JP3089269B2 - 網状セルロース - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、人工的培養物中
にセルロースを生産することができるアセトバクター
（Acetobacter ) の菌株に関する。さらに詳しくは、こ
の発明のアセトバクターの株は、培養中のセルロース生
産の喪失をまねく不安定性を示すことなく攪拌培養にお
いて多量のセルロースを生産する能力を有することを特
徴とする。この発明のアセトバクターの株はさらに、グ
ルコン酸を生産する実質的に低下した能力によりさらに
特徴付けられる。人工培地中でこのようなグルコン酸ネ
ガティブ(glcＡ- ) 株を用いるセルロース生産は、これ
らの株が培地を実質的に酸性化しないために促進され
る。このようなグルコン酸ネガティブのアセトバクター
株は高細胞濃度培養において有用である。 【０００２】この発明はさらに、新規な性質を有する細
菌性セルロース生成物に関する。特に、この発明は網状
セルロース(reticulated cellulose) 生成物に関する。
この網状の細菌性セルロース生成物は、静置培養条件低
下でセルロース生産性微生物により生産される細菌性セ
ルロース生成物の微視的構造と異る微視的構造により特
徴付けられる。 【０００３】この発明はさらに、攪拌培養条件下で、一
般には４時間を超える持続される時間にわたってセルロ
ース生産微生物を培養することにより網状セルロース生
成物を製造する方法に関する。攪拌培養条件下での細菌
性セルロースの持続する効率的生産は予想外のことであ
った。 【０００４】 【従来の技術】アセトバクターによるセルロースの生産
は少なくとも1930年代以来熱のこもった研究対象であっ
た。1947年に、グルコース及び酸素の存在下でアセトバ
クターの非増殖細胞がセルロースを合成することが示さ
れた。 Hestrin, S.、Aschner,M. 及び Mager, J.、Nat
ure 159：64(1947)。Hestrin 等の観察以来、アセトバ
クターは種々の条件下でセルロースの生産を伴って培養
されてきた。 【０００５】例えば、約90〜 100サイクル／分の往復振
とうにより培養された場合、細胞は大きなゲル塊中に混
入される。培地が渦動を伴って攪拌される条件下で増殖
した場合、セルロースと細胞から成る星状のゲル体が形
成される。静置培養として増殖した場合、空気／培地界
面に薄膜(pellicle)が形成される。この薄膜は、培養物
を収容する容器の液面と同じ表面形状及び面積を一般に
有するパッドとして形成される。Hestrin 及びSchramm,
Biochem.Journal 58 : 345 −352 (1954)。 【０００６】Hestrin 及びSchramm は、10％未満の生存
細胞を含有するアセトバクターの凍結乾燥調製物による
迅速なセルロース生産を観察した。しかしながらこれら
の実験は、３〜４時間という比較的短時間にわたる前記
のような凍結乾燥調製物による振とう条件下でのセルロ
ース生産のみを測定しており、そしてグルコースの存在
下でアセトバクターにより生産されるグルコン酸により
惹起される実質的なpH変化を制御するためにクエン酸塩
緩衝条件下で行われた。 【０００７】アセトバクターによるポリサッカライドの
合成は、非増殖培養物を用いて幾つかのグループにより
行われた。これらの研究の幾かにおいては、Hestrin 及
びSchramm (1954)により記載されているように、アセト
バクターNRRLB 42株が培養され、セルロース薄膜が除去
され、0.01Ｍ Tris −EDTA中に再懸濁され、凍結され、
そして次に解凍された。これらの処理された細胞は、細
胞の増殖を維持しないがしかし調製された細胞によるセ
ルロースの合成を可能にする酵素活性を保存する条件下
での生化学的研究のために使用された。 【０００８】しかしながら、セルロース生産のためにア
セトバクターを培養するための条件の決定の進歩は、広
範な報告の対象ではなかった。そして、1982年12月16日
に出願された米国特許出願No.450,324の優先権を主張す
る英国特許出願No.2,131,701A 中に記載されている、ア
セトバクターの培養のために使用される条件は、Hestri
n 及びSchramm (1951)において記載された条件すなわ
ち、約６の始発pH、15℃〜30℃、そして好ましくは20℃
