添加した。回転培養装置で回転しながら、３７℃で３０分培養した後、ＬＢ培地を３００μＬ添加し、さらに回転培養装置で回転しながら、３７℃で１時間培養した。その後、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地寒天プレートに広げて３７℃で一晩インキュベーションすることで、形質転換体を得た。

　ＰＣＲ法による単位遺伝子の増幅とプラスミドへのクローニング
　ＴＡＫＡＲＡ　Ｅｘ－Ｔａｑ用１０×酵素２．５μＬ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ溶液　２μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬのプライマーのセットをそれぞれ０．２５μＬ、鋳型となる枯草菌のゲノムＤＮＡ　１μＬ、滅菌水１６μＬ、Ｅｘ－ＴａｑＨＳ　０．５μＬを添加して、９４℃で５ｍｉｎインキュベーション後、９８℃で２０ｓｅｃ、５８℃で３０ｓｅｃ、７２℃、１ｍｉｎ／ｋｂを３０サイクル行うことでＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片に対して、ｐＣＲ－ＸＬ－ＴＯＰＯ　Ｋｉｔ（インビトロジェン）をマニュアルに従って用いた。あるいは、プラスミドｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ－ＸｃｍＩをＸｃｍＩで切断して作製したＴＡクローニングベクターによりＴＡクローニング法によりクローニングする際には、ＰＣＲ産物をＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔにより精製後、その１μＬを１０ｎｇ／μＬの上記ベクター断片１μＬと混合し、そこにＴＡＫＡＴＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ）Ｍｉｘ　２μＬを加え、１６℃で終夜インキュベーションした。このライゲーション溶液の４μＬを４０μＬの大腸菌ＤＨ５α、あるいはＪＭ１０９のケミカルコンピテントセルに添加して、氷上で１５ｍｉｎ恒温後、４２℃で３０ｓｅｃ熱ショックを与え、２ｍｉｎ氷上で放置後、ＬＢ培地を２００μＬ添加して、３７℃で１ｈ恒温後、カルベニシリンを１００μｇ／ｍＬの濃度で含む、１．５％寒天を含むＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することによりプラスミドの形質転換体を得た。

　大腸菌プラスミド精製と制限酵素切断
　望ましい配列を有するＤＮＡ断片をクローンするプラスミドを持つ大腸菌形質転換体をそれぞれ２ｍＬの１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン入りＬＢ培地で３７℃、１２０ｓｐｍ、一晩終夜培養し、得られた菌体に対して、ＱＩＡ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、マニュアルに従ってプラスミドを精製した。およそ２０μｇのプラスミドを含む４０μＬのＤＮＡ溶液に１０×Ｃｕｔ　ｓｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ　５０μＬ、ＳｆｉＩ制限酵素（ＮＥＢ）５μＬを添加し、５０℃、２ｈ反応させることにより単位ＤＮＡ断片をプラスミドベクターから切り離した。

　低融点アガロースゲルによるＤＮＡのサイズ分画
　制限酵素処理したＤＮＡ溶液を、１％の低融点アガロースゲル（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　Ａｇａｒｏｓｅ　ＴｙｐｅＶＩＩ，　シグマ社）で、１×ＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ）存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．Ｎ　核酸用電気泳動システム、コスモバイオ社）で、５０Ｖ（約４Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、１ｈ泳動することにより、プラスミドベクターと単位ＤＮＡを分離した。この泳動ゲルを、１μｇ／ｍＬの臭化エチジウム（シグマ社）を含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍＬで３０ｍｉｎ染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）で照らすことにより可視化することで、所定の大きさのＤＮＡ断片をカミソリで切り出し、１．５ｍＬチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に、１×ＴＡＥバッファーを添加することにより全体積を約７００μＬとし、これを６５℃、１０ｍｉｎ恒温することにより、ゲルを溶解した。その後、等量のＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク社）を添加し、良く混合することで制限酵素を失活した。遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μＬ）を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。ここに１－ブタノール（和光純薬工業社）を５００μＬ添加し、良く混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１－ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μＬ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μＬと、エタノール９００μＬを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿し、これを７０％エタノールでリンスして、２０μＬのＴＥに溶解した。

　ＤＮＡ濃度調整
　測定対象のＤＮＡをおよそ数ｎｇ／μＬの濃度に調整したもの２５μＬに、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）をＴＥで１／１２，５００に希釈したワーキング液を１２５μＬ添加して、良く混合することで測定サンプルとした。既知濃度のＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ　λ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ（２５０μｇ／ｍＬ））をＴＥで希釈することで３１．２５ｎｇ／μＬから２倍の希釈系列を１２段階作製し、これらの２５μＬに同様にワーキング溶液を１２５μＬ添加して、良く混合することで、スタンダード希釈系列とした。測定サンプルと希釈系列スタンダードを黒色の９６穴プレートに移し、蛍光プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　ＦＬ）で、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光強度を測定し、スタンダード希釈系列から作製した検量線により測定対象のＤＮＡ濃度を決定した。

　ＯＧＡＢ法による遺伝子集積
　遺伝子集積用ベクターおよび集積対象の各ＤＮＡ断片を１０ｆｍｏｌの等モルを含むように混合し、ＴＥで全体の体積を１０μＬに調整した。そこに２×ライゲーションバッファー（２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、１３２ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２０　ｍＭ　ＤＴＴ、０．２　ｍＭ　ＡＴＰ、３００　ｍＭ　ＮａＣｌ）を１１μＬ添加し、全体を３７℃で５ｍｉｎ間恒温した後、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。１０μＬを取って電気泳動することによりライゲーションされていることを確認後、これを１０μＬ新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを１００μＬ添加し、３７℃で３０ｍｉｎ、ダックローターで回転培養した。その後、３００μＬのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈ、ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。

