CN110331175B - 混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法 - Google Patents

混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法属于生物可降解塑料合成领域。一、取总底物体积1/20～1/10量的活性污泥置于SBR反应器中，加入奇数碳脂肪酸浓度为SCOD 100～500mg/L的底物进行PHA菌群驯化；二、丰盛期长度以SCOD下降达到拐点计，丰盛‑饥饿比为1:3～1:5，下一周期接种比例以OD600计，使初始OD600为0.3～0.4；三、稳定后将底物奇数碳脂肪酸浓度依次增加为SCOD 1000、1500～3000、3500～5000mg/L，每个梯度以最大PHA合成率和PHA浓度为指标，连续两周期标准差小于5％判断为稳定；四、在最高浓度稳定后，丰盛期末收集70～80％菌体用于回收PHA产品，另20～30％菌体在饥饿期后接种于下一周期。本发明合成的PHA含较高比例的3HV和3H2MV单体，加工性良好。

Description

混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法
技术领域
本发明属于生物可降解塑料合成领域，具体涉及以奇数碳脂肪酸为底物驯化具有聚羟基烷酸酯(PHA)合成能力的混合菌群并用来合成和提取PHA产物。
背景技术
聚羟基烷酸脂(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一类由微生物在碳源充足而其他营养元素缺乏的条件下，在细胞内合成的一类聚酯，作为碳源和能源的储存物质。其理化性质与石油基塑料相似，并可在自然环境中被微生物完全降解，因此PHA被认为是一种具有广阔应用前景和巨大开发价值的生物可降解塑料，也成为备受关注的新型环保材料。
目前PHA的生产方式主要是利用纯菌以单一物质(如高纯度糖类)为底物进行合成，虽然可获得较好的产率，但成本高，而且要求无菌操作。已有研究表明，利用具有PHA合成能力的混合菌群以单一的或混合的挥发性脂肪酸为底物，也能够合成高积累率的PHA。这种方式能够降低PHA生产成本，简化操作过程。偶数碳脂肪酸为底物合成的PHA主要由3HB单体组成，这种PHA产物存在脆性强、延展性弱、机械加工性差等局限性。本发明中采用奇数碳脂肪酸驯化菌群和合成PHA，可优化PHA产物的单体组成和理化性质；考虑到奇数碳脂肪酸相对于偶数碳脂肪酸更难被微生物利用，故采用底物浓度从低到高的驯化方式以提高菌群的稳定性和对底物的适应性；同时不再需要单独的PHA合成批式反应器，直接在丰盛-饥饿模式下周期性地进行PHA合成和提取。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的PHA生产方式成本高、混合菌群合成的PHA机械加工性能较差的问题，提供了混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其不仅可以节约运行成本，而且可以优化PHA的单体组成和性质。
本发明的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，具体步骤如下：
一、取总底物体积1/20～1/10量的活性污泥置于SBR反应器中，加入奇数碳脂肪酸浓度为SCOD 100～500mg/L的底物，开始驯化具有PHA合成能力的混合菌群；
二、一个驯化周期包含丰盛期和饥饿期，底物SCOD浓度的下降达到拐点时视为丰盛期结束，控制丰盛-饥饿比为1:3～1:5；饥饿期结束时对反应器内所有混合液进行离心以获得混合菌体，下一周期的菌体接种比例由OD600控制，接种后使初始OD600为0.3～0.4；
三、以周期最大PHA合成率和最大PHA浓度为指标，连续两周期的标准差小于5％判断为菌群稳定；在最低底物浓度菌群达到稳定后，将进样浓度依次增加为SCOD 1000、1500～3000、3500～5000mg/L，每次底物浓度提升需在菌群稳定后进行；
四、在最高底物浓度达到菌群稳定后，于每个周期的丰盛期末收集70～80％菌体用于回收、提取PHA产物，另20～30％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期。
五、重复步骤四的操作，即可实现在每个运行周期利用混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯。
所述的奇数碳脂肪酸为丙酸或戊酸；
步骤三中所述的底物为奇数碳脂肪酸。
本发明与现有的混合菌群合成PHA的工艺相比，有如下优点：
本发明采用奇数碳脂肪酸驯化菌群和合成PHA，与偶数碳脂肪酸为底物相比，合成的PHA中3HV、3H2MV等单体的比例较高，因此PHA产物的理化性质和机械性能可得到提升；本发明采用底物浓度从低到高的驯化方式，而非固定的底物浓度，从而提高菌群的稳定性和对奇数碳脂肪酸底物的适应性，并使驯化后的菌群在最大程度上保留更多的PHA合成菌，提高菌群合成能力。
本发明提出在PHA混合菌群驯化完成后，同步进行菌群稳定富集和PHA合成，即保持在丰盛-饥饿模式下，于每个周期的丰盛期末收集70～80％菌体用于提取和回收PHA产物，另20～30％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期，实现周期性的PHA合成和提取，因而不再需要单独设置PHA批式合成反应器，简化操作过程，降低运行成本，在长期SBR反应器运行中保持并逐步提高PHA混合菌群的稳定性和合成能力，对进一步促进PHA合成的大规模产业化应用起到了重要作用。
附图说明
图1为本发明PHA菌群驯化稳定后，SBR反应器运行一个周期内菌群稳定富集同步PHA回收示意图；其中，①为丰盛期，②为饥饿期，③为总周期。
图2为本发明中pHA合成情况随底物戊酸浓度变化的运行效果图；其中，
Figure BDA0002118054110000031
为丰盛期长度柱状图，
Figure BDA0002118054110000032
为最大PHA合成率柱状图，
Figure BDA0002118054110000033
为最大PHA浓度柱状图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，具体步骤如下：
一、取总底物体积1/15量的活性污泥置于SBR反应器中，加入丙酸浓度为SCOD300mg/L的底物，开始驯化具有PHA合成能力的混合菌群；
二、一个驯化周期包含丰盛期和饥饿期，底物SCOD浓度的下降达到拐点时视为丰盛期结束，控制丰盛-饥饿比为1:3；饥饿期结束时对反应器内所有混合液进行离心以获得混合菌体，下一周期的菌体接种比例由OD600控制，接种后使初始OD600为0.3；
三、以周期最大PHA合成率和最大PHA浓度为指标，连续两周期的标准差小于5％判断为菌群稳定；在最低丙酸浓度菌群达到稳定后，将进样丙酸浓度依次增加为SCOD 1000、2000、4000mg/L，每次底物浓度提升需在菌群稳定后进行；