〜28℃の範囲の温度である。 【０００９】Bergesy Manual of Systematic Bacteriol
ogy Kreig 及びHolt編、第１版、William & Wilkins 、
バルチモア及びロンドン（1984）中Deley 等、“Acetob
acteracea", 267 −272 頁、によれば、増殖のための最
も良好な炭素源は、記載の順序に、エタノール、グリセ
リン及び乳酸である。ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノー
ル及びＤ−グルコースからは酸が生成される。 【００１０】英国特許出願No.2,131,701A に記載されて
いる炭素源は、スラクトース、マンニトール、ソルビト
ール及びグルコース（これらのすべては急速なセルロー
ス生産をもたらす）、並びにグリセリン、ガラクトー
ス、ラクトース、マルトース及びシュークロース（これ
らのすべては一層緩慢な増殖をもたらす）を包含する。
ソルボース、マンノース、セロビオース、エリスリトー
ル、エタノール及び酢酸を用いる場合、増殖は観察され
なかった。 【００１１】英国特許出願No.2,131,701A においては、
培地を除去するために処理した後に創傷手当用品として
使用するための密着ゲル状材料を製造することが所望さ
れる。このマット状形態を得るため、数時間〜数日間又
は数週間にわたる細胞増殖、及びセルロース生産の間、
培養物は不動状態に保持される。 【００１２】不動又は静置培養条件下での密着マット又
は薄膜の形成は英国特許出願No.1,131,701A 中に記載さ
れている培養様式であるが、この特許はさらに、セルロ
ース合成アセトバクターを含有する培地の間欠的攪拌は
微生物により生産されるセルロースフィブリルの長さを
調節することができることを説明している。間欠的攪拌
は、微生物によるフィブリルの綿状延長速度及び細胞表
面からフィブリルを攪拌剪断する時間間隔により決定さ
れる有限の長さのフィブリルをもたらす。しかしなが
ら、セルロース生産に対する連続的攪拌の効果について
は検討されていない。 【００１３】連続攪拌培養におけるアセトバクターから
のセルロースの生産は多くの問題点を伴い、従来その最
も困難なものは培養の不安定性であった。この不安定性
はセルロース生産能力が喪失すること及び非生産型細胞
によりセルロース生産細胞が次第に駆逐されることによ
り現われる。菌株の不安定性は、セルロース非生産性微
生物の変異株又は変種の自然的出現の結果であろう。 【００１４】非生産株のこの出現は、攪拌培養物中での
増殖中に培養物の集団バランスをセルロース生産型から
セルロース非生産型に移行せしめるのに十分な頻度をも
って起こるようである。振とう培養におけるセルロース
生産性の喪失もまた、遺伝的変化に基くセルロース非生
産性型への変異ではなく常に生理的因子の結果であろ
う。Leisinger 等、Ueber cellulosefrie Mutanten Von
Acetobacter xylinum,Arch. Mikrobiol, 54 : 21−36
(1966)。原因は不明であるが、攪拌培地中での細菌性セ
ルロースの断続的生産は今まで報告されていない。 【００１５】アセトバクターのセルロース・ネガティブ
(Cel- ) 株は、メタンスルホン酸エチル (EMS)、亜硝酸
及びＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）を
用いる化学的変異誘発により作られた。静置培養におい
て増殖した場合、ＥＭＳ−変異株及び亜硝酸−変異株の
すべて、並びにＮＧ−変異株の90％がセルロース生産タ
イプに復帰した。Valla 等、Cellulose −Negative Mut
ants of Acetobacterxyllinum, J.Gen, Microbiol. , 1
28(7)：1401−1408(1982)。 【００１６】静置培養におけるセルロース生産性株と非
生産性株との混合培養物の増殖は、セルロース生産性株
に非常に有利であり、他方、振とうフラスコ中でのこの
ような混合培養物の増殖は非生産性株に有利である。Va
lla 等（1982）。この結果によれば、この微生物により
生産されたセルロースマット又は薄膜は、アセトバクタ
ー細胞が酵素の供給の豊富な液体静置培地の表面に達す
ることを可能にするという仮説が支持される。酸素の溶
解速度及び低い酸素溶解度が増殖を制限する振とう条件
