CN103087935A - 共轭亚油酸的发酵方法及所用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酿酒酵母表面展示系统表达亚油酸异构酶，并利用该酶催化合成t10,c12-共轭亚油酸的方法。本发明构建了含有来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶基因（pai）的表达载体，获得了含有该表达载体的酿酒酵母菌株。经诱导培养后，亚油酸异构酶在酿酒酵母中得到展示表达，将该酶加入到含有底物亚油酸的缓冲液中，进行催化反应，生成t10,c12-共轭亚油酸。本发明利用微生物表面展示系统将亚油酸异构酶连接在酿酒酵母细胞壁上，使细胞外底物与酶充分接触，提高催化效率，并且能够获得具有生理活性的单一异构体，简化分离纯化步骤，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及菌株的构建及发酵，尤其是一种共轭亚油酸的发酵方法及所用菌株。
背景技术
共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，简称CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸，是人体必需的脂肪酸亚油酸（linoleic acid，简称LA）衍生而成的一系列位置和构象异构体的总称。CLA具有抗癌、抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、调节血糖、增强机体免疫能力、促进生长等多种生理活性，其中，t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。
在自然界中，CLA广泛存在于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。目前，工业上生产CLA主要采用化学异构法，即通过亚油酸的碱催化异构化。但是，这种方法获得的产物是多种异构体的混合物，除了具有生理活性的异构体外，还含有多种安全性未知的副产物，而活性异构体的分离纯化是十分困难的。采用基因工程技术，获得能够表达亚油酸异构酶的菌株，利用自身的亚油酸异构酶将LA转化成CLA，条件温和，并且能够合成具有生理活性的单一异构体，不仅可以大大简化后续分离纯化的步骤，降低生产成本，而且对于将来CLA用于临床试验以及膳食添加不同CLA异构体的合理配比，都具有混合异构体无法比拟的优点。来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（pai）是唯一一种已知晶体结构的亚油酸异构酶，能够将LA转化成单一的活性异构体t10,c12-CLA，并已在大肠杆菌、酵母、烟草及大米等多种系统中成功的进行了表达。
发明内容
本发明的目的在于利用酿酒酵母表面展示系统表达了来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶，成功构建了一株通过展示亚油酸异构酶能催化合成单一活性异构体t10,c12-CLA的酵母工程菌株，并利用该菌株成功发酵合成t10,c12-共轭亚油酸。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌，含有亚油酸异构酶基因，基因序列见序列3，表达载体的pYD1，宿主菌为酿酒酵母EBY100。
而且，所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。
在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌的培养方法，步骤为：将所述基因工程菌接种到含有半乳糖的YNB-CAA培养基中，诱导培养，离心，收集菌体。
而且，所述半乳糖浓度为1-2%(W/V)。
而且，所述诱导培养温度为20-25°C，诱导培养时间为48-96h。
而且，将所述工程菌加入到含有底物亚油酸的缓冲液中进行振荡反应，反应后获得共轭亚油酸。
而且，所述缓冲液pH为6.5-7.5。
而且，所述缓冲液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
而且，所述振荡反应温度为30-37°C，振荡反应时间为4-36h。
一种制备共轭亚油酸的全细胞催化剂，含有如权利要求1所述的基因工程菌，所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明通过将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶基因插入载体pYD1中，构建了表达载体pYD1::pai，并将它导入酿酒酵母EBY100中，获得含有表达载体pYD1::pai的酿酒酵母菌株EBY100-pYD1-pai，本菌株经诱导培养后，PAI成功的展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物亚油酸充分接触，并将LA转化为单一活性异构体t10,c12-CLA。
2、本发明首次利用酿酒酵母表面展示系统，将亚油酸异构酶基因展示在细胞壁表面，使得底物能够与其充分的接触，既能够提高亚油酸异构酶的催化效率，又能够获得具有生理活性的单一异构体，不需要再进一步纯化分离，提高生产效率。
3、本发明利用微生物表面展示系统将亚油酸异构酶连接在酿酒酵母细胞壁上，使细胞外底物与酶充分接触，提高催化效率，并且能够获得具有生理活性的单一异构体，省掉分离纯化步骤，降低生产成本。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母表面展示系统原理示意图。
