KR20170058790A - 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Abstract

셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법{A method for screening microorganisms having enhanced productivity of cellulose}
셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
셀룰로오스는 베타-디-글루코피라노스(β-D-glucopyranose)가 베타-1,4-글루코시드(β-1,4-glucoside) 결합된 긴 사슬을 이루고 이들이 수소결합으로 유지되는 리본형 다발(ribbon-like bundle) 구조를 갖는다.
미생물 셀룰로오스(microbial cellulose)는 헤미셀룰로오스, 펙틴, 리그닌 등을 함유하는 식물 셀룰로오스와 달리, 순수 셀룰로오스로 구성되어 있다. 따라서, 미생물을 이용하여 불순물이 없는 순수한 셀룰로오스를 얻을 수 있다. 미생물 셀룰로오스는 생체 적합성 및 기계적 성질이 우수하여 의료용, 미용, 식용, 전기전자 분야 등에서 다양하게 활용될 수 있다. 그러나, 만족할 만한 수준의 셀룰로오스 생산성을 갖는 자연 미생물의 부재로 인하여 활용 규모가 협소하였다.
대사공학(metabolic engineering) 기술이 발달함에 따라, 셀룰로오스 고생산미생물을 제조하기 위한 시도가 활발하게 이루어지고 있다. 현재 셀룰로오스를 생산하는 대부분의 미생물에 대해 알려진 유전자 조작 수단이 없어, 대부분 무작위 돌연변이 유발에 의해 균주를 개량해왔다. 이러한 방법을 동해 무작위로 제조된 수많은 후보 변이 균주들 중 셀룰로오스 생산능이 향상된 균주를 보다 효율적으로 선별하는 방법이 요구된다.
일 양상은 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 스크리닝된 미생물을 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 상기 미생물 및 셀룰로오스가 포함된 배양물을 얻는 단계; 상기 배양물의 광학 밀도 A 및 광학 밀도 B를 동시에 또는 순차적으로 측정하여, 대조군에 비해 광학 밀도 A가 큰 배양물에 대하여 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율을 얻는 단계; 및 대조군에 비해 상기 비율이 큰 미생물을 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물로 선별하는 단계를 포함하고, 상기 광학 밀도 A는 가시광선 영역의 짧은 파장에서 측정되는 것이고, 상기 광학 밀도 B는 가시광선 영역의 긴 파장에서 측정되는 것인, 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 미생물은 아에로박터(Aerobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 알라칼리게네스(Alacaligenes) 속, 아조토박터(Azotobacter) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 사르시나(Sarcina) 속, 또는 글루코나세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, 글루코나세토박터 속 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 글루콘아세토박터 크실리누스(Gluconacetobacter xylinus)일 수 있다. 글루콘아세토박터 크실리누스는 아세토박터 크실리눔(Acetobacter xylinum) 또는 코마가타에이박터 크실리누스(Komagataeibacter xylinus)로도 명명될 수 있다.
상기 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물은 돌연변이된 미생물 또는 재조합 미생물을 포함할 수 있다. 용어 "돌연변이된" 또는 "변이된"은 변이가 유발되지 않은 대조군과 비교하여 유전자 수준에서 변이가 발생된 것을 의미한다. 상기 돌연변이는 무작위 또는 특정 위치에서 발생된 돌연변이일 수 있다. 상기 돌연변이는 유전자를 이루는 뉴클레오티드의 부가, 결실, 및/또는 치환에 의한 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이된 미생물은 자연에서 발견되는 변이된 미생물 및/또는 인위적으로 변이가 유발된 미생물을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이된 미생물은 자연에서 발견되는 미생물에 변이를 유발하여 제조된 것일 수 있다. 상기 돌연변이된 미생물은 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis) 또는 방향성 돌연변이 유발(directed mutagenesis)에 의해 생성된 것일 수 있다. 상기 돌연변이된 미생물은 핵산 셔플링(nucleic acid shuffling) 또는 합성 셔플링(synthetic shuffling)에 의해 생성된 것일 수 있다. 상기 무작위 돌연변이의 유발은 화학 물질의 처리, UV 처리, 실수-유발 PCR(error-prone PCR), 또는 DNA 셔플링에 의한 것일 수 있다.
