CN112011581A - 一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法及其应用 - Google Patents

一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法，所述方法包括：将能够产生细菌纤维素膜的菌株，在酸性发酵培养基中静态发酵培养，形成所述细菌纤维素膜；其中，所述发酵培养基中含有多糖，含有或者不含有琼脂。本发明能快速制备均一性好、纤维孔隙率高，可作为生物膜基材使用的细菌纤维素膜，本发明的方法具有发酵时间短，成本低廉且易于实现大规模的培养的优点。

Description

一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法及其应用。
背景技术
细菌纤维素是由细菌产生的一种纯净的纤维素，是目前发现的自然界中天然存在最细的纳米级纤维。细菌纤维素具有的优良特征包括具有较高的生物相容性和良好的生物可降解性，较高的亲水性和持水性能，较高结晶度，100％的纯净度，较高的化学吸附能力，较好的机械性能，高弹性，高回弹性及高拉伸强度。这众多优点使细菌纤维素具有作为各类医学材料运用的潜力。目前已有研究证明细菌纤维素能够运用在创面敷料、人造皮肤、人造血管、骨组织再生材料、人工角膜、心脏瓣膜等，具有较高的医用价值。
细菌纤维素在医疗材料上的应用主要是膜类材料，以纯净纤维素膜、片状聚合膜或复合膜为主。目前运用微生物发酵生产细菌纤维素主要有静态培养、振荡培养和搅拌培养的方法，振荡培养的细菌纤维素呈球状或毛绒状，搅拌培养得到的细菌纤维素呈絮状，只有静态培养能够通过直接发酵得到层状、片状的纤维素膜。
目前液体静止发酵方法得到的纤维素膜存在均一性不高、发酵时间长、孔隙较少以及生产难以扩大的问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法，利用该方法发酵获得的细菌纤维素膜均一性高，孔隙率高，该方法还具有简单易行，发酵时间短，成本低廉且易于实现大规模培养的特点。
本发明提供一种快速发酵均一细菌纤维素膜(利用酸性培养基快速制备均一的细菌纤维素膜)的方法，具体包括以下步骤：
发酵菌株是能够产生细菌纤维素膜的菌株，发酵培养基内含有多糖、有或者没有琼脂，培养基为酸性，发酵周期为24～72小时，形成的细菌纤维素膜的厚度为1-3mm。该细菌纤维素膜均一性好、透明度高、纤维孔隙率高，该方法易于实现大规模培养。该方法包括以下步骤：
(1)种子培养基配制
其中，每升所述种子培养基中包含的各组成成分及其含量为：葡萄糖20～30 g，酵母粉5～10g，蛋白胨5～10g，玉米浆10～20g，磷酸氢二钠1.5～3g，柠檬酸1～1.5g，其余为水，pH值(5.00～6.00)。
优选地，所述种子培养基中包含的各组成成分及其含量为：葡萄糖20g，酵母粉5g，蛋白胨5g，玉米浆10g，磷酸氢二钠2.7g，柠檬酸1.15g，pH值6.00。
(2)发酵培养基配制
其中，每升所述发酵培养基中包含的各组成成分及其含量为：碳源30～70g，有机氮源10～20g，磷酸氢二钠1.5～3g，柠檬酸1～1.5g，多糖0.1～10g，琼脂 0～15g，补水到1L，pH值4.0～5.5。115℃灭菌20min，冷却至40℃～50℃，添加 3～15mL乙醇，混合均匀后分装到无菌的发酵容器中。
优选地，每升所述发酵培养基中包含的各组成成分及其含量为：碳源40g，有机氮源20g，磷酸氢二钠2.7g，柠檬酸1.15g，多糖为海藻酸钠5g，琼脂7g，补水到1L，pH值5.0。115℃灭菌20min，冷却至40℃～50℃，添加10mL乙醇，混合均匀后分装到无菌的发酵容器中。
(3)种子液制备：使用种子培养基活化产细菌纤维素菌株，将活化的菌液以体积比1～5％的接种量转接-新种子培养基，在28℃～30℃、120～250r/min条件下振荡培养至对数生长期(优选培养12～16小时)。使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液。
所述“种子培养基活化产细菌纤维素菌株”具体步骤为：将甘油保存的菌种倒入种子培养基，在28～30℃、120～200r/min条件下振荡培养24小时。
优选地，所述“种子培养基活化产细菌纤维素菌株”具体步骤中，将甘油保存的菌种倒入种子培养基，在30℃、200r/min条件下振荡培养24小时。
优选地，所述菌种种子液制备包括：使用种子培养基活化产细菌纤维素菌株，将活化的菌液以体积比3％的接种量转接新种子培养基，在30℃、200r/min条件下振荡培养16小时。使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液。
(4)静态发酵培养：将发酵培养基灭菌后，在无菌条件下分装到事先灭好菌的容器中，并冷却，然后将种子液以体积比8％～30％的接种量小心接种到凝结的发酵培养基表面，静态培养24-72小时，得到细菌纤维素膜。其中，即使发酵培养基中不含琼脂，而由于其中含有多糖，发酵培养基也可以凝结，形成较软固体培养基，从而可以实现菌种在培养基表面静态培养。这也是本发明的创新发明点之一。
其中，发酵培养的温度为28-32℃。优选地，所述发酵培养的时间为30℃。
优选地，所述发酵培养的时间为48小时。
(5)细菌纤维素膜的制备：取出生长在容器培养基表面的纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L 的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
