CN105695531B - 一种控制分子量制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

一种控制分子量制备细菌纤维素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，在细菌纤维素制备过程中通过优化培养体系，并添加甘油醛或甘露糖直接作为封端碳源合成入产物分子中，使产物不再具备使纤维素分子链再增长的结构；由此达到控制分子链增长的目的，实现了分子量的控制，制备可溶解的不同分子量的BC。本发明制备方法，大大降低了细菌纤维素的分子量，同时产物的微观结构、产率、持水率、结晶指数、热稳定性及重现性都较好，操作简便，便于工业化生产。

Description

一种控制分子量制备细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种控制分子量制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素（BC）是一种以木醋杆菌(Acetobacter Xylinum, A.x)为代表的微生物合成的胞外多糖，是D-吡喃葡萄糖单体以β-1,4糖苷键聚合而成的直链高分子化合物，其聚合度(DPw)在1050-16800不等，直链间彼此平行且无分支结构，相邻糖链通过分子内和分子间氢键作用形成三维网状结构。BC具有植物纤维素无法比拟的一些优良性能，如纯度高、结晶度高、极佳的形状维持能力和抗撕力等，更重要的是BC在其合成时性能可调控，故而被认为是目前世界上最好的纤维素。但BC的溶解非常困难，如果采用BC作为模型化合物去深入研究纤维素，尤其需要可溶解且窄的甚至均一的分子量分布的BC。
但目前这样的报道及研究较少，2012年冯玉红等通过半乳糖醛酸合成了低相对分子质量的细菌纤维素；另外，Kunihiko Waanabe等通过在合成体系中添加一些不能使分子链端再增长的封端单体，如甘油（glycerol）来达到生物合成控制分子量的目的。所以，非常有必要寻求控制分子量的行之有效切实和工业化的方法，来制备可溶解的不同分子量的BC。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，在细菌纤维素制备过程中通过优化培养体系，并添加甘油醛或甘露糖直接作为封端碳源合成入产物分子中，使产物不再具备使纤维素分子链再增长的结构；由此达到控制分子链增长的目的，实现了分子量的控制，制备可溶解的不同分子量的BC。
本发明技术方案为：
一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
1）菌种的活化：将木醋杆菌菌种经固体斜面培养基30℃恒温静置活化3～5天，再接种于种子培养基中，于25℃恒温静置培养2天，得液体活化种子液；
2）BC膜的制备：将液体活化种子液以体积分数为4.0～8.0%的接种量，接入发酵培养基中，在发酵培养基里面添加浓度为5～20g/L的甘油醛或甘露糖作为封端碳源，28～32℃超声至完全溶解，超滤，滤液30℃恒温震荡2h，加碳酸氢钠的饱和水溶液调pH值至7.0，30℃静置培养2～3天，得到透明BC膜；
3）BC膜的纯化
将透明BC膜用超纯水冲洗24h，然后用质量浓度1～2%的氢氧化钠水溶液于90℃煮4h，再用乙酸中和PH值至7.0，最后用去离子水冲洗后，于28～32℃真空干燥至恒重，得到干态的细菌纤维素。
步骤1)中，所述的斜面培养基为每升含有硫酸铵3～5 g，硫酸镁0.2～1 g，琼脂15～20 g，余量为新鲜椰子水，pH 3.5～5.0；
步骤1)中，所述的种子培养基为每升含有蔗糖0～50g，硫酸铵3～5g，硫酸镁0.2～1g，磷酸二氢钾0.5～2g，余量为发酵椰子水，pH 3.50～5.00；
步骤2）中，所述的发酵培养基为每升含有蔗糖0～20g，硫酸铵3～5g，硫酸镁0.2～1g，磷酸二氢钾0.5～2g，余量为发酵椰子水，pH 3.50～5.00；
上述发酵椰子水优选新鲜椰子水自然发酵3～5天；
进一步地，所述的发酵椰子水更优选新鲜椰子水添加2～5wt%鲜榨紫薯汁后自然发酵3～5天。
本发明控制分子量制备细菌纤维素的方法，其有益效果为： 以椰子水为主要培养体系，通过优化培养基成分及在BC膜制备的发酵过程中添加不同比例的封端碳源甘露糖或者甘油醛，大大降低了BC的分子量，同时产物的微观结构、产率、持水率、结晶指数、热稳定性及重现性都较好，操作简便，便于工业化生产。
