KR102295345B1

KR102295345B1 - 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주 및 이를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산방법

Info

Publication number: KR102295345B1
Application number: KR1020190144291A
Authority: KR
Inventors: 안지영; 김양훈; 이선형
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-08-30
Also published as: KR20210057490A

Abstract

본 발명은 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주, 상기 균주를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물 및 상기 균주를 박테리아 나노셀룰로오스 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)는 야생형 균주에 비하여 월등히 뛰어난 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는다. 따라서 본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 이용하는 경우 고부가가치 물질인 박테리아 나노셀룰로오스를 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주 및 이를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산방법{Mutant strain of gluconacetobacter hansenii having enhanced bacterial nano-cellulose productivity, and method for producing the bacterial nano-cellulose using the same}

본 발명은 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주, 상기 균주를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물 및 상기 균주를 박테리아 나노셀룰로오스 생산방법에 관한 것이다.

박테리아 나노셀룰로오스(Bacterial nanocellulose, 이하 간략하게 ‘BNC’라 약칭함)는 글루콘아세토박터 속 균주를 포함한 여러 종류의 세균이 생산할 수 있는 셀룰로오스를 말한다. BNC는 (C₆H₁₀O₅)n의 중합체로 구성되어 있으며, 높은 순도와 높은 수분 보유력, 다공성 등의 특징을 가지고 있다. 이러한 특성 덕분에 BNC는 현재 상처 드레싱, 약물 전달 시스템, 조직 공학 등 다양한 방면에 이용하기 위한 연구가 매우 활발히 수행되고 있다.

BNC가 상업적인 목적으로 활발히 이용되기 위해서는 높은 생산성을 필요로 하는데 기존의 균주에서는 충분한 생산성을 나타내지 못하므로 생산성의 향상이 필요한 시점이다. 많은 연구들에서 BNC의 생산성을 높이기 위하여 배양배지의 조성 및 배양조건을 변경하는 방법을 이용하고 있다. 그러나, 배양환경의 변경으로 인한 생산성 향상에는 한계가 존재하므로 생산성 향상을 위한 다른 방법이 필요하다.

한편, 글루콘아세토박터 한세니 균주가 BNC를 생산하기 위하여 관여되는 유전자에는 여러 종류가 존재한다. Acs 오페론, cmcAx, ccpAx, CRP/FNR 등의 많은 유전자가 BNC를 생산하는데 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이 중에서 직접적으로 BNC 생산에 연관되어 있는 것은 Acs 오페론이다. Acs 오페론은 Acs A, B, C, D 로 이루어져 있으며 Acs A는 셀룰로오스의 기본 단위를 형성하기 위해 UDP-글루코스를 이용하는 촉매 서브 유닛이다. Acs B는 cyclic di-GMP 결합 도메인을 갖는 조절 서브 유닛을 제공한다. Acs C는 유전자는 셀룰로오스 합성효소의 막 복합체 형성에서 주된 복합체이며 세포벽으로부터의 셀룰로오스 방출에 관여한다. Acs D는 셀룰로오스 사슬의 ß-1,4 결합을 절단하여 성숙한 셀룰로오스의 결정화에 관여하며 세포로부터의 셀룰로오스 방출을 위한 역할을 한다고 알려져 있다. 이 외에도 ccpAx, crp/fnr 등의 유전자가 존재하는데 ccpAx는 Cellulose-complimenting 단백질로써 BC crystallization/regulation에 관여한다. crp/fnr은 Cyclic-AMP receptor protein/fumarate-nitrate reductase 로, 전사조절인자로써의 역할을 한다.

본 발명자는 글루콘아세토박터 한세니 균주를 UV 조사를 통해 돌연변이시킨 후 BNC의 생산성이 높아진 글루콘아세토박터 한세니 균주를 분리하고자 하였으며, 그 결과 돌연변이 균주 중 특정 균주가 crp/fnr 유전자 변이를 통해 야생형에 비해서 BNC의 생산성이 월등히 높아진 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2009-0129068호 한국공개특허 제10-2018-0029450호

따라서 본 발명의 목적은 야생형 대비 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 박테리아 나노셀룰로오스 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 야생형 대비 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 AcsA, AcsD, ccpAx 및 crp/fnr 유전자의 발현량이 야생형 균주에 비해 증대될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 나노셀룰로오스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 탄소원으로 글루코오스, 프룩토오스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 탄소원 이외에 펩톤, 효모 추출물, Na₂HPO₄ 및 시트르산을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 pH 4 내지 pH 6 조건을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)는 야생형 균주에 비하여 월등히 뛰어난 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는다. 따라서 본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 이용하는 경우 고부가가치 물질인 박테리아 나노셀룰로오스를 효과적으로 생산할 수 있다.