　超遠心法によるプラスミドの大量調製
　培養終了後、５０ｍＬずつ５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）４本に分注し、５，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨てて、菌ペレットをボルテックスにより完全にほぐした。大腸菌の場合はＰ１　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）単独を使用し、枯草菌の場合は、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび１０ｍｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡを添加したＰ１　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）溶液を使用し、菌を入れたチューブ４本にそれぞれ５ｍＬずつ添加し、よく混合した。これを室温で５分間インキュベーションした。４本のチューブにそれぞれＰ２　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５ｍＬずつ添加し、ゆっくりと混合し、室温で５分間インキュベーションした。さらに、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５ｍＬずつ添加し、白濁物質が均等に分散できるようにある程度強い力で混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）に移した。それぞれのチューブに５ｍＬのフェノール飽和ＴＥを添加し、激しく混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）に移した。１００％エタノールをそれぞれ２０ｍＬ添加し混合して、５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に５．４ｍＬのＴＥを添加し、完全に溶解した。次に、６．４０ｇの塩化セシウムを投入し、完全に溶解した。更に、１．１ｇ／ｍＬの塩化セシウム溶液（１．１ｇの塩化セシウムと１ｍＬの水を混ぜて作製した溶液、体積調整せず）を２．６ｍＬ添加した。最後に、１０ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液を６００μＬ添加し、よく混合した。超遠心チューブ（ベックマン３６２１８１）１本に中身を移した。バランスとの重さの違いが２０ｍｇ以内になるように、水、あるいは１．１ｇ／ｍＬ塩化セシウム溶液（比重約１．５ｇ／ｍＬ程度）を添加して重さを微調整した。超遠心装置（ベックマンコールター）で以下の条件で遠心を行った。温度：１８℃、速度：５０，０００ｒｐｍ、加速度：Ｍａｘ、減速度：Ｍａｘ。１５時間以上遠心した。

　遠心終了後、紫外線（３６５ｎｍ）観察下で、針（２１Ｇ×５／８”）をセットした１ｍＬのシリンジをｃｃｃ型のプラスミドのバンドに挿し、プラスミド溶液を回収し、１５ｍＬチューブに移した。ここにＰ３を５００μＬ添加し、次に、全体が３ｍＬになるように水を添加した。さらに、９ｍＬの１００％エタノールを添加した。５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿に７００μＬのＴＥを添加し、ＤＮＡを溶解した。これを１．５ｍＬのチューブに移し、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μＬ以下になるまで続けた。水層が４５０μＬ以下になったら、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５０μＬ添加し、更にエタノールを９００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、得られたペレットＤＮＡを９００μＬの７０％エタノールでリンス後、２２μＬのＴＥに溶解した。

　分析ＨＰＬＣによるリポペプチドの分析
　培養液を５０ｍＬ遠心チューブに入れて、そこに１２Ｎ塩酸を加えてｐＨ２にし、発生した沈殿を９，１６０×ｇで１０ｍｉｎ遠心することによりペレットとして回収した。ここに、４ｍＬの９５％エタノールを添加し、マグネチックスターラーで１時間混合した後、９，１６０×ｇで１０ｍｉｎ遠心することにより、上清を回収した。これを０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通過させることにより、ＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣは、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－２［直径４．６ｍｍ　×　長さ２５０ｍｍ］；ｇＬサイエンス）を用いた。溶離液は、（Ａ）０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液、（Ｂ）０．０２％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル：イソプロピルアルコール＝７：３の有機溶剤の２種類を用いた。常に、２つの溶離液の合計が１ｍＬ／ｍｉｎとなるように流した。各溶離液の時間変化は以下の様になる。開始時（０分）は、Ａ＝６０％、Ｂ＝４０％で、以降直線的にＡが減少しＢが増加するように変化し、３０分後にＡ＝０％、Ｂ＝１００％となってから、そのままの状態を５ｍｉｎ維持した後、Ａ＝６０％、Ｂ＝４０％を１０ｍｉｎ維持した。検出は、２０５ｎｍの吸収で行った。

　大量分取用ＨＰＬＣによるペプチド精製
　５００ｍＬ三角フラスコに２００ｍＬのテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）添加ＡＣＳ培地を入れ、そこに植菌し、３０℃、１２０ｓｐｍで４日間培養した。培養液を１２Ｎ塩酸でｐＨ２に調整し、発生した沈殿を、９，１６０×ｇ、１０ｍｉｎの遠心により回収した。そこに、５００ｍＬの９５％エタノールを加え、攪拌により溶出後、０．４５μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）　１５０ｍＬ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ，　０．４５μｍ　１３．６ｃｍ²　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ａｃｅｔａｔｅ）を通過させることでろ過した。得られたろ液のうち、３００ｍＬをローターリーエバポレーターにより１００ｍＬまで濃縮した。再度、０．４５μｍのフィルターでろ過し、ローターリーエバポレーターにより、１０～１５ｍＬまで濃縮した。さらに、真空遠心濃縮器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ　Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）により濃縮後、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルター（ｈｔｓｌａｂｓ．ｃｏｍ，　Ｓｔａｎｄａｒｄ／　Ｆｉｌｔｅｒｖｉａｌ　ＰＴＦＥ　０．４５μＭ　Ｗ／Ｐｒｅ－ｓｌｉｔ　ｓｅｐｔｕｍ　Ｂｌｕｅ　ｓｎａｐ　ｃａｐ　ＰＫ１００）を通過させて大量分取ＨＰＬＣ用サンプルとした。フラクションコレクター（ＦＲＣ－１０Ａ）を有する島津製作所製ＨＰＬＣ装置に、カラムにＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，　Ｌｕｎａ（登録商標）　５μｍ　Ｃ１８（２）　１００Å，　ＬＣ　Ｃｏｌｕｍｎ　２５０　ｘ　１０ｍｍ，　Ｅａを搭載して、カラム温度４０℃、流速３ｍＬ／ｍｉｎの条件を用いた。溶離液は、分析用ＨＰＬＣと同じＡとＢを用い、ＡとＢの割合の時間変化も分析用ＨＰＬＣと同様の条件を用いた。検出は、２０５ｎｍを用いた。