四、在最高底物浓度达到菌群稳定后，于每个周期的丰盛期末收集75％菌体用于回收、提取PHA产物，另25％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期。
五、重复步骤四的操作，即可实现在每个运行周期利用混合菌群以丙酸为底物合成聚羟基烷酸酯，PHA合成率可达35％以上。
本实施方式步骤一和步骤三中所述的底物除含有碳源外，还有氮源、磷源、微量元素和硫脲；
以(NH4)2SO4为氮源，以K2HPO4和KH2PO4为磷源，根据进水底物SCOD的不同调整氮源和磷源加入量，使C/N/P(摩尔比)＝150:10:1；
每1L底物中含有浓度为0.02g/L的硫脲和1mL的微量元素储备液，所述的微量元素储备液的组成为：1.5g/L MnSO4·H2O、0.2g/L CuSO4·5H2O、0.2g/L CoCl2·6H2O、0.2g/LZnSO4·7H2O、1g/L H3BO3、0.2g/L Na2SiO3·9H2O、0.05g/L Na2MoO4·2H2O、0.05g/L NiSO4·6H2O、1g/L EDTA-2Na。
本实施方式所述的SBR反应器需满足以下条件：在SBR反应器底部安装曝气装置，控制曝气速率使反应器内混合液的溶解氧大于2mg/L，并安装机械搅拌装置，控制搅拌速率为100rpm。
本实施方式采用奇数碳脂肪酸驯化菌群和合成PHA，与偶数碳脂肪酸为底物相比，合成的PHA中3HV、3H2MV等单体的比例较高，因此PHA产物的理化性质和机械性能可得到提升；本实施方式采用底物浓度从低到高的驯化方式，而非固定的底物浓度，从而提高菌群的稳定性和对奇数碳脂肪酸底物的适应性，并使驯化后的菌群在最大程度上保留更多的PHA合成菌，提高菌群合成能力。
本实施方式提出在PHA混合菌群驯化完成后，同步进行菌群稳定富集和PHA合成，即保持在丰盛-饥饿模式下，于每个周期的丰盛期末收集70～80％菌体用于提取和回收PHA产物，另20～30％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期，实现周期性的PHA合成和提取，因而不再需要单独设置PHA批式合成反应器，简化操作过程，降低运行成本，在长期SBR反应器运行中保持并逐步提高PHA混合菌群的稳定性和合成能力，对进一步促进PHA合成的大规模产业化应用起到了重要作用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤一中所述的取总底物体积1/10量的活性污泥置于SBR反应器中，微生物无过渡生长现象，PHA合成率可达35％以上。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点在于：所述的奇数碳脂肪酸为戊酸，PHA合成率可达35％以上，3HV单体和3H2MV单体比例之和可达30％以上。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点在于：步骤一中所述的加入奇数碳脂肪酸浓度为SCOD 500mg/L的底物，PHA合成率可达35％以上。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点在于：步骤二中所述的控制丰盛-饥饿比为1:4，PHA合成率可达40％以上。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点在于：步骤二中所述的接种后使初始OD600为0.35，微生物无过渡生长现象，PHA合成率可达35％以上。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点在于：步骤三中所述的将进样浓度依次增加为SCOD 1000、3000、5000mg/L，PHA合成率可达40％以上。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点在于：步骤四中所述的于每个周期的丰盛期末收集70％菌体用于回收、提取PHA产物，另30％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期，微生物保留时间稳定，PHA合成率可达35％以上。其它与具体实施方式一至七之一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
本实施例的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，具体步骤如下：
一、取100mL的高碑店污水处理厂的活性污泥置于工作体积为1L的SBR反应器中，反应器需满足以下条件：在SBR反应器底部安装曝气装置，控制曝气速率使反应器内混合液的溶解氧大于2mg/L，并安装机械搅拌装置，控制搅拌速率为100rpm。加入900mL戊酸浓度为SCOD 500mg/L，含氮源、磷源、微量元素和硫脲的底物，开始驯化具有PHA合成能力的混合菌群；
二、一个驯化周期包含丰盛期和饥饿期，底物SCOD浓度的下降达到拐点时(小于50mg/L)视为丰盛期结束，控制丰盛-饥饿比为1:3；饥饿期结束时对反应器内所有混合液进行离心以获得混合菌体，下一周期的菌体接种比例由OD600控制，接种后使初始OD600为0.3；
三、以周期最大PHA合成率和最大PHA浓度为指标，连续两周期的标准差小于5％判断为菌群稳定；在底物浓度为SCOD 500mg/L菌群达到稳定后，将进样浓度依次增加为以戊酸计SCOD 1000、2000、4000mg/L，每次底物浓度提升需在菌群稳定后进行；
四、在底物浓度为SCOD 3000mg/L菌群达到稳定后，于每个周期的丰盛期末收集75％菌体用于回收、提取PHA产物，另25％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期。
五、重复步骤四的操作，即可实现在每个运行周期利用混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯。
本实施例步骤二中所述的底物中的氮源、磷源、微量元素和硫脲的加入量及配比如下：
以(NH4)2SO4为氮源，以K2HPO4和KH2PO4为磷源，根据进水底物SCOD的不同调整氮源和磷源加入量，使C/N/P(摩尔比)＝150:10:1；
每1L底物中含有浓度为0.02g/L的硫脲和1mL的微量元素储备液，所述的微量元素储备液的组成为：1.5g/L MnSO4·H2O、0.2g/L CuSO4·5H2O、0.2g/L CoCl2·6H2O、0.2g/LZnSO4·7H2O、1g/L H3BO3、0.2g/L Na2SiO3·9H2O、0.05g/L Na2MoO4·2H2O、0.05g/L NiSO4·6H2O、1g/L EDTA-2Na。
本实施例的PHA合成情况随底物戊酸浓度变化的运行效果图如图2所示。通过本实施例中的工艺，可使得在戊酸浓度为SCOD 3000mg/LPHA菌群稳定后，丰盛期长度为24h，总周期长度为96h，丰盛期末细胞干重(CDW)达3g/L，PHA合成率达42.5％，PHA浓度达1.3g/L，收集其中75％菌体用于回收PHA产品，另25％饥饿期后接种于下一周期。本发明合成的PHA含3HV单体24％、3H2MV单体8％，机械加工性良好。

