CN110241147A - 一种发酵生产l-苹果酸联产丁二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L‑苹果酸联产丁二酸的方法，所述方法在发酵过程中，通过流加氢氧化钙混悬液控制发酵液的pH值在5.5～7.0的范围。本发明提供的方法可以根据发酵产酸自行控制氢氧化钙混悬液的流加量，确保发酵液中无过量的钙离子，发酵料液自然沉降速率快，且氢氧化钙混悬液无需灭菌，从而达到节约成本和易于提取的目的。

Description

一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体为一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法。

背景技术

苹果酸，又名羟基琥珀酸或羟基丁二酸，具有右旋(D-型)或左旋(L-型)两种旋光异构体及DL-型外消旋体三种型式产品。L-苹果酸广泛存在于生物体中，是生物体代谢过程TCA循环中产生的一种重要的有机酸，在食品、医药、化工、日化和保健等领域具有广泛用途。由于L-苹果酸口感接近天然苹果的酸味，且与柠檬酸相比具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，香味特殊且不损伤口腔和牙齿，已被广泛应用于高档饮料、食品等行业，有可能替代柠檬酸成为新一代食品添加剂。此外，它还具有重要的生理功能，可食药两用，比如苹果酸具有护肝功能，将其与民间治疗肝病的草药配伍，开发成护肝产品，可加强人体新陈代谢，提高免疫力。

近年来，L-苹果酸市场逐渐启动，国际市场对苹果酸的需求量快速增加，已呈现严重供不应求的局面。在欧美各国及日本的食品饮料生产中，苹果酸已成为不可缺少的基本原料之一。苹果酸的生产方法主要由化学合成法、转化法和发酵法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法需要用的原料富马酸多为石油基产品，限制了L-苹果酸在食品、医药等安全领域的应用，随着化石资源的枯竭也必将影响L-苹果酸的可持续性生产。发酵法生产L-苹果酸主要分为一步法发酵和两步法发酵。其中两步发酵法由于涉及到两种微生物，培养条件要求严格，发酵周期过长，产酸相对较低，其局限性较大，难以工业化生产。

在一步发酵法生产L-苹果酸的过程中，一般以碳酸钙作为中和剂，该方法存在着以下问题：(1)碳酸钙灭菌过程中需要消耗大量的水电气且易发生灭菌不彻底的现象；(2)碳酸钙过量致使提取的酸解过程中硫酸的额外消耗量大且产生的废品硫酸钙的量大，环保压力较大；(3)发酵结束后，发酵料液中的苹果酸钙、菌丝体、碳酸钙等混合在一起，不易发生自然沉降，增加提取的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵生产L-苹果酸的方法，从而解决现有技术中以碳酸钙作为中和剂所存在的问题，同时降低生产成本，并实现高产苹果酸以及丁二酸。

具体而言，本发明提供一种发酵生产L-苹果酸的方法，所述方法在发酵过程中通过流加氢氧化钙混悬液的方式控制发酵液的pH值在5.5～7.0的范围内。

为了提高发酵效果，本发明优选在发酵过程中通过流加氢氧化钙混悬液的方式控制发酵液的pH值在6.0～6.5的范围内。本发明进一步优选在接入发酵菌株前，用所述氢氧化钙混悬液调节发酵培养基的pH在6.6～7.0的范围内。

本发明提供的方法可以根据发酵产酸自行控制氢氧化钙混悬液的流加量，确保发酵液中无过量的钙离子，发酵料液自然沉降速率快，且氢氧化钙混悬液无需灭菌，从而达到节约成本和易于提取的目的。

本发明所述流加是指小流量、连续不断地添加，为发酵领域的常规操作方式。

本发明优选所述氢氧化钙混悬液的浓度为30％～60％，更优选为45～55％。所述百分浓度为质量体积百分比(％，w/v)。本发明通过大量实践发现，当发酵过程中流加60％以上浓度的氢氧化钙时，由于混悬液较稠，管道容易堵塞，操作方便性较差，且浓度较大，进罐时局部pH较高，对菌体活性可能产生不利影响；当发酵过程中流加30％以下浓度的氢氧化钙时，由于混悬液较稀，致使发酵培养基中带入了大量的水分，稀释了产酸产量。

本发明发酵生产苹果酸的方法为一步发酵法。本发明用于发酵生产L-苹果酸的菌株可选用适于一步发酵法生产苹果酸的已知菌株，例如噬热毁丝霉((Myceliophthorathermophila)。