　実施例１：プリパスタチンＮＲＰＳへのＳｆｉＩサイトの導入
　プリパスタチンは、枯草菌が生産する１０アミノ酸からなる環状リポペプチドで、ＮＲＰＳにより生合成される。プリパスタチンＮＲＰＳは、図１に示すようにＰｐｓＡ、ＰｐｓＢ、ＰｐｓＣ、ＰｐｓＤ、ＰｐｓＥの５つの酵素からなるが、それぞれ、２個、２個、２個、３個、１個の指定されたアミノ酸の伸長に関わる。ＰｐｓＡ－ＰｐｓＥ間には、全部で１０個のモジュールが存在しており、枯草菌ゲノム上でも同じ順序でＮＲＰＳ遺伝子が並んでいる。本実施例では、モジュールの境界となる、Ｃドメインと隣のモジュールのＡドメインとの間の領域（以後Ｃ－Ａリンカーと表現）のＤＮＡ配列中に制限酵素ＳｆｉＩサイトを導入した。まず、ＰｐｓＡ－ＰｐｓＥ間に存在する１０個のＣ－Ａリンカー領域のうち、Ｃドメイン中のＣ５コンセンサス配列（（ＩＶ）ＧｘＦＶＮＴ（ＱＬ）（ＣＡ）ｘＲ）とＡドメイン中のＡ１コンセンサス配列（Ｌ（ＴＳ）ＹｘＥＬ）の間のアミノ酸配列を収集し、これをｃｌｕｓｔｒａｌＷにより、マルチプルアライメント解析を行った（図２）。その結果、Ａ１コンセンサス配列からＣ５コンセンサス配列方向に２５アミノ酸離れた場所に、アミノ酸配列に多様性がみられる部分が存在するため、そこに注目した。ＳｆｉＩサイトは、５‘－ＧＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣＣ－３’（／は切断場所、Ｎは、Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ何れでもよい）は、１３塩基に及び、ＮＲＰＳコード領域中の最大で連続した５アミノ酸に影響を及ぼす。ＯＧＡＢ法を行う上で必要となる、各ＳｆｉＩ切断により生成する突出配列は相補鎖も考慮に入れた上で唯一の突出となる含む点、さらに突出の３塩基の配列中に最低限１塩基のＧあるいはＣ塩基を含む点を満たしながら、ＳｆｉＩサイトの導入によるコード領域アミノ酸配列の野生型配列からの変更を最小限にするために、以下のルールに従って改変するＤＮＡ配列を決定した（図３）。まず、ＳｆｉＩサイト１３塩基のうち、最もＣドメインに近いＧ塩基を、影響を与える可能性のある５つのアミノ酸のうち最上流のアミノ酸をコードするコドンの３番目の塩基に位置付けることで、同義語コドンへの変換の可能性を高めるようにした。２～４番目の塩基のＧＣＣにより、野生型のアミノ酸配列に関係なくアラニンをコードするようにした。５～７番目の塩基は、形成されることになる突出配列の特異性を担保しながらできるだけ野生型の配列に類似するようにした。８～１０番目の塩基は、形成されることになる突出配列の特異性を担保しながら野生型と同一アミノ酸をコードするように試み、それが困難な場合でもコドンの２番目の塩基が野生型と同じになるようにすることで、コードされるアミノ酸の疎水性・親水性が大きく変更されないように設計した。１１～１３番目の塩基は、野生型のアミノ酸配列に関係なくアラニンをコードするようにした。このような設計指針に基づいて、図３及び配列番号１～２２に示すように、プライマーの５’末端に設計したＳｆｉＩサイトが位置付けられるように設計したプライマーを使用して、野生型枯草菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ－ＸＬ－ＴＯＰＯ　ｋｉｔ（インビトロジェン）によりマニュアルに従って大腸菌ＤＨ５αにクローニングすることで、ｐｐｓ０１～ｐｐｓ０９のＤＮＡ断片を得た。最後のモジュールとなるｐｐｓ１０については、Ｃ－Ａリンカー中のｐｐｓ０９の接続部分（上流側）からｐｐｓＥ遺伝子の下流に存在する推定ρ因子非依存性ターミネーター配列（下流側）までを含むように増幅するプライマーを設計した。また、ｐｐｓ０１よりも上流のｐｐｓ００領域については、ｐｐｓ００とｐｐｓ０１との接続部分から、ｐｐｓオペロンのプロモーター領域を含むように増幅するプラマーを設計した。ｐｐｓ００断片およびｐｐｓ１０断片も同様にｐＣＲ－ＸＬ－ＴＯＰＯにクローニング後、ベクターへのクローニング方向を確認した後、ｐｐｓ００をクローニングするプラスミドのＳｐｅＩサイトに、ｐｐｓ１０をクローニングするプラスミドをＳｐｅＩとＸｂａＩで切断して得られるｐｐｓ１０を含む断片を連結し、ｐｐｓ００とｐｐｓ１０がゲノム中の位置関係を保持した状態で連結されたクローンを選択して、ｐＣＲ－ｐｐｓ００－ｐｐｓ１０を構築した。このプラスミドを制限酵素ＳｆｉＩで部分分解し、ｐｐｓ００がｐｐｓ１０と連結された４．３ｋｂのＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル電気泳動よりサイズ分画し、精製後、大腸菌－枯草菌のシャトルプラスミドベクターのｐＧＥＴＳ１０９ＤｒａＩＩＩのＤｒａＩＩＩクローニングサイトに連結し、ｐＧＥＴＳ１０９ＤｒａＩＩＩ－ｐｐｓ００－ｐｐｓ１０を構築した。このプラスミドをＳｆｉＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動によるサイズ分画により長いＤＮＡ断片を切り出し精製することで、ＯＧＡＢ法で使用可能なベクターＤＮＡ断片を得た。このベクターＤＮＡ断片と、ｐｐｓ０１からｐｐｓ０９のＤＮＡ断片をクローニングするプラスミドＤＮＡからＳｆｉＩにより切断して得られたｐｐｓ０１からｐｐｓ０９までの断片を等モル濃度になるように混合し、ＯＧＡＢ法により集積を行った（図４）。形質転換後、枯草菌をテトラサイクリン入りＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することにより、５７個の形質転換体を得た。ランダムに選択した、１２個のコロニーをテトラサイクリン入りＬＢ培地で培養後、プラスミドを少量精製し、ＳｆｉＩおよび他の制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動により切断パターンを解析した（図５）。その結果、１２個中５個が、ｐｐｓ００－ｐｐｓ０１－ｐｐｓ０２－ｐｐｓ０３－ｐｐｓ０４－ｐｐｓ０５－ｐｐｓ０６－ｐｐｓ０７－ｐｐｓ０８－ｐｐｓ０９－ｐｐｓ１０の連結を含むＤＮＡであった。このうちの一つをｐｐｓＷ０３と命名した（配列番号２３）。