上述方法中所用的产生细菌纤维素膜的菌包括醋酸菌属(Acetobacter)、葡糖醋杆菌属Gluconacetobacter、驹形杆菌属Komagataeibacter、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Aehromobaeter)、产碱杆菌属(lcaligcncs)、气杆菌属(Aerobaeter)、固氮菌属(Azotobaeter)、根瘤菌属 (Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等能够产生细菌纤维的菌株中的一种或多种。
上述方法中所用的发酵培养基中碳源为葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘油、蔗糖等中的一种或多种。
上述方法中所用的发酵培养基中有机氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米浆等中的一种或多种。
上述方法中所用的发酵培养基中多糖为羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、瓜尔豆胶、黄原胶、卡拉胶中的一种或多种，主要作用是增加发酵培养基的粘度，可以在静态条件下为纤维素产生菌提供一定的悬浮支撑，有利于形成纤维束排列更加整齐的层状结构。
上述发酵培养基中添加的多糖，所述发酵培养基内的多糖作为单一种类添加的浓度最适范围分别为羧甲基纤维素钠2～7g/L，海藻酸钠2～7g/L，瓜尔豆胶 1～5g/L，黄原胶0.5～5g/L，卡拉胶0.5～5g/L。
上述发酵培养基中添加的多糖，所述发酵培养基内的多糖作为多种种类添加的浓度最适范围为0.1～7g/L。
上述方法中所用的发酵培养基呈酸性，pH值在4.0～5.5之间。
上述方法中，需要在发酵培养基凝结以前添加一定量乙醇，能够有效促进细菌生产细菌纤维素。
上述方法中，乙醇的添加应该在发酵培养基凝结以前，有助于乙醇均匀分散在培养基的其他成分中。
上述方法中，乙醇的添加应该在接种种子液以前，能够防止添加乙醇的瞬间，培养基内局部高浓度的乙醇对细菌造成损伤。优选地，一边添加乙醇一边搅拌。
上述方法中，静态发酵所用的容器为培养皿、扁瓶、方盒等具有一定表面积的容器。本发明中，所述“一定表面积”是指静置条件下，培养基凝结后要与空气有一定的接触面积，接触面积应大于1cm2，接触面积与所用培养基的体积比应大于3(cm2/mL)。
上述方法中，细菌纤维素膜厚度为0.5～5mm。
上述方法中使用种子培养基振荡培养菌体，将菌体培养至生长对数期时，采用无菌脱脂棉过滤的方法去除成束状的细菌纤维素，将去除束状纤维素的菌液作为种子液接种发酵。
本发明中，所述方法的机理为，所添加的大分子多糖为细菌纤维素提供黏附的模板，细菌产生的细菌纤维素大分子长链可以通过氢键作用黏附于多糖分子链 (如图28所示)。所述多糖的添加而提供的模板使细菌纤维素的排布更具规律性。多糖的黏附作用使细菌纤维素丝之间的绞合度降低，形成了更大的纤维缝隙(如图29所示)。
本发明还提供了所述发酵方法制备得到的细菌纤维素膜。
本发明还提供了所述细菌纤维素膜在作为医用敷料、医用载药材料、生物膜类材料中的应用。
本发明采用三种措施来确保生产0.1～5mm厚度范围内的均一性好，即肉眼观察膜片无裂痕，无星点状结块；透明度高，在波长为600纳米处的光透过率高于35％；纤维孔隙率高的细菌纤维素膜。一、低pH条件下培养基形成较软的固体的平整平面，使纤维素产生菌能够在表面上生长并分泌纤维素，形成均一透明的纤维素膜；二、在发酵培养基中添加大分子的多糖物质，在培养基中能增加培养基的粘度，可以在静态条件下为纤维素产生菌提供一定的悬浮支撑，有利于形成纤维束排列更加整齐的层状结构；三、在发酵培养基中添加乙醇能够有效提高纤维素的产量，缩短细菌纤维素的发酵时间。
本发明提供一种细菌纤维素膜类材料的制备方法，该方法简单易行，发酵时间短，成本低廉且易于实现大规模的培养，利用该方法能快速制备细菌纤维素膜，得到的细菌纤维素膜均一性高，孔隙率高的特点。解决了目前利用微生物发酵制备纤维素膜材料的生产中存在的均一性不高，发酵时间长，孔隙较少，以及生产难以扩大的问题。以本发明方法制备的细菌纤维素膜材料能够作为医用敷料、医用载药材料、生物膜类材料应用。
附图说明
图1为通过实施例1发酵所得细菌纤维素膜。
图2为通过实施例2发酵所得细菌纤维素膜。
图3为图2膜材料的扫描电镜图。
图4为图2膜材料的流变性能测定图。
图5为图2的膜材料的透光度测定图。
图6为通过实施例3发酵所得细菌纤维素膜。
图7为通过实施例4发酵所得细菌纤维素膜。
图8为通过实施例5发酵所得细菌纤维素膜。
图9为图8膜材料的表面扫描电镜图。
图10为图8膜材料的内部扫描电镜图。
图11为图8膜材料的流变性能测定图。
图12为图8的膜材料的透光度测定图。
图13为通过实施例6发酵所得细菌纤维素膜。
图14为通过实施例9发酵所得细菌纤维素膜。
图15为通过实施例10发酵所得细菌纤维素膜。
图16为通过实施例11发酵所得细菌纤维素膜。
图17为通过实施例12发酵所得细菌纤维素膜。
图18为通过实施例13发酵所得细菌纤维素膜。
图19为通过实施例14发酵所得细菌纤维素膜。
图20为通过实施例15发酵所得细菌纤维素膜。
图21为通过实施例16发酵所得细菌纤维素膜。
图22为通过实施例17发酵所得细菌纤维素膜。
图23为通过实施例18发酵所得细菌纤维素膜。
图24为通过实施例19发酵所得细菌纤维素膜。