도 1은 야생형 균주를 이용 배지의 탄소원을 달리하여 생성한 각 BNC의 SEM 촬영 결과이다.
도 2는 야생형 균주를 이용 배양 시간에 따른 BNC의 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 UV 돌연변이 유도 전 선별된 콜로니들의 BC 생산능력을 확인한 결과이다.
도 4는 UV 돌연변이 유도 이후 선별된 콜로니들의 BC 생산능력을 확인한 결과이다.
도 5는 배지의 종류별, pH 조건별 배양에 따른 돌연변이 균주와 야생형 균주의 BNC 생산량을 나타낸 표이다.
도 6a 내지 6d은 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. Reference는 NCBI에 존재하는 G. hansenii ATCC_23769, PC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능을 가진 G. hansenii 균주, NC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능이 없는 G. hansenii 균주, PM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능이 향상된 본 발명의 G. hansenii 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), NM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능을 잃은 G. hansenii 균주를 뜻한다.
도 7a 내지 7c는 AcsA 유전자의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. Reference는 NCBI에 존재하는 G. hansenii ATCC_23769, PC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능을 가진 G. hansenii 균주, NC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능이 없는 G. hansenii 균주, PM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능이 향상된 본 발명의 G. hansenii 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), NM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능을 잃은 G. hansenii 균주를 뜻한다.
도 8은 AcsD 유전자의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. Reference는 NCBI에 존재하는 G. hansenii ATCC_23769, PC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능을 가진 G. hansenii 균주, NC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능이 없는 G. hansenii 균주, PM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능이 향상된 본 발명의 G. hansenii 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), NM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능을 잃은 G. hansenii 균주를 뜻한다.
도 9a 내지 9d는 ccpAx 유전자의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. Reference는 NCBI에 존재하는 G. hansenii ATCC_23769, PC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능을 가진 G. hansenii 균주, NC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능이 없는 G. hansenii 균주, PM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능이 향상된 본 발명의 G. hansenii 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), NM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능을 잃은 G. hansenii 균주를 뜻한다.
도 10a 내지 10d는 crp/fnr 유전자의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. Reference는 NCBI에 존재하는 G. hansenii ATCC_23769, PC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능을 가진 G. hansenii 균주, NC는 돌연변이 유도 전 BNC 생산능이 없는 G. hansenii 균주, PM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능이 향상된 본 발명의 G. hansenii 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), NM은 돌연변이 유도 후 BNC 생산능을 잃은 G. hansenii 균주를 뜻한다.
도 11은 AcsA, crp/fnr, ccpAx, AcsD 네 유전자를 돌연변이 전과 후 G. hansenii에서 mRNA 발현량을 real-time PCR을 통해 확인한 결과이다.

본 발명은 야생형 대비 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 ‘박테리아 나노셀룰로오스(Bacterial nanocellulose, 이하 간략하게 ‘BNC’라 약칭함)‘는 글루콘아세토박터 속 균주를 포함한 여러 종류의 세균이 생산할 수 있는 셀룰로오스를 말한다. BNC는 (C₆H₁₀O₅)n의 중합체로 구성되어 있으며, 높은 순도와 높은 수분 보유력, 다공성 등의 특징을 가지며, 이러한 특성 덕분에 BNC는 현재 상처 드레싱, 약물 전달 시스템, 조직 공학 등 다양한 방면에 이용되고 있다.

본 발명에서 ‘야생형’이라 함은 돌연변이형에 대응하여 보통 자연상태에서 나타나는 정상형을 가리킨다.

본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)는 UV 조사를 통해 발생한 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이체이다. 변이주(돌연변이체)는 일반적으로 돌연변이원(약제 또는 자외선) 처리를 행하는 것, 계대 배양에 의한 적응 또는 자연 변이에 의해 제작될 수 있다. 본 발명에서는 UV 처리를 통해 발생한 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이체를 분리하였다.

본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주는 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 확인 결과, 기존 글루콘아세토박터 한세니와 16s rRNA의 서열이 100% 일치하는 것으로 나타났다.

이렇게 분리한 돌연변이 균주는, 2019년 8월 1일자로 기관에 기탁하였으며, 기탁기관으로부터 기탁번호 KCTC 13907BP를 부여받았다.

본 발명에서는 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)와 야생형간 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 비교하였으며, 그 결과 본 발명의 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)의 박테리아 나노셀룰로오스 생산량이 야생형에 비해 2~3배 뛰어남을 확인하였다. 또한, 상기 균주는 AcsA, AcsD, ccpAx 및 crp/fnr 유전자의 발현량이 야생형 균주에 비해 증대되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 야생형 대비 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)의 배양물을 제공한다.

본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)의 배양물은 상기 본 발명의 균주를 미생물 배양에 사용되는 공지된 배지 및 배양방법을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 배양하기 위하여, 미생물 배양에 사용되는 배지, 바람직하게는 초산균 배양에 사용되는 배지, 보다 바람직하게는 셀룰로오스 생산용 배지를 선택하여 사용함으로써 셀룰로오스를 보다 고수율로 생산할 수 있다

본 발명의 일 구체예에서 상기 균주의 배양배지는 2% 탄소원, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.27% Na₂HPO₄, 0.115% 시트르산을 포함할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 균주의 배양물은, 상기 배지에 본 발명의 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양 방법(예를 들어, 정치배양, 교반배양)에 따라, 바람직하게는 초산균 배양 방법에 따라, 보다 바람직하게는 1 중량%(배지 전체 중량 대비)로 접종하고 28~30℃에서 5 내지 10일간 배양하여 제조할 수 있다.

본 발명의 배양물은 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)에 의해 생산되는 나노셀룰로오스를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)는 야생형 대비 박테리아 나노셀룰로오스를 매우 효과적으로 생산할 수 있으므로 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물은 셀룰로오스를 생산하는 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 균주의 배양물의 제조방법에 대해서는 상기 기술한 바와 같으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 균주를 셀룰로오스 생산용 배지에 접종한 다음 정치배양 또는 교반배양하여 배양물을 제조할 수 있다. 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물은 당업계에 공지된 미생물 또는 배양물의 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 셀룰로오스 생산용 조성물에 1 내지 5 중량%로 함유될 수 있다.

본 발명은 또한, 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 나노셀룰로오스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 배지는 탄소원으로 글루코오스, 프룩토오스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 배지는 탄소원 이외에 펩톤, 효모 추출물, Na₂HPO₄ 및 시트르산을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배지는 pH 4 내지 pH 6 조건을 가질 수 있다.

본 발명의 박테리아 나노셀룰로오스의 생산 방법은 상기 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP)를 배지에서 배양하는 단계 이후에 배양단계에서 배양된 균주 배양물로부터 박테리아 나노셀룰로오스를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 균주의 배양을 통하여 셀룰로오스의 막이 형성된 것을 수산화나트륨 용액에 침지시킨 후, 증류수로 세척하여 순수한 셀룰로오스를 생산할 수 있다.

