CN104789217B - 一种两亲性碳量子点及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两亲性碳量子点及其制备方法，本发明是以辣椒粉为碳源，在空气气氛中热解，再经乙醇提取、纯化得到两亲性碳量子点。该法制得的碳量子点粒径为0.5~4.5纳米，表面既带有羟基、羧基、醛基、氨基等亲水基团，又带有甲基、亚甲基、苯基等疏水基团，因此是两亲性的。该碳量子点的荧光量子产率为70~75%。该制备方法操作简单，原料价廉易得，可用于大规模制备两亲性碳量子点。而且，制得的两亲性碳量子点比其他单一疏水性或者单一亲水性的碳量子点的生物相容性更好，细胞显影效果更强，因此可以较好的用于生物显影、生物医学成像和荧光检测等领域。

Description

一种两亲性碳量子点及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料的制备及应用技术领域，具体涉及一种两亲性碳量子点及其制备方法。

背景技术

荧光碳量子点是一种近似球型且粒径小于10纳米的零维碳纳米颗粒，因其粒径小而具有与半导体量子点相似的光致发光性能。

经过近十年的研究发展，碳量子点已经成为继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一。碳量子点的发现弥补了传统金属半导体量子点的一些缺陷，不仅具有优良的光学性能、小尺寸特性，而且毒性小、生物相容性好，易于实现表面功能化，在生物细胞的显影、生物医学成像、药物筛选检测、生物芯片、生物传感等领域具有重要的应用，例如文献Li Cao,Xin Wang,Ya-Ping Sun,et al.J.Am.Chem.Soc.,2007,129,11318-11319中报道的将人类乳腺癌细胞与碳量子点共培养2小时从而实现癌细胞的荧光标记。

自从2004年Scrivens等人首次报道碳点以来，众多科研工作者已经先后发掘多种制备荧光碳量子点的方法，可将这些方法归纳为自上而下法和自下而上法。自上而下法是指通过物理或化学的方法使块体材料的尺寸由大变小，直至达到纳米级，如电弧放电法、激光消融法、电化学法等。例如申请号为201210388668.9的发明专利公开了一种利用电弧法制备单壁碳纳米管时所产生的石墨杂质为原料制备水溶性碳量子点的新方法，通过将石墨杂质分散到含有表面活性剂的水溶液中，经与高锰酸钾等强氧化剂反应后再用碱中和、透析分离从而制得单一亲水性碳量子点，但是该方法不适于大规模制备碳量子点，并且在制备的过程中使用了各种非环境友好型的强酸等强氧化剂。自下而上法主要是尺寸由小变大，主要是化学法合成，如有机物热解法、微波合成法等，例如申请号为201410023002.2的发明专利公开了一种掺氮碳量子点的制备方法，通过将有机酸和有机胺混合后水热反应制得掺氮的碳量子点水分散液，再经萃取，干燥，制得掺氮碳量子点固体粉末，然而该方法所采用的原料也是非环境友好型的有机酸、有机胺，且原料不易得，制得的碳量子点也是单一亲水性的。另外，文献Liu S,Tian J Q,Sun X P,et al.Adv.Mater.,2012,24:2037-2041中报道的以青草为碳源通过高压釜水热3小时制备碳量子点，该法制备的碳量子点是单一亲水性的，其荧光量子产率较低，只有6.5％。

可以制备碳量子点的碳源众多，从最初的碳纳米管、石墨、炭黑、蜡烛灰、天然气烟灰、活性炭、木炭灰、和碳纤维等无机碳材料，发展到柠檬酸盐、糖类、淀粉、维生素、花生皮、西瓜皮和咖啡渣等有机含碳天然产物，均可用来合成荧光碳量子点。相比于采用无机碳材料来说，选择天然产物作为制备碳量子点的原料，不仅价廉易得，方法简单无污染，而且制备出来的碳量子点大多具有良好的生物相容性，可以说是一种经济的、绿色合成途径。但是大多数以天然产物为碳源制备的碳量子点的荧光量子产率不高，基本都是在50％以下，而且所制得的碳量子点是单一亲水性的或者是单一疏水性的，即都是单亲性碳量子点。因为生物细胞膜一般都是由磷脂双分子层膜构成，而细胞内基质95％都是由水构成。所以单一亲水性或者疏水性的碳量子点应用于生物细胞荧光显影时效果不佳。

