CN101215584A - 农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺。解决了目前浪费或低利用农作物秸秆这一木质纤维材料的问题。本发明工艺步骤包括：(1)秸秆的稀碱液预处理20min；(2)超声处理10min；(3)添加硫酸中和处理；(4)添加纤维素酶酶解处理60min；(5)培养基制备；(6)接种发酵，产物琥珀酸以钙盐的形式存在，琥珀酸浓度达到75g/L。本发明以大量的农作物秸秆纤维半纤维为主要原料制备琥珀酸，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，使琥珀酸成为未来最重要的生物基化工产品之一，其工业规模的微生物转化将成为一个最具发展潜力的绿色工艺模式，将会撑起一个全新的C4开发利用平台。

Description

农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺

技术领域

本发明涉及农产品生化加工领域，具体地说是利用放线杆菌消耗秸秆水解液的五、六碳糖混合发酵制备琥珀酸的新工艺。

背景技术

我国每年浪费或低利用的木质纤维材料总共约10亿吨，其中农作物秸秆一项就大约有7亿多吨，其主要成分为纤维、半纤维、木质素。在秸秆的主要成分中，纤维素由于结晶程度高，难于水解，纯酸解速度快，但是副产物多，纯酶解纯度高但速度慢，如何降低副产物同时提高水解速度是整个农作物秸秆降解的关键。而对于秸秆中的半纤维素来说，禾本科农作物秸秆多含木聚糖，可用通过工艺控制在降解半纤维的同时增加纤维素的可介性，以利于进一步完全水解，最终水解液中是五、六碳糖混和液。通过酸解或酶解的方法获得的低分子糖用于生物转化可以大规模制备琥珀酸、乳酸、乙醇等代谢产物，其产业前景相当广阔。

琥珀酸广泛应用于食品、医药、油漆、塑料等行业，可以直接或间接合成包括苯环类在内的250种以上的化工产品，目前琥珀酸主要依赖石化原料制备，使其广泛应用受到限制。

琥珀酸作为三羧酸循环的中间体，也是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌累积产物，产生琥珀酸的微生物包括丙酸产生菌、典型的胃肠菌、瘤胃菌等，产琥珀酸放线杆菌就是其中最为重要的一种，该菌能够广泛利用纤维、半纤维、纤维二糖、以及大部分的六碳糖和五碳糖作为原料分解合成琥珀酸。一旦该菌生物转化秸秆水解液制备琥珀酸在工艺上实现，则工业应用潜力巨大。

发明内容

为了更好的利用农作物秸秆这一木质纤维材料，本发明的目的是提供一种农作物秸秆水解液五、六碳混合糖发酵制备琥珀酸新工艺。

实现上述目的具体发明方法如下：

产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes ATCC55618)有营养消耗简单、不易染菌、兼性厌氧等特点，具有工业化生产的潜力，作为本专利的菌源，温度为37℃，取胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)生长1天的菌斜面作为原始种子。

制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液：斜面菌种直接接种于含有250mL培养基的三角瓶中，温度为37℃，培养基各种成分重量配比如下：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)5g/L，玉米浆(CSL)15g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)1.16g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)0.7g/L，氯化钠(NaCl)1.0g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.2g/L。进行CO₂和H₂混合气培养18小时，得种子液。

秸秆的稀碱液预处理：取1000g粉碎40目的风干玉米秸秆添加于含5L水的反应釜中，同时添加分析纯氢氧化钙1.85g，控制pH为12.0，加热至95℃，搅拌维持20min，其中半纤维素得到部分降解。

超声处理：将水解液置于95℃50赫兹条件下超声处理10min，在加速水解半纤维素的同时，有效增大纤维素的可及性。

酸中和处理：添加2.50g浓度为98％的硫酸，中和液体pH至中性，分离固体成分及硫酸钙沉淀。

酶解处理：添加酶活力为15U/mg的液体纤维素酶5.0g，维持60℃，搅拌酶解60min，水解液中五、六碳混合糖浓度约70g/L，其中葡萄糖与木糖质量比约为2∶1，分别为46.2g/L及23.7g/L。