본 발명의 균주에 의해 생산된 박테리아 나노셀룰로오스는 매끄럽고, 견고성 및 탄력성이 우수하며, 열특성이 매우 우수한 나노 구조의 셀룰로오스로서 화학소재, 의약품 소재, 화장료 소재 등 다양한 산업분야에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

글루콘아세토박터 한세니( Gluconacetobacter hansenii ) 균주를 이용한 BNC의 생산 및 배양조건 설정 BNC 수분함량 측정

본 실험에서는 글루콘아세토박터 한세니의 배양 및 박테리아 나노셀룰로오스(Bacterial nanocellulose: 이하 간략하게 ‘BNC’라 약칭함)의 효율적인 생산을 위해서 배양 배지의 조성 및 배양조건을 달리하여 BNC의 생산량을 확인하였다.

<1-1> BNC의 생산

생산된 BNC의 특성 확인을 위하여 기본 배양조건을 이용하여 글루콘아세토박터 한세니를 배양하여 BNC를 생산하였다. 기본 배양에 사용된 배양 배지는 조성은 2% 글루코오스, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.27% Na₂HPO₄, 0.115% 시트르산을 이용하였고, 아세트산을 이용하여 배지의 pH를 5로 조절하였다. ATCC에서 분양받은 균주(ATCC 23769)는 위 조성의 배지에 2% 아가로오스를 첨가하여 만든 고체배지에 도말하여 28℃의 B.O.D 배양기에서 3일간 정치배양 하였다. 고체배지에 자란 균주를 채취하여 위 조성의 액체배지 10ml에 접종하여 28℃, 200rpm에서 일주일간 배양시킨 글루콘아세토박터 한세니 배양액을 4000rpm, 5분간 원심분리한 후, 1X PBS 버퍼를 이용해 3번 세척해 주었다. 이후, 위 조성의 배지를 이용하여 OD 600 값이 1.0이 되도록 현탁해 주었다. 이 현탁액을 플라스크 혹은 세포배양판에 접종하여 28℃의 B.O.D 배양기에서 7일간 정치배양 하였다.

배양 후 플라스크 혹은 세포배양판의 배지 표면에 생성된 BNC를 분리하여 채취하였으며 BNC를 사용하기 위한 세척 전처리를 수행하였다. 첫 번째 세척은 0.5M NaOH 용액에 BNC를 넣고 60℃에서 저어주며 30분 동안 진행하였다. 첫 번째 세척이 끝나면 80℃의 3차 증류수에 BNC를 옮겨 저어주며 30분 동안 두 번째 세척을 진행한다. 세척이 끝나면 새로운 3차 증류수에 BNC를 옮겨 121℃에서 20분간 멸균시켰다.

<1-2> 생산된 BNC의 세척 여부에 따른 특성 확인을 위한 SEM 촬영

세척 단계별 BNC의 형태를 확인하기 위하여 SEM 촬영을 진행하였다. 세척 전, NaOH 세척 후, 증류수 세척 후, 멸균 후의 BNC 총 네 종류의 형태를 확인하였다. SEM 촬영을 진행하기 전 각 BNC는 원활한 SEM 촬영을 위하여 동결건조를 수행하였다. 동결건조를 위하여 세포배양 접시에 커버글라스를 깔고 그 위에 BNC를 각각 올려주었다. 그 후, 세포배양 접시의 뚜껑에 주사바늘을 이용하여 5~6개의 구멍을 뚫어주고 뚜껑을 닫아 세포배양접시를 파라필름을 이용하여 뚜껑이 분리되지 않도록 봉한다.

위 과정이 끝나면 동결건조기에 BNC가 담긴 세포배양접시들을 넣고 -80℃에서 완전히 건조될 때 까지 6시간 이상 충분히 동결건조 하였으며, 건조가 완료된 BNC 샘플을 이용하여 SEM 촬영을 진행하였다. SEM 촬영 결과, 아예 세척을 거치지 않은 BNC의 경우 글루콘아세토박터 한세니 균들이 제거되지 않아 균들이 그대로 남아있는 모습을 보였으며 그로 인해 BNC의 형태를 확인할 수 없었다. NaOH 세척 후에는 균들은 제거되었으나 용액 안의 물질들로 인한 결정들로 뒤덮여있는 모습을 확인 할 수 있었고, 역시나 BNC의 형태는 확인할 수 없었다. 증류수 세척까지 마쳐야만 불순물들이 제거되어 제대로 된 BNC의 형태를 확인할 수 있었다. 하지만 증류수 세척까지만 진행할 경우 미처 제거되지 못한 불순물들이 조금씩 남아있어 사용에 적합하다고 판단되지 않았으며 멸균까지 끝마친 BNC만이 경우 거의 모든 불순물이 제거되어 사용에 적합하다고 판단되었다(결과 미도시).

<1-3> 배양 배지의 탄소원 종류 선별

상기에 기재된 배양배지의 조성에서 탄소원을 달리하였을 경우 BNC의 특성이 달라지는지 확인하기 위하여 글루코스 대신 프룩토오스, 만니톨을 탄소원으로 한 배양배지를 제작하여 같은 조건으로 배양 후 생성된 BNC의 특성을 SEM 촬영을 통해 확인하였다. 탄소원 외의 다른 조건은 모두 동일하게 하여 28℃에서 7일간 정치배양 후 생성된 BNC를 분리하여 NaOH 및 증류수 세척, 멸균까지 모두 수행하였다. 세척 후의 각 탄소원별 BNC들을 동결건조 후 SEM 촬영을 진행하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 각 탄소원별로 생성된 BNC는 큰 차이는 없었으나, BNC의 밀도에서 차이를 보였다. 프룩토오스를 탄소원으로 한 BNC가 가장 밀도가 높게 생성된 모습을 보였고, 만니톨, 글루코오스 순으로 밀도가 낮아지는 모습을 보였다. 용도별로 탄소원을 선택하여 사용할 수 있으나, 본 발명에서의 경우 글루코오스를 탄소원으로 하여 이후의 실험을 진행하였다.