发明内容

本发明的目的是提供一种与细胞磷脂双分子层膜生物相容性好，应用于荧光显影时效果更佳的表面带有亲水基团和疏水基团的两亲性碳量子点及其制备方法。

本发明提供的一种两亲性碳量子点，其表面带有亲水基团和疏水基团，粒径为0.5～4.5纳米，荧光量子产率为70～75％，分别用紫外光、蓝光和绿光激发可分别呈现出蓝光、绿光和红光。本发明制得的两亲性碳量子点含有羟基、羧基、醛基、氨基等亲水基团以及甲基、亚甲基、苯基等疏水基团。

本发明提供了上述两亲性碳量子点的制备方法，其包括下述步骤：

(1)称取辣椒粉在300～400摄氏度下焙烧1～2小时，将焙烧后的黑色试样研磨成粉；

(2)向上述得到的黑色粉末中加入无水乙醇，超声分散，微滤，终滤液于45-60摄氏度烘干得到淡黄色粉末A；

(3)向上述制得的淡黄色粉末A中加入超纯水，超声分散，微滤，滤液冻干得淡黄色粉末B；

(4)向上述制得的淡黄色粉末B中加入无水乙醇，超声分散，利用硅胶柱层析去除碳量子点中的荧光有机物杂质，洗脱剂为体积比5:1的二氯甲烷与甲醇的混合液；

(5)将层析柱中的硅胶粉与碳量子点混合物取出后分散于无水乙醇中，超声后利用微孔滤膜反复抽滤至少3次，滤液于45-60摄氏度烘干得到淡黄色粉末C；

(6)向上述制得的淡黄色粉末C加入超纯水，超声分散，利用透析袋在超纯水中透析48～72小时后，冻干得到淡黄色碳量子点粉末。

本发明步骤(1)所述辣椒粉是市售的普通食品级辣椒粉，其中含有维生素、辣椒碱、辣椒红素等物质。

优选的，步骤(1)焙烧时的升温速度为5～10摄氏度每分钟。

步骤(2)对微滤所得滤液再反复微滤3次以上为佳。

优选步骤(2)和步骤(3)微滤时采用孔径为0.22微米的微孔滤膜。

对于本发明所述步骤(4)，其中利用柱层析的方法可去除辣椒粉热解产物中的有机物杂质。

步骤(5)微孔滤膜孔径0.22微米。

步骤(6)透析袋截留分子量500～1000。

对于本发明所述步骤(6)，其中利用透析的方法可去除辣椒粉热解产物中的无机盐杂质。

对于本发明中所用到的无水乙醇和超纯水是作为对两亲性碳量子点进行提取、纯化的分散剂，其仅是用于更好更充分的提取两亲性碳量子点。

本发明是利用辣椒粉在空气气氛中热解碳化生成碳化产物，再经过提取、纯化得到两亲性碳量子点，所得两亲性碳量子点的优势在于：

(1)该碳量子点易分散于无水乙醇、乙醚、二氯甲烷等有机溶剂，并也可较好地分散于水、PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)、生物培养基等水溶液体系中；

(2)该碳量子点的粒径为0.5～4.5纳米，表面既带有羟基、羧基、醛基、氨基等亲水基团，又带有甲基、亚甲基、苯基等疏水基团，因此是两亲性的。该两亲性碳量子点既能溶于水，又可以在乙醇等有机溶剂中很好地分散，易于进行表面钝化或修饰；

