CN112695024B

CN112695024B - 一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用

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Publication number: CN112695024B
Application number: CN201911011728.3A
Authority: CN
Inventors: 陈海琴; 杨波; 高鹤; 赵建新; 陈永泉; 张灏; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN112695024A

Abstract

本发明公开了一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。本发明的来源于双岐杆菌的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达12.1～42.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11‑CLA的含量高达84.3～89.1％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11‑CLA的微生物提供了充实的理论支持。

Description

一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一系列含有共轭双键、具有多种位置和几何异构体的脂肪酸的总称。研究表明，共轭亚油酸具有抗癌、降脂、抗动脉粥状硬化、调节能量代谢、增强机体免疫力与促进生长发育等生理作用，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，而cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA是共轭亚油酸异构体中最具有生理活性的两种异构体。因此，市场上对cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA的需求极大。

天然的共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物、某些植物和海洋生物中，并且，这些天然的共轭亚油酸主要以cis9,trans11-CLA的形式存在，生理活性极高，但是，它们含量极少，难以满足市场对于共轭亚油酸的需求。因此，人们逐渐开发了人工合成共轭亚油酸的方法。

目前，人工合成共轭亚油酸的方法主要有化学合成法以及微生物合成法。其中，化学合成法会导致很多有毒性的副产物的产生，对环境以及人体均具有毒害作用，并且，通过化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离，因此，化学合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产。与化学合成法相比，微生物合成法具有污染少、所得共轭亚油酸异构体种类单一的优点，因此，微生物合成法是一种极具潜力的可实现共轭亚油酸大规模工业化生产的方法。

不过，现有的微生物合成法仍存在以下缺陷：

第一，大部分可高产共轭亚油酸的微生物均为致病菌，存在极大的安全性问题，不能直接作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，例如，溶纤维丁酸弧菌、丙酸杆菌以及产芽孢梭状芽孢杆菌等；

第二，部分可高产共轭亚油酸的微生物生产共轭亚油酸产量不高，若作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，生产效率过低，例如，植物乳杆菌ZS2058(具体可见参考文献：齐慧,杨波等.植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸机理的研究[D],江南大学,2017)。

上述缺陷均使得现有的微生物合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产，因此，急需找到一种安全性高且产量高的共轭亚油酸生产菌株以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可用于生产共轭亚油酸的亚油酸异构酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase,EC 5.2.1.5)，其特征在于，所述亚油酸异构酶为：

(a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有亚油酸异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，所述由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)，所述由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，所述由SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，所述由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于齿双歧杆菌 (Bifidobacterium dentium)。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了上述亚油酸异构酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产共轭亚油酸方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA和/或trans9,trans11-CLA。

本发明还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至培养基中，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，得到培养液 A；在培养液A中加入终浓度为0.01～1.0mM的IPTG，于温度为15～20℃、转速为150～250rpm 的条件下诱导培养12～16h，得到培养液B；将培养液B离心，收集湿菌体；以亚油酸为底物，在含亚油酸的反应体系中加入湿菌体，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下进行反应，得到富含共轭亚油酸的反应液；将富含共轭亚油酸的反应液进行提取，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述宿主细胞接种至培养基中，于温度为 37℃、转速为200rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，得到培养液A；在培养液A中加入终浓度为0.01～1.0mM的IPTG，于温度为18℃、转速为200rpm的条件下诱导培养12～16h，得到培养液B；将培养液B离心，收集湿菌体；以亚油酸为底物，在含亚油酸的反应体系中加入湿菌体，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下进行反应，得到富含共轭亚油酸的反应液；将富含共轭亚油酸的反应液进行提取，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系包含缓冲液以及亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6～7。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6.5。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸在反应体系中的浓度为0.05～0.15mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸在反应体系中的浓度为0.1mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述湿菌体在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述湿菌体在反应体系中的浓度为1mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为LB培养基。

本发明还提供了一种生产上述亚油酸异构酶的方法，所述方法为先将上述宿主细胞加入培养基中，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下培养，得到富含亚油酸异构酶的培养液，然后将富含亚油酸异构酶的培养液进行提取，得到亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将上述宿主细胞加入培养基中，于温度为 37℃、转速为200rpm的条件下培养，得到富含亚油酸异构酶的宿主细胞，然后将富含亚油酸异构酶的宿主细胞进行提取，得到亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为LB培养基。