<1-4> 배양 시간에 따른 생산량

상기에서 결정된 배양배지의 조건을 이용하여 배양시간별 BNC의 생산량을 확인해 보기 위하여 일주일간 상기의 조건대로 글루콘아세토박터 한세니를 28℃, 24-웰(well) 세포배양판에서 7일간 정치배양하며 각 날짜별로 BNC를 회수 및 세척하였다. BNC의 생성량을 측정하기 위하여 핸드타월에 물기를 흡수시켜 물기 제거 후 무게를 측정하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 배양 1일 및 2일차에는 BNC가 생성되지 않았으며 3일차부터 채취 가능한 BNC가 생성되었다. 시간이 지날수록 생성되는 BNC의 양은 증가하였으며 배양 6일 및 7일차 이후에는 비슷한 양의 BNC가 생성되었다. 5일 이상 배양한 BNC부터 사용가능한 정도의 두께를 가진 BNC가 생성되었으므로 본 발명에서는 5일을 적정 배양시간으로 설정하였다.

<1-5> BNC의 수분함량 측정

상기에서 실시예 <1-1>에서 생산된 BNC의 수분함량 측정을 위하여 커버글라스를 넣은 35

디쉬의 건조 전 무게를 측정하여 기록한 후 핸드타월을 이용하여 겉 표면의 물기를 흡수시킨 BNC를 얹어 한번 더 무게를 측정하였다. 그 후 75℃ 드라이 오븐에서 12시간 이상 완전 건조시키고 한 번 더 무게를 측정하였다. BNC를 넣지 않고 건조시킨 커버 글래스와 35

디쉬의 건조 후 무게 변화를 고려하여 건조 전후의 BNC의 무게를 확인하여 수분함량은 (Wwet-Wdry)/ Wwet×100 로 계산하였다.

그 결과 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, BNC는 평균적으로 99.54%의 수분함량을 나타내었다.

BNC의 수분함량 측정 결과

	Initial weight(g)	Dry weight(g)	water content(%)
1	0.0555±0.0002	0.0005±0.0001	99.0991
2	0.0899±0.0007	0.0001±0.00004	99.88877
3	0.0936±0.0004	0.0002±0.00003	99.78632
4	0.0858±0.0004	0.0005±0.0001	99.41725
평균			99.54

<실시예 2>

UV돌연변이법을 이용한 글루콘아세토박터 한세니 균주의 유전자 변이

본 실험에서는 BNC의 생산량을 증가시키기 위한 방법으로써 UV를 통한 돌연변이 유발을 이용하였다. UV 돌연변이 유도 이후에 콜로니들을 선별하여 BNC 생산량 확인 후 가장 생산량이 증가한 콜로니를 선정 후 UV 돌연변이 유도 전의 균주와의 유전자 변화를 확인하였다.

<2-1> UV돌연변이법을 이용한 유전자 변이

자세하게는 선별 전의 글루콘아세토박터 한세니 배양액을 이용하여 고체배지에 선상도말 후 B.O.D 배양기에서 28℃에 3일간 배양하였다. 고체배지에 자란 콜로니들 중 32개를 선별하여 액체배지에 접종 후 7일간 28℃, 200rpm의 진탕배양기에 배양하였다. 32개의 콜로니 배양액을 4000rpm, 5분간 원심분리 후 1X PBS 버퍼를 이용하여 3번씩 세척해 준 후 OD 600값이 1.0이 되도록 액체배지를 이용하여 현탁 해 주었다. 현탁한 배양액들을 세포배양판에 각각 접종해준 후, 28℃의 B.O.D 배양기, 12-웰(well) 세포배양판에서 5일간 배양하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 32개의 콜로니 배양액 중 가장 많은 BNC를 생산한 콜로니는 28번 콜로니였으며 이 콜로니를 이후의 실험에 이용하였다.

BNC를 가장 많이 생성한 콜로니 28의 배양액을 3개의 고체배지에 선상도말하여 무균실험대에서 각각 5분, 10분, 30분간 UV에 노출시키고 28℃의 B.O.D 배양기에서 3일간 배양시켰다. clean bench에서 UV를 처리하였습니다. UV파장은 322nm이었다.

UV 돌연변이 유도 이후 배양시킨 각 고체배지 각각의 처리군에서 콜로니를 5개 씩 선별하여 액체배지에 접종하고 28℃, 200rpm의 진탕배양기에서 7일간 배양하였으며 위와 마찬가지로 세척, OD값 통일 후 세포배양판에 접종하였다. 12-웰(well) 세포배양판에 각각 접종 후 5일 간 28℃의 B.O.D 배양기에서 배양 후 생산된 BNC를 수거, 세척 후 무게를 측정하여 각 콜로니 별 BNC 생산량을 확인하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 총 15개의 콜로니 중 5개의 콜로니는 BNC 생산능력을 상실하여 BNC를 생산하지 못하였으며(5min-3, 10min-1, 10min-2, 30min-2, 30min-5), 가장 BNC 생산능력이 증가한 콜로니는 UV를 5분 조사시킨 콜로니들 중 첫 번째 콜로니였다(5min-1).

상기 가장 BNC 생산능력이 증가한 콜로니(5min-1)를 대상으로 하여 하기 실험을 진행하였다.

<2-2> 배양 배지의 탄소원 종류 선별

배양배지의 조성(2% 글루코오스, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.27% Na₂HPO₄, 0.115% 시트르산을 포함하며 아세트산을 이용하여 배지의 pH를 조절함)에서 탄소원을 달리하였을 경우 BNC의 특성변화 유무를 확인하기 위하여 탄소원을 글루코오스, 프룩토오스, 만니톨로 달리해 제작하여 같은 조건으로 배양 후 생성된 BNC의 특성을 SEM 촬영을 통해 확인하였다.