下では、セルロース生産性細胞の選択的集合及びそれに
よりもたらされる酸素に関する物質移動の制限のため、
セルロース・ネガティブ株が有利である。 【００１７】従って、攪拌された培地中での安定なセル
ロース生産菌であるアセトバクターの株を同定しそして
単離することは、培地への十分な酸素供給のために攪拌
を必要とする程十分に濃厚な培養物中でアセトバクター
からセルロースを大規模生産するために非常に重要であ
ることは容易に明らかであろう。 【００１８】アセトバクターは特徴的にグラム陰性の、
0.６〜0.８μｍ×1.０〜４μｍの棒（桿）状細菌であ
る。この菌は厳格に好気性であり、代謝は呼吸的であ
り、決して発酵的ではない。これはさらに、セルロース
と化学的に同一である多数のポリβ−１，４−グルカン
鎖を生成する能力により区別される。多数セルロース鎖
又はミクロフィブリルは、細胞膜に対して外側の部位の
細菌表面において合成される。これらのミクロフィブリ
ルは約1.６nm×5.８nmの断面寸法を有する。静置又は放
置培養条件において、ミクロフィブリルは細菌表面で一
緒になって約3.２nm×133nm の断面寸法を有するフィブ
リルを形成する。 【００１９】これらの微生物によって生産されたセルロ
ースフィブリルは、木材パルプから製造されたセルロー
スと多くの点で類似しているが、幾つかの点で異なる。
特に、差異はこれらのフィブリルの断片幅である。アセ
トバクターにより生産されたセルロースフィブリルは、
パルプカバ又は松材から典型的に製造されるセルロース
ファイバーより、通常２オーダー狭い。これらのアセト
バクター生産フィブリルの小さい断面サイズは、それに
伴う常用の木材セルロースより大きい表面積及びセルロ
ースの本来的な親水性と相まって、水性溶液を吸収する
異常に大きな能力を有するセルロース生成物を導く。 【００２０】高い吸収性のこの能力は、熱傷の治療にお
いて使用される包帯の製造において、又は、長時間の外
科処置の間に暴露された器官の表面の乾燥を防止するた
めの外科用包帯として有用であることが証明されてい
る。このような用途、及びアセトバクターにより生産さ
れたそのままの薄膜の処理により作られる種々の医薬含
浸パッドが英国特許出願No.2,131,701A に記載されてい
る。この英国特許出願の薄膜は、不動状態に維持される
培地トレイ中で、増殖するアセトバクターにより生産さ
れる。 【００２１】アセトバクターは偏性好気性菌であるた
め、すなわちこのものは酸素の非存在下では増殖するこ
とができないため、アセトバクターによるセルロースの
生産は空気−液体培地表面において起こる。各細菌は空
気−液体界面において１本のフィブリルを連続的に生産
する。新しいセルロースが表面で形成されるに従って既
在のセルロースは増殖培地中に押し出される。その結
果、静置培養条件下で生産されたセルロース薄膜はセル
ロースファイバーの層から成る。 【００２２】このようにして生産されたセルロースの体
積は、空気と培地との界面によりかなり制限される。攪
拌条件下、上昇した溶存酸素濃度において培養された場
合、既知のアセトバクター株がセルロース非生産株に変
る傾向は、経済的に製造し得るセルロースの量を厳しく
制限する。従って、長期にわたる攪拌発酵における単位
容器容量当りの高いセルロース生産性は今まで報告され
ていない。 【００２３】攪拌又は静置による回分培養におけるアセ
トバクターによるセルロースの製造に伴う他の問題は、
グルコースをグルコン酸及びケトグルコン酸に転換する
アセトバクターの能力である。生物によるこのような酸
生産に伴うpHの低下もまた、特に回分培養において、生
産されるセルロースの量を制限する。さらに、グルコン
酸の生産は、セルロース生産の犠牲において培地からグ
ルコースを除去する。 【００２４】 【発明の概要】本発明者は新規な性質を有する細菌性セ
ルロース生成物を創製した。特に、本発明者は網状セル
ロース生成物を開発した。この網状細菌性セルロース生
成物は、静置培養条件下でセルロース生産性微生物によ
り生産された細菌性セルロースの微視的構造とは異る微
視的構造を有することを特徴とする。 【００２５】既知の静置培養条件下で生産された細菌性
セルロースは、重なりそしてからみ合った別々のセルロ
ースストランド又はフィブリルから成る組織化されてい
ない（disorganized) 層構造により特徴付けられる。こ
の組織化されていない層構造は、微生物アセトバクター