为了进一步提高发酵效果，本发明对发酵过程采用的培养基组成进行优选。本发明通过大量实践发现，在发酵培养基中加入磷酸或柠檬酸，可以显著降低发酵周期，增加苹果酸和丁二酸的产量，提高总酸转化率。所述磷酸或柠檬酸的添加量优选为0.1～0.4g/L，更优选为0.15～0.25g/L。

作为本发明的一种优选方案，除了所述磷酸或柠檬酸外，每升所述发酵培养基中含有下述组分：葡萄糖250～300g，豆粕粉150～200g，

K₂HPO₄ 0.1～0.2g，KH₂PO₄ 0.1～0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.15g，生物素0.1～0.3mg，NaCl 0.05～0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.05～0.15g，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.2g。上述发酵培养基可以采用自来水作为溶剂。其中葡萄糖为一次性投入，无需补料流加，操作简单方便。

在发酵过程中，可控制发酵参数以实现最优的发酵效果。例如，发酵的温度优选为43～47℃；发酵过程中优选维持溶氧为20～35％，上述溶氧参数可通过控制发酵过程中的风量、转速、罐压等实现。

与现有技术相比，本发明提供的发酵生产L-苹果酸的方法简单易行，可以根据发酵产酸自行控制流加量，确保发酵液中无过量的钙离子，发酵料液自然沉降速率快，且氢氧化钙混悬液无需灭菌，从而达到节约成本和易于提取的目的。

附图说明

图1为实施例1中L-苹果酸和丁二酸的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但是不应也不能构成对本发明的限制。

实施例1

本实施例提供了一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，具体为：

(1)茄子瓶斜面培养：

噬热毁丝霉(购自中科院天津工业微生物研究所)在无菌的条件下接种于固体斜面培养基，45℃恒温培养7天；用0.8％NaCl和0.1％吐温-80洗孢子并计数；

其中，所述茄子瓶斜面培养基含有如下组分：蔗糖20g、琼脂15g、柠檬酸钠2.5g、KH₂PO₄ 5g、NH₄NO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、氯化钙0.1g、0.1g/L生物素1ml、微量元素溶液2ml；其中，微量元素溶液成分(g/L)为：柠檬酸5g、ZnSO4·7H₂O 0.1g、Fe(NH₄)₂SO₄·6H₂O1g、CuSO₄·5H₂O 0.25g、MnSO₄·H₂O 0.05g、H₃BO₃ 0.05g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；

(2)摇瓶种子培养：

将2.5×10⁷个孢子转接到250ml三角瓶中(含100ml种子培养基)，45℃，150rpm培养24～26h；

其中，摇瓶培养基(每升)含有如下组分：葡萄糖30g、豆粕粉9g、K₂HPO₄ 0.15g、KH₂PO₄ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、氯化钙0.1g、0.1g/L生物素1ml、微量元素溶液1ml；其中，微量元素溶液成分(g/L)为：柠檬酸5g、ZnSO₄·7H₂O 0.1g、Fe(NH₄)₂SO₄·6H₂O 1g、CuSO₄·5H₂O 0.25g、MnSO₄·H₂O 0.05g、H₃BO₃ 0.05g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；

(3)发酵培养：

利用上海保兴50L发酵罐进行发酵培养，发酵罐装液量60％；

发酵培养基包括如下组分：葡萄糖250g，豆粕粉180g，K₂HPO₄ 0.15g，KH₂PO₄0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，0.1g/L生物素2ml，NaCl 0.08g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O0.15g，0.2g磷酸，余量为自来水。

发酵培养基的pH于接种前用氢氧化钙混悬液调至6.6～7.0；将1L步骤(2)培养的菌种火焰接种到发酵培养基中，发酵温度45℃，罐压0.045MPa，通风比1:0.3，搅拌转速300～500rpm，全程通过提转速控制溶氧15～35％，发酵过程中通过流加50％氢氧化钙混悬液控制pH6.0，当残糖降至1g/L以下(残糖的测定方法为：取发酵液进行离心，稀释至相应倍数后，采用SBA生物传感分析仪测定葡萄糖含量)，氢氧化钙不再消耗时放罐；所述氢氧化钙为济南德闻化工有限公司生产的含量大于96％的产品。

经检测，本实施发酵生产的发酵周期为120h，苹果酸的产量为180g/L，丁二酸的产量为30g/L，总酸转化率为84.0％。

上述苹果酸和丁二酸的测定方法为：1ml发酵液加入1ml 3M H₂SO₄进行充分水解后，离心，取上清，用安捷伦1200高效液相色谱仪测定苹果酸含量，5M H₂SO₄为流动相，流速为0.5mL/min，进样量20μL。苹果酸出峰时间为10.745min，丁二酸出峰时间为12.953min(如图1所示)。