또한, 돌연변이 여부에 따른 BNC 생산량의 변화를 확인하기 위하여 탄소원은 위와 같이 3가지로, pH 조건은 4, 5, 6으로 달리하여 배지 제작 후 다른 조건은 모두 동일하게 하여 28℃에서 7일간 정치배양 후 생성된 BNC를 분리하여 NaOH 및 증류수 세척, 멸균까지 모두 수행하였다. 세척 후의 각 탄소원별 BNC들을 동결건조 후 SEM 촬영을 진행하였으며, 각 배지의 조성별 BNC 생산량은 핸드타월로 물기를 제거한 후 무게로 측정하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 각 탄소원별로 생성된 BNC는 큰 차이는 없었으나, BNC의 밀도에서 차이를 보였다. 푸룩토오스를 탄소원으로 한 BNC가 가장 밀도가 높게 생성된 모습을 보였고, 만니톨, 글루코오스 순으로 밀도가 낮아지는 모습을 보였다. 용도별로 탄소원을 선택하여 사용할 수 있으나, 본 발명에서의 경우 글루코오스를 탄소원으로 하여 이후의 실험을 진행하였다. 모든 배지 종류에서 돌연변이 균주가 돌연변이 되지 않은 균주보다 2~3배 더 높은 생산량을 보였으며, 대조군(정상) 균주의 경우 BNC를 생산하지 못하는 배지도 존재하였다. 가장 높은 생산량을 보이는 배지는 글루코오스를 탄소원으로 한 pH 4 배지였으므로, 이후의 실험에 사용된 배지의 조성은 이로 고정하였다.

<2-3> 배양 시간에 따른 생산량

상기에서 결정된 배양배지의 조건을 이용하여 배양시간별 BNC의 생산량을 확인해 보기 위하여 일주일간 상기의 조건대로 글루콘아세토박터 한세니를 28℃, 페트리접시에서 7일간 정치배양하며 각 날짜별로 BNC를 회수 및 세척하였다. BNC의 생성량을 측정하기 위하여 핸드타월에 물기를 흡수시켜 물기 제거 후 무게를 측정하였다.

측정 결과, 배양 1일 및 2일차에는 BNC가 생성되지 않았으며 3일차부터 채취 가능한 BNC가 생성되었다. 시간이 지날수록 생성되는 BNC의 양은 증가하였으며 배양 5일차 이후에는 비슷한 양의 BNC가 생성되었다. 5일 이상 배양한 BNC부터 사용가능한 정도의 두께를 가진 BNC가 생성되었으므로 본 발명에서는 5일을 적정 배양시간으로 설정하였다.

<2-4> 돌연변이 균주를 이용하여 생산된 BNC의 물리적 특성 검사

본 발명의 돌연변이 균주를 이용하여 생산된 BNC의 물리적 특성을 확인하기 위하여 두께 측정 및 인장강도와 인열강도를 측정하였다. 모든 물리적 특성은 23℃, 습도 55%의 환경에서 측정되었으며 BNC의 두께는 버니어캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 인장강도는 스트립법으로, 인열강도는 엘멘도르프법으로 측정되었다. 인장강도와 인열강도는 각각 4회씩 반복시험 하였다.

그 결과 하기 표 2에서 나타낸 바와 같이, BNC의 두께는 310±120μm로 나타났으며, 인장강도는 0.07±0.002, 인영강도는 0.231±0.04로 나타났다.

돌연변이 균주를 이용하여 생산된 BNC의 물리적 특성

시료	Thickness (μm)	Tensile Strength (MPa)	Elongation (%)	Tear Strength (N)
BNC	310±120	0.07±0.02	11.07±4.04	0.231±0.04

<실시예 3>

글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주의 BNC 생산성 향상 확인을 위한 PCR 및 real-time PCR

본 실험에서는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주의 BNC 생산성이 증가한 요인을 파악하기 위해 BNC 생산 관련 유전자들의 돌연변이 전, 후의 서열 확인 및 mRNA 발현량 확인을 진행하였다.

<3-1> 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주의 BNC 생산관련 유전자 변이 확인 위한 PCR

BNC의 생산량 증가의 요인을 파악하기 위하여 BNC 생산과 관련된 유전자인 Acs 오페론 및 ccpAx, crp/fnr 유전자의 돌연변이 유무를 PCR 및 시퀀싱을 통하여확인하였다. 각각의 유전자는 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, PCR을 수행하기 위한 반응물의 조성은 1X Ex taq buffer, 5ul dNTP(각 2mM), F 프라이머 1ul, R 프라이머 1ul, 주형 DNA 1ul, taq polymerase 0.3ul 를 이용하였다. 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 3에서 자세히 나타내었다. PCR은 pre-denaturation 95℃ 4분, denaturation 95℃ 30초, annealing은 각 유전자별 프라이머의 Tm값의 평균온도로 30초, extension 72℃에서 1kb당 1분의 조건으로 30 cycle 수행하였다.

PCR 수행을 위하여 제작된 각 유전자별 프라이머의 서열

프라이머명	Sequence	Tm (℃)
AcsA_F	5'- ATGGGGAAAATTCTTTCCATTCGC -3'	57
AcsA_R	5'- GTCTTCGGTCACGGTCTG -3'	56.6
AcsD_F	5'- ACCGGATTTCACCCTGTT -3'	52.1
AcsD_R	5'- TCAGGTCGCGGAACTGC -3'	56
ccpAx_F	5'- GTGAGTGCTTCAGGGTCTG -3'	57.1
ccpAx_R	5'- TTAGGATTCTTCTTCGTTTTCACG -3'	55.3
crp/fnr_F	5'- ATGCCGCCCGAAGAGAC -3'	56
crp/fnr_R	5'- TTACTTCCCCGGCGGCT -3'	56
16s rRNA_F	5'- GCTCAGAGCGAACGCTG -3'	56
16s rRNA_R	5'- CTACCTTGTTACGACTTCAC -3'	53.4

<3-2> 유전자의 돌연변이 유무 확인을 위한 시퀀싱 수행

완료된 PCR 반응물은 PCR purification kit(LaboPass™ PCR Purification Kit；　Cosmogenetech, Korea)을 이용하여 정제되었으며 시퀀싱 분석에 이용되었다.