により代表されるセルロース生産性微生物の増殖パター
ンを反映する。 【００２６】静置培養において、アセトバクターは典型
的には液体培地の表面と酸素を含有する空気との界面で
増殖する。細菌が増殖するに従って、セルロースファイ
バーは連続的に形成され、そして蓄積し、培地中に深く
沈む。こうして形成されたセルロース薄膜は空気−培地
界面でアセトバクターの細胞の増殖する集団を支持する
連続層状セルロースファイバーの塊から成る。 【００２７】この発明の攪拌培養条件に従って生産され
るセルロースの巨視的及び微視的構造は、既知の静置培
養条件に従って生産されたそれとは異る。巨視的には、
この発明のセルロースは、空気−培地界面における連続
薄膜としてではなくペレットとして培養物中に形成され
る。微視的には、この発明のセルロース生成物は三次元
網状構造によって特徴付けられる。 【００２８】この構造は、相互に連結して三次元的に延
びる格子状パターンを形成するセルロースの頻繁に太く
なるストランドにより特徴付けられる。静置培養におい
て生産される細菌性セルロースは、平行であるがしかし
組織化されていない平面中、主としてストランドの長軸
にそって方向付けられたセルロースのオーバーラップす
る近接するストランドにより特徴付けられる。 【００２９】これに対して、この発明のセルロース生成
物の網状構造は、オーバーラップしているのではなく相
互に連結されているセルロースのストランドにより特徴
付けられる。これらの相互連結されたストランドはおよ
そ直角な方向付け及びおよそ平行な方向付けの両方を有
する。 【００３０】その結果、この発明の網状セルロース生成
物は走査電子顕微鏡写真においてさらに一般的に窓のあ
る形状を有し、他方、静置培養において生産されたセル
ロースは走査電子顕微鏡写真において、相互の上に十字
状に重ねられているがしかしある１つの層中では実質的
に平行しているストランドの形状を有する。 【００３１】この発明のセルロース生成物のストランド
は、攪拌を伴わない対応する培地中で生産されたそれよ
りも一般に太い。網状セルロースは、約0.１〜約0.２ミ
クロンの幅で配置された相互連結されたフィラメントか
ら成っていた。非攪拌条件下で生産されたセルロースの
フィラメント又はストランドは約0.05〜0.２ミクロンの
幅で配置されており、多くのストランドが0.05〜約0.10
ミクロンの幅で配置されていた。 【００３２】さらに、非網状セルロース生成物のフィブ
リルは、網状生成物のフィブリルに比べて、一層低頻度
で分岐しそして相互連結されているようである。非網状
セルロース生成物は相互に接触する多くのフィブリルを
有するようであるが、フィブリルは相互連結されている
のではなくむしろ相互に重層されている。これに対し
て、この発明の網状セルロースのフィブリルは相互に連
結して相互連結ファイバーの実質的に連続的なネットワ
ークを形成するファイバーの大きな比率を有する。 【００３３】この発明の網状セルロース生成物は、非攪
拌条件下で生産されたセルロースに対して幾つかの利点
を有する。網状セルロース生成物はアセトバクターのご
ときセルロース生産性微生物の攪拌培養において特徴的
に生産されるため、これは常用の大容量発酵法により製
造され得る。従って、従来技術の増殖の緩慢な不動培地
でのセルロース薄膜の製造と異り、この発明の網状セル
ロース生成物は、アセトバクターの急速増殖培養物中
で、高い容積生産性及び網状セルロース生成物の高濃度
を伴って製造され得る。 【００３４】この発明の網状セルロース生成物を非攪拌
条件下で生産された細菌性セルロース生成物から区別す
ることができる１つの方法は、紙様シートへの一体化に
対するその特徴である。網状セルロース生成物のバッチ
は、常用手段、例えば、ブリティッシュ・ディスペンサ
ーによる水中への分散、及びこれに続くシート型での形
成及び種々の倍数での圧縮によるハンドシート（hand s
heet) に成形される場合圧縮（densification)に対して
広範囲の耐性を与える。 【００３５】網状セルロース生成物の幾つかのバッチ
は、上記のような手段によりハンドシートに成形される
場合、圧縮（densification)に対する実質的な耐性を提
供することが見出された。異る湿圧縮負荷を用いること
により、約 300〜約 900kg／m3の範囲の密度を有する一
連のシートが製造され、圧縮（densification)に対して
実質的な耐性を示すものは約300 〜約 500kg／cm3 であ