　ＳｆｉＩサイトを導入したＮＲＰＳによるプリパスタチンの生産の確認
　ＮＲＰＳ生産宿主となるＢＵＳＹ９２６１を、ｐｐｓＷ０３で枯草菌コンピテントセル法により形質転換し、得られた株をｐｐｓＷ０３／ＢＵＳＹ９２６１と命名した。この株をテトラサイクリン入りＬＢ培地で前培養後、ＡＣＳ培地で３０℃で５日間培養した。この株の培養液の酸性沈殿物をエタノールで抽出して分析用ＨＰＬＣで分析したところ、野生株のＢＥＳＴ８６２８株のプリパスタチンと同じ保持時間にピークが観察された（図６）。大量分取用ＨＰＬＣによりこのピーク物質を回収し、質量分析を行ったところ、プリパスタチンを生産していることが確認された（図７）。ｐｐｓＷ０３と同様の配列を持つがＳｆｉＩサイトを有さない野生型のＮＲＰＳを有するプラスミドｐｐｓＷ１０は、ＳｆｉＩで切断したｐＧＥＴＳ１０９ＤｒａＩＩＩ－ｐｐｓ００－１０でＢＥＳＴ８６２８株を形質転換することで、ＢＲｅＴ法（Ｔｏｍｉｔａ，　Ｓ．，　Ｔｓｕｇｅ，　Ｋ．，　Ｋｉｋｕｃｈｉ，　Ｙ．，　Ｉｔａｙａ，　Ｍ．，　２００４．　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｇｅｎｏｍｅ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ．　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　７０，　２５０８-２５１３．を参照のこと）により構築した（図５）。これをＢＵＳＹ９２６１株に導入したｐｐｓＷ１０／ＢＵＳＹ９２６１株を比較対象として培養した。その結果、ｐｐｓＷ０３／ＢＵＳＹ９２６１株は、ｐｐｓＷ１０／ＢＵＳＹ９２６１株と同様のプリパスタチン生産量を示した（図８）。ＳｆｉＩサイトの導入がプリパスタチンの生産量に影響を与えないことが確認された。

　実施例２：キメラＮＲＰＳの構築
　実施例１で作製したプリパスタチンＮＲＰＳの第７番目のモジュールをコードするｐｐｓ０７断片、及び第８番目のモジュールをコードするｐｐｓ０８断片を、他のＮＲＰＳ由来のモジュールのＤＮＡ断片に置き換えることで新規組換えＮＲＰＳ遺伝子を構築した（図９）。枯草菌のサーファクチンＮＲＰＳのモジュールで置き換えた。サーファクチンＮＲＰＳの第４番目のモジュールをコードするｓｒｆ０７断片のために、実施例１での指針と同様にＡ１コンセンサス配列からおよそ２５アミノ酸上流の位置に、ｐｐｓ０７と同一の突出配列が形成されるようにＳｆｉＩサイトを設計した。また、サーファクチンＮＲＰＳの第５番目モジュールをコードするｓｒｆ０８断片についても同様に、Ａ１コンセンサス配列からおよそ２５アミノ酸上流の位置に、ｐｐｓ０８と同一の突出配列が形成されるようにＳｆｉＩサイトを設計した。実施例１と同様に、配列番号２４～２７のプライマーを用いて枯草菌１６８株ゲノムＤＮＡをテンプレートにしてｓｒｆ０７およびｓｒｆ０８のＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ－ＸＬ－ＴＯＰＯにクローニングした。得られたプラスミドをＳｆｉＩにより切断することにより、ｓｒｆ０７断片とｓｒｆ０８断片を取得した。

