CN102492737A - 从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，它包括以下步骤：发酵产聚羟基烷酸酯的微生物菌株后，收集发酵液中的菌体细胞；在超声波发生器内，将菌体细胞与有机溶剂混合，有机溶剂用量为菌体细胞的10-30倍，在40-80℃下，超声波振动20-70分钟，获得固液混合物；将固液混合物进行离心或过滤分离，得到含有聚羟基烷酸酯的液相；将含有聚羟基烷酸酯的液相冷却到0-10℃，维持10-30分钟，得到析出聚羟基烷酸酯结晶后形成的浑浊液；将浑浊液离心或过滤分离，得到固体聚羟基烷酸酯；将固体聚羟基烷酸酯进行干燥，得到成品聚羟基烷酸酯。该方法过程简单、操作简便、能量消耗低、生产成本低、产品提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程下游产物分离纯化技术领域，具体涉及一种从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法。
背景技术
聚羟基烷酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHAs）是近二十年来迅速发展起来的生物高分子材料，在环境保护和医学应用发面发挥重要的作用，已经成为一个新材料生产、开发和应用的方向，为生物材料领域最为活跃的热点之一。聚羟基烷酸酯是微生物将过量碳源以碳源和能源的形式贮存而合成的一类胞内热塑性聚酯，累积量可占到细胞干重的30% - 80%。对于PHAs，当聚合单体中碳原子数目为3-5时，由此构成的PHAs称为短链PHAs；当碳原子数目为6-15时，称之为中长链PHAs。目前已经发现并确定了100多种具有不同单体结构的PHAs，新的单体结构仍在不断发掘中。随着单体结构及含量的不同，PHAs的物理性质和工程性质也会产生很大的差异。PHAs不仅具有类似于化学合成塑料的热塑性，而且具有生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性和耐紫外线辐射的性质。因此在医药、包装、农业等方面都有着广泛的应用前景。
目前阻碍PHAs大规模化生产和推广应用的首要问题就是成本过高，约为普通石化塑料的2-4倍，其中主要包括原料费用和分离纯化过程的费用。虽然经过20多年的大量研究，生产成本已逐渐降低，但要想实现工业化、与石化塑料争夺市场，PHAs的生产成本还有待进一步降低。而PHAs的生产成本中大部分是PHAs的分离纯化所需的成本。随着发酵水平的不断提高，发酵成本大幅降低后，分离纯化过程成为制约PHAs生产成本降低的主要因素。目前分离聚羟基烷酸酯常采用机械破碎法、酶解法等先将细胞壁破裂，再用化学试剂（如十二烷基磺酸钠、NaOH、次氯酸钠等）将细胞内其他物质分解，或者用有机溶剂（如氯仿、二氯甲烷等）将PHAs萃取出来。利用化学试剂处理细胞通常需要在较高温度下进行反应，常常会造成产物PHAs的降解，影响产品应用性能。而溶剂萃取过程通常需要大量的溶剂、涉及到溶剂蒸发浓缩、溶剂的冷凝回收再利用，整个过程能量消耗量大。再加之，5%左右的PHAs溶入有机溶剂中，就会导致溶剂粘度增大，从而影响分离过程的提取率、分离产品的纯度等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，该方法过程简单、操作简便、能量消耗低、生产成本低、产品提取率高。
本发明所采用的技术方案为：
从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，包括以下步骤：
（1）发酵产聚羟基烷酸酯的微生物菌株后，收集发酵液中的菌体细胞；
（2）在超声波发生器内，将步骤（1）获得的菌体细胞与有机溶剂混合，有机溶剂用量为菌体细胞的10-30倍，在40-80℃下，超声波振动20-70分钟，获得固液混合物；
（3）将步骤（2）得到的固液混合物进行离心或过滤分离，得到含有聚羟基烷酸酯的液相；
（4）将步骤（3）得到的含有聚羟基烷酸酯的液相冷却到0-10℃，维持10-30分钟，得到析出聚羟基烷酸酯结晶后形成的浑浊液；
（5）将步骤（4）得到的浑浊液离心或过滤分离，得到固体聚羟基烷酸酯；
（6）将步骤（5）得到的固体聚羟基烷酸酯进行干燥，得到成品聚羟基烷酸酯。
所述步骤（3）中固液混合物进行离心或过滤分离后得到的固相重复步骤（2）后，离心或过滤分离，得到液相并入步骤（3）得到的含有聚羟基烷酸酯的液相。该步骤可以提高聚羟基烷酸酯的产品提取率。
所述步骤（1）中产聚羟基烷酸酯的微生物菌株为Ralstonia eutropha、 Psedomonas putida中的一种。
所述有机溶剂为异丙醇、异丁醇、正己烷中的一种或几种。
所述步骤（6）中的干燥为室温下自然干燥，或80-100℃下烘箱干燥，或40-80℃下真空干燥。