图25为通过实施例20发酵所得细菌纤维素膜。
图26为通过实施例21发酵所得细菌纤维素膜。
图27为通过实施例22发酵所得细菌纤维素膜。
图28为不同大分子多糖与细菌纤维素形成氢键示意图。其中左边SodiumAlginate链表示海藻酸钠，中间的BC链为细菌纤维素，右边CMC链表示羧甲基纤维素钠。
图29为大分子多糖黏附细菌纤维素形成的纤维丝示意图。
其中，图1至图27为使用本发明制备细菌纤维素膜的方法，不同具体实施方式制备所得纤维素膜的图、及其性能测定图，其中，图1、图2、图6-8、图 13—27为不同实施方式制备的纤维素膜的图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
在以下表1为形成较软固体培养基的优选组合，(表格中符号为“√”项)。
表1.较软固体培养基优选组合
Figure RE-GDA0002212299100000061
Figure RE-GDA0002212299100000071
注：“N”表示不能形成较软固体培养基，“√”表示能形成较软固体培养基。
实施例1(对照例1)
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，调节pH值6.00，115℃灭菌20min，冷却备用。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养14～18小时，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液。
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以10％的接种量接入发酵培养基中，充分振荡均匀分装20mL于90mm培养皿中，30℃培养箱中静态培养4天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)发酵得到的纤维素膜肉眼观察不均一，呈现聚集的圆点形状(附图1证明)；薄厚也不均一，厚度在0.3～8mm之间均有分布，发酵周期较长达4天。
实施例1中，发酵培养基pH为酸性，发酵培养基未添加乙醇，细菌纤维素生产速度慢；发酵培养基中不含多糖，未形成凝结状态的表面平整的培养基，产生的细菌纤维素成圆形结块。
实施例2(对照例2)
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min，使用时添加乙醇10，振荡均匀。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以10％的接种量接入发酵培养基中，充分振荡均匀分装20mL于90mm培养皿中，30℃培养箱中静态培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)发酵得到的纤维素膜肉眼观察不均一，呈现聚集的星云形状的纹理(附图2证明)；薄厚不均一，厚度在0.3～8mm之间均有分布，发酵周期缩短为3天。
(7)利用扫描电镜观察所得细菌纤维素的微观结构，其结构致密、无规律性、纤维丝粗细不均一(附图3证明)。
(8)将所得细菌纤维素湿润膜用打孔器打成直径1.5cm的圆形，利用流变仪测定10个样品的储存模量，平均储存模量为88.13Pa±35.18Pa，组内标准差较大，样品均一性较差(附图4证明)。
(9)测定其光透过率，在光波长为600nm处的平均光透过率为55.7％，5 个样品重复性较差，说明膜均一性差(附图5证明)。
实施例2中，发酵培养基pH为酸性，发酵培养基中添加乙醇，细菌纤维素生产速度加快，3天即可达到0.3～8mm厚；发酵培养基中不含多糖、不含琼脂，未形成凝结状态的表面平整的培养基，产生的细菌纤维不均一，有星云状的纹理，不能作为纤维素膜材料使用。
实施例3
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，琼脂7，pH值6.00，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)观察发酵得到的纤维素，未得到均一的细菌纤维素膜，成膜部分的膜层薄厚不均，厚度在1～5mm之间，纤维素有星点状结块(附图6证明)，无法实现将整块纤维素膜材料取出。
实施例3中，发酵培养基pH为酸性，发酵培养基中添加乙醇，细菌纤维素生产速度加快，3天即可达到1～5mm厚；发酵培养基中添加琼脂，培养基凝结呈易碎的固体状态，不能生产均一的细菌纤维素膜，纤维素也不能作为纤维素膜材料使用。
实施例4
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值6.0，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，局部有星点状的结块，厚度为3～5mm之间。(附图7证明)。
实施例4中，发酵培养基pH为酸性，发酵培养基中添加乙醇，细菌纤维素生产速度加快，3天即可达到3～5mm厚；发酵培养基中添加多糖、琼脂，培养基凝结呈固体状态，比实施例3中的培养基韧性更佳，生产的细菌纤维素膜均一性得到改善，但局部仍然有星点状的结块。
实施例5
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20mL分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20mL发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块，厚度为3～3.5mm之间。(附图8证明)。