우선적으로 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 확인 결과, 모든 균주(strain)가 비교 글루콘아세토박터 한세니의 16s rRNA 유전자와 100% 일치하는 것으로 나타나, 해당 균주가 글루콘아세토박터 한세니 균주임을 확인하였다(도 6 참조).

시퀀싱을 수행한 다른 유전자들 중 AcsA(ADTV01000012.1:6736-7683), AcsD(ADTV01000012.1:15243-15713), ccpAx(M96060.1:1423-2484) 유전자들 대부분 UV 돌연변이 유도 전과 후에 약간의 서열변화가 나타났다. 그 중 가장 큰 변화가 나타난 것은 crp/fnr(ADTV01000003.1:c34693-33416) 유전자이며, 이 유전자의 경우 1140bp 부근에서 변이가 일어나 종결코돈이 생성된 것을 확인하였다(도 7 내지 도 10 참조). 서열변화가 일어난 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주의 AcsA, AcsD, ccpAx 및 crp/fnr 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 2 내지 5로 표시하였으며, crp/fnr 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시하였다.

<3-3> DNA binding motif probability 확인

후속 실험으로서 전사조절인자인 crp/fnr 유전자의 종결코돈 생성이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 DNA binding motif prediction tool (http://biomine.cs.vcu.edu/servers/DRNApred/)를 이용하여 종결코돈 생성 전과 후의 DNA binding probability를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 4에서 나타낸 바와 같이 종결코돈이 생성된 경우에서 DNA binding probability가 증가하였음을 확인하였다.

종결코돈의 생성여부에 따른 crp/fnr 유전자의 DNA binding probability 결과

Name	Probability of DNA binding	Score
Reference crp/fnr	0.1459	-1.767
Mutation crp/fnr	0.2244	-1.240

crp/fnr 유전자의 발현량이 증가할 경우, BNC의 생산량이 증가한다는 논문(Richard V et al, Frontiers in Microbiology, December(2015), Volume 6, Article 1459)이 존재하나 종결코돈 생성 및 DNA binding probability 증가만으로 유전자 발현량의 증가와 같은 효과를 나타낸다고 판단할 수는 없으므로 추가적인 실험을 진행하였다.

<3-4> BNC 생산관련 유전자들의 발현량 확인을 위한 real-time PCR 수행

BNC의 생산량 증가의 요인을 파악하기 위하여 BNC 생산과 관련된 유전자인 Acs 오페론 및 ccpAx, crp/fnr 유전자의 mRNA 발현량을 real-time PCR을 통해 확인하였다. 각각의 유전자는 특이적인 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 수행하였으며, real-time PCR을 수행하기 위한 반응물의 조성은 1X GoTaq® qPCR Master Mix(promega), F 프라이머 1ul, R 프라이머 1ul, 주형 DNA 1ul를 이용하였다. 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머의 서열은 표 5에서 자세히 나타내었다. Real-time PCR은 pre-denaturation 95℃ 2분, denaturation 95℃ 15초, annealing 및 extension은 60℃에서 60초간 40 cycle 수행하였다.

real-time PCR 수행을 위하여 제작된 각 유전자별 프라이머의 서열

프라이머명	Sequence	Tm (℃)
AcsA_qF	5'- ACCCCGCATCACTTCTATTCCC -3'	60
AcsA_qR	5'- TCGCATCCCAGAAATCGTTGCC -3'	60
AcsD_qF	5'- GATCGAACTGAACGCGCTTCTG -3'	60
AcsD_qR	5'- ATAATCACCAAACGCACCCGCC -3'	60
ccpAx_qF	5'- CAGGATGACCAGCATGACCAAG -3'	60
ccpAx_qR	5'- GTTTTCACGACGACGCAACAG -3'	58.2
crp/fnr_qF	5'- TGAACATCGCAGGCAGTCAC -3'	57.4
crp/fnr_qR	5'- CCAGCAGGAAGAACAGCATCAG -3'	60
16s rRNA_qF	5'- AAGCAACGCGCAGAACCTTACC -3'	60
16s rRNA_qR	5'- ACATCTCACGACACGAGCTGAC -3'	60

그 결과 도 11에서 나타낸 바와 같이, UV 돌연변이 유발을 통해 BNC 생산량이 증가한 본 발명의 돌연변체에서 AcsA, AcsD, ccpAx, crp/fnr 유전자들의 mRNA 발현량이 모두 증가한 것을 확인하였다.

본 실험에서는 BNC를 생산하는 균주인 글루콘아세토박터 한세니의 UV 돌연변이 방법를 통해 BNC 생산성이 향상된 균주를 분리하였다. 분리된 균주(글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주)는 BNC 생성 관련 유전자의 서열 변화 및 발현량 증가로 인하여 BNC의 생산능력이 향상된 균주임을 확인하였다.