图2为本发明表达载体pYD1::pai的结构示意图。
图3为本发明pYD1::pai转化酿酒酵母PCR鉴定电泳结果图。
图4为本发明EBY100-pYD1-pai表面展示亚油酸异构酶催化合成t10,c12-CLA的产量测定图。
图5为本发明EBY100-pYD1-pai表面展示亚油酸异构酶催化合成t10,c12-CLA的气相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明的内容包括：带有天然亚油酸异构酶pai基因的表达质粒，含有PAI表达质粒的能够生产t10,c12-CLA的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株的构建方法和所述酿酒酵母菌株生产t10,c12-CLA的方法。
本发明通过将来源于P.acnes的pai基因插入载体pYD1中，构建了表达载体pYD1::pai，并将它导入酿酒酵母EBY100中，获得含有表达载体pYD1::pai的酿酒酵母菌株EBY100-pYD1-pai。上述菌株经诱导培养后，PAI成功的展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物亚油酸充分接触，并将LA转化为单一活性异构体t10,c12-CLA。
所述的天然亚油酸异构酶基因（pai）来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes），菌株保藏编号为ATCC6919，该基因的GenBank号为AX062088.1，其核苷酸序列如序列3所示。
所述的表达质粒将pai基因插入初始载体pYD1（购自invitrogen公司，货号V83501）；所述的酿酒酵母将构建后的表达质粒转入初始菌株酿酒酵母EBY100中（购自invitrogen公司，货号C83900）；
所述的酿酒酵母表面展示亚油酸异构酶的方法是，将酿酒酵母接种到YNB-CAA中，经半乳糖诱导培养，离心，收集菌体，洗涤，得到表面展示有亚油酸异构酶的酿酒酵母菌株；所述的半乳糖浓度为1-2%；所述的诱导温度为20-25°C；所述的诱导时间为48-96h；
所述的酿酒酵母表面展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法是，将已表面展示亚油酸异构酶的酿酒酵母菌株作为全细胞催化剂加入到含有亚油酸的缓冲液中（pH6.5-7.5），振荡反应；所述的缓冲液为磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液；所述的反应温度为30-37°C；所述的反应时间为4-36h；
一、酿酒酵母表面展示系统表达载体的构建
以痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的基因组为模板，利用表1中的引物进行PCR扩增。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer（含Mg2+）25μl，dNTP（25mM）5μl，上游引物PAI-F和下游引物PAI-R（10μM）各1μl，模板(痤疮丙酸杆菌全基因组DNA)1μl，KOD Fx DNA聚合酶0.5μl，加无菌水至终体积为50μl。
PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸90s，反应35个循环，68℃后延伸10min。
表1所用引物序列
将已获得的目的基因pai用EcoRI和XhoI进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pYD1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄青霉素抗性（100μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得表达载体pYD1::pai，见图2。
二、含有表达载体的酿酒酵母菌株的构建
无氨基酵母氮源(YNB)固体筛选培养基的成分：葡萄糖2%，酵母氮源碱0.67%，硫酸铵0.5%，琼脂2%。
初始菌株酿酒酵母EBY100为色氨酸营养缺陷型菌株（购自invitrogen，货号C83900，色氨酸营养缺陷型是为了后期筛选所用，载体pYD1含有TRP1基因，转化进菌株EBY100后能恢复其色氨酸的合成能力，就能在无氨基酵母氮源(YNB)固体筛选培养基上生长，而EBY100是不能在YNB上生长的，只能在含有色氨酸的YPD培养基上生长），初始载体pYD1含有TRP1基因，含有表达载体的酿酒酵母菌株能够在色氨酸缺失的培养基上生长，因此选用YNB固体筛选培养基。
将上述已获得的表达载体转化酿酒酵母EBY100，具体方法为：
⑴酿酒酵母EBY100在YPD平板上进行三区划线，30℃培养48h，获得单菌落；
⑵挑取一个单菌落，接种于YPD液体培养基中，30℃振荡培养至2×107cell/ml；
⑶4°C、5000rpm离心，收集菌体，将菌体重新悬浮于无菌水中，重复一次；
⑷4°C、5000rpm离心，收集菌体，将菌体重新悬浮于50μl0.1M乙酸锂缓冲液中；
⑸向上述感受态细胞中依次加入50%PEG3350240μl、1M乙酸锂36μl、2mg/ml鲑鱼精单链DNA50μl（使用前煮沸5min，置于冰上2min），待转化质粒（载体pYD1::pai）10μl，如入无菌水至终体积360μl，剧烈振荡混匀；
⑹30℃水浴30min，42℃热休克40min，8000rpm离心，收集菌体，加入1mlYPD液体培养基重悬菌体，30℃复苏培养4h；