(7)利用扫描电镜观察所得细菌纤维素的微观结构，纤维素表面疏松多孔 (附图9证明)，内部结构成层状排列(附图10证明)、纤维丝较均一。
(8)将所得细菌纤维素湿润膜用打孔器打成直径1.5cm的圆形，利用流变仪测定10个样品的储存模量，平均储存模量为35.16Pa±3.69Pa，组内标准差较小，样品均一性较好(附图11证明)。
(9)测定其光透过率，在光波长为600nm处的平均光透过率为61.9％，5 个样品重复性较好，说明膜均一性好(附图12证明)。
实施例6
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值4.0，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块，厚度为3～4mm(附图13证明)。
实施例7
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值3.5，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)静置冷却后，培养基仍然呈现液体状态，不能凝结成较软固体培养基，无法使用本发明中的方法制备细菌纤维素膜。
实施例8
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值3.0，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)静置冷却后，培养基仍然呈现液体状态，不能凝结成较软固体培养基，无法使用本发明中的方法制备细菌纤维素膜。
实施例9
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值5.0，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图14证明)，厚度为3～5mm。
实施例10
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值5.5，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图15证明)，厚度为3～5mm。
实施例11
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值6.5，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜有局部的星点状结块，厚度在1～5 厘米间均有分布，没有形成平整均一的细菌纤维素膜(附图16证明)。原因是发酵培养基pH值为6.5，经过步骤(2)分装冷却后硬度高，不利于平整均一的细菌纤维素膜的生成。
实施例12
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值7.0，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养3天。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜有非常多的的星点状结块，厚度在1～5厘米间均有分布，没有形成平整均一的细菌纤维素膜(附图17证明)。原因是发酵培养基pH值为7.0，经过步骤(2)分装冷却后硬度高，不利于平整均一的细菌纤维素膜的生成。且该培养基pH非酸性，不利于产纤维素细菌的生长。
实施例13
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，羧甲基纤维素钠5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为1.8～2.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块。(附图18证明)。
实施例14
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，瓜尔豆胶2.5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2～2.5mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图19证明)。
实施例15
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，黄原胶1.2，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为4～4.3mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图20证明)。
实施例16
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，卡拉胶1.7，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为1.8～2.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图21证明)。
实施例17
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠2.5，羧甲基纤维素钠2.5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2.5～3.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图22证明)。
