CN110396188B - 一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于发酵法生产ε‑聚赖氨酸的后提取方法，属于提取分离技术领域。本发明主要是利用电渗析技术和膜分离技术提取发酵液中的ε‑聚赖氨酸。具体步骤是：将发酵液热絮凝处理后经陶瓷膜过滤进行固液分离，再经过超滤膜过滤除去可溶性大分子物质，用活性炭进行脱色，过滤得脱色液，将脱色液经电渗析处理，将解析液压入纳滤膜装置进行循环浓缩，浓缩液经喷雾或减压冷冻干燥即得ε‑聚赖氨酸产品。相较于传统离子交换提取方法，采用本方法提取ε‑聚赖氨酸，产品回收率可达80%以上，纯度高达98%以上；用电渗析技术取代传统的离子交换技术后可节约用水60%，吨产品环保成本降低50%。本发明既能够减少废水产生、自动化程度高、又具有提取回收率高、提取产品纯度高等优势，适合工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法。
背景技术
ε-聚赖氨酸（ε-PL）是通过链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌等微生物发酵合成的一种氨基酸同型聚合物，它一般由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成，分子量通常为2500-4500D。ε-聚赖氨酸是一种抗菌谱广、生物安全性高、热稳定性强、pH适用范围宽的新型营养型高附加值食品防腐剂。
ε-聚赖氨酸的制备主要包括两部分：微生物发酵、提取与精制。目前ε-聚赖氨酸发酵单位已达到大规模工业化生产的发酵水平，在日本已实现产业化。相比较在发酵水平方面上取得的进步，ε-聚赖氨酸后提取技术并未发生实质性进展，目前已公布的ε-聚赖氨酸分离提取方法，主要包括菌体的固液分离、离子交换吸附与洗脱、产品脱色等。其中离子交换技术一直是ε-聚赖氨酸提取的核心方法，众所周知，离子交换技术具有产物回收率高、除杂能力强和操作成熟等优点，但其在活化和再生环节中酸碱消耗量大、废水量多的缺陷却始终无法避免。在ε-聚赖氨酸的生产中，分离提取成本占到总生产成本的70-80%，提取工艺繁琐、收率低、产品纯度低、费用高一直是限制ε-聚赖氨酸工业化的重要因素。
因此，在环保要求越来越高的背景下，革除离子交换工艺，采用电渗析和多级膜技术，开发一种自动化程度高、产品损失率低、有效降低污染的绿色提取方法，将是该技术领域科研人员亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的是克服现有ε-聚赖氨酸提取工艺的不足，提供一种利用电渗析技术和膜分离技术从发酵液中提取ε-聚赖氨酸的方法。本发明提供的整个工艺流程流畅，自动化程度高，获得的产品回收率可达80%以上、纯度高达98%以上。用电渗析技术取代传统的离子交换技术后可节约用水60%，吨产品环保成本降低50%。
具体的， 本发明的目的可通过如下技术措施来实现：
该方法按如下步骤进行：
（1）发酵液预处理：将含有30g/L以上的ε-聚赖氨酸的发酵液调节pH值至2-6，加热至50-80℃进行热絮凝处理10-60min，以降低发酵液黏度；
（2）固液分离：将预处理液冷却至20-40℃后，经孔径为100-500nm的陶瓷膜过滤，控制操作压力为0.01-0.05MPa，除去菌体和絮凝沉降的物质；
（3）超滤：将陶滤液压入超滤膜系统，超滤膜的截留分子量为6000-20000D，控制温度为20-50℃，在操作压力0.1-0.15MPa条件下，将陶滤液中的水溶性大分子物质和水不溶性小颗粒杂质去除；
（4）脱色：将收集的超滤透过液调整pH值为2-6，加入0.1-2%的活性炭，加热至60-90℃，脱色处理0.5-4h除去色素物质，过滤后得脱色液；
（5）电渗析：采用两室多层式电渗析装置，将脱色液注入淡室进料速度0.5-5L/h，将1-10mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为20-60V，处理时间为2-10h；
（6）纳滤：将解析液压入纳滤膜装置进行循环浓缩，使ε-聚赖氨酸浓度至10-50%，所述纳滤膜采用是卷式膜，截留分子量为200-800D，工作压力可在0.5-0.8MPa，温度为20-50℃；
（7）干燥：浓缩液经喷雾或减压冷冻干燥，即得ε-聚赖氨酸产品。
本发明所述的发酵液，是利用白色链霉菌（Streptomyces albus）发酵制备得到。
其中，所述的发酵培养基包含如下组分（按照g/L计）：葡萄糖20-100，酵母浸粉50-200,玉米浆2-10, (NH4)2SO41-20, K2HPO4·7H2O 0.5-3，MgSO4·7H2O 0.1-1，ZnSO4·7H2O0.01-0.1，FeSO4·7H2O 0.01-0.1，用氨水调pH值为6-7。
其中，所述的培养的条件是：种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基，培养温度为25～40℃，当发酵液pH值降低至4.0-4.5时，利用的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.5之间直至发酵结束，培养时间为72-200h。