Claims (8)

1.混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于，步骤如下：
一、取总底物体积1/20～1/10量的活性污泥置于SBR反应器中，加入奇数碳脂肪酸浓度为SCOD 100～500mg/L的底物，开始驯化具有PHA合成能力的混合菌群；
二、一个驯化周期包含丰盛期和饥饿期，底物SCOD浓度的下降达到拐点时视为丰盛期结束，控制丰盛-饥饿比为1:3～1:5；饥饿期结束时对反应器内所有混合液进行离心以获得混合菌体，下一周期的菌体接种比例由OD600控制，接种后使初始OD600为0.3～0.4；
三、以周期最大PHA合成率和最大PHA浓度为指标，连续两周期的标准差小于5％判断为菌群稳定；在最低底物浓度菌群达到稳定后，将进样浓度依次增加为SCOD 1000、1500～3000、3500～5000mg/L，每次底物浓度提升需在菌群稳定后进行；
四、在最高底物浓度达到菌群稳定后，于每个周期的丰盛期末收集70～80％菌体用于回收、提取PHA产物，另20～30％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期；
五、重复步骤四的操作，实现在每个运行周期利用混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯。
2.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤一中所述的奇数碳脂肪酸为丙酸或戊酸。
3.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤一中所述的底物SCOD浓度为200～300mg/L。
4.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤一中所述的底物除含有碳源外，还有氮源、磷源、微量元素和硫脲，C/N/P的摩尔比＝150:10:1。
5.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤二中所述的控制丰盛-饥饿比为1:3。
6.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤二中所述的接种后初始OD600为0.35。
7.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤三中所述的将进样浓度依次增加为SCOD 1000、2000、4000mg/L。
8.根据权利要求1所述的混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于步骤四中所述的于每个周期的丰盛期末收集75％菌体用于回收、提取PHA产物，另25％菌体留在SBR反应器中在饥饿期后接种于下一周期。
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