상기 방법에서 대조군은 유전적으로 조작되지 않은 동일 종류의 미생물 또는 변이가 유발되지 않은 동일 종류의 미생물일 수 있다. 상기 대조군은 모균주(parent strain)로도 명명될 수 있다. 상기 대조군은 유전적으로 조작되지 않은 또는 변이가 유발되지 않은 상태에서 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물일 수 있다. 또한, 상기 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물은 상기 대조군에 비해 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물일 수 있다.
상기 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 당해 분야의 통상의 기술자가 적절하게 결정할 수 있다. 상기 배양은 정치 배양(static culture) 또는 진탕 배양(agitated culture)일 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 상기 미생물의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수되거나 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 단당류, 이당류 및/또는 다당류를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다. 상기 배지는 헤스트린-슈람(Hestrin-Schramm: HS) 배지, 변형 HS 배지, LB 배지, 변형 LB 배지, YPD 배지, 변형 YPD 배지 또는 제한 배지(defined medium)일 수 있다.
상기 배양은 호기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 약 20 내지 40℃, 약 22 내지 38℃, 또는 약 25 내지 37℃일 수 있다. 배양 배지의 pH는 약 4.0 내지 7.5, 약 4.0 내지 7.0, 또는 약 4.5 내지 7.0일 수 있다.
상기 배양은 마이크로플레이트 상에서 이루어질 수 있다. 상기 마이크로플레이트의 각 웰(well)에서 상이한 종류의 돌연변이된 미생물이 배양될 수 있다. 상기 마이크로플레이트는 96 웰 마이크로플레이트일 수 있다. 상기 배양은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 마이크로플레이트 상에서 동시에 이루어질 수 있다. 상기 배양은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 각 웰에서 배지의 양은 0.1 내지 0.25 mL, 예를 들면, 0.15 mL 또는 0.2 mL일 수 있다. 상기 배양은 10시간 이상, 20시간 이상, 30시간 이상, 40시간 이상, 50시간 이상, 60시간 이상, 70시간 이상, 80시간 이상, 또는 90시간 이상 이루어질 수 있다.
용어 "광학 밀도(optical density)"는 물질이 광을 흡수하는 비율을 나타내며, 흡광도(absorbance)로도 명명될 수 있다. 상기 배양물의 광학 밀도 A는 미생물에 의한 광학 밀도와 셀룰로오스에 의한 광학 밀도가 합쳐진 값일 수 있다. 상기 미생물에 의한 광학 밀도는 미생물의 흡광도로도 명명될 수 있다. 상기 미생물의 흡광도는 배양물 중에 존재하는 미생물에 대한 log(I0/Ic) 값을 의미할 수 있다 (Io는 입사광의 강도이고 Ic는 투과광의 강도임). 상기 셀룰로오스에 의한 광학 밀도는 셀룰로오스의 혼탁도(turbidity)로도 명명될 수 있다. 상기 셀룰로오스의 혼탁도는 배양물 중에 존재하는 셀룰로오스에 대한 log(I0/Ip) 값을 의미할 수 있다 (Io는 입사광의 강도이고 Ip는 투과광의 강도임). 상기 광학 밀도 B의 대부분은 미생물에 의한 광학 밀도에 의한 것일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 배양물의 광학 밀도 A 및 광학 밀도 B는 동시에 또는 순차적으로 측정될 수 있다. 즉, 상기 광학 밀도 B의 측정은 광학 밀도 A의 측정과 함께 또는 광학 밀도 A의 측정 이후 이루어질 수 있다. 상기 광학 밀도 B의 측정이 광학 밀도 A의 측정 이후 이루어질 경우, 상기 광학 밀도 B의 측정은 광학 밀도 A를 측정한 모든 배양물을 대상으로 또는 대조군에 비해 광학 밀도 A가 큰 배양물만을 대상으로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 광학 밀도를 순차적으로 측정하는 단계는, 상기 배양물의 광학 밀도 A를 측정한 후 대조군에 비해 광학 밀도 A가 큰 배양물에 대하여 광학 밀도 B를 측정하여 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율을 얻는 것일 수 있다.