附图说明
图1 为细菌纤维素的红外谱图，图中1为只加蔗糖，2为只加甘油醛，3为只加甘露糖；
图2为分别以纯的蔗糖、甘露糖和甘油醛合成细菌纤维素的扫描电镜图，a蔗糖，b甘露糖，c甘油醛；
图3为不同碳源合成细菌纤维素的X-射线衍射谱图，1蔗糖，2甘露糖，3甘油醛；
图4为不同碳源合成细菌纤维素的热失重曲线图，1 蔗糖，2甘露糖，3甘油醛。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明实施例主要原料、试剂和仪器
菌种：木醋杆菌Y05(Acetobacter xylinum Y05)，购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC M207163。
试剂：新鲜椰子水；新鲜椰子水自然发酵3～5天的发酵椰子水；新鲜椰子水添加2～5wt%鲜榨紫薯汁后自然发酵3～5天的发酵椰子水；甘露糖、甘油醛及其他试剂均为分析纯。
仪器：傅里叶变换红外光谱仪（TENSOR27型）：德国Bruker公司；多晶X射线衍射仪(D8 Advance)：德国Bruker公司；凝胶色谱分析仪（Waters1515 HPLC泵，Waters2414示差检测器）：美国Waters公司；扫描电镜(S-3000N)：日本Hitachi公司；热失重分析仪(SDT-Q600)：美国TA公司。
实施例1（发酵培养基中蔗糖：甘油醛质量比为10:10）
一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
1）菌种的活化：将木醋杆菌菌种经固体斜面培养基30℃恒温静置活化4天，再接种于种子培养基中，于25℃恒温静置培养2天，得液体活化种子液；斜面培养基为每升含有硫酸铵4g，硫酸镁0.5 g，琼脂18 g，余量为新鲜椰子水，pH 4.0；种子培养基为每升含有蔗糖25g，硫酸铵4g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1.5g，余量为发酵椰子水，pH 4.5；
2）BC膜的制备：将液体活化种子液以体积分数为6.0%的接种量，接入发酵培养基中，在发酵培养基里面添加浓度为10g/L的甘油醛，28℃超声至完全溶解，超滤，滤液30℃恒温震荡2h，加碳酸氢钠的饱和水溶液调pH值至7.0，30℃静置培养2天，得到透明BC膜；发酵培养基为每升含有蔗糖10g，硫酸铵4g，硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾1.5g，余量为自然发酵椰子水，pH 4.5；
3）BC膜的纯化
将透明BC膜用超纯水冲洗24h，然后用质量浓度1.5%的氢氧化钠水溶液于90℃煮4h，再用乙酸中和PH值至7.0，最后用去离子水冲洗后，于30℃真空干燥至恒重，得到干态的细菌纤维素。
步骤1)和2）中，所述的发酵椰子水为新鲜椰子水添加3wt%鲜榨紫薯汁后自然发酵4天。
实施例2～4：
方法同实施例1，不同之处在于发酵培养基中蔗糖：甘油醛质量比依次为15:5、5:15、0:20。
实施例5（发酵培养基中蔗糖：甘露糖质量比为10:10）
一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
1）菌种的活化：将木醋杆菌菌种经固体斜面培养基30℃恒温静置活化3天，再接种于种子培养基中，于25℃恒温静置培养2天，得液体活化种子液；斜面培养基为每升含有硫酸铵3 g，硫酸镁0.2 g，琼脂15 g，余量为新鲜椰子水，pH 3.5；种子培养基为每升含有蔗糖5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钾0.5g，余量为发酵椰子水，pH 4.00；
2）BC膜的制备：将液体活化种子液以体积分数为4.0%的接种量，接入发酵培养基中，在发酵培养基里面添加浓度为10g/L的甘露糖，28℃超声至完全溶解，超滤，滤液30℃恒温震荡2h，加碳酸氢钠的饱和水溶液调pH值至7.0，30℃静置培养3天，得到透明BC膜；发酵培养基为每升含有蔗糖10g，硫酸铵3g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钾0.5g，余量为自然发酵椰子水，pH 3.50；