(3)银离子、铁离子会使碳量子点水溶液的荧光强度明显的减弱甚至淬灭，因此它可用于银离子、铁离子的检测；

(4)该碳量子点在去离子水、无水乙醇中的荧光量子产率分别为70％、75％，可较好的满足于生物细胞显影技术的应用。荧光量子产率的测量方法通常采用参比法，即在碳量子点的最佳激发波长下，分别测定待测试样与参比试样(罗丹明B)的积分荧光强度以及在相同紫外激发波长下二者的吸光度(吸光度值均小于0.10，以0.07～0.09为宜)，利用以下公式进行计算：

$\mathrm{\φ}={\mathrm{\φ}}_r\×\frac{I}{I_r}\×\frac{A_r}{A}\×\frac{n^2}{n_r^2}$

式中，φ和φ_r分别表示待测试样与参比试样的荧光量子产率；I和I_r分别表示待测试样与参比试样的积分荧光强度；A和A_r分别表示待测试样与参比试样在相同激发波长下的入射光的吸光度；n和n_r分别为待测试样与参比试样的折射率。

(5)该碳量子点具有优异的荧光性能，其荧光强度具有激发光波长依赖性，若采用300～380纳米激发光激发，荧光发射峰会出现约65纳米红移现象，分别用紫外光、蓝光和绿光激发可以呈现出蓝光、绿光和红光，可应用于生物细胞显影技术；

(6)采用MTT法检测制得的两亲性碳量子点的细胞毒性。测试结果显示Hela细胞(人类子宫颈癌细胞)与200微克每毫升的碳量子点/DMEM培养基溶液共培养24小时后，细胞的存活率仍维持在80％以上，表明制得的两亲性碳量子点具有良好的生物相容性。

(7)Hela细胞与200微克每毫升的碳量子点/DMEM培养基溶液共培养2小时后，细胞显影效果比现有或者现已报道的单一亲水性或者单一疏水性的碳量子点的显影效果更佳。所以该发明制得的两亲性碳量子点可很好地应用于生物标记、细胞显影等领域。

本发明合成的两亲性碳量子点与细胞磷脂双分子层膜生物相容性更好，更容易穿过细胞膜进入细胞内，并且在细胞内含水基质中分散性也很好，因此采取本专利发明的两亲性碳量子点应用于荧光显影时的效果更佳。

附图说明

图1是本发明的两亲性碳量子点透射电镜图，插图为粒径统计图。

图2是本发明的两亲性碳量子点水溶液的紫外-可见光谱和荧光发射光谱(激发光波长为310纳米)。

图3是本发明的两亲性碳量子点的傅立叶变换红外光谱图。

图4是本发明的两亲性碳量子点的MTT法细胞毒性测试结果(两亲性碳量子点与Hela细胞共培养24小时)。

图5是本发明的两亲性碳量子点用于细胞显影的荧光显微镜照片。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

(1)称取0.5克辣椒粉于坩埚(5毫升)中，放入箱式电阻炉中，在400摄氏度下焙烧90分钟，升温速度为5摄氏度每分钟，将焙烧后的黑色试样研磨成粉末；

(2)向上述得到的黑色粉末中加入10毫升的无水乙醇，超声30分钟，静置，取上清液抽滤，抽滤时采用孔径为0.22微米的微孔滤膜，收集滤液并反复抽滤3次，滤液于50摄氏度鼓风干燥机中烘干得到淡黄色粉末A；

(3)向上述制得的淡黄色粉末A中加入10毫升超纯水，超声分散，微孔滤膜抽滤，收集滤液，利用冷冻干燥机冻干得到淡黄色粉末B；

(4)向上述制得的淡黄色粉末B中加入10毫升无水乙醇，超声分散，利用柱层析去除碳量子点中的荧光有机物杂质，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的混合液(体积比为5:1)。