上述总酸转化率是苹果酸产量与丁二酸的产量之和占投入糖量的百分比，具体计算公式为：

实施例2

本实施例提供了一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，与实施例1相比，区别仅在于：发酵过程中通过流加60％氢氧化钙混悬液控制pH6.0。

经检测，本实施发酵生产的发酵周期为130h，苹果酸的产量为170g/L，丁二酸的产量为28g/L，总酸转化率为76.6％。

发酵过程中流加60％或以上浓度的氢氧化钙时，由于混悬液较稠，管道容易堵塞，操作方便性较差，且浓度较大，进罐时局部pH较高，对菌体活性可能产生不利影响。

实施例3

本实施例提供了一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，与实施例1相比，区别仅在于：发酵过程中通过流加30％氢氧化钙混悬液控制pH6.0。

经检测，本实施发酵生产的发酵周期为118h，苹果酸的产量为155g/L，丁二酸的产量为20g/L，总酸转化率为81.7％。

发酵过程中流加30％或以下浓度的氢氧化钙时，由于混悬液较稀，致使发酵培养基中带入了大量的水分，稀释了产酸产量。

实施例4

本实施例提供了一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，与实施例1相比，区别仅在于：每升所述发酵培养基中，用0.2g柠檬酸代替0.2g磷酸。

经检测，本实施发酵生产的发酵周期为120h，苹果酸的产量为175g/L，丁二酸的产量为33g/L，总酸转化率为83.2％。

实施例5

本实施例提供了一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，与实施例1相比，区别仅在于：所述发酵培养基中不含有磷酸。

经检测，本实施发酵生产的发酵周期为140h，苹果酸的产量为130g/L，丁二酸的产量为20g/L，总酸转化率为60.0％。

对比例

本对比例提供了一种发酵生产L-苹果酸的方法。

本对比例与实施例1相比，区别仅在于：在步骤(3)发酵培养过程中，用碳酸钙代替氢氧化钙作为中和剂，且所述碳酸钙采用批补(分批补料)的加入方式；具体而言，添加底钙2.4kg，三次补料，48h、72h、96h分别补加一次，每次添加2.4L浓度为50％的碳酸钙混悬液(浓度为50％是指：2.4L碳酸钙混悬液含固体碳酸钙1.2kg)。本对比例采用的碳酸钙为江西省白瑞碳酸钙有限公司生产的轻质碳酸钙。

对比例与实施例1的产量以及中和剂原料成本比较如表1所示。

表1：产量及中和剂原料成本比较

从以上结果可知，使用碳酸钙作为中和剂和使用氢氧化钙作为中和剂的产酸水平无明显差异，但从成本角度而言，碳酸钙的成本高且用量多，因此，每利用50L发酵罐生产一批苹果酸所使用的碳酸钙原料成本是氢氧化钙原料成本的2.82倍；同时，使用碳酸钙需要高温灭菌，每批需要多消耗约3kg的蒸汽，蒸汽单价按400元/吨计算。综上可知，从中和剂的角度出发，每利用50L发酵罐生产一批苹果酸，使用碳酸钙作为中和剂的成本是氢氧化钙的3.33倍。本发明采用的方案，在确保苹果酸以及联产丁二酸产量的基础上，大大降低了生产成本。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种发酵生产L-苹果酸联产丁二酸的方法，其特征在于，在发酵过程中，通过流加氢氧化钙混悬液控制发酵液的pH值在5.5～7.0的范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过流加氢氧化钙混悬液控制发酵液的pH值在6.0～6.5的范围内。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在接入发酵菌株前，用所述氢氧化钙混悬液调节发酵培养基的pH在6.6～7.0的范围内。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钙混悬液的质量体积百分浓度为30％～60％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钙混悬液的质量体积百分浓度为45％～55％。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法为一步发酵法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用于发酵生产L-苹果酸的菌株为噬热毁丝霉。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，用于发酵生产L-苹果酸的发酵培养基中添加有磷酸或柠檬酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，磷酸或柠檬酸在所述发酵培养基中的添加量为0.1～0.4g/L，优选为0.15～0.25g/L。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，每升所述发酵培养基中还含有下述组分：葡萄糖250～300g，豆粕粉150～200g，K₂HPO₄ 0.1～0.2g，KH₂PO₄ 0.1～0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.15g，生物素0.1～0.3mg，NaCl 0.05～0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.05～0.15g，FeSO₄·7H₂O 0.1～0.2g。