⑺将酿酒酵母菌悬液均匀涂布到YNB平板上，30°C培养2-4d，获得单菌落。
挑取5个pYD1::pai转化子，以PAI-F、PAI-R为引物，分别对上述转化子进行亚油酸异构酶基因的菌落PCR验证。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer2μl，MgCl21.6μl，dNTP（10mM）0.4μl，上游引物PAI-F和下游引物PAI-R（10μM）各0.8μl，模板1μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。
PCR反应条件为：94°C预变性2min，96℃变性40s，56℃退火1min，72℃延伸90s，反应35个循环，72°C再延伸5min，结果如图3所示，第一泳道为阳性对照，以质粒pYD1::pai为PCR扩增模板，第二泳道为阴性对照，以出发菌株EBY100的基因组DNA为PCR扩增模板，后五个泳道为以5个转化子的全菌体DNA为模板进行的PCR扩增产物，与阴性对照菌株相比，阳性转化子能够扩增出pai基因(1275bp)的条带，说明表达载体pYD1::pai已经成功转入酿酒酵母EBY100中。
三、含有表达载体的酿酒酵母的诱导表达和转化产物分析
YNB-CAA诱导培养基的成分：半乳糖2%，酵母氮源碱0.67%，硫酸铵0.5%，CAA0.5%。
将上述酿酒酵母菌株活化后，接种到YNB-CAA培养基中，20℃诱导培养48h，6000rpm离心，收集菌体细胞，将收集的菌体细胞用0.9%的生理盐水洗涤两次，加入到含有4mg/ml亚油酸的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，30℃、200rpm振荡培养进行转化反应，每隔一定时间测定t10,c12-CLA的产量，以含有空载体pYD1的酿酒酵母细胞的转化产物作为阴性对照。结果如图4所示，随着反应时间的增加，t10,c12-CLA的产量逐渐增加，其中，在反应初期0-4h，t10,c12-CLA产量增加显著，随后的4-20h，t10,c12-CLA产量增长缓慢，并在20h达到最大。其中，EBY100-pYD1-pai生成CLA的最大产量为18.2μg/ml，而含有空载体pYD1的酿酒酵母菌体细胞检测不到t10,c12-CLA的生成。
将上述酿酒酵母细胞转化20h的产物，用2倍体积氯仿/甲醇溶液（2:1，V/V），振荡萃取，取有机相于30℃进行旋蒸，除去有机溶剂，在旋蒸后的产物中，加入氯仿溶解混匀，加入硫酸/甲醇溶液（4%，V/V），于75℃中水浴加热反应1h，使其充分甲酯化，反应结束后，加入色谱纯的正己烷，振荡萃取，干燥，过滤，用于气相色谱检测。结果如图5所示，图A：CLA甲酯标样的气相色谱图，图B：含有空载体pYD1的阴性对照菌株转化产物的气相色谱图，图C：含有表达载体pYD1:pai的酿酒酵母菌株EBY100-pYD1-pai转化产物的气相色谱图。CLA甲酯标样的气相色谱图表明，两种异构体得到了比较好的分离，其中c9,t11-CLA的保留时间为19.29min，t10,c12-CLA的保留时间为19.63min（图5A）。含有空载体pYD1的阴性对照菌株的转化产物中没有CLA的生成（图5B）。对EBY100-pYD1-pai的转化产物进行气相色谱分析，该菌株催化LA转化生成的产物在保留时间19.56min出现典型峰（图5C），通过与CLA甲酯标样保留时间的比对，表明这种产物为t10,c12-CLA。
Claims (10)
1.一种在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌，其特征在于：含有亚油酸异构酶基因，基因序列见序列3，表达载体的pYD1，宿主菌为酿酒酵母EBY100。
2.根据权利要求1所述的在细胞壁表达亚油酸异构酶基因的基因工程菌，其特征在于：所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。
3.如权利要求1所述的在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌的培养方法，其特征在于：步骤为：将所述基因工程菌接种到含有半乳糖的YNB-CAA培养基中，诱导培养，离心，收集菌体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述半乳糖浓度为1-2%(W/V)。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述诱导培养温度为20-25°C，诱导培养时间为48-96h。
6.利用如权利要求所述的基因工程菌发酵共轭亚油酸的方法，其特征在于：将所述工程菌加入到含有底物亚油酸的缓冲液中进行振荡反应，反应后获得共轭亚油酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述缓冲液pH为6.5-7.5。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述缓冲液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述振荡反应温度为30-37°C，振荡反应时间为4-36h。
10.一种制备共轭亚油酸的全细胞催化剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的基因工程菌，所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。
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