[有益效果]

(1)本发明的来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)的氨基酸序列如SEQID No.1 所示的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达42.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11-CLA的含量高达89.1％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11-CLA的微生物提供了充实的理论支持。

(2)本发明的来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的氨基酸序列如SEQID No.2 所示的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达12.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11-CLA的含量高达84.3％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11-CLA的微生物提供了充实的理论支持。

(3)本发明的来源于假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达19.5％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11-CLA的含量高达88.9％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11-CLA的微生物提供了充实的理论支持。

(4)本发明的来源于齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)的氨基酸序列如SEQID No.4 所示的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达13.5％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11-CLA的含量高达87.1％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11-CLA的微生物提供了充实的理论支持。

附图说明

图1：IPTG浓度对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、E.coli BL21(DE3) /pET28a-bli、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi的共轭亚油酸转化率的影响。

图2：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi所产共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型及各共轭亚油酸异构体占比。

图3：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli所产共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型及各共轭亚油酸异构体占比。

图4：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi所产共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型及各共轭亚油酸异构体占比。

图5：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi所产共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型及各共轭亚油酸异构体占比。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、E.coli BL21(DE3)购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pET-28a(+)载体购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的细菌基因组DNA提取试剂盒以及质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，型号分别为DP302、DP103。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL 的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

亚油酸异构酶比酶活的检测方法：收集菌体，将菌体加入KPB缓冲液(pH 6.5)中，并将菌体用玻璃珠破碎，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于8000g离心10min收集上清，得到粗酶液；调整粗酶液中蛋白含量为0.5mg/mL，并将调整后的粗酶液分装至6个反应玻璃瓶中，每个玻璃瓶1mL；分别在玻璃瓶中加入终浓度为0.1mg/mL亚油酸，于37℃反应60min，得到反应液；反应结束后，迅速在反应液中加入异丙醇以及正己烷，对脂肪酸进行萃取，测定脂肪酸的含量变化(脂肪酸含量变化的检测方法参考下述共轭亚油酸转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及共轭亚油酸中各共轭亚油酸异构体占比的检测方法)，从而计算比酶活；比酶活(U/mg)＝W/(T×M)，其中，W为反应生成的共轭亚油酸的质量(μg)， T为反应时间(min)，M为待测样品质量(mg)。

其中，亚油酸异构酶比酶活的定义为：于37℃、pH 6.5的条件下，1min内转化生成1mg 共轭亚油酸所需的酶量，单位为U/mg。

共轭亚油酸转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及共轭亚油酸中各共轭亚油酸异构体占比的检测方法：按照1mL反应液+1mL异丙醇+2mL正己烷的比例，在反应液中加入异丙醇和正己烷，得到混合液；将混合液涡旋振荡30s；静置分层；移取上层的正己烷层至干净的螺旋玻璃瓶内，氮吹至干；接着加入400μL的甲醇，涡旋30s；每个玻璃瓶中加入40μL的重氮甲烷，进行甲酯化，此时溶液为黄绿色，反应15min，如果颜色不褪色，代表甲酯化比较充分；充分甲酯化后的液体经过氮吹至干，分别加入200μL的正己烷进行回溶，离心后，将上清液转移至色谱进样瓶中，暂存至GC-MS检测；

其中，共轭亚油酸转化率＝(共轭亚油酸的质量/对照组中亚油酸的质量)×100％。

实施例1：编码亚油酸异构酶的基因的筛选

具体步骤如下：

通过PacBio测序平台采集短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828(记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中)在亚油酸胁迫下的转录组学数据，采样时间点分别为3h，8h，15h。经过生信分析发现，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828 中三个时间点处基因转录水平均增大的基因共8个，根据转化水平变化大小将这8个基因分别注释为编码“未知蛋白1”、“蜜二糖载体蛋白”、“核糖激酶”、亚油酸水合酶、“未知蛋白2”、“转录调控蛋白”、“核糖结合ABC通道蛋白1”以及“核糖结合ABC通道蛋白2”的基因，其中，编码“未知蛋白1”的基因在8h时的转录水平较3h上升68倍，15h和8h时的转录水平较3h上调了3.5倍和8.2.倍，并且，其未与其他基因形成基因簇，因此，推测该基因参与CLA转化的可能性比较大(“未知蛋白1”的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、编码“未知蛋白1”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)。