本发明的优点在于：（1）将细胞破碎（超声波）过程与聚羟基烷酸酯溶剂萃取过程耦合为一体，不但可以大大的强化溶剂萃取过程，增强分离效果，而且可以大幅度的减少过程所需的时间，提高过程速率，增强过程的经济性；（2）采用低温结晶方法，避免了常规溶剂萃取法中蒸发浓缩和冷凝降温回收溶剂过程，使过程能量消耗量大为降低，可以有效降低过程的成本。本发明提供的从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，具有过程简单、操作简便、能耗低、成本低、提取率高等优点，适合用于聚羟基烷酸酯规模化生产过程。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
现使用从Ralstonia eutropha合成（具体合成方法参阅尚龙安等2003年发表的文章Optimization of Propionic Acid Feeding for Production of Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in Fed-Batch Culture of Ralstonia eutropha. Chinese Journal of Chemical Engineering. 11(2):220-223 ）含有聚羟基烷酸酯的菌体细胞中分离提纯聚羟基烷酸酯作为例子，对本发明进行详细说明，具体步骤如下：
（1）发酵产聚羟基烷酸酯的微生物菌株后，将发酵液离心，弃去上清液得到含有聚羟基烷酸酯的Ralstonia eutropha湿细胞。称取发酵结束后Ralstonia eutropha湿细胞50克。
（2）在超声波发生器（300W）内，将50克Ralstonia eutropha湿细胞与750克异丙醇混合，在频率40kHz、50℃下超声破碎和萃取30分钟，得到固液混合物。
（3）将步骤（2）得到的固液混合物在8000转下离心分离10分钟，收集含有聚羟基烷酸酯的液相浓液以及固渣。将固渣再与250克异丙醇混合，重复步骤（2）之后，在8000转下离心分离10分钟，弃去固渣相，将获得的液相与前期离心分离得到的液相浓液（约750克）混合，得到含有聚羟基烷酸酯液体。
（4）将步骤（3）得到的含有聚羟基烷酸酯的液相收集到2000毫升的烧杯中，并将烧杯置于冰浴中，不断搅拌液体，使其冷却到8℃，并维持15分钟，就会发现有聚羟基烷酸酯结晶析出，形成浑浊液。
（5）将步骤（4）得到的浑浊液立即倒入离心瓶，并在5℃、8000转下离心分离10分钟，得到固体聚羟基烷酸酯和有机溶剂，获得有机溶剂可供后续再次分离时重复使用。
（6）将步骤（5）得到的固体聚羟基烷酸酯在50℃的真空干燥箱（真空度700mmHg）中干燥5小时，得到成品聚羟基烷酸酯。
通过检测计算，利用上述方法分离提纯得到的聚羟基烷酸酯的纯度为92.2%，提取率为90.5%，聚羟基烷酸酯产品的分子量为560000道尔顿。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）发酵产聚羟基烷酸酯的微生物菌株后，收集发酵液中的菌体细胞；
（2）在超声波发生器内，将步骤（1）获得的菌体细胞与有机溶剂混合，有机溶剂用量为菌体细胞的10-30倍，在40-80℃下，超声波振动20-70分钟，获得固液混合物；
（3）将步骤（2）得到的固液混合物进行离心或过滤分离，得到含有聚羟基烷酸酯的液相；
（4）将步骤（3）得到的含有聚羟基烷酸酯的液相冷却到0-10℃，维持10-30分钟，得到析出聚羟基烷酸酯结晶后形成的浑浊液；
（5）将步骤（4）得到的浑浊液离心或过滤分离，得到固体聚羟基烷酸酯；
（6）将步骤（5）得到的固体聚羟基烷酸酯进行干燥，得到成品聚羟基烷酸酯。
2.根据权利要求1所述的从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：所述步骤（3）中固液混合物进行离心或过滤分离后得到的固相重复步骤（2）后，离心或过滤分离，得到液相并入步骤（3）得到的含有聚羟基烷酸酯的液相。
3.根据权利要求1所述的从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：所述步骤（1）中产聚羟基烷酸酯的微生物菌株为Ralstonia eutropha、 Psedomonas putida中的一种。
4.根据权利要求1所述的从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：所述步骤（2）中有机溶剂为异丙醇、异丁醇、正己烷中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的从微生物胞内分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：所述步骤（6）中的干燥为室温下自然干燥，或80-100℃下烘箱干燥，或40-80℃下真空干燥。
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