实施例18
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，卡拉胶2.5，pH值4.5，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2.5～3.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块。(附图23证明)。
实施例19
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，卡拉胶2.5，pH值5.5，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20mL分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2.5～3.0mm之间，，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块(附图24证明)。
实施例20
(1)种子培养基配制(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配制(g/L)：甘露醇40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，羧甲基纤维素钠5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，20ml分装于90mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接相同的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有20ml发酵培养基的90mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的 0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块，厚度为2～2.3mm之间(附图25证明)。
实施例21
(1)种子培养基配置(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00±0.02，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配置(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，海藻酸钠5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，120ml分装于150mm培养皿中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接100mL体系的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液。
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有120ml发酵培养基的150mm培养皿中，覆盖于发酵培养基表面。30℃培养箱中静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基，使用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2-6h，重复2-3次，使用0.1mol/L 的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2.5～3.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块。(附图26证明)。
实施例22
(1)种子培养基配置(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，玉米浆10，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，pH值6.00±0.02，115℃灭菌20min后作为种子培养基。
(2)发酵培养基配置(g/L)：葡萄糖40，酵母粉12.5，磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.15，羧甲基纤维素钠5，琼脂7，pH值4.3，115℃灭菌20min，稍微冷却后无菌操作添加乙醇10，振荡均匀，1200ml分装于620mm×420mm×95mm的容器中。
(3)种子液制备：使用250mL三角瓶，以30mL种子培养基体系活化CGMCC 1.1812木糖葡糖酸醋杆菌菌株，将活化的菌液以3％的接种量转接100mL体系的种子培养基，振荡培养至对数期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液。
(4)发酵培养：将(3)中制备的种子液振荡均匀，以20％的接种量接入含有1200ml发酵培养基的620mm×420mm×95mm的培养容器中，覆盖于发酵培养基表面。室温静置培养48h。