通过同样的方法分别从长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)以及齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)中获得其他可能参与CLA转化的基因(将分别从长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)以及齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)中获得的可能参与CLA转化的基因分别注释为编码“未知蛋白3”、“未知蛋白4”、“未知蛋白5”的基因，其中，“未知蛋白3”的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示、编码“未知蛋白3”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，“未知蛋白4”的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示、编码“未知蛋白4”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，“未知蛋白5”的氨基酸序列如SEQ ID No.4 所示、编码“未知蛋白5”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)。

实施例2：编码亚油酸异构酶的基因的克隆

具体步骤如下：

从保菌管中挑取短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的菌液划线于MRS 固体培养基上，于37℃恒温厌氧工作站中培养48h，获得单菌落；挑取单菌落接种于MRS 液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中继续静置培养24h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中培养24h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取湿菌体中的基因组DNA，并通过PCR反应扩增bbi；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小，获得bbi(此bbi基因即为编码“未知蛋白1”的基因)；其中，扩增bbi所用引物见表1；

PCR反应体系包含：KOD 1μL、ddH2O 29μL、上下游引物各1μL、基因组DNA 1μL、dNTP 5μL、10×reactionbuffer 5μL以及Mg²⁺3μL；

PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1min)循环30次； 68℃，5min；12℃，5min。

通过与获得bbi同样的方法分别从长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)以及齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)中获得 bli(此bli基因即为编码“未知蛋白3”的基因)、bpi(此bpi基因即为编码“未知蛋白4”的基因)以及bdi(此bdi基因即为编码“未知蛋白5”的基因)；其中，扩增bli、bpi以及 bdi所用引物见表1。

表1引物序列

实施例3：亚油酸异构酶在大肠杆菌中的表达

具体步骤如下：

将pET-28a(+)载体导入大肠杆菌E.coli DH5α中，获得大肠杆菌E.coli DH5α/pET28a；将大肠杆菌E.coli DH5α/pET28a划线于LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、 200rpm的摇床中培养14h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10 min，获得湿菌体；使用质粒小提试剂盒提取湿菌体中的pET-28a(+)载体；将获得的pET-28a (+)载体用50μL的ddH₂O回溶，于-20℃下储存。

使用限制性内切酶HindⅢ和Nde I对获得的pET-28a(+)载体以及实施例2获得的bbi、 bli、bpi、bdi基因进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物，具体连接体系如表2。

将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pET28a-bbi、pET28a-bli、pET28a-bpi以及pET28a-bdi。

将获得的重组质粒pET28a-bbi、pET28a-bli、pET28a-bpi以及pET28a-bdi分别导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、E.coli BL21 (DE3)/pET28a-bli、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi。

将获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli、 E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi分别划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm 的条件下培养12h，获得发酵液；将发酵液于4℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体进行破碎后于4℃、12000g的条件下离心10min，获得细胞破碎上清液；检测获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活，检测结果如下：

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为6.7U/mg、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为1.7U/mg、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为1.8U/mg、重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3) /pET28a-bdi发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为1.4U/mg。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli、E.coliBL21(DE3) /pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi均可成功表达亚油酸异构酶。

表2连接体系

实施例4：重组大肠杆菌的应用

具体步骤如下：

将实施例3获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、E.coli BL21(DE3) /pET28a-bli、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi的活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.4～0.6后，在培养基中分别加入终浓度为0mM、0.05mM、0.1mM、 0.3mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM的IPTG继续于18℃、200rpm的条件下诱导培养15h，得到培养液；将培养液分别于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体按0.5 mg湿菌体/mL的浓度分别回悬至KPB缓冲溶液(pH＝6.5)中，然后在KPB缓冲溶液中分别加入终浓度为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的亚油酸，于37℃、200rpm的条件下反应3h；反应结束后，检测反应液中共轭亚油酸的转化率，并且，检测所得共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体的类型及各共轭亚油酸异构体占比，检测结果见图1-5。