상기 방법은, 광학 밀도를 측정하기 전 배양물 중 셀룰로오스를 분산시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분산은 상기 배양물이 들어있는 용기에 진동을 가함으로써 달성될 수 있다. 상기 분산은 상기 배양물이 들어있는 용기를 교반하거나 진탕함으로써 달성될 수 있다. 상기 진동을 가하는 것 또는 교반 또는 진탕하는 것은 10초 이내, 8초 이내, 6초 이내, 또는 5초 이내로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 광학 밀도의 측정은 동일 배양물에 대하여 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 또는 6회 이상 이루어질 수 있다. 상기 광학 밀도는, 동일 배양물에 대하여 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 또는 6회 이상 측정하여 얻어진 값들 중 평균값으로부터의 편차가 5% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 12% 이상, 또는 15% 이상인 값을 제거한 나머지 측정값에 대한 평균값일 수 있다. 상기 광학 밀도는 예를 들면, 동일 배양물에 대한 3회 이상의 측정값 중 편차가 10% 이내인 값에 대한 평균값일 수 있다.
상기 광학 밀도의 측정은 고속 대량 스크리닝 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 상기 측정 단계는 하나의 고속 대량 스크리닝 시스템에서 배양 단계와 함께 이루어질 수 있다. 상기 광학 밀도의 측정은 배양 시작 시점으로부터 10시간 이후, 20시간 이후, 30시간 이후, 40시간 이후, 50시간 이후, 60시간 이후, 70시간 이후, 80시간 이후, 또는 90시간 이후 이루어질 수 있다. 상기 광학 밀도의 측정은 배양 중에 이루어질 수 있다. 상기 광학 밀도의 측정은 배양 중 실시간으로 이루어질 수 있다. 상기 실시간 측정 결과로부터 여러 변이 균주의 초기 셀룰로오스 생산 속도를 비교할 수 있다.
상기 측정 단계에서, 가시광선 영역의 짧은 파장은 380 nm 내지 420 nm, 390 nm 내지 410 nm, 또는 395 nm 내지 405 nm의 범위에 속하는 것일 수 있다. 상기 짧은 파장은 예를 들면, 400 nm일 수 있다. 상기 가시광선 영역의 긴 파장은 750 nm 내지 800 nm, 760 nm 내지 800 nm, 770 nm 내지 800 nm, 780 nm 내지 800 nm, 또는 790 nm 내지 800 nm의 범위에 속하는 것일 수 있다. 상기 긴 파장은 예를 들면, 800 nm일 수 있다.
상기 방법은 대조군에 비해 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율이 큰 미생물을 플라스크에서 배양하여 셀룰로오스가 포함된 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물 중 셀룰로오스의 함량을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 플라스크 배양에 있어서, 배양 부피는 50 mL 이상, 40 mL 내지 50 mL, 30 mL 내지 40 mL, 20 mL 내지 30 mL, 또는 20 mL 이하일 수 있다. 상기 배양은 정치 배양 또는 진탕 배양일 수 있다. 상기 배양 조건은 당해 분야의 통상의 기술자가 적절하게 결정할 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 상기 미생물의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 단당류, 이당류 및/또는 다당류를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다. 상기 배지는 HS 배지, 변형 HS 배지, LB 배지, 변형 LB 배지, YPD 배지, 변형 YPD 배지 또는 제한 배지일 수 있다.
상기 배양은 상기 배양은 호기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 약 20 내지 40℃, 약 22 내지 38℃, 또는 약 25 내지 37℃일 수 있다. 배양 배지의 pH는 약 4.0 내지 7.5, 약 4.0 내지 7.0, 또는 약 4.5 내지 7.0일 수 있다. 상기 배양은 통기성 플라스크(vented flask) 중에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 셀룰로오스의 함량 측정은 배양물로부터 셀룰로오스를 분리한 후 이루어질 수 있다. 셀룰로오스의 분리를 위해 배양물이 세척될 수 있다. 상기 셀룰로오스의 함량은 셀룰로오스의 건조 중량을 의미할 수 있다. 상기 플라스크 배양으로부터 얻어진 배양물 중 셀룰로오스의 함량을 측정함으로써 대조군에 비해 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율이 큰 미생물이 실제로 대조군에 비해 향상된 셀룰로오스 생산성을 갖는지 여부를 추가로 확인할 수 있다.
다른 양상은 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 배양하여 셀룰로오스를 생산하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 미생물, 광학 밀도 A, 광학 밀도 B, 배양 단계, 및 측정 단계에 대해서는 전술된 바와 같다. 상기 배양은 플라스크 배양일 수 있다. 상기 플라스크 배양에 대해서는 전술된 바와 같다.