(5)细菌纤维素膜的提取：取出纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基，使用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2-6h，重复2-3次，使用0.1mol/L 的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性。
(6)观察发酵得到的纤维素膜，纤维素膜均一，厚度为2.5～3.0mm之间，没有任何裂痕，没有任何星点状的结块。(附图27证明)。
上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都涵盖在本发明保护范围内。

Claims (13)

1.一种快速发酵均一细菌纤维素膜的方法，其特征在于，将能够产生细菌纤维素膜的菌株，在酸性发酵培养基中静态发酵培养，形成所述细菌纤维素膜；其中，所述发酵培养基中含有多糖，含有或者不含有琼脂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用种子培养基振荡培养菌体，将菌体培养至生长对数期时，采用无菌脱脂棉过滤的方法去除成束状的细菌纤维素，将去除束状纤维素的菌液作为种子液接种发酵。
3.如权利要求2中所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)所述种子培养基配制
其中，每升所述种子培养基中包含的各组成成分及其含量为：葡萄糖20～30g，酵母粉5～10g，蛋白胨5～10g，玉米浆10～20g，磷酸氢二钠1.5～3g，柠檬酸1～1.5g，其余为水；
所述种子培养基pH值5.00～6.00；
(2)所述发酵培养基配制
其中，每升所述发酵培养基中包含的各组成成分及其含量为：碳源30～70g，有机氮源10～20g，磷酸氢二钠1.5～3g，柠檬酸1～1.5g，多糖0.1～10g，琼脂0～15g，其余为水；接种前向每升发酵培养基中添加3～15mL乙醇；
其中，所述发酵培养基的pH值为4.0～5.5；
(3)种子液制备
使用种子培养基活化产细菌纤维素菌株，将活化的菌液以1～5％的接种量转接种子培养基，振荡培养至对数生长期，使用无菌脱脂棉球过滤成束纤维素后作为种子液；
(4)静态发酵培养
将发酵培养基灭菌后，在无菌条件下分装到事先灭好菌的容器中，并冷却，然后将种子液以体积比8％～30％的接种量接种到凝结的发酵培养基表面，静态培养24-72小时。
(5)细菌纤维素膜的制备
取出生长在容器表面的纤维素膜，用水清洗去除纤维素膜上残留的培养基后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，去除碱液，再用新鲜的0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h后，重复3次，再使用0.1mol/L的乙酸浸泡20min，用水冲洗至中性后即为细菌纤维素膜。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产生细菌纤维素膜的菌株包括醋酸菌属Acetobacter、葡糖醋杆菌属Gluconacetobacter、驹形杆菌属Komagataeibacter、土壤杆菌属Agrobacterium、假单胞杆菌属Pseudomonas、无色杆菌属Aehromobaeter、产碱杆菌属lcaligcncs、气杆菌属Aerobaeter、固氮菌属Azotobaeter、根瘤菌属Rhizobium和八叠球菌属Sarcina。
5.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘油、蔗糖中的一种或多种。
6.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的有机氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米浆中的一种或多种。
7.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的多糖为羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、瓜尔豆胶、黄原胶、卡拉胶中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中单一种类的多糖添加浓度的最适范围分别为羧甲基纤维素钠2～7g/L，海藻酸钠2～7g/L，瓜尔豆胶1～5g/L，黄原胶0.5～5g/L，卡拉胶0.5～5g/L。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中多种类型多糖同时添加的最适浓度范围是0.1～7g/L。
10.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值在4.0～5.5之间。
11.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述静态发酵所用的容器为具有一定表面积的容器。
12.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述静态发酵的时间为24～72小时，和/或，所述细菌纤维素膜的厚度为0.5～5mm。
13.如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述细菌纤维素膜均一性好、透明度高、纤维孔隙率高。
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