如图1可知，当IPTG终浓度为0.1mM时，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi、 E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli、E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi以及E.coli BL21(DE3) /pET28a-bdi反应获得的反应液中共轭亚油酸的转化率最高。

如图2-5可知，当IPTG终浓度为0.1mM时，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bbi 反应获得的反应液中共轭亚油酸的转化率可达42.1％，其中，89.1％为cis9,trans11-CLA、1％为trans10,cis12-CLA、9.9％为trans9,trans11-CLA；

当IPTG终浓度为0.1mM时，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bli反应获得的反应液中共轭亚油酸的转化率为12.1％，其中，84.3％为cis9,trans11-CLA、1.2％为trans10, cis12-CLA、4.5％为trans9,trans11-CLA；

当IPTG终浓度为0.1mM时，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bpi反应获得的反应液中共轭亚油酸的转化率为19.5％，其中，88.9％为cis9,trans11-CLA、0.98％为trans10, cis12-CLA、10.1％为trans9,trans11-CLA；

当IPTG终浓度为0.1mM时，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bdi反应获得的反应液中共轭亚油酸的转化率为13.5％，其中，87.1％为cis9,trans11-CLA、1.3％为trans10, cis12-CLA、11.6％为trans9,trans11-CLA。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 1

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Asn Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Thr Gly Gly Ile Val Ala Phe Leu Val Val Pro Ala Val

35 40 45

Leu Thr Val Tyr Phe Ile Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala

50 55 60

Asp Trp Ala Leu Asn Asn Pro Thr Tyr Val His Met Thr Ser Trp Phe

65 70 75 80

His Tyr Ala Lys Leu Tyr Ala Ala Thr Ile Gly Cys Ile Gly Phe Met

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Lys Trp Gly Ser Ile Gly Lys Ser His Trp Phe Lys

100 105 110

Cys Phe Pro Phe Val Ile Val Ala Ile Asn Ile Leu Ile Ala Val Val

115 120 125

Ser Asp Phe Glu Ser Ala Ile Arg Gly Trp Gly Thr Thr Trp Ile Ser

130 135 140

Thr Glu Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Trp His Asn Val Phe Asn Gly

145 150 155 160

Leu Ala Gly Ile Leu Asn Ile Phe Cys Met Thr Gly Trp Phe Gly Ile

165 170 175

Tyr Ala Ser Lys Lys Lys Asp Asp Met Leu Trp Pro Asp Met Thr Trp

180 185 190

Val Phe Ile Val Ala Tyr Asp Leu Trp Asn Phe Cys Tyr Thr Tyr Asn

195 200 205

Cys Leu Pro Thr His Ser Trp Tyr Cys Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala

210 215 220

Pro Thr Val Ala Asn Phe Phe Trp Asn Lys Gly Gly Trp Ile Gln Asn

225 230 235 240

Arg Ala Asn Thr Leu Ala Ile Trp Cys Met Phe Ala Gln Val Phe Pro

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Met Phe Gln Asp Tyr Ser Val Phe Ser Thr Gln Ser Val Asn Asn Pro

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Asn Val Asn Leu Ala Val Ser Leu Ile Ala Leu Val Ala Asn Val Leu

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Ala Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Arg Ala Lys Lys Gln Gly Ile Asn Pro

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Trp Thr Lys Glu Val Phe Lys Gly Thr Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Ile

305 310 315 320

Ala Arg Ala Asp Ala Ser Glu Leu Val Ala

325 330

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<400> 2

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Asn Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Thr Gly Gly Val Ile Ala Phe Leu Val Ile Pro Ala Val

35 40 45

Leu Thr Val Tyr Phe Ile Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala

50 55 60

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His Tyr Ala Lys Leu Tyr Ala Ala Thr Ile Gly Cys Ile Gly Phe Met

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115 120 125

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Asn Val Asn Leu Ala Val Ser Leu Ile Ala Leu Ala Ala Asn Val Leu