　キメラＮＲＰＳ遺伝子について、以下のキメラ１～３の３つのパターンを作製した（図９）。
　キメラ１：ｐｐｓ００－ｐｐｓ０１－ｐｐｓ０２－ｐｐｓ０３－ｐｐｓ０４－ｐｐｓ０５－ｐｐｓ０６－ｓｒｆ０７－ｐｐｓ０８－ｐｐｓ０９－ｐｐｓ１０（配列番号２８）
　キメラ２：ｐｐｓ００－ｐｐｓ０１－ｐｐｓ０２－ｐｐｓ０３－ｐｐｓ０４－ｐｐｓ０５－ｐｐｓ０６－ｐｐｓ０７－ｓｒｆ０８－ｐｐｓ０９－ｐｐｓ１０（配列番号２９）
　キメラ３：ｐｐｓ００－ｐｐｓ０１－ｐｐｓ０２－ｐｐｓ０３－ｐｐｓ０４－ｐｐｓ０５－ｐｐｓ０６－ｓｒｆ０７－ｓｒｆ０８－ｐｐｓ０９－ｐｐｓ１０（配列番号３０）

　これらのプラスミドは、枯草菌宿主ＢＥＳＴ８６６６株を用いてＯＧＡＢ法により集積した。正しく集積されたそれぞれのプラスミドを、ｐｐｓＡＢＣＤＥを欠損する枯草菌宿主ＢＵＳＹ９２６１株にコンピテントセル法で導入し、得られた株を、それぞれＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｉｍｅｒａ１、ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｉｍｅｒａ２、ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｉｍｅｒａ３と命名した。各株をＬＢ培地で前培養後、ＡＣＳ培地で５日培養して、分析ＨＰＬＣにより分析したところ、これらの株が、既知のプリパスタチンやサーファクチンとは異なる移動度の化合物を生産していることを確認した。より詳細な構造解析を行うため、大量培養を行い、その後、大量分取用ＨＰＬＣを行うことで、新規物質を精製した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる構造決定の結果、ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ１からは、
・キメラペプチド１：　β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－ＯＨ（配列番号６１）
ＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ２およびＢＵＳＹ９２６１／ｃｈｍｅｒａ３からは、
・キメラペプチド２および３：　β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－ＯＨ（配列番号６２）
のペプチドが生産されることが示唆された（図１０）。

　キメラ１～３のプラスミドにコードされるＮＲＰＳ遺伝子から予想されるペプチド産物は、
・キメラ１由来：　β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－ＯＨ（配列番号６３）（あるいは、このペプチドのＮ末端の脂肪酸鎖上の水酸基またはＮ末端に近い方のＴｙｒの水酸基と、Ｃ末端のカルボキシル基との間のラクトン環形成物）
・キメラ２由来：　β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－ＯＨ（配列番号６４）（あるいは、このペプチドのＮ末端の脂肪酸鎖上の水酸基またはＮ末端に近い方のＴｙｒの水酸基と、Ｃ末端のカルボキシル基との間のラクトン環形成物）
・キメラ３由来：　β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－ＯＨ（配列番号６５）（あるいは、このペプチドのＮ末端の脂肪酸鎖上の水酸基またはＮ末端に近い方のＴｙｒの水酸基と、Ｃ末端のカルボキシル基との間のラクトン環形成物）
であった。予想と異なり、導入したｓｒｆ０７もしくはｓｒｆ０８を境目として、その前半側は、サーファクチンＮＲＰＳ由来、後半側はプリパスタチンＮＲＰＳ由来の新規ペプチドとなっており、キメラペプチド２と３は、同一のペプチドであった。この原因は、ＢＵＳＹ９２６１に導入したキメラ１～３のプラスミドが、何らかの理由により宿主のゲノムＤＮＡ中に存在する野生型サーファクチンＮＲＰＳ遺伝子と、ｓｒｆ０７あるいはｓｒｆ０８の相同性を利用して組み込まれた結果であると想定される。いずれにしても、新規ペプチドが得られた。

　実施例３（仮想実施例）：サーファクチン合成酵素へのＳｆｉＩ認識配列の導入
　実施例１のプリパスタチンＮＲＰＳと同様に、Ｃドメインのコンセンサス配列のＣ１配列の上流２５アミノ酸の部分に図１１に示すように、制限酵素ＳｆｉＩの認識部位を導入する。ＯＧＡＢ法のための各ブロック（単位ＤＮＡ）を配列番号３１～４２に示すプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅する。遺伝子断片をｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ－３－ＡａｒＩにクローニングして、正しい塩基配列のクローンを準備する。実施例２で作製した単位ＤＮＡのｓｒｆ０７とｓｒｆ０８を含めた全単位ＤＮＡであるｓｒｆ００、ｓｒｆ０４～ｓｒｆ１０を準備し、実施例１と同様にＯＧＡＢ法によりｓｒｆ００－ｓｒｆ０４－ｓｒｆ０５－ｓｒｆ０６－ｓｒｆ０７－ｓｒｆ０８－ｓｒｆ０９－ｓｒｆ１０が連結した集積プラスミドをＢＥＳＴ９７３１株により構築する（配列番号４３）。このプラスミドはサーファクチンを生産する。