<3-5> 본 발명의 균주 기탁

본 발명자들은 상기 BNC의 생산능력이 향상된 균주(글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주)를 2019년 8월 1일자로 기관에 기탁하였으며, 기탁기관으로부터 기탁번호 KCTC 13907BP를 부여받았다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13907BP

20190801

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mutant strain of gluconacetobacter hansenii having enhanced bacterial nano-cellulose productivity, and method for producing the bacterial nano-cellulose using the same <130> NPDC-81088 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA_reference <400> 1 agtttgagtt ttatatctgg ctcagagcga acgctggcgg catgcttaac acatgcaagt 60 cgcacgaacc tttcggggtt agtggcggac gggtgagtaa cgcgtaggga tctgtccatg 120 ggtgggggat aactttggga aactgaagct aataccgcat gacacctgag ggtcaaaggc 180 gcgagtcgcc tgtggaggaa cctgcgttcg attagctagt tggtggggta aaggcctacc 240 aaggcgatga tcgatagctg gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgca agcctgatcc 360 agcaatgccg cgtgtgtgaa gaaggttttc ggattgtaaa gcactttcag cggggacgat 420 gatgacggta cccgcagaag aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg 480 aagggggcaa gcgttgctcg gaatgactgg gcgtaaaggg cgcgtaggcg gttgttacag 540 tcagatgtga aattcccggg cttaacctgg gggctgcatt tgatacgtga cgactagagt 600 gtgagagagg gttgtggaat tcccagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tgggaagaac 660 accggtggcg aaggcggcaa cctggctcat gactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga 720 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac gatgtgtgct ggatgttgga 780 tggcttggcc attcagtgtc gtagttaacg cgataagcac accgcctggg gagtacggcc 840 gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900 aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag gacttgacat gcggaggctg tgtccagaga 960 tgggcatttc tcgcaagaga cctccagcac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgcctttagt tgccagcacg 1080 tctgggtggg cactctaaag gaactgccgg tgacaagccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140 caagtcctca tggcccttat gtcctgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacagtgg 1200 gaagccaggc agcgatgccg agcggatctc caaaagccgt ctcagttcgg attgcactct 1260 gcaactcgag tgcatgaagg tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt tgaccttaag 1380 ccggtgagcg aaccgcaagg acgcagccga ccacggtcgg gtcagcgact ggggtgaagt 1440 cgtaacaagg tag 1453 <210> 2 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AcsA polynucleotide sequence of Gluconacetobacter hansenii mutant strain(KCTC 13907BP) <400> 2 atggggaaaa ttctttccat tcgcggtgct gggctgatta ttggtgtttt tggcctgtgt 60 gcgctgattg cggctacgtc cgtgaccctg ccgccagaac agcagttgat tgtggcattt 120 gtatgtgtcg tgatcttttt tattgtcggt cataagccca gccgtcggtc ccagattttc 180 cttgaagtgc tgtcagggct ggtttcgctg cgctatctga catggcgcct gacggaaacg 240 ctttcattcg atacatggtt gcagggtctg cttgggacaa tgcttctggt ggcggaactt 300 tacgccctga tgatgctgtt cctcagctat ttccagacga tcgcgccgct gcatcgtgcg 360 cctctgccgc tgccgccgaa ccctgacgaa tggcccacgg tcgatatctt cgtcccgacc 420 tataacgaag aactgagcat tgtccgcctg acggtgctgg gatcactggg gattgactgg 480 ccaccggaaa aggtgcgggt tcatatcctt gatgacggcc gtcgtcctga attcgccgcc 540 tttgccgctg aatgtggcgc gaattatatc gcccgcccga cgaacgaaca tgcaaaggcc 600 ggtaatctta actatgccat tggtcatacc gatggtgatt acatcctgat ctttgactgc 660 gaccacgtcc cgacccgcgc cttcctgcag ttgacaatgg gctggatggt cgaagacccg 720 aagatcgcgc tgatgcagac cccgcatcac ttctattccc ccgacccgtt ccagcggaac 780 ctgtcggctg gttatcgtac cccgcccgag ggcaacctgt tttatggcgt ggtgcaggat 840 ggcaacgatt tctgggatgc gaccttcttt tgcgggtcat gtgcaatcct gcgtcgcacg 900 gcgattgagc agatcggcgg ctttgcgacc cagaccgtga ccgaagac 948 <210> 3 <211> 472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AcsD polynucleotide sequence of Gluconacetobacter hansenii mutant strain(KCTC 13907BP) <400> 3 atgacaattt ttgagaaaaa accggatttc accctgtttc ttcagaccct gtcatgggaa 60 attgatgatc aggtcgggat cgaggtcagg aacgagctcc tgcgtgaggt cggacggggc 120 atgggcacgc gcatcatgcc gccgccgtgc cagaccgtgg acaagctgca gatcgaactg 180 aacgcgcttc tggccctgat cggctggggc accgtgacgc tcgaactcct cagcgaggac 240 cagtccctgc gcatcgtgca tgaaaacctg ccgcaggttg gcagcgcggg cgaaccttcg 300 ggcacgtggc tggctccggt gctggagggg ctgtatggcc gctgggtgac gtcgcaggcg 360 ggtgcgtttg gtgattatgt cgttacacgc gatgtggacg ccgaggatct gaatgctgtt 420 ccgcgtcaga ccatcatcat gtacatgcgc gtgcgcagtt ccgcgacctg aa 472 <210> 4 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ccpAx polynucleotide sequence of Gluconacetobacter hansenii mutant strain(KCTC 13907BP) <400> 4 gtgagtgctt cagggtctga tgaggtggct gggggagggc aggctggaag tccgcaggat 60 tttcagcggg tcctgcgttc ttttggtgtc gaaggtgggc agtattccta