도 1은 셀룰로오스 생산 균주의 광학 밀도를 가시광선 영역에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 광학 밀도 기반 방법을 통해 예측된 값과 실제 셀룰로오스 생산성과의 상관도(correlation)를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 모균주 및 5종의 변이 균주의 400 nm에서의 광학 밀도를 나타낸다.
도 3b는 도 3a의 균주의 (400 nm에서의 광학 밀도) / (800 nm에서의 광학 밀도)의 비율을 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 셀룰로오스 생산 균주의 광학 밀도 측정
Komagataeibacter xylinus DSM 46604 균주를 독일생물자원센터(DSMZ)로부터 구입하였다. HTS 기기 (Thermo Scientific/Liconic/Perkin Elmer)를 이용하여 균주를 배양하고 광학 밀도를 측정하였다. 광학 밀도를 최소 3회 측정하여 그 평균값을 얻었다. 얻은 평균값으로부터 10% 이상의 편차를 나타내는 값을 제거한 나머지 값으로부터 평균값을 얻었다. 매 측정 전 마이크로플레이트에 5초간 진동을 주어 셀룰로오스가 잘 섞이도록 하였다. 이하 실시예에서도 동일한 방법으로 균주의 배양 및 광학 밀도의 측정을 수행하였다.
2 wt/vol%의 글루코오스 및 1 vol%의 에탄올이 포함된 헤스트린-슈람(Hestrin-Schramm: HS) 배지 0.15 mL/well을 함유한 96 웰 마이크로 플레이트에 Komagataeibacter xylinus DSM 46604 균주를 접종하고 30℃에서 90시간 동안 정치배양하면서 8시간 마다 가시광선 영역에서 광학 밀도를 측정하였다.
도 1은 셀룰로오스 생산 균주의 광학 밀도를 가시광선 영역에서 측정한 결과를 나타낸다. 균주 배양물의 광학 밀도를 파장에 따라 측정하여 실선을 얻었다. 이 배양물을 90℃에서 1N NaOH에 16시간 동안 담근 후 물로 완전히 세척하여 균주 및 배지를 제거하였다. 균주 및 배지가 제거된 배양물의 광학 밀도를 파장에 따라 측정하여 점선을 얻었다. 실선은 셀룰로오스에 의한 광학 밀도와 균주에 의한 광학 밀도, 즉, 셀룰로오스의 혼탁도(turbidity)와 균주의 흡광도(absorbance)가 합하여진 값을 나타낸다. 점선은 셀룰로오스의 혼탁도 값만을 나타내므로, 실선과 점선의 차이가 균주의 흡광도를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 파장이 길어질수록 균주의 흡광도는 큰 값을 갖는 반면, 셀룰로오스의 혼탁도는 훨씬 작은 값을 갖는다. 이는 가시광선 영역의 긴 파장에서 측정된 광학 밀도가 균주의 밀도를 잘 반영한다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 광학 밀도 기반 셀룰로오스 고생산 균주 선별 방법
2.1. 광학 밀도 기반 셀룰로오스 고생산 균주의 선별
실시예 1에 따르면, 가시광선 영역의 짧은 파장에서의 광학 밀도가 크다는 것은 시료 중 균주의 밀도 또는 셀룰로오스의 농도가 높다는 것을 나타낸다. 가시광선 영역의 긴 파장의 경우 광학 밀도의 대부분을 균주의 흡광도가 차지하므로, 가시광선 영역의 긴 파장에서 측정된 광학 밀도로부터 균주의 밀도를 비교적 정확하게 알아낼 수 있다. 이를 기초로, 하기와 같은 셀룰로오스 고생산 균주의 선별 방법을 개발하였다:
(1) 균주의 배양물에 대하여 가시광선 영역의 짧은 파장에서 광학 밀도 A를 측정하거나, 상기 광학 밀도 A와 함께 가시광선 영역의 긴 파장에서 광학 밀도 B를 측정한다.
(2) 대조군보다 A 값이 큰 배양물에 대하여 가시광선 영역의 긴 파장에서 광학 밀도 B를 측정하거나 (1)에서 측정된 광학 밀도 B를 이용하여 (광학 밀도 A) / (광학 밀도 B)의 비율을 계산한다.
