CN114796009A - 一种快速生产细菌纤维素面膜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用固态培养基快速发酵生产细菌纤维素面膜的方法，所述方法包括：将能产生细菌纤维素的菌株在种子培养基中活化后，接种到固态发酵培养基中静态发酵培养，形成所述细菌纤维素面膜；其中，所述固态发酵培养基pH值为5.0～7.0。本发明所述方法能快速地生产均一性好、透明度高、贴肤性强的细菌纤维素面膜，且易于实现大规模培养。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种利用固态培养基快速发酵生产细菌纤维素面膜的方法。
背景技术
随着人们保养意识的提高，面膜作为清洁护理面部皮肤的化妆品受越来越多爱美人士的青睐。目前，市场上的面膜基材包括无纺布、纯棉纤维、水凝胶、生物纤维等。其中，无纺布面膜是市场上最常见的面膜，其质地蓬松，成本相对较低，但与皮肤亲和性不佳，厚重不服帖，透气性较差，且无纺布的生产过程中消耗大量的石油资源，为环境不友好型材料。因此，研究开发新的面膜基材有很大的应用价值。
细菌纤维素是由微生物代谢产生的一种纳米级纤维，具有许多的优良特性，如高纯度，高结晶度，高抗张强度和弹性模量，较高的亲水性和持水性能，良好的生物相容性和生物可降解性等。因此，这种新型生物纳米材料在膜类材料上具有很大的应用潜力。
目前运用微生物生产细菌纤维素主要有静态培养、振荡培养和搅拌培养的方法，只有静态培养能够直接发酵得到片状的纤维素膜。但通过液体静态发酵得到的纤维素膜存在均一性不高、发酵时间长、难以扩大培养等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用固态培养基快速发酵生产细菌纤维素面膜的方法。利用该方法发酵获得的细菌纤维素膜，厚度仅有0.1～0.5mm，而且均一性高，透明度高，贴肤性强，该方法操作简便，适用于大规模生产细菌纤维素面膜。
本发明提供了一种利用固态培养基发酵生产均一的细菌纤维素面膜的方法，包括以下步骤：
(1)将产细菌纤维素菌株加入种子培养基中，在28～30℃、120～200rpm(优选30℃、200rpm)条件下振荡培养20～24小时进行活化；
(2)将活化后的菌液以体积比3～8％(优选3％)的接种量转接至新种子培养基，在28～30℃、120～200rpm(优选30℃、200rpm)条件下振荡培养12～16小时至对数生长期得到种子液；
(3)然后将种子液以体积比12～15％(优选12％)的接种量接种至固态发酵培养基中，28～30℃(优选30℃)静态培养，形成细菌纤维素面膜。
本发明步骤(3)后还包括洗涤：将获得的细菌纤维素面膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min。最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜。
进一步包括保存步骤：将上述洗涤后的细菌纤维素面膜常规高温高压灭菌处理后保存。
步骤(1)中，所述产生细菌纤维素膜的菌株为木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacterxylinus)和汉氏驹形杆菌(Komagataeibacter hansenii)。
步骤(1)、(2)中，所述种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2～3％、酵母粉0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、磷酸氢二钠0.15～0.3％、柠檬酸0.1～0.15％，余量纯水，pH值为5.0～6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
优选地，所述种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。
步骤(3)中，所述固态发酵培养基由以下成分组成：果糖3～5％、酵母粉1～3％、磷酸氢二钠0.15～0.3％、柠檬酸0.1～0.15％、琼脂1.5～2.5％，余量纯水，pH值5.0～7.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至40～50℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装至无菌的发酵容器中。
优选地，所述发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至40～50℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装至无菌的发酵容器中。
步骤(3)中，所述静态培养时间为21-36小时；优选地，所述静态培养时间为21小时。
上述方法中，需要在固态发酵培养基凝结以前添加一定量的乙醇，能有效促进细菌生产细菌纤维素。
上述方法中，乙醇的添加应该在固态发酵培养基凝结以前，有助于乙醇均匀分散在培养基中。
上述方法中，使用种子培养基振荡培养菌株至对数生长期后，需使用无菌脱脂棉过滤去除成束状的细菌纤维素，以去除束状纤维素的菌液作为种子液接种发酵，有利于避免生产的细菌纤维素面膜出现星点状结块。
上述方法中，菌株发酵过程中转接种子液时，应使种子液均匀地分布在固态发酵培养基表面，能保证产生的细菌纤维素面膜厚度均一。
上述方法中，静态发酵所使用的容器为90mm培养皿、150mm培养皿，培养皿中固态发酵培养基含量分别为20mL、85mL。
优选地，所述发酵容器为150mm玻璃培养皿。
上述方法中，细菌纤维素面膜厚度为0.1～0.5mm；优选地，为0.3mm。
在一个具体实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)利用细菌发酵生产细菌纤维素面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21～36小时，形成的细菌纤维素面膜厚度为0.1～0.5mm；
a.菌株活化
将甘油管保存的产细菌纤维素菌种加入种子培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养20～24小时；
b.菌株传代
将活化后的菌液以体积比3％的接种量转接至新种子培养基，在30℃、200rpm条件下振荡培养12～16小时至对数生长期。使用无菌脱脂棉球过滤去除纤维素后作为种子液；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21～36小时，得到细菌纤维素膜。
(2)洗涤：将上述获得的细菌纤维素膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min。最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜。
(3)保存：将上述洗涤后的细菌纤维素面膜常规高温高压灭菌处理后保存。
本发明中，采用的固态发酵培养基能为产细菌纤维素菌提供支撑力，发酵过程中细菌纤维素膜贴附在培养基上生成，确保形成的细菌纤维素膜均一性高。
本发明还提供了由上述方法制备得到的细菌纤维素面膜。
所述细菌纤维素面膜厚度为0.1～0.5mm；优选地，为0.3mm。
所述细菌纤维素面膜均一性高，透明度高，贴肤性强。
本发明的有益效果包括：本发明采用的固态发酵培养基能为产细菌纤维素菌提供一定的支撑力，形成的细菌纤维素面膜均一性好。本发明通过控制发酵培养时间，有效地控制发酵产生的细菌纤维素面膜的厚度。本发明以150mm玻璃培养皿发酵培养产生细菌纤维素面膜，经简单剪裁后可直接用作面膜基材。本发明采用弱碱溶液浸泡、弱酸溶液中和、水浸泡处理的方法处理细菌纤维素面膜，制备所得细菌纤维素面膜均一性好、透明度高、贴肤性强。
附图说明
图1为通过本发明实施例1发酵所得细菌纤维素面膜；
图2为通过本发明实施例2发酵所得细菌纤维素面膜；
图3为通过本发明实施例3发酵所得细菌纤维素面膜；
图4为通过本发明实施例4发酵所得细菌纤维素面膜；
图5为通过本发明实施例5发酵所得细菌纤维素面膜；