(5)将层析柱中的硅胶粉与碳量子点混合物取出后分散于50毫升无水乙醇中，超声后利用微孔滤膜反复抽滤3次，滤液可于50摄氏度鼓风干燥机中烘干得到淡黄色粉末C。

(6)向上述制得的淡黄色粉末C加入10毫升超纯水，超声分散，利用透析袋(截留分子量500～1000)在超纯水中透析48小时后，利用冷冻干燥机冻干得到淡黄色纯碳量子点。

如图1所示，本发明所得两亲性碳量子点透射电镜图，进行粒径统计所得两亲性碳量子点粒径0.5～4.5纳米，平均粒径2.55纳米。

如图3是本发明的两亲性碳量子点的傅立叶变换红外光谱图。其中3398cm^-1为羟基伸缩振动峰，3300cm^-1为仲胺基N-H伸缩振动峰，2854cm^-1为醛基C＝O伸缩振动峰，1400cm^-1为羧基C＝O不对称伸缩振动峰，这些都是亲水性基团；2928cm^-1为亚甲基不对称伸缩振动峰，1624cm^-1为苯环骨架振动峰，1377cm^-1为甲基不对称变形振动峰，这些都是疏水性基团。

如图4所示，采用MTT法检测制得的两亲性碳量子点的细胞毒性。MTT法是一种常见的检测细胞存活和生长的方法，检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT(噻唑蓝)还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒以沉积在细胞中，死细胞却无此功能，然后用DMSO(二甲基亚砜)溶解出细胞中的甲瓒，再用酶联免疫检测仪在540纳米或720纳米波长条件下测定其吸光度，以此间接反映活细胞数量。MTT细胞毒性测试结果显示Hela细胞(人类子宫颈癌细胞)与200微克每毫升的碳量子点/DMEM培养基溶液共培养24小时后，细胞的存活率仍维持在80％以上，表明制得的两亲性碳量子点具有良好的生物相容性。

如图5所示，以本发明的两亲性碳量子点用于细胞显影实验表明：未导入本发明两亲性碳量子点的细胞在荧光显微镜下不显颜色；导入两亲性碳量子点后以405纳米光激发呈蓝色荧光；导入两亲性碳量子点后以488纳米光激发呈绿色荧光；导入两亲性碳量子点后以543纳米光激发呈红色荧光。该碳量子点在去离子水、无水乙醇中的荧光量子产率分别为70％和75％。

Claims (6)

1.两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）称取辣椒粉在300~400摄氏度下焙烧1~2小时，将焙烧后的黑色试样研磨成粉末；

（2）向上述得到的黑色粉末中加入无水乙醇，超声分散，微滤，终滤液于45-60摄氏度烘干得到淡黄色粉末A；

（3）向上述制得的淡黄色粉末A中加入超纯水，超声分散，微滤，滤液冻干得淡黄色粉末B；

（4）向上述制得的淡黄色粉末B中加入无水乙醇，超声分散，利用硅胶柱层析去除碳量子点中的荧光有机物杂质，洗脱剂为体积比5:1的二氯甲烷与甲醇的混合液；所述柱层析采用200～300目柱层层析硅胶粉；

（5）将层析柱中的硅胶粉与碳量子点混合物取出后分散于无水乙醇中，超声后利用微孔滤膜反复抽滤至少3次，滤液于45-60摄氏度烘干得到淡黄色粉末C；

（6）向上述制得的淡黄色粉末C加入超纯水，超声分散，利用透析袋在超纯水中透析48~72小时后，冻干得到淡黄色碳量子点粉末。

2.如权利要求1所述两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤（1）焙烧时的升温速度为5~10摄氏度每分钟。

3.如权利要求1所述两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤（2）对微滤所得滤液再反复微滤3次以上。

4.如权利要求1所述两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）微滤时采用孔径为0.22微米的微孔滤膜。

5.如权利要求1所述两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤（5）微孔滤膜孔径0.22微米。

6.如权利要求1所述两亲性碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤（6）透析袋截留分子量500~1000。