った。 【００３６】低い密度にもかかわらず、これらの紙様シ
ートは、インストロン・ユニバーサル試験装置を用いる
Technical Association of the Pulp and Paper Indust
ry(TAPPI) 法に従って測定した場合、非常に高い引張り
強さ（tensile strength）を有する。典型的には、300
〜 500kg／m3の密度範囲のシートの引張り指数（tensil
e index)は 100〜150 ニュートン−メーター／ｇの間で
ある。約 500kg／m3以下の密度を有するクラフトパルプ
から形成された対応するシートは引張り強さを実質的に
有しない。 【００３７】静置培養条件下で製造されたセルロースか
ら形成されたハンドシートは圧縮（densification)に対
する上記の耐性を示さない。典型的には、非攪拌培養の
セルロースからのこのようなシートは、用いられた湿圧
縮負荷に依存して約 500〜約750kg／m3の密度を有す
る。 【００３８】この発明はさらに、攪拌培養条件下で長時
間にわたりセルロース生産性微生物を培養することによ
り網状セルロース生成物を製造する方法に関する。攪拌
培養条件下での細菌性セルロースの生産は、アセトバク
ターのセルロース非生産性株を選択する攪拌培養条件の
よく知られている傾向に照らして驚くべきことである。
Valla 等（1982) 。さらに、これらの条件下で生産され
るセルロースの網状構造は全く予想外のことである。 【００３９】この明細書において使用する場合、アセト
バクター（Acetobacter)なる語は、微生物の属、そして
特にセルロースを生産する属の構成員に関する。この記
載に該当する多くの微生物が知られているが、それらの
菌学的分類は議論すべき対象であった。例えば、アメリ
カン・タイプ・カルチュアー・コレクションのカタログ
の第15版にNo.10245、No.10821、及びNo.23769として挙
げられているセルロース生産性微生物は、アセトバクタ
ー・アセチ・サブスペシス・キシリヌム（Acetobacter
aciti subsp.xylinum)、及びアセトバクター・パストリ
アヌス(Acetoba cter pasteurianus)の両者として分類さ
れている。 【００４０】従って、後でさらに説明するような攪拌培
養条件下での安定性の特徴を有するアセトバクターのす
べてのセルロース生産性株は、それがアセトバクター・
アセチ・サブスペシス・キシリヌムとして、アセトバク
ター・パストリアヌスとして、又は他の名称で分類され
ていても、この発明の範囲に属すると考えられる。本発
明者は、発酵槽工程条件を含む攪拌培養条件及び非攪拌
培養条件の両者において長時間培養において安定なアセ
トバクターの多くの株を発見しそして開発した。 【００４１】菌株の安定性は攪拌条件下において証明さ
れる。すなわち、攪拌条件下液体培地中で増殖したアセ
トバクターのサブカルチュアーを固体培地上に置いた場
合のコロニー形態により決定する場合、この発明の菌株
は42〜45世代の発酵過程の終りにおいて0.５％未満のオ
ーダーの非常に低い頻度でセルロース非生産性型に変化
するようである。 【００４２】この発明のアセトバクターの株を変異処理
し、そして多数の誘導体株を選択した。選択された株の
１つ及びその子孫は、グルコース含有培地で増殖した場
合の非常に低下したグルコン酸生成能力により特徴付け
られる。低下したグルコン酸生成能力を有するこのよう
な株は安定である。発酵槽ブロスからのサンプルのサブ
カルチュアーがグルコース含有培地上で炭酸カルシウム
を透明にするコロニーを形成する能力を有しないことに
より決定した場合、42〜45世代の発酵過程の終点におい
て、0.５％未満のグルコン酸生産型が検出される。これ
らの株は、セルロース非生産型への変化及びグルコン酸
生産型への変化に関して安定である。 【００４３】セルロース生産性微生物の増殖及び網状セ
ルロース生成物のための炭素源として、汚染微生物を含
有しない種々の原料を使用することができる。適当な炭
素源には、純粋な形態もしくは部分精製された形態で
の、又はモノサッカライド−もしくはジサッカライド−
含有原料としての、モノサッカライド類及びジサッカラ
イド類、例えばトウモロコシ澱粉及び糖蜜由来のグルコ
ースが含まれる。 【００４４】この発明の株によるセルロースの製造は、
静置条件下で可能であるのよりも高い溶存酸素濃度を可