图6为通过本发明实施例6发酵所得细菌纤维素面膜；
图7为通过本发明实施例7发酵所得细菌纤维素面膜；
图8为通过本发明实施例8发酵所得细菌纤维素面膜；
图9为通过本发明实施例8发酵所得细菌纤维素面膜。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的保护范围的限定。
实施例1(对照例1)
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为24小时；
a.菌株活化
将甘油管保存的产细菌纤维素菌种加入种子培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养20小时；
b.菌株传代
将活化后的菌液以体积比3％的接种量转接至新种子培养基，在30℃、200rpm条件下振荡培养12小时至对数生长期。使用无菌脱脂棉球过滤去除纤维素后作为种子液；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养24小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂0.7％，余量纯水，pH值4.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：将上述获得的细菌纤维素膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min。最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜；
(3)保存：将上述洗涤后的细菌纤维素面膜常规高温高压灭菌处理后保存。
实施例1中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为4.0，琼脂添加量为0.7％，为半固态培养基，发酵周期为24小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.36mm，肉眼观察不均一，且表面有裂缝(见图1)。
实施例2(对照例2)
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为36小时；
a.菌株活化
将甘油管保存的产细菌纤维素菌种加入种子培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养20小时；
b.菌株传代
将活化后的菌液以体积比3％的接种量转接至新种子培养基，在30℃、200rpm条件下振荡培养12小时至对数生长期。使用无菌脱脂棉球过滤去除纤维素后作为种子液；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养36小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂0.7％，余量纯水，pH值4.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：将上述获得的细菌纤维素膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min。最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜；
(3)保存：将上述洗涤后的细菌纤维素面膜常规高温高压灭菌处理后保存。
实施例2中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为4.0，琼脂添加量为0.7％，为半固态培养基，发酵周期延长至36小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度达0.5mm，肉眼观察较为均一，但经洗涤处理后无法呈现透明状态，且亲肤性较差，易滑落(见图2)。
实施例3
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
将甘油管保存的产细菌纤维素菌种加入种子培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养20小时；
b.菌株传代
将活化后的菌液以体积比3％的接种量转接至新种子培养基，在30℃、200rpm条件下振荡培养12小时至对数生长期。使用无菌脱脂棉球过滤去除纤维素后作为种子液；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值5.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：将上述获得的细菌纤维素膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min。最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜；
(3)保存：将上述洗涤后的细菌纤维素面膜常规高温高压灭菌处理后保存。
实施例3中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为5.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.16mm，肉眼观察较为均一，但细菌纤维素面膜边缘卷缩，不利于铺展(见图3)。
实施例4
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为24小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养24小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值5.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例4中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为5.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵周期为24小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.34mm，肉眼观察较为均一，韧性较好，但不够透亮(见图4)。
实施例5
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例5中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.22mm，肉眼观察较为均一，韧性较好，且经洗涤处理后较为透明(见图5)。
实施例6
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为24小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养24小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装20mL至90mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例6中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵周期为24小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.40mm，肉眼观察较为均一，但不够透亮。(见图6)。
实施例7
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值5.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm玻璃培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例7中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为5.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm玻璃培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度仅0.1mm，肉眼观察较为透明均一，较易铺展(见图7)。