通过上述方法一般可制得ε-聚赖氨酸含量为大于30g/L的发酵液。
本发明的有益效果在于：
（1）首次将电渗析技术应用于ε-聚赖氨酸的后提取工艺，取代了传统的离子交换技术，酸碱用量减少90%，采用电渗析技术后可节约用水60%，吨产品环保成本降低50%；
（2）本发明用电渗析取代了传统离子交换工艺后显著降低了人工成本。目前离子交换工艺为人工操作控制，该岗位需要配置人员为5人左右，而采用电渗析技术自动化控制后，人工可降低到2人，该工序吨提取成本降低50%；
（3）本发明将膜分离技术引入到ε-聚赖氨酸分离提取工艺，应用陶瓷膜代替板框过滤和离心、超滤膜除去可溶性大分子、纳滤代替减压浓缩技术，整个工艺流程流畅，自动化程度高，料液无二次污染；
（4）本发明提供的ε-聚赖氨酸分离提取方法，所得的ε-聚赖氨酸产品回收率可达80%以上、纯度高达98%以上。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：ε-聚赖氨酸发酵液的制备
发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母浸粉80g/L，玉米浆6g/L，(NH4)2SO410g/L，K2HPO4·7H2O 2g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.04g/L,FeSO4·7H2O 0.05g/L，用氨水调pH值为6.8；
将白色链霉菌（Streptomyces albus）的种子液，按照8%的接种量接种于发酵培养基，培养温度为30℃，当发酵液pH值降低至4.0时，利用的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间直至发酵结束，发酵时间为170h；
通过上述发酵方法制得的发酵液中ε-聚赖氨酸含量为32.5g/L。
实施例2：ε-聚赖氨酸的提取
（1）取10L实施例1制备的发酵液，加10%的HCl调节pH值至4.0，加热至70℃热处理30min；
（2）待预处理液冷却至25℃后，进行固液分离，选择孔径为200nm陶瓷膜，控制操作压力在0.03MPa左右，加入2L纯化水冲洗陶瓷膜，获得陶滤液11L；
（3）将陶滤液压入超滤膜系统，超滤膜的截留分子量为8000D，控制温度为40℃，控制操作压力在0.1MPa，加入2L纯化水冲洗超滤膜，重复冲洗3次，获得超滤透过液15.2L；
（4）将收集的超滤透过液用10%的NaOH调整pH值为6.0，加入1%的活性炭，加热至70℃，脱色处理2h，过滤后得脱色液15L；
（5）采用两室多层式电渗析装置，将脱色液注入淡室进料速度5L/h，将2mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为20V，处理时间为3h，获得的解析液18L，解析液电导为1200μS/cm；
（6）将解析液压入纳滤膜装置，纳滤膜截留分子量为200D，控制工作压力不超过0.8MPa，温度不超过30℃，循环浓缩8倍；
（7）将浓缩液经喷雾干燥，即得ε-聚赖氨酸产品；
按照上述步骤获得的产品经检测，ε-聚赖氨酸纯度为98.5%，收率为83%。
实施例3：ε-聚赖氨酸的提取
（1）取10L实施例1制备的发酵液，加10%的HCl调节pH值至2.0，加热至50℃热处理10min；
（2）待预处理液冷却至20℃后，进行固液分离，选择孔径为100nm陶瓷膜，控制操作压力在0.05MPa左右，加入4L纯化水冲洗陶瓷膜，获得陶滤液13.5L；
（3）将陶滤液压入超滤膜系统，超滤膜的截留分子量为20000D，控制温度为30℃，控制操作压力在0.12MPa，加入1L纯化水冲洗超滤膜，重复冲洗3次，获得超滤透过液15.6L；
（4）将收集的超滤透过液用10%的NaOH调整pH值为4.0，加入0.2%的活性炭，加热至90℃，脱色处理4h，过滤后得脱色液15.4L；
（5）采用两室多层式电渗析装置，将脱色液注入淡室进料速度2L/h，将5mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为40V，处理时间为8h，获得的解析液17L，解析液电导为900μS/cm；
（6）将解析液压入纳滤膜装置，纳滤膜截留分子量为800D，控制工作压力不超过0.5MPa，温度不超过50℃，循环浓缩15倍；
（7）将浓缩液经减压冷冻干燥，即得ε-聚赖氨酸产品；
按照上述步骤获得的产品经检测，ε-聚赖氨酸纯度为98.2%，收率为81.6%。
实施例4：ε-聚赖氨酸的提取
（1）取10L实施例1制备的发酵液，加10%的NaOH调节pH值至6.0，加热至80℃热处理50min；
（2）待预处理液冷却至40℃后，进行固液分离，选择孔径为400nm陶瓷膜，控制操作压力在0.01MPa左右，加入3L纯化水冲洗陶瓷膜，获得陶滤液12L；
（3）将陶滤液压入超滤膜系统，超滤膜的截留分子量为12000D，控制温度为45℃，控制操作压力在0.15MPa，加入4L纯化水冲洗超滤膜，重复冲洗2次，获得超滤透过液18.5L；