能にする条件下で行われよう。攪拌されながらセルロー
ス生産を維持する菌株の能力は、使用される培地中の溶
存酸素を増加せしめるための種々の手段を許容する。す
なわち、生産されたセルロースのインペラーへの付着は
不利であろうが、培地中に浸漬されたインペラーによる
培地の直接攪拌が好結果をもって使用された。溶存酸素
を増加せしめるために培養物を攪拌する手段は、微生物
発酵分野における当業者によく知られている。培養液中
の酸素は0.01〜0.４気圧酸素の間で異ることができる。 【００４５】ブロスを攪拌するためにインペラーを使用
する発酵槽（14ｌ）において、ブロスの特性（粘度）及
び生ずるセルロースの特性（粒子のサイズ及び形態、沈
降速度、並びにハンドシートの形成）の両者が高いイン
ペラー速度（行われた試行において約600rpm以上）によ
り影響を受けることが見出された。これらの結果がすべ
ての発酵槽容積及び構成及び／又は攪拌の方法に妥当す
るか否かは不明である。 【００４６】しかしながら、行われた試験においてはよ
り高いインペラー速度／より長い攪拌時間が、より長い
粒子沈降時間、より高い懸濁液粘度、ハンドシート試験
におけるより少ないセルロース保持、及びより小さい粒
子をもたらした。従って、セルロースの意図される最終
用途に依存して、微生物をこのような攪拌条件下で培養
することを回避するのが好ましい。従って、十分に低い
攪拌速度及び短い攪拌時間で発酵を行うことによりセル
ロース生成物の性質の実質的な低下を回避するのが好ま
しい。 【００４７】この発明のセルロース生産性微生物を培養
するための効果的なpH範囲は４〜６であり、そして好ま
しくは4.５〜5.５である。pHは、クエン酸塩のごとき緩
衝剤を培地に加えることにより、あるいは所望の範囲に
pHを維持するのに十分な量の塩基又は酸を培地に加える
ことにより、調節することができる。 【００４８】 【発明の具体的な記載】以下のこの発明の具体的な記載
において、多くの培地を記載する。これらの培地は特に
ことわらない限り下記の組成を有する。Ｒ20−２培地は
次の組成を有する。Ｒ20−２ バクトペプトン ５ｇ／ｌ 酵母エキス ５ｇ／ｌ Na2HPO4 2.７ｇ／ｌ クエン酸 1.15ｇ／ｌ 炭素源 特に示される通り（特に示されない場合は ２％グルコース） 最終pH 5.０±0.２ Ｒ20は上記と同じであるが、最終pHは6.０である。 【００４９】Ｒ20−３は上記と同じであるがクエン酸が
省略されている。Ｙ−１培地は、最小培地とも称し、次
の組成を有する。化合物 最終濃度（mM) (NH4)2SO4 25 KH2PO4 7.３ MgSO4 1.０ FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.0011 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 pH＝5.０ グルコース 特にことわらない限り２ｗ／ｖ％ 【００５０】Ｙ−１培地を用いるすべての研究のため、
上記最小培地に下記のビタミン混合物を 100倍希釈で加
えた。ビタミン混合物 化合物 mg／Ｌ イノシトール 200 ナイアシン 40 ピリドキシンHCl 40 チアミンHCl 40 パントテン酸カルシウム 20 リボフラビン 20 ｐ−アミノ安息香酸 20 葉 酸 0.２ ビオチン 0.２ 【００５１】コーンスティープリカー培地は次の組成を
有する。成 分 最終濃度（mM) (NH4)2SO4 25 KH2PO4 7.3 MgSO4 1.0 FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.001 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 ビタミン混合物（前記） 10ml／ｌ 炭素源 特に示される通り（特に示されな い場合はグルコース２ｗ／ｖ％又 は４ｗ／ｖ％） コーンスティープリカー 特に示される通り（通常 （遠心後の上清画分） ２ｖ／ｖ％又は５ｖ／ｖ％） 消泡剤 0.01ｖ／ｖ％ 最終pH＝5.０±0.２ 【００５２】コーンスティープリカーの組成は供給者及
び処理の態様により異る。コーンプロダクツユニット
（Corn Products Unit) 、ＣＰＣ北米、ストックトン、
カリホルニアから得られる典型的なコーンスティープリ