(3) 대조군보다 (광학 밀도 A) / (광학 밀도 B)의 비율이 큰 균주를 선별한다.
2.2. 변이 균주의 제조 및 광학 밀도의 측정
N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)에 의한 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis)을 이용하여 Komagataeibacter xylinus DSM 46604의 변이 균주를 제조하였다. NTG를 아세톤에 10.0%(w/v)로 완전히 용해시킨 후 멸균수를 첨가하여 최종 농도 1.0%(w/v)의 NTG 용액을 제조하였다. 모균주 Komagataeibacter xylinus DSM 46604를 2 wt/vol%의 글루코오스 및 1 vol%의 에탄올이 포함된 10 mL의 HS 배지가 들어있는 50 mL 튜브에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에 NTG 용액을 첨가하여 최종 농도가 30 ㎍/mL이 되도록 하고 50분 동안 34℃, 250 rpm에서 배양하였다. 이후 4,000 rpm으로 7분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 상기 HS 배지(20 ㎖)로 2회 세척하여 NTG를 제거하였다. NTG가 제거된 튜브에 10 ㎖의 HS 배지를 첨가하여 30℃, 250 rpm에서 24시간 배양한 후 HS 한천 고체 배지에 도말하였다. 고체 배지를 30℃에서 72시간 동안 배양한 후 변이 균주의 콜로니를 확보하였다.
HS 배지 0.15 mL/well을 함유한 96 웰 마이크로 플레이트에 모균주 및 변이 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 동안 정치배양한 후 400 nm에서 광학 밀도 A 및 800 nm에서의 광학 밀도 B를 측정하였다. 광학 밀도를 최소 3회 측정하여 그 평균값을 얻었다. 얻은 평균값으로부터 10% 이상의 편차를 나타내는 값을 제거하고 나머지 값으로부터 평균값을 얻었다. 매 측정 전 마이크로플레이트에 5초간 진동을 주어 셀룰로오스가 잘 섞이도록 하였다.
2.3. 신뢰도 검정
광학 밀도 기반 방법의 신뢰도를 검정하기 위하여, 실시예 2.2에서 수득된 변이 균주를 플라스크에서 동일 조건으로 배양하여 셀룰로오스 생산성을 측정하였다.
모균주와 변이 균주들을 2 wt/vol%의 글루코오스 및 1 vol%의 에탄올이 포함된 50 mL의 HS 배지가 담겨있는 250 mL 플라스크에서 72시간 동안 34℃, 250 rpm에서 배양하였다. 배양 후 생성된 셀룰로오스를 90℃에서 200 mL의 1N NaOH 중에 16시간 동안 담근 후 물로 완전히 세척하여 균주와 배지를 제거하였다. 세척된 셀룰로오스를 동결건조하여 그 중량을 측정하였다. 광학 밀도 기반 방법을 통해 예측된 값과 실제 셀룰로오스 생산량을 아래의 수식으로 비교하였다.
상관도 (%비) = (셀룰로오스의 양변이 균주 - 셀룰로오스의 양모균주)% ÷ (광학 밀도의 비변이 균주 - 광학 밀도의 비모균주)%
여기서, (셀룰로오스의 양변이 균주 - 셀룰로오스의 양모균주)%는 (플라스크에서 변이 균주가 실제 생산한 셀룰로오스의 양 (mg) - 플라스크에서 모균주가 실제 생산한 셀룰로오스의 양 (mg)) ÷ 플라스크에서 모균주가 실제 생산한 셀룰로오스 양 (mg) x 100이다. (광학 밀도의 비변이 균주 - 광학 밀도의 비모균주)%는 (마이크로플레이트에서 측정한 변이 균주의 광학 밀도의 비(A/B변이균주) - 마이크로플레이트에서 측정한 모균주의 광학 밀도의 비(A/B모균주)) ÷ 마이크로플레이트에서 측정한 변이 균주의 광학 밀도의 비(A/B변이균주) x 100이다.