ccggccgttt 120 gttgaccgtt cctttgatgt gacaggcgtg cccgaggctg ttgaaaggca cttcgatcag 180 gcggagcatg acacggcggt tgaggagcag gtcactcccg cgccacaaat cgcggtcgca 240 ccgccaccgc cgccagtcgt tcctgacccg cccgccatcg tgacggaaac cgcgcccccg 300 ccgcctgtcg tggtcagcgc gccggtcacg tatgaacccc cggctgccgc cgtgccggca 360 gagcctcccg ttcaggaagc ccccgtgcag gcggcgccgg ttccccccgc gcctgtgccc 420 ccgattgcgg agcaggctcc tcctgcggcg ccggatccgg catccgtgcc gtatgcgaac 480 gtcgcggcgg cacccgttcc acctgatccc gcaccggtta cgcctgcgcc gcaggcgcgc 540 gtgacggggc cgaacacccg tatggtggaa cccttttccc gcccgcaggt ccgcacggtg 600 caggaggggg caaccccgtc acgtgtacct tcgcgttcaa 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gctgatcctt 300 ggggtgttcg gggtcgtggg cgcaatcgga accgccattt cggtgcctgc agccggatgg 360 atcgaacgcg cgccagaggc gatgaacgca ctgggcgaac gcctggcatt cctgcgcggc 420 ccgatccacc tgctcaacac cgcctcggcg cggatcgaaa gtttcatgaa catcgcaggc 480 agtcaccttg accacgcgac caaggcgggc ggcgatgacg ccgaacatat cgtgatgtcc 540 acagcccccg ccagcggggg attcgacagc ttcggttcct ccctgctgct gggaacgcgg 600 gcgtttgtgg ggcagttctt taccatgatc ctgatgctgt tcttcctgct ggcgcagggg 660 gacagcctgc tgcgacggtt tgtggagatc atgcccacct ttgcggacaa gcggcggacc 720 gtgcagatcg cctatcagat cgaacgtaat gtctcgctct atctggcaac gatcacgatc 780 atcaatttcc tcgtcggtct tgcgaacatg ttgcaatgct ggctgctggg catgcccaac 840 ccgctgctgt ggggggtgat ggcatttttg ctgaactata tccccatcat cggaccaatg 900 atggggatca ccatctattt ccttgtgggg ctgttcacgt tcccttccgt cctgcaggca 960 accctgccgc ctgcgatcta tctgtgcatc cacctgacgg agggggagac gattacgccc 1020 atggtgctgg cgcggcgctt tacgcttaac cctgtgctgg tcatgggatc attgatgttc 1080 tgggactggc tgtgggggat cggtggcgca ttcctgtccg ggccgctgct cgcttgattc 1140 aagatcatct gtgaccatgt cgatatcctg actcctatcg gccacatcgt cggcggcccg 1200 acacgggggg cgacgacgac tcccttattc acaccggaca tgattgatga ggatgacagt 1260 cagccgccgg ggaagtaa 1278 <210> 6 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> crp/fnr polypeptide sequence of Gluconacetobacter hansenii mutant strain(KCTC 13907BP) <400> 6 Met Pro Pro Glu Glu Thr Met Pro Thr Pro Ser Glu Thr Pro Ser Ala 1 5 10 15 Thr Pro Thr Tyr Glu Ser Met Gln Gln His Arg Ala Arg Glu Val Met 20 25 30 Arg His Thr Arg Met Asp Leu Lys Thr Ala Cys Leu Leu Val Leu Cys 35 40 45 Ile Leu Ala Val Phe Tyr Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ile Ile Leu 50 55 60 Pro Met Ile Leu Ala Leu Val Val Asn Leu Leu Leu Ser Ser Pro Met 65 70 75 80 Arg Phe Leu His Leu Lys Leu Lys Leu Pro Lys Pro Leu Ala Ala Leu 85 90 95 Val Leu Ile Leu Gly Val Phe Gly Val Val Gly Ala Ile Gly Thr Ala 100 105 110 Ile Ser Val Pro Ala Ala Gly Trp Ile Glu Arg Ala Pro Glu Ala Met 115 120 125 Asn Ala Leu Gly Glu Arg Leu Ala Phe Leu Arg Gly Pro Ile His Leu 130 135 140 Leu Asn Thr Ala Ser Ala Arg Ile Glu Ser Phe Met Asn Ile Ala Gly 145 150 155 160 Ser His Leu Asp His Ala Thr Lys Ala Gly Gly Asp Asp Ala Glu His 165 170 175 Ile Val Met Ser Thr Ala Pro Ala Ser Gly Gly Phe Asp Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Arg Ala Phe Val Gly Gln Phe Phe Thr 195 200 205 Met Ile Leu Met Leu Phe Phe Leu Leu Ala Gln Gly Asp Ser Leu Leu 210 215 220 Arg Arg Phe Val Glu Ile Met Pro Thr Phe Ala Asp Lys Arg Arg Thr 225 230 235 240 Val Gln Ile Ala Tyr Gln Ile Glu Arg Asn Val Ser Leu Tyr Leu Ala 245 250 255 Thr Ile Thr Ile Ile Asn Phe Leu Val Gly Leu Ala Asn Met Leu Gln 260 265 270 Cys Trp Leu Leu Gly Met Pro Asn Pro Leu Leu Trp Gly Val Met Ala 275 280 285 Phe Leu Leu Asn Tyr Ile Pro Ile Ile Gly Pro Met Met Gly Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Phe Leu Val Gly Leu Phe Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ala 305 310 315 320 Thr Leu Pro Pro Ala Ile Tyr Leu Cys Ile His Leu Thr Glu Gly Glu 325 330 335 Thr Ile Thr Pro Met Val Leu Ala Arg Arg Phe Thr Leu Asn Pro Val 340 345 350 Leu Val Met Gly Ser Leu Met Phe Trp Asp Trp Leu Trp Gly Ile Gly 355 360 365 Gly Ala Phe Leu Ser Gly Pro Leu Leu Ala 370 375

Claims

야생형 대비 증대된 박테리아 나노셀룰로오스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 AcsA, AcsD, ccpAx 및 crp/fnr 유전자의 발현량이 야생형 균주에 비해 증대되는 글루콘아세토박터 한세니 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC 13907BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 갖는 균주.
제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양물의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 박테리아 나노셀룰로오스 생산용 조성물.
제1항의 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 나노셀룰로오스의 생산 방법.
제5항에 있어서,
상기 배지는 탄소원으로 글루코오스, 프룩토오스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서,
상기 배지는 탄소원 이외에 펩톤, 효모 추출물, Na₂HPO₄ 및 시트르산을 더 포함하는, 방법.
제5항에 있어서,
상기 배지는 pH 4 내지 pH 6 조건을 갖는, 방법.