ES2660741T3

ES2660741T3 - Celulosa bacteriana y bacteria que la produce

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Publication number: ES2660741T3
Application number: ES13869657.0T
Authority: ES
Inventors: Kenji Tajima; Ryota KOSE; Hiroaki Sakurai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2018-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: CN107164426A; KR102077716B1; AU2013366934B2; US20170191100A1; RU2654675C2; EP2940145B1; SA515360697B1; CN104995308A; AU2013366934A1; WO2014104318A1; CA2896699C; US9879295B2; US20150376666A1; EP2940145A4; KR20150114479A; RU2015131154A; EP2940145A1; US9611495B2; PL2940145T3; CA2896699A1

Abstract

Una celulosa bacteriana producida por una bacteria que tiene una característica física de (a) siguiente: (a) una transmitancia de la luz, a una longitud de onda de 500 nm y un camino óptico de 10 mm, de agua que contiene la celulosa bacteriana a una concentración final de 0,1 ± 0,006 % (p/p) del 35 % o superior.

Description

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(3) Determinación del producto

Se precultivó la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) para hacer proliferar células bacterianas. Posteriormente, se añadió la solución de cultivo obtenida mediante el precultivo (solución de precultivo) al medio de cultivo de HS (fuente de carbono, glucosa), que luego se sometió a cultivo estacionario a 30 ºC durante aproximadamente 8 días para realizar el cultivo principal con el fin de formar una película gelificada en la superficie del medio de cultivo. Se obtuvieron el espectro de espectroscopia de infrarrojos (IR) y el perfil de difracción de rayos X de la película gelificada y se analizaron de acuerdo con un método habitual. Como resultado de ello, se demostró que la película gelificada era una celulosa que tenía una estructura cristalina de tipo I. Como resultado de la obtención y del análisis de una imagen de microscopio electrónico de barrido de acuerdo con un método habitual, se demostró que las fibras de celulosa que tienen un ancho del orden de los nanómetros (nanofibras de celulosa) forman una estructura reticular en la película gelificada. A partir de estos resultados, se determinó que la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) produce celulosa.

Ejemplo 2: Evaluación del producto obtenido mediante cultivo aireado y agitado

(1) Preparación del producto mediante cultivo aireado y agitado

Se sometió BDF-B a tratamiento de neutralización y se sometió además a tratamiento en autoclave para proporcionar BDF-B pretratado.

Se prepararon medios de cultivo en los que se añadió glicerol reactivo (un reactivo garantizado de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en lugar de glucosa como fuente de carbono en un medio de cultivo de HS que contenía 2 % (p/v) de CMC (calidad química, de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) y en los que el BDF-B pretratado se añadió a una concentración del 2 % (p/v) en lugar de glucosa en el medio de cultivo de HS que contenía CMC, y se denominó medio de cultivo principal con glicerol y un medio de cultivo principal con BDF-B, respectivamente. Se precultivó primero la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) para hacer proliferar células bacterianas. A continuación, se inoculó la solución de precultivo en 5 l del medio de cultivo principal con glicerol y del medio de cultivo principal con BDF-B, y usando el fermentador, se sometió a cultivo aireado y agitado durante 4 días en condiciones de un volumen de aireación de 7 a 10 l/minuto, un número de revoluciones de 200 a 800 rpm, y una temperatura de 30 ºC para realizar el cultivo principal. Se añadió una solución acuosa de NaOH al 1 % (p/v) a la solución de cultivo obtenida mediante el cultivo principal (solución de cultivo principal), que luego se agitó a 60 ºC y 80 rpm durante 4 a 5 horas para lisar las células bacterianas. Después de someter el producto resultante a centrifugación, se retiró el sobrenadante para recuperar el precipitado con el fin de eliminar los componentes celulares bacterianos hidrosolubles. Se repitió la operación de adición de agua ultrapura a la misma, de realización de la centrifugación y luego de eliminación del sobrenadante hasta que el pH del precipitado en estado húmedo alcanzó 7 o menos para purificar el producto, y la solución resultante se denominó solución BC de cultivo agitado.

(2): Preparación de celulosa bacteriana mediante cultivo estacionario

Se obtuvo una película gelificada mediante el método descrito en (3) del Ejemplo 1 y se cortó a un tamaño de aproximadamente 1 cm x 1 cm. Posteriormente, se añadió una solución acuosa de NaOH al 1 % (p/v), que luego se agitó a 60 ºC y 80 golpes/minuto durante 4 a 5 horas, y luego se agitó durante una noche a 20 ºC. Se retiró el líquido por filtración usando una gasa de metal para recuperar una película gelificada. Se repitió la operación de adición de agua ultrapura a la misma y de agitación de la solución resultante durante una noche a 20 ºC hasta que el pH alcanzó 7 o menos para la purificación, seguido del tratamiento en suspensión usando una mezcladora durante varios minutos, y la solución resultante se denominó solución de BC de cultivo estacionario tratada en mezclador.

(3): Análisis

Se añadieron la solución de BC de cultivo agitado de (1) del presente Ejemplo 2 y la solución de BC de cultivo estacionario tratada con mezclador de (2) del presente Ejemplo 2 gota a gota a una placa de silicio, se secaron y luego se suministraron a un espectrofotómetro infrarrojo. (FT/IR-4200; JASCO Corporation), y se midieron a un

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número acumulativo de 32 y una resolución de 2 cmo 4 cmpara proporcionar un espectro de IR. Los resultados se muestran en la Figura 4. Como se muestra en la Figura 4, los espectros de IR de las soluciones BC de cultivo agitado obtenidas usando el medio de cultivo principal con BDF-B y el medio de cultivo principal con glicerol tenían formas similares al espectro de IR de la solución de BC de cultivo estacionario tratada con mezclador. A partir de estos resultados, se determinó que el producto obtenido sometiendo la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) a cultivo agitado usando BDF-B o glicerol reactivo como fuente de carbono se determinó que era una celulosa.