　実施例４：キメラＮＲＰＳライブラリーの構築
　実施例１で作製したプリパスタチンＮＲＰＳ遺伝子にＳｆｉＩサイトを導入したプラスミドｐｐｓＷ０３と、実施例３で作製するサーファクチンＮＲＰＳ遺伝子にＳｆｉＩサイトを導入したプラスミドｓｒｆ－ＳｆｉＩを使用して、ＷＯ２０２０／２０３４９６で示すＣｏｍｂｉ－ＯＧＡＢ法によりキメラプラスミドライブラリーを構築する。ｐｐｓＷ０３とｓｒｆ－ＳｆｉＩプラスミドを超遠心法により高純度に精製し、それぞれ１ｆｍｏｌずつを制限酵素ＳｆｉＩで切断し、フェノール処理、ブタノール処理、エタノール沈殿を行うことでＤＮＡ断片を精製する。得られたＤＮＡを混合し、２×ライゲーションバッファーとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて疑似タンデムリピート状に連結し、これをプリパスタチン、サーファクチンの量ＮＲＰＳを欠損したＢＵＳＹ９７３１にｓｆｐ遺伝子を搭載した枯草菌にコンピテントセル法で導入することにより、キメラＮＲＰＳライブラリーが構築できる（図１２）。

　実施例５：異なるサイトへの制限酵素認識部位の導入
　実施例１でプリパスタチンＮＲＰＳのＣ１コンセンサス配列から２５アミノ酸上流部分にＳｆｉＩサイトを導入したが、実施例５では、これとは異なりＣ３コンセンサス配列から下流に２５アミノ酸離れた場所に制限酵素ＰｆｌＭＩサイトを導入する。ＰｆｌＭＩが認識する３’－ＣＣＡＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ－５’（／は切断場所、Ｎは、Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ何れでもよいことを示す。）は、プリパスタチンＮＲＰＳ内には、１か所しかない。実施例１と同様にＰｆｌＭＩサイトを付加した各単位ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、大腸菌プラスミドベクターにクローニング後、ＰｆｌＭＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動により各単位ＤＮＡを精製する。これらの単位ＤＮＡ及びＯＧＡＢ集積用ベクターＤＮＡを等モル濃度に混合して、枯草菌ＢＥＳＴ９７３１株を用いてＯＧＡＢ法により遺伝子集積を行う。得られたプラスミドＤＮＡをＢＵＳＹ９６２１株に導入することにより、ＰｆｌＭＩサイトを導入したＮＲＰＳ遺伝子から生産されたプリパスタチンＮＲＰＳによるプリパスタチンが生産される。

　実施例６：イチュリンＮＲＰＳへの制限酵素サイトの導入
　枯草菌ＲＢ１４株が生産するイチュリンＡは、βアミノ脂肪酸と７つのアミノ酸が環状に連結したＮＲＰで、ｉｔｕＡ、ｉｔｕＢ、ｉｔｕＣの３つのＯＲＦにコードされるＮＲＰＳにより合成される。これら３つのＯＲＦはこの順番で連続しており、遺伝子の内部には、制限酵素ＳｆｉＩサイトは存在しない。イチュリンＡのＮＲＰＳのＣ１コンセンサス配列から２５アミノ酸上流部分にＳｆｉＩサイトを導入すべく、実施例１と同様にＳｆｉＩサイトを付加した各単位ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、大腸菌プラスミドベクターにクローニング後、ＳｆｉＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動により各単位ＤＮＡを精製する。これらの単位ＤＮＡ及びＯＧＡＢ集積用ベクターＤＮＡを等モル濃度に混合して、枯草菌ＢＥＳＴ９７３１株を用いてＯＧＡＢ法により遺伝子集積を行う。得られたプラスミドＤＮＡをＢＵＳＹ９６２１株に導入することにより、ＳｆｉＩサイトを導入したＮＲＰＳ遺伝子から生産されたイチュリンＡＮＲＰＳによりイチュリンＡが生産される。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２２年７月２９日に出願された特願２０２２－１２１８２２に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示によれば、効率的に新規ＮＲＰＳを作製でき、そうすることで効率的なＮＲＰ生産を可能とするＮＲＰＳや、新規のＮＲＰを提供するＮＲＰＳの提供を可能とし得る。