3）BC膜的纯化：将透明BC膜用超纯水冲洗24h，然后用质量浓度2%的氢氧化钠水溶液于90℃煮4h，再用乙酸中和PH值至7.0，最后用去离子水冲洗后，于28℃真空干燥至恒重，得到干态的细菌纤维素。
步骤1)和2）中，所述的发酵椰子水为新鲜椰子水自然发酵3天。
实施例6～8：
方法同实施例5，不同之处在于发酵培养基中蔗糖：甘露糖质量比依次为15:5、5:15、0:20。
实施例9
一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
1）菌种的活化：将木醋杆菌菌种经固体斜面培养基30℃恒温静置活化5天，再接种于种子培养基中，于25℃恒温静置培养2天，得液体活化种子液；斜面培养基为每升含有硫酸铵5 g，硫酸镁1g，琼脂20 g，余量为新鲜椰子水，pH5.0；种子培养基为每升含有蔗糖50g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，余量为发酵椰子水，pH 5.00；
2）BC膜的制备：将液体活化种子液以体积分数为8.0%的接种量，接入发酵培养基中，在发酵培养基里面添加浓度为20g/L的甘油醛，32℃超声至完全溶解，超滤，滤液30℃恒温震荡2h，加碳酸氢钠的饱和水溶液调pH值至7.0，30℃静置培养3天，得到透明BC膜；发酵培养基为每升含有蔗糖20g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，余量为自然发酵椰子水，pH 5.00；
3）BC膜的纯化
将透明BC膜用超纯水冲洗24h，然后用质量浓度2%的氢氧化钠水溶液于90℃煮4h，再用乙酸中和PH值至7.0，最后用去离子水冲洗后，于32℃真空干燥至恒重，得到干态的细菌纤维素。
步骤1)和2）中，所述的发酵椰子水为新鲜椰子水自然发酵3天。
对比例1
方法同实施例1，不同之处在于步骤2）BC膜的制备发酵培养基中含蔗糖20g/L，在发酵培养基里面不添加甘油醛或甘露糖。
细菌纤维素性能测试：以实施例1～8及对比例1制备的细菌纤维素（即纯化后的BC薄膜）为测试对象。
测试方法
1.1持水率测试
用滤纸吸取纯化后的BC薄膜表面的水分，所得膜定义为湿膜，称其湿膜质量m1；80℃干燥至恒重，所得膜定义为干膜，其质量为m2。持水率按（1）式计算
1.2BC薄膜的产率
培养皿中的膜于80℃干燥至恒重，称其质量为m (g)，培养皿中原培养液体积为V(L)，BC薄膜的产率R（g/L）为：
1.3BC薄膜的表征
傅里叶变换红外光谱分析：KBr压片。
扫描电镜表征：放大倍数8000倍。
X-射线衍射仪测试：Cu靶，管压40 kV，管流40 mA，扫描范围为5o-40o。
热重分析：N2气氛，升温速率为10℃/min，温度范围为30℃～600℃。
1.4 衍生化和凝胶色谱分析
取BC粉末0.1g至100mL圆底烧瓶中，加2.5mL三氟乙酸（TFA）和0.8mL三氟乙酸酐（TFAA），常温下磁力搅拌2～3h后得到高粘度透明溶液，向内加6mL氯仿稀释，室温放置16h，用200mL二乙醚沉淀、洗涤，得到白色聚合物。产物于室温下80 Pa放置20h，后150℃，80 Pa干燥40min除去TFA或二乙醚，得纯细菌纤维素三氟乙酸酯（CTFA）。取CTFA0.3g，用色谱纯的四氢呋喃（THF）1mL溶解，过滤后进样。色谱柱为聚苯乙烯凝胶柱，标样为聚苯乙烯，柱温为45℃，流速为1mL/min，保留时间为15 min。
2 性能测试结果
2.1 持水率测试
由表1所示，添加甘露糖后产物的持水率成上升的趋势，而添加甘油醛后产物的持水率成下降的趋势，但甘露糖或者甘油醛的添加量对其持水率没有太大的变化。
表1 实施例及对比例不同质量比的蔗糖与甘露糖或者甘油醛的产物的持水率
2.2 BC的产率
由表2可以看出，培养基中添加甘露糖后，产物的产率较未添加甘露糖的要大，且随着甘露糖添加量的增加，产物的产率逐渐增大，而培养基中添加甘油醛后，产物的产率较未添加甘油醛的要小，且随着甘油醛添加量的增加，产物的产率逐渐减小。
表2 实施例及对比例不同质量比的蔗糖与甘露糖或者甘油醛的产物的产率
2.3 BC的表征
2.3.1傅里叶变换红外光谱分析
细菌纤维素红外谱图如图1所示，只加蔗糖的BC（1）、只加甘露糖的BC（3）和只加甘油醛的BC（2）的红外谱图，对照三个图的红外特征峰，几乎完全一至，说明它们产物的结构是一样的。
2.3.2 扫描电镜表征