Ejemplo 3: Dispersibilidad de celulosa bacteriana en agua

(1) Aspecto del agua que contiene celulosa bacteriana

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Tiempo de retención/minutos: Volumen de retención /ml Media/ml Desviación típica/ml

Muestra D (1ª): 39,2 2,744 2,76 0,02

Muestra D (2ª): 39,4 2,758

Muestra D (3ª): 39,8 2,786

Solución de CNF derivada de pulpa (1ª): 42,9 3,003 3,04 0,04

Solución de CNF derivada de pulpa (2ª): 43,4 3,038

Solución de CNF derivada de pulpa (3ª): 43,9 3,073

Pululano (1º): 45,7 3,199 3,24 0,04

Pululano (2º): 46,8 3,276

Pululano (3º): 46,4 3,248

Como se muestra en la Tabla 3 y en la Figura 8, el volumen de retención de la parte superior del máximo de cada una de las muestras A, B, C y D fue de una media de 2,79 ml, 2,81 ml, 2,82 ml y 2,76 ml, respectivamente y, bajo en comparación con lis 3,04 ml de la solución de CNF derivada de pulpa y 3,24 ml para el pululano. Estos resultados mostraron que el peso molecular medio de la celulosa bacteriana obtenida sometiendo la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) a un cultivo agitado fue superior al de la celulosa derivada de pulpa y superior a 85,3 × 104 en términos del pululano. La Tabla 3 también mostró que cuando la celulosa bacteriana obtenida sometiendo la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) a cultivo agitado se sometió a cromatografía de permeación en gel en las condiciones anteriores, el volumen de retención del máximo superior del cromatograma alcanzó de 2,5 ml (inclusive) a 3,0 ml (no inclusive), ya que el volumen de retención del máximo superior de cada una de las muestras A, B, C y D estuvo en el intervalo de 2,737 a 2,849 ml.

Ejemplo 7: Morfología de la celulosa bacteriana

(1) Medición del ancho de la fibra

Se proporcionaron la solución de BC de cultivo agitado que usaba el medio de cultivo principal con glicerol de (1) del Ejemplo 2 y la solución de BC de cultivo estacionario tratada con mezclador de (2) del Ejemplo 2. Se ajustaron cada una de estas soluciones de celulosa a una concentración del aproximadamente 0,001 % (p/p), y luego, se añadieron 10 µl de cada solución gota a gota a una rejilla de cobre recubierta con Formvar y secada al aire. Posteriormente, se añadieron gota a gota 5 µl de una solución acuosa de acetato de gadolinio al 5 % (p/v), y se retiró el exceso de solución con un filtro de papel 10 segundos más tarde para la tinción negativa. El resultado se observó en un microscopio electrónico de transmisión a una tensión de aceleración de 80 kV y una ampliación de la observación de

30.000 veces para medir el ancho de las fibras de celulosa basándose en la imagen observada. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Como se muestra en la Figura 9, el ancho de las fibras de celulosa era de 17 ± 8 nm para la solución de BC de cultivo agitado, siendo destacadamente bajo en comparación con los 55 ± 22 nm de la solución de BC de cultivo estacionario tratada con mezclador, y con una baja desviación típica. Estos resultados mostraron que la celulosa bacteriana obtenida sometiendo la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) a un cultivo agitado formó fibras finas y uniformes que mostraban pequeñas variaciones del ancho entre las fibras.

(2) Determinación de la uniformidad del ancho de fibra y del estado de agregación

Se proporcionaron la solución de BC de cultivo agitado que usaba el medio de cultivo principal con BDF-B de (1) del Ejemplo 2 y la solución de CNF derivada de pulpa de (1) del Ejemplo 3. Se ajustaron cada una de estas soluciones de celulosa a una concentración del aproximadamente 0,01 % (p/p), y luego, se repitió 10 veces la operación de pulverizar la solución sobre una rejilla de cobre recubierta con Formvar y secarla usando un secador. Posteriormente, se añadieron gota a gota 5 µl de una solución acuosa de acetato de gadolinio al 5 % (p/v), y se retiró el exceso de solución con un filtro de papel. Además, se repitió 2 veces la secuencia de añadir gota a gota 5 µl de agua ultrapura y luego retirar el exceso de solución con un filtro de papel, seguida de la tinción negativa mediante secado al aire. El resultado se observó bajo un microscopio electrónico de transmisión a una tensión de aceleración de 80 kV y una ampliación de la observación de 10.000 veces. Los resultados se muestran en la Figura 10. También se observó con nicoles cruzados usando un microscopio polarizante. Los resultados se muestran en la Figura 11.

Como se muestra en la Figura 10, se observaron muchas fibras de celulosa que tenían anchos comparables en la escala nanométrica en la solución de BC de cultivo agitado, mientras que se observaron fibras de celulosa que tenían diversos anchos, incluyendo anchos de hasta aproximadamente 500 nm, en la solución de CNF derivada de pulpa. A partir de estos resultados, se determinó nuevamente que la celulosa bacteriana obtenida sometiendo la cepa NEDO-01 (cepa SIID9587 de G. intermedius) a un cultivo agitado forma fibras que tienen un ancho uniforme en la escala nanométrica.

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Claims

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