发酵培养基制备：在水解液中添加营养物质后，发酵培养基各种成分重量比如下：六碳糖葡萄糖46.2g/L，五碳糖木糖23.7g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)0.5g/L，玉米浆(CSL)2.0g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)00.2g/L，氯化钠(NaCl)0.3g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.05g/L。将5L培养基泵入7L规模的厌氧发酵罐内，直接121℃在线灭菌20min。

接种发酵：将250mL产琥珀酸放线杆菌种子培养液接入发酵罐中，进行厌氧发酵，控制厌氧气体CO₂和H₂混合气流速为0.05L·min^-1·L^-1，其中CO₂和H₂的体积比为2∶1，搅拌转速为120r/min，培养温度为37℃，通过流加无菌浓氢氧化钙乳液控制发酵液pH5.5-pH6.0，培养30h，产物琥珀酸以钙盐的形式存在，琥珀酸浓度达到75g/L，5L发酵液中制备获得350g琥珀酸。

本发明的农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺与常规的秸秆生物加工及常规地琥珀酸发酵相比，有益技术效果体现在：

(1)本发明以大量的农作物秸秆纤维半纤维为主要原料制备琥珀酸，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，使琥珀酸成为未来最重要的生物基化工产品之一，其工业规模的微生物转化将成为一个最具发展潜力的绿色工艺模式，将会撑起一个全新的C4开发利用平台。

(2)本发明的稀碱处理秸秆时，围绕半纤维素的水解控制条件不剧烈，耗能小。

(3)其超声加工经过碱液处理的半水解液能够有效提高纤维素的可及性，有利于后续处理。

(4)经过稀碱和超声处理的水解液进一步酶解时，酶解效率效率高，大大降低酶成本。

(5)工艺采用的菌种能够同步高效利用五、六碳糖，比普通菌株利用秸秆水解液的效率高。

(6)由于气体中的CO₂参与底物固定反应，菌株生物转化制备琥珀酸比制备其他代谢物如乙醇等产物转化率高。

(7)菌株的发酵制备工艺稳定，有利于工业化生产。

附图说明

图1为产琥珀酸放线杆菌的秸秆水解液五、六碳糖混和发酵代谢途径。

图2秸秆生物转化制备琥珀酸工艺流程，通过流程图可以看出工艺简单高效。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地说明。

实施例1：

农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺包括下述步骤：

(1)斜面菌种的准备

将产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes ATCC55618)划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板，设置培养温度为37℃，进行CO₂和H₂混合气室培养1天的菌斜面作为原始种子。

(2)制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液

斜面菌种直接接种于250mL三角瓶，培养基各种成分重量配比采用：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)5g/L，玉米浆(CSL)15g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)1.16g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)0.7g/L，氯化钠(NaCl)1.0g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.2g/L。摇瓶转速为100转/min，进行CO₂和H₂混合气培养18小时，温度为37℃，得种子液。

(3)秸秆的稀碱液预处理

取1000g粉碎40目的风干玉米秸秆添加于含5L水的反应釜中，同时添加分析纯氢氧化钙1.85g，控制pH为12.0，加热至95℃，搅拌维持20min，其中半纤维素得到部分降解。

(4)超声处理

将水解液置于95℃50赫兹条件下超声处理10min，在加速水解半纤维素的同时，有效增大纤维素的可及性。

(5)酸中和处理

添加2.50g浓度为98％的硫酸，中和液体pH至中性，分离固体成分及硫酸钙沉淀。

(6)酶解处理

添加酶活力为15U/mg的液体纤维素酶5.0g，维持60℃，搅拌酶解60min，水解液中五、六碳混合糖浓度约70g/L，其中葡萄糖与木糖质量比约为2∶1，分别为46.2g/L及23.7g/L。