（4）将收集的超滤透过液用10%的HCl调整pH值为2.0，加入2%的活性炭，加热至60℃，脱色处理0.5h，过滤后得脱色液18.3L；
（5）采用两室多层式电渗析装置，将脱色液注入淡室进料速度4L/h，将10mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为60V，处理时间为4.5h，获得的解析液21L，解析液电导为600μS/cm；
（6）将解析液压入纳滤膜装置，纳滤膜截留分子量为600D，控制工作压力不超过0.6MPa，温度不超过40℃，循环浓缩10倍；
（7）将浓缩液经喷雾干燥，即得ε-聚赖氨酸产品；
按照上述步骤获得的产品经检测，ε-聚赖氨酸纯度为99.0%，收率为80.2%。
对照1
对实施例1制备的发酵液，采用CN200910152931.2提供的方法进行提取，具体是：
用30%HCl调ε-聚赖氨酸发酵液pH为2.0，然后加热至60℃，保温10min，冷却至20℃后经板框过滤，并用30％盐酸对滤层进行顶洗、板框复滤后得清滤液；
用30%NaOH调清滤液pH为9.0。将其压入152树脂吸附柱（高径比为3:1）中进行吸附，吸附过程应控制一定的流速，同时不断加入NaOH，保证pH值保持为9.0，直到树脂吸附达饱和状态。用纯化水洗涤饱和树脂，至洗涤液体澄清为止。用预先配制的3N的HCl进行解析，控制解析速度，待pH降至3.5时，解吸结束，得解析液。在解析液中加入4.0%的活性炭，加热升温至60℃，搅拌脱色10分钟，然后冷却至20℃，过滤得脱色液。将脱色液压入膜滤装置（4000分子量的滤膜膜芯）进行循环浓缩，将脱色液浓缩至ε-聚赖氨酸含量在3%时，停止浓缩，得浓缩液。浓缩液经喷雾干燥即得ε-聚赖氨酸产品；
按照上述步骤获得的产品经检测，ε-聚赖氨酸纯度为86.8%，收率为68.5%。
对照2
省略实施例2中的步骤（2），其他条件与实施例2一致，处理实施例1制备的发酵液。结果显示，按照此方法所得ε-聚赖氨酸纯度为92.3%，收率为85.9%。
对照3
将实施例3中的步骤（5）进行调整，其他处理条件与实施例3一致，处理实施例1制备的发酵液；
其中，调整后的步骤（5）具体是：采用两室多层式电渗析装置，将脱色液注入淡室进料速度10L/h，将5mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为40V，处理时间为1.5h；
结果显示，按照上述步骤获得的产品经检测，ε-聚赖氨酸纯度为93.40%，收率为82.2%。
Claims (6)
1.一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
（1）发酵液预处理：将发酵液调整pH值至2-6，加热至50-80℃，处理时间为10-60min；
（2）固液分离：热絮凝处理后，冷却至20-40℃后经陶瓷膜过滤，获得陶滤液，所述陶瓷膜孔径为100-500nm；
（3）超滤：利用超滤膜系统，将陶滤液中的水溶性大分子物质和水不溶性小颗粒杂质去除，得到超滤透过液；超滤膜元件的截留分子量为6000-20000D；
（4）脱色：将收集的滤液调整pH值为2-6，加热至60-90℃，脱色处理0.5-4h，过滤得脱色液；
（5）电渗析：将脱色液经电渗析处理，获得解析液；
（6）纳滤：将解析液压入纳滤膜装置进行循环浓缩，得ε-聚赖氨酸含量为10-50%的浓缩液；其中，采用的纳滤膜截留分子量为200-800D；
（7）干燥：浓缩液经喷雾或减压冷冻干燥，即得ε-聚赖氨酸产品；
在步骤（5）中，所述的电渗析处理具体为：采用两室多层式电渗析器，清滤液注入淡室，1-10mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4；电渗析处理运行条件为：运行电压20-60V，进料速度0.5-5L/h，处理时间2-10h。
2.根据权利要求1所述的一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于步骤（1）所述发酵液是利用白色链霉菌（Streptomyces albus）发酵制得，所述发酵液中含有30g/L以上的ε-聚赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于步骤（2）所述的陶瓷膜的操作压力为0.01-0.05MPa。
4.根据权利要求1所述的一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于步骤（3）所述的超滤膜元件可以是管式膜或卷式膜，工作压力为0.05-0.3MPa，温度为20-50℃。
5.根据权利要求1所述的一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于步骤（4）所述的活性炭用量为0.1-2%。
6.根据权利要求1所述的一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法，其特征在于步骤（6）所述的纳滤浓缩，工作压力可在0.5-0.8MPa，温度为20-50℃。
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