도 2는 광학 밀도 기반 방법을 통해 예측된 값과 실제 셀룰로오스 생산성과의 상관도(correlation)를 나타내는 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 광학 밀도 기반 방법을 통해 예측된 값과 실제 셀룰로오스 생산성과의 상관도는 약 95.4%으로 나타났다. 도 2의 결과는 셀룰로오스 생산성이 우수한 균주를 선별하는 데 있어서 광학 밀도 기반 방법이 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 광학 밀도를 기반으로 한 셀룰로오스 고생산 균주의 선별
실시예 2.2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Komagataeibacter xylinus DSM 46604의 변이 균주를 제조하였다. 수득된 1,800여 종의 변이 균주에 대한 콜로니를 HS 배지 0.15 mL/well을 함유한 96 웰 마이크로 플레이트에 접종하여 30℃에서 90시간 동안 정치배양한 후 400 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 광학 밀도를 최소 3회 측정하여 그 평균값을 얻었다. 얻은 평균값으로부터 10% 이상의 편차를 나타내는 값을 제거한 나머지 값으로부터 평균값을 얻었다. 매 측정 전 마이크로플레이트에 5초간 진동을 주어 셀룰로오스가 잘 섞이도록 하였다.
400 nm에서의 광학 밀도가 모균주에 비해 높은 5종의 균주를 선별하였다. 높은 균주 밀도로 인해 높은 광학 밀도가 얻어진 경우를 배제하기 위하여, 선별된 5종의 균주에 대하여 800 nm에서의 광학 밀도를 측정하고, (400 nm에서의 광학 밀도) / (800 nm에서의 광학 밀도)의 비율을 계산하였다.
도 3a는 모균주 및 5종의 변이 균주의 400 nm에서의 광학 밀도를 나타낸다. 도 3b는 도 3a의 균주의 (400 nm에서의 광학 밀도) / (800 nm에서의 광학 밀도)의 비율을 나타낸다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 1종의 변이 균주가 모균주에 비해 (400 nm에서의 광학 밀도) / (800 nm에서의 광학 밀도)의 비율이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 이 변이 균주를 모균주에 비해 셀룰로오스의 생산성이 향상된 균주로 선정하였다.
선별된 변이 균주의 실제 셀룰로오스 생산량을 측정한 결과, 모균주 대비 생산량이 약 10% 증가한 것으로 나타나, 광학 밀도 기반 방법을 통해 셀룰로오스 생산성이 우수한 균주를 선별할 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 상기 미생물 및 셀룰로오스가 포함된 배양물을 얻는 단계;
    상기 배양물의 광학 밀도 A 및 광학 밀도 B를 동시에 또는 순차적으로 측정하여, 대조군에 비해 광학 밀도 A가 큰 배양물에 대하여 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율을 얻는 단계; 및
    대조군에 비해 상기 비율이 큰 미생물을 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물로 선별하는 단계를 포함하고,
    상기 광학 밀도 A는 가시광선 영역의 짧은 파장에서 측정되는 것이고, 상기 광학 밀도 B는 가시광선 영역의 긴 파장에서 측정되는 것인, 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 스크리닝하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물이 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물이 돌연변이된 미생물 또는 재조합 미생물을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이된 미생물이 무작위 돌연변이 유발에 의해 생성된 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 배양이 마이크로플레이트 상에서 이루어지는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 광학 밀도를 순차적으로 측정하는 단계는, 상기 배양물의 광학 밀도 A를 측정한 후 대조군에 비해 광학 밀도 A가 큰 배양물에 대하여 광학 밀도 B를 측정하여 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율을 얻는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 광학 밀도의 측정 전 배양물 중 셀룰로오스를 분산시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 광학 밀도는 동일 배양물에 대한 3회 이상의 측정값 중 편차가 10% 이내인 값에 대한 평균값인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 광학 밀도가 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 시스템에 의해 측정되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 측정이 배양 중 이루어지는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 짧은 파장이 380 nm 내지 420 nm의 범위에 속하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 긴 파장이 750 nm 내지 800 nm의 범위에 속하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    대조군에 비해 광학 밀도 A / 광학 밀도 B의 비율이 큰 미생물을 플라스크에서 배양하여 셀룰로오스가 포함된 배양물을 얻는 단계; 및
    상기 배양물 중 셀룰로오스의 함량을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 1의 셀룰로오스 생산성이 향상된 미생물을 배양하여 셀룰로오스를 생산하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스를 생산하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 배양이 플라스크 배양인 것인 방법.
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