(7)发酵培养基制备

在水解液中添加营养物质后，发酵培养基各种成分重量比如下：六碳糖葡萄糖46.2g/L，五碳糖木糖23.7g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)0.5g/L，玉米浆(CSL)2.0g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)00.2g/L，氯化钠(NaCl)0.3g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.05g/L。将5L培养基泵入7L规模的厌氧发酵罐内，直接121℃在线灭菌20min。由于菌株能够同时利用五、六碳糖进行发酵，因此培养基中的葡萄糖与木糖完全能被菌株代谢，见图1。

(8)接种发酵

将250mL产琥珀酸放线杆菌种子培养液接入发酵罐中，进行厌氧发酵，控制厌氧气体CO₂和H₂混合气流速为0.05L·min^-1·L^-1，其中CO₂和H₂的体积比为2∶1，搅拌转速为120r/min，培养温度为37℃，通过流加无菌浓氢氧化钙乳液控制发酵液pH5.5-pH6.0，培养30h，产物琥珀酸以钙盐的形式存在，琥珀酸浓度达到75g/L，5L发酵液中制备获得350g琥珀酸。从以上步骤可以看出秸秆生物转化制备琥珀酸的总体流程简单，见图2。

实施例2：

以小麦秸秆为原料转化制备琥珀酸，工艺条件等同实施例1。

实施例3：

以水稻秸秆为原料转化制备琥珀酸，工艺条件等同实施例1。

Claims (5)

1.农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺，其特征在于：

A、农作物秸秆的稀碱液预处理：

取1000g粉碎40目的农作物秸秆添加于含5L水的反应釜中，同时添加分析纯氢氧化钙1.85g，控制pH为12.0，加热至95℃，搅拌维持20min，得水解液；

B、超声处理：

将水解液置于温度95℃、功率50赫兹条件下超声处理10min；

C、酸中和处理：

在超声处理后水解液中，添加2.50g浓度为98％的硫酸，所得中和液体pH至中性，分离固体成分及硫酸钙沉淀，得中和处理液；

D、酶解处理：

在中和处理液中添加酶活力为15U/mg的液体纤维素酶5.0g，维持温度60℃，搅拌酶解60min，所得酶解处理液中五、六碳混合糖浓度约70g/L；

E、培养基制备：

在上述酶解处理液中添加营养物质后得培养基，将5L培养基泵入7L规模的厌氧发酵罐内，直接121℃在线灭菌20min；各种营养物质重量比如下：六碳糖葡萄糖46.2g/L，五碳糖木糖23.7g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)0.5g/L，玉米浆(CSL)2.0g/L，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.5g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)00.2g/L，氯化钠(NaCl)0.3g/L，氯化镁(MgCl₂·6H₂O)0.05g/L；

F、接种发酵：

将250mL产琥珀酸放线杆菌种子培养液接入发酵罐中，进行厌氧发酵，控制厌氧气体CO₂和H₂混合气流速为0.05L·min^-1·L^-1，搅拌转速为120r/min，培养温度为37℃，培养30h，并通过流加无菌浓氢氧化钙乳液来控制发酵液pH5.5-pH6.0；产物琥珀酸以钙盐的形式存在，琥珀酸浓度达到75g/L，5L发酵液中制备获得350g琥珀酸。

2.根据权利要求1所述农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺，其特征在于：发酵菌种为产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes ATCC55618)。

3.根据权利要求1所述农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺，其特征在于：所述农作物秸秆为小麦秸秆或水稻秸秆或玉米秸秆。

4.根据权利要求1所述农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺，其特征在于：秸秆水解后葡萄糖与木糖质量比约为2∶1，分别为46.2g/L及23.7g/L。

5.根据权利要求1所述农作物秸秆生物转化制备琥珀酸工艺，其特征在于：通过控制CO₂和H₂混合气流速0.05L·min^-1·L^-1时，其中CO₂和H₂的体积比为2∶1。

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