实施例8
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例8中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm玻璃培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.16mm，肉眼观察较为透明均一，无星点状结块，无裂纹，韧性较好，易于铺展，与肌肤较为贴合(见图8、9)。
实施例9
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值7.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例9中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为7.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.12mm，肉眼观察较为透明均一，边缘有轻微卷缩。
实施例10
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂2％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例10中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为2％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.16mm，肉眼观察较为透明均一，韧性较好，不易撕裂，易于铺展，与肌肤较为贴合。
实施例11
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂2.5％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例11中，所用产细菌纤维素菌株为汉氏驹形杆菌(Komagataeibacterhansenii)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为2.5％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm玻璃培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.16mm，肉眼观察较为透明均一，韧性较好，不易撕裂，易于铺展，与肌肤较为贴合。
实施例12
(1)利用细菌发酵生产面膜：产细菌纤维素菌株活化，传代，接种至固态发酵培养基中，发酵周期为21小时；
a.菌株活化
同本发明实施例3；
b.菌株传代
同本发明实施例3；
c.菌株发酵
将上述制备种子液以体积比12％的接种量转接至固态发酵培养基表面，30℃静态培养21小时，得到细菌纤维素膜。
所述菌株活化使用的产细菌纤维素菌株为木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacterxylinus)。
所述菌株活化、菌株传代采用的种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，余量纯水，pH值为6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min。
所述菌株发酵采用的固态发酵培养基由以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5％，余量纯水，pH值6.0。将上述成分于115℃高压灭菌20min，冷却至45℃，添加1.5％乙醇，混合均匀后分装85mL至150mm培养皿中。
(2)洗涤：同本发明实施例3；
(3)保存：同本发明实施例3。
实施例12中，所用产细菌纤维素菌株为木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacterxylinus)，发酵培养基pH为6.0，琼脂添加量为1.5％，为固态培养基，发酵培养体系扩大至150mm玻璃培养皿，发酵周期为21小时，发酵得到的细菌纤维素面膜厚度约为0.16mm，肉眼观察较为透明均一，韧性较好，不易撕裂，易于铺展，与肌肤较为贴合。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (10)
1.一种以固态培养基快速发酵生产细菌纤维素面膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将产细菌纤维素菌株加入种子培养基中，在28～30℃、120～200rpm条件下振荡培养20～24小时进行活化；
(2)将活化后的菌液以体积比3～8％的接种量转接至新种子培养基，在28～30℃、120～200rpm条件下振荡培养12～16小时至对数生长期得到种子液；
(3)然后将种子液以体积比12～15％的接种量接种至固态发酵培养基中28～30℃静态培养，形成细菌纤维素面膜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)后还包括洗涤、保存步骤：将获得的细菌纤维素面膜以蒸馏水洗涤后，以0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h以去除残留细菌，重复3次，再用0.1mol/L的乙酸溶液浸泡20min；最后，用水洗去多余的弱酸溶液，使膜呈中性，即为细菌纤维素面膜；然后将洗涤后的细菌纤维素面膜高温高压灭菌处理后保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述产生细菌纤维素膜的菌株为木糖驹形氏杆菌Komagataeibacter xylinus和汉氏驹形杆菌Komagataeibacterhansenii。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中所述种子培养基由以下成分组成：葡萄糖2～3％、酵母粉0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、磷酸氢二钠0.15～0.3％、柠檬酸0.1～0.15％，余量纯水，pH值为5.0～6.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌株发酵采用的固态发酵培养基有以下成分组成：果糖3～5％、酵母粉1～3％、磷酸氢二钠0.15～0.3％、柠檬酸0.1～0.15％、琼脂1.5～2.5％，余量纯水，pH值5.0～7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌株发酵采用的固态发酵培养基有以下成分组成：果糖4％、酵母粉1.225％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％、琼脂1.5～2.5％，余量纯水，pH值6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述静态培养的时间为21～36小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌纤维素面膜的厚度为0.1～0.5mm。
9.根据权利要求1-8之任一项所述方法制备得到的细菌纤维素面膜。
10.根据权利要求9所述的细菌纤维素面膜，其特征在于，所述细菌纤维素面膜的厚度为0.1～0.5mm。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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