配列番号１：プライマー００－Ｆ
CGACTTGGCCGATGTGGCCCGGGAGACCTGTTTTCCAAGAG
配列番号２：プライマー００－Ｒ
TTTAGGGGCCGCCACGGCCGTCTTGTTAAACTCATACAACAATTTTTG
配列番号３：プライマー０１－Ｆ
CAAGACGGCCGTGGCGGCCCCTAAAGCTTTCACCCTGC
配列番号４：プライマー０１－Ｒ
TTGAGCGGCCTCAACGGCCGTTTTGTTAAATTCAAAGACTATTTTTTGTT
配列番号５：プライマー０２－Ｆ
CAAAACGGCCGTTGAGGCCGCTCAAAAAGATATTCCTTTTCATCGC
配列番号６：プライマー０２－Ｒ
GTTCACGGCCGGACGGGCCGTTTCGTTAAACAATTGGATAACCTGTTG
配列番号７：プライマー０３－Ｆ
CGAAACGGCCCGTCCGGCCGTGAACAAAACGATACCCCAATTG
配列番号８：プライマー０３－Ｒ
TCTCGGGGCCAGGGCGGCCTGCCCCATTTTTTCAAGGAGTAAC
配列番号９：プライマー０４－Ｆ
GGGGCAGGCCGCCCTGGCCCCGAGAAATGAAAACATAGTAAGC
配列番号１０：プライマー０４－Ｒ
TTCAGGGGCCACACTGGCCGTCCTGTTATTTTGAGAAACGATTTTCC
配列番号１１：プライマー０５－Ｆ
CAGGACGGCCAGTGTGGCCCCTGAAGCCCCAACC
配列番号１２：プライマー０５－Ｒ
TCTTGGGGCCTCTATGGCCGTACGATTGAGCTCGTGG
配列番号１３：プライマー０６－Ｆ
TCGTACGGCCATAGAGGCCCCAAGAAATGAAACCATCAGCAG
配列番号１４：プライマー０６－Ｒ
GGTTTCGGCCACTGGGGCCTGATCTGTGATTTCTCCAATCAGC
配列番号１５：プライマー０７－Ｆ
AGATCAGGCCCCAGTGGCCGAAACCATCCATGCCATGTTTG
配列番号１６：プライマー０７－Ｒ
TGAATAGGCCGTCACGGCCAACAGATGGCATGATTCAATGAAATCTC
配列番号１７：プライマー０８－Ｆ
TCTGTTGGCCGTGACGGCCTATTCAATGAATCAAACGCTCCACTATG
配列番号１８：プライマー０８－Ｒ
TCCGTAGGCCTTCGCGGCCCCGGTGTTAAACTCATTAAGCAG
配列番号１９：プライマー０９－Ｆ
CACCGGGGCCGCGAAGGCCTACGGAGTTCAAACAATCAGTCAATTG
配列番号２０：プライマー０９－Ｒ
CTTTGGGGCCTCCGTGGCCGTATTGTTGAACTGTGTGACAATCTG
配列番号２１：プライマー１０－Ｆ
CAATACGGCCACGGAGGCCCCAAAGAATCATACAATTATCGATTTATTTC
配列番号２２：プライマー１０－Ｒ
AAGCTTGGCCAAGACGGCCATACAAAAAGAAAGACGGACAGAGAATGGC
配列番号２３：ｐｐｓＷ０３
配列表に記載の通り。
配列番号２４：プライマーｓｒｆ０７－Ｆ
CAGCACGGCCGCAGAGGCCCCTGAAGGAATGGCTGTTCAC
配列番号２５：プライマーｓｒｆ０７－Ｒ
GGTTGCGGCCGTCATGGCCGTCATATGTCTTTCTTCTAGCAAAGCAGC
配列番号２６：プライマーｓｒｆ０８－Ｆ
TATGACGGCCATGACGGCCGCAACCTTTGCAGCACTTTTTGAAAAACAG
配列番号２７：プライマーｓｒｆ０８－Ｒ
TGTCGGGGCCGTCGGGGCCTTGCCCTTCCATGCCTCAAGAAGC
配列番号２８：キメラ１
配列表に記載の通り。
配列番号２９：キメラ２
配列表に記載の通り。
配列番号３０：キメラ３
配列表に記載の通り。
配列番号３１：プライマーｓｒｆ００－Ｆ
TAGGGCCGATGTGGCCCAAAAATGTCATGAAAGAATCGTTGTAAGACGCTC
配列番号３２：プライマーｓｒｆ００－Ｒ
CTTACGGGCCCCCACGGCCTTACCGCCGGCCCTCG
配列番号３３：プライマーｓｒｆ０４－Ｆ
CGGTAAGGCCGTGGGGGCCCGTAAGGACATGACGATACCAGAG
配列番号３４：プライマーｓｒｆ０４－Ｒ
TTTCGGGGCCGCACTGGCCCCCGGGTTAAACTGCTGAATTTGC
配列番号３５：プライマーｓｒｆ０５－Ｆ
CCCGGGGGCCAGTGCGGCCCCGAAAGATAAAACAATTGTTCAGCTGTTTGAG
配列番号３６：プライマーｓｒｆ０５－Ｒ
TGTCGGGGCCGCTAGGGCCTTGCCCTTCCAAGCCTCAAGAAG
配列番号３７：プライマーｓｒｆ０６－Ｆ
GGGCAAGGCCCTAGCGGCCCCGACAGACAAAACGGTTCATCAGC
配列番号３８：プライマーｓｒｆ０６－Ｒ
TTCAGGGGCCTCTGCGGCCGTGCTGTTAAACACCTCGACAATTTG
配列番号３９：プライマーｓｒｆ０９－Ｆ
GGGCAAGGCCCCGACGGCCCCGACAGACAAAACGGTTCATCAG
配列番号４０：プライマーｓｒｆ０９－Ｒ
TGTTTCGGCCGCCGGGGCCGGCGGGTTTAAGCC
配列番号４１：プライマーｓｒｆ１０－Ｆ
CCCGCCGGCCCCGGCGGCCGAAACAAAGCCTCTGACGTATTGG
配列番号４２：プライマーｓｒｆ１０－Ｒ
TAGGGCCAAGAAGGCCTTATGAAACCGTTACGGTTTGTGTATTAAGAAATTCGA
配列番号４３：ｓｒｆＡＡ－ＡＣ
配列表に記載の通り。
配列番号４４：Ａ１コアモチーフ配列
Ｌ（ＴＳ）ＹｘＥＬ
配列番号４５：Ａ２コアモチーフ配列
ＬＫＡＧｘＡＹＬ（ＶＬ）Ｐ（ＬＩ）Ｄ
配列番号４６：Ａ３コアモチーフ配列
ＬＡＹｘｘＹＴＳＧ（ＳＴ）ＴＧｘＰＫＧ
配列番号４７：Ａ５コアモチーフ配列
ＮｘＹＧＰＴＥ
配列番号４８：Ａ６コアモチーフ配列
ＧＥＬｘＩｘＧｘＧ（ＶＬ）ＡＲＧＹＬ
配列番号４９：Ａ７コアモチーフ配列
Ｙ（ＲＫ）ＴＧＤＬ
配列番号５０：Ａ８コアモチーフ配列
ＧＲｘＤｘＱＶＫＩＲＧｘＲＩＥＬＧＥＩＥ
配列番号５１：Ａ９コアモチーフ配列
ＬＰｘＹＭ（ＩＶ）Ｐ
配列番号５２：Ａ１０コアモチーフ配列
ＮＧＫ（ＶＬ）ＤＲ
配列番号５３：Ｔコアモチーフ配列
ＤｘＦＦｘｘＬＧＧ（ＨＤ）Ｓ（ＬＩ）
配列番号５４：Ｃ１コアモチーフ配列
ＳｘＡＱｘＲ（ＬＭ）（ＷＹ）ｘＬ
配列番号５５：Ｃ２コアモチーフ配列
ＲＨＥｘＬＲＴｘＦ
配列番号５６：Ｃ３コアモチーフ配列
ＭＨＨｘＩＳＤＧ（ＷＶ）Ｓ
配列番号５７：Ｃ４コアモチーフ配列
ＹｘＤ（ＦＹ）ＡＶＷ
配列番号５８：Ｃ５コアモチーフ配列
（ＩＶ）ＧｘＦＶＮＴ（ＱＬ）（ＣＡ）ｘＲ
配列番号５９：Ｃ６コアモチーフ配列
（ＨＮ）ＱＤ（ＹＶ）ＰＦＥ
配列番号６０：Ｃ７コアモチーフ配列
ＲＤｘＳＲＮＰＬ
配列番号６１：キメラペプチド１
β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ
配列番号６２：キメラペプチド２および３
β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ
配列番号６３：キメラ１推定ペプチド
β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ
配列番号６４：キメラ２推定ペプチド
β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ
配列番号６５：キメラ３推定ペプチド
β－ヒドロキシ脂肪酸－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ

Claims (32)

1. 　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物プラスミドを作製する方法であって、
   　開始プラスミドのセットを準備する工程であって、前記開始プラスミドのセットの各々は、少なくとも１つのＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列および少なくとも１つの制限酵素認識配列を含む、工程と、
   　前記開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、得られた切断核酸断片を複数含む混合物を調製する工程と、
   　前記複数の切断核酸断片をライゲーションして連結核酸を形成する工程と、
   　前記連結核酸を形質転換生物に接触させて生成物プラスミドを形成する工程と
   を含む方法。
2. 　前記複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む、請求項１に記載の方法。
3. 　前記複数の切断核酸断片は、同じ突出配列を有し、複数種類のアミノ酸を捕捉する前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む切断核酸断片のセットを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 　前記切断核酸断片の各々は、３～５塩基長の突出配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、隣接するＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列の間に位置する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間に位置する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 　前記開始プラスミドにおいて、前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間の領域であって、前記Ｃドメインコード領域および前記Ａドメインコード領域を含まない領域に位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 　前記制限酵素認識配列の少なくとも１つが、前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列内に存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 　前記制限酵素認識配列の少なくとも１つが、前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列外に存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 　前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールにおいて非天然の配列である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 　前記切断核酸断片の各々が、最大１つのＮＲＰＳモジュールを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 　前記制限酵素認識配列は、制限酵素特異的認識部位とは異なる部位で切断される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 　前記制限酵素認識配列は、ＳｆｉＩ、ＢｇｌＩ、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩまたはＢｓｐＱＩの認識配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 　前記開始プラスミドの各々は、４～１２のＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 　前記切断核酸断片を含む混合物を調製する工程において、前記開始プラスミドの各々は、互いに異なる突出配列を有する切断核酸断片を生じる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 　前記切断核酸断片を含む混合物が溶液である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、選択マーカー配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 　前記選択マーカー配列が、薬剤耐性マーカー配列を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、枯草菌において作動可能な複製起点を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 　前記開始プラスミドの各々は、独立して同じまたは異なる、前記ＮＲＰＳをコードする塩基配列の上流にプロモーター領域を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法によって作製された生成物プラスミドまたはプラスミドライブラリー。
22. 　請求項２１に記載の生成物プラスミドまたはプラスミドライブラリーから生産されるＮＲＰＳ。
23. 　請求項２２に記載のＮＲＰＳから生産されるＮＲＰ。
24. 　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸であって、
    　少なくとも１つのＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列、および
    　前記ＮＲＰＳモジュールにとって非天然の制限酵素認識配列
    を含む、核酸。
25. 　前記制限酵素認識配列は、隣接する前記ＮＲＰＳモジュールをコードする塩基配列の間に位置する、請求項２４に記載の核酸。
26. 　前記制限酵素認識配列は、前記ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間に位置する、請求項２４または２５に記載の核酸。
27. 　前記制限酵素認識配列は、ＮＲＰＳモジュールのＣドメインコード領域とＡドメインコード領域との間の領域であって、前記Ｃドメインコード領域および前記Ａドメインコード領域を含まない領域に位置する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の核酸。
28. 　前記制限酵素認識配列は、任意の種類の塩基が存在し得る領域を内部に含む配列を認識する制限酵素の認識配列である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の核酸。
29. 　前記制限酵素認識配列は、ＳｆｉＩの認識配列である、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の核酸。
30. 　前記核酸にコードされる前記ＮＲＰＳモジュールの数が、４～１２である、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の核酸。
31. 　非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）をコードする核酸配列を含む生成物核酸を作製する方法であって、
    　請求項２４～３０のいずれか一項に記載の核酸を開始核酸として準備する工程と、
    　前記制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記核酸を処理して、切断核酸断片を調製する工程と、
    　前記切断核酸断片をライゲーションして、前記開始核酸とは異なる生成物核酸を形成する工程と
    を含む方法。
32. 　請求項３１に記載の方法によって生産される生成物核酸。