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Ala Arg Ala Asp Glu Ser Glu Leu Ala Ala

325 330

<210> 3

<211> 327

<212> PRT

<213> 假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）

<400> 3

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Thr Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

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325

<210> 4

<211> 328

<212> PRT

<213> 齿双歧杆菌（Bifidobacterium dentium）

<400> 4

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115 120 125

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<210> 5

<211> 993

<212> DNA

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 5

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aagtggggct ctatcggcaa atcccactgg ttcaagtgct tcccgttcgt gatcgtggcc 360

atcaacatcc tcatcgccgt ggtctctgac ttcgaatccg ccatccgcgg ctggggcacc 420

acctggatct ccactgaagg cgtgaccctc tacggtggct ggcacaacgt gttcaacggc 480

ttggccggca tcctcaatat cttctgcatg accggctggt tcggcatcta cgcctccaag 540

aagaaggacg acatgctctg gccggacatg acctgggtgt tcatcgtggc ctacgatctg 600

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gctcgcgccg atgcatcgga gttggtggcg tag 993

<210> 6

<211> 993

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<400> 6

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cactatgcca agctgtacgc ggccaccatc ggctgcatcg gtttcatggc cctcaaatac 300

aagtggggat ccatcggcaa atcgcactgg ttcaagtgct tcccgttcgt gatcgtggcc 360

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acgtggatct ccaccgaagg cgtgaccctg tacggtggct ggcacaacgt cttcaacggc 480

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<210> 7

<211> 984

<212> DNA

<213> 假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）

<400> 7

atgttgttcc aagtctatgg cgacaccgcc atataccagt ggatcggatg gatcctcgta 60

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gcccgccagg aagtcgccgc ctga 984

<210> 8

<211> 986

<212> DNA

<213> 齿双歧杆菌（Bifidobacterium dentium）

<400> 8

atgttgttcc aagtctatgg cgacaccgcc gtatatcagt ggatcggctg gatccttgtc 60

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atcaacatcc tcatcgccgt ggtttccgac ttcgaatccg cgatccgcgc atggggcacc 420

acctgggtct ccaccgaagg cgtgacgctc atgggcggct ggcacaacgt gttcaacggc 480

gtggcgggcc tcatcaacat cgcctgcatg accggatggt tcggcatcta cgtgtcgaag 540

aggaagcagg acatgctctg gcccgacatg acgtgggtgt tcatcgtagc ctacgacctg 600

tggaacttct gctacaccta caactgcctg cccacccact cgtggtactg cggtctggcg 660

ctgctgcttg caccgaccgt cgccaacttc ttctggaaca agggcggctg gattcagaac 720

cgcgccaaca cactcgccat ctggtgcatg ttcgcgcagg tgttccctgc cttccaggac 780

gagtccaagt tcgccgtgca gtcggtgaac aacccgaacg tgaacctgac cgtgtcgatc 840

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cccgccgcga agatctggcg gcctga 986

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcctatgc tgtttcaggt ctacggcga 29

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catatgctac gccaccaact ccgat 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aagcctatgc tgtttcaggt ctacg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catatgctag gccgccaatt cagac 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

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<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

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<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aagcctatgt tgttccaagt ctatg 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

catatgtcag gccgccagat cttcg 25

Claims

1.一种亚油酸异构酶在生产共轭亚油酸方面的应用；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为将表达氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的亚油酸异构酶的大肠杆菌接种至培养基中，于温度为35~40℃、转速为150~250rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.4~0.6，得到培养液A；在培养液A中加入终浓度为0.01~1.0 mM的IPTG，于温度为15~20℃、转速为150~250 rpm的条件下诱导培养12~16 h，得到培养液B；将培养液B离心，收集湿菌体；以亚油酸为底物，在含亚油酸的反应体系中加入湿菌体，于温度为35~40℃、转速为150~250 rpm的条件下进行反应，得到富含共轭亚油酸的反应液；将富含共轭亚油酸的反应液进行提取，得到共轭亚油酸。

3.如权利要求2所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述共轭亚油酸为cis9, trans11-CLA和/或trans9, trans11-CLA。