分别以纯的蔗糖、甘露糖和甘油醛合成细菌纤维素的扫描电镜图如图2，由图2可见都有明显的三维网状结构，纤维带之间通过氢键交织成三维网状结构， BC因其三维网状结构而具有良好的机械性能与极佳的吸湿性能，但添加甘露糖和甘油醛合成的BC的三维网状结构立体感更强。
2.3.3 X-射线衍射仪测试
图3所示为培养基中添加蔗糖、甘露糖和甘油醛等不同碳源所得产物的X-射线衍射谱图，由图3可以看出，添加甘露糖或者甘油醛后，产物的衍射峰变弱。用JADE5.0软件计算产物的结晶指数，其结果如表3所示。甘露糖或者甘油醛的添加，产物的结晶指数呈下降的趋势，但变化不大。
表3不同碳源合成BC的结晶指数
2.3.4 热重分析
图4所示为以蔗糖、甘露糖和甘油醛等不同碳源合成BC的热失重曲线图，由图4可知，三者的热失重曲线几乎重合，都有明显的三个失重过程，100℃前的失重是含水的一个失重过程，250-380℃是BC的一个碳化分解过程，380-600℃是BC中的菌体或脂质蛋白等成分的分解，此时基本全部分解。但不同碳源不同比例的合成的BC的失重百分比差别不大。
2.3.5凝胶色谱测试
由表4可见，添加不同碳源如甘露糖或者甘油醛所得产物的纤维素三氟乙酸酯的分子量比用蔗糖为碳源合成BC的纤维素三氟乙酸酯的分子量降低了10万多，相对分子质量分布指数增大，但不同比例的甘露糖或者甘油醛其分子量和相对分子质量分布指数的变化不大。由此可见，添加甘露糖或者甘油醛产物的分子量会下降，相对分子质量分布指数会增大，但甘露糖或者甘油醛的添加量对产物的分子量和相对分子质量分布指数没有太大影响。
表4 实施例1～8及对比例1不同质量比蔗糖与甘露糖或者甘油醛产物的纤维素三氟乙酸酯的分子量及分布
由上述分析可知，以椰子水为主要培养体系，添加不同比例的蔗糖/甘露糖或者甘油醛为封端碳源，随着甘露糖或者甘油醛的增加产物的结构、微观结构、产率、持水率及结晶指数及热稳定性都没有太大差别，但甘露糖或者甘油醛的添加却大大降低了BC的分子量，所以甘露糖或者甘油醛作为封端碳源来合成细菌纤维素可有效控制其分子量。

Claims (6)

1.一种控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）菌种的活化：将木醋杆菌菌种经固体斜面培养基30℃恒温静置活化3～5天，再接种于种子培养基中，于25℃恒温静置培养2天，得液体活化种子液；
2）BC膜的制备：将液体活化种子液以体积分数为4.0～8.0%的接种量，接入发酵培养基中，在发酵培养基里面添加浓度为5～20g/L的甘油醛或甘露糖作为封端碳源，28～32℃超声至完全溶解，超滤，滤液30℃恒温震荡2h，加碳酸氢钠的饱和水溶液调pH值至7.0，30℃静置培养2～3天，得到透明BC膜；
3）BC膜的纯化：将透明BC膜用超纯水冲洗24h，然后用质量浓度1～2%的氢氧化钠水溶液于90℃煮4h，再用乙酸中和PH值至7.0，最后用去离子水冲洗后，于28～32℃真空干燥至恒重，得到干态的细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的斜面培养基为每升含有硫酸铵3～5 g，硫酸镁0.2～1 g，琼脂15～20 g，余量为新鲜椰子水，pH 3.5～5.0。
3.根据权利要求1所述的控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的种子培养基为每升含有蔗糖0～50g，硫酸铵3～5g，硫酸镁0.2～1g，磷酸二氢钾0.5～2g，余量为发酵椰子水，pH 3.50～5.00。
4.根据权利要求1所述的控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于：步骤2）中，所述的发酵培养基为每升含有蔗糖0～20g，硫酸铵3～5g，硫酸镁0.2～1g，磷酸二氢钾0.5～2g，余量为发酵椰子水，pH 3.50～5.00。
5.根据权利要求3或4所述的控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的发酵椰子水为新鲜椰子水自然发酵3～5天。
6.根据权利要求3或4所述的控制分子量制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的发酵椰子水为新鲜椰子水添加2～5wt%鲜榨紫薯汁后自然发酵3～5天。
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