カーサンプルLot E804は下記の組成を有する。 【００５３】主たる成分 ％ 固形分 43.8 粗蛋白質 18.4 脂 肪 0.5 粗繊維 0.1 灰 分 6.9 カルシウム 0.02 リ ン 1.3 無窒素抽出物 17.8 非蛋白性窒素 1.4 NaCl 0.5 カリウム 1.8 還元糖（デキストロースとして） 2.9 澱 粉 1.6 pH 4.5 【００５４】Ｙ３−３培地は次の組成を有する。成 分 濃 度 酵母エキス 10ｇ／ｌ ペプトン 10ｇ／ｌ KH2PO4 4mM K2HPO4 6mM グルコース 20ｇ／ｌ pH 6.0 【００５５】この発明の１つの観点は、アセトバクター
（Acetobacter)の幾つかのセルロース生産性株に関す
る。この発明のアセトバクターの株の安定性は、セルロ
ースを生産しない表現型への非常に低い転換頻度により
示される。攪拌条件下で増殖したアセトバクターのサブ
カルチュアーを42〜45世代の発酵サイクルの終点で固体
培地上にプレートした場合のコロニー形態により決定す
る場合、セルロースを生産しない表現型への転換頻度は
５×10-3である。 【００５６】セルロース生産株のコロニーは一般にベー
ジュ色又は白色であり、そして小形であり、もり上って
おり又は凸形であり、そしてサイズがコンパクトであ
る。これに対して、セルロース非生産株は固体培地上に
大形の、通常平らなコロニーを形成する。 【００５７】この発明の安定なアセトバクターの株はナ
サン・レジョナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern
Regional Research Laboratory)、ペオリア、イリノ
イ、米国、から入手したＡ．キシリヌム（A.xylinum)N
o.NRRL B42 の最初の単離株から誘導された。Ｒ−20−
２培地の寒天プレート上でのNRRL株の増殖は２種類のコ
ロニー形態を示し、一方が白色であり、他方がベージュ
色であった。顕微鏡的には、ベージュ色のコロニーはア
セトバクターの株に典型的な長い棒（桿）形の細胞を有
する。この株を1306−３と命名する。 【００５８】親NRRL B42株と異り、1306−３株は、 Cou
so, R.O.等、Biosynthesisof Polysrccharides in Acet
o bacter xylinum；Sequential Synthesis of a Heptas
accharide Diphosphete Prenol；Eur. J．Biochem. 123
: 617−627(1982) により報告されたような水溶性ポリ
サッカライドを生産しない。1306−３株の培養物は、種
々の炭素源を含有する異る培地上で培養した場合、微視
的形態及び巨視的コロニー形態のいずれにおいても安定
である。さらに、この発明の株のコロニー及び細胞形態
は、種々の培地で静置培養又は振とう液体培養された場
合に安定なままである。 【００５９】1306−３株及びその子孫は、種々の炭素源
及び窒素源を含有する種々の液体培地中でセルロースを
生産することができる。カゼイン加水分解物、酵母エキ
ス、マルトエキス、アンモニウム塩、コーンスティープ
リカー及び他の窒素リッチ物質を、アミノ酸、窒素、ミ
ネラル及びビタミン類の一般源として使用することがで
きる。コーンスティープリカーは0.１ｖ／ｖ％〜10ｖ／
ｖ％の範囲において好ましい。 【００６０】振とうフラスコ培養においては５ｖ／ｖ％
のコーンスティープリカーが好ましい。発酵槽において
は、初期濃度２ｖ／ｖ％のコーンスティープリカーに、
発酵の過程で追加の２ｖ／ｖ％のコーンスティープリカ
ーが補充される。種々の炭素源を使用することができ、
これにはマンニトール、ソルビトール、シュークロー
ス、フラクトース、及びグルコースが包含される。但
し、後者の炭素源を用いて、Ｄ−グルコン酸及びケトグ
ルコン酸、例えば２−ケト−Ｄ−グルコン酸又は５−ケ
ト−グルコン酸が1306−３株により生産される。 【００６１】有意に少ない量のＤ−グルコン酸を生産す
るこの発明のアセトバクターの株も本発明者等により開
発された。これを後にさらに記載する。網状セルロース
生成物の生産において有用な炭素源は、モノサッカライ
ドもしくはその混合物、例えばグルコース及びフラクト
ース、ジサッカライド、例えばシュークロース、及びモ
ノサッカライドとジサッカライドとの混合物により特徴
付けられる。さらに、炭素源は糖の複合混合物（comple
x mixture)、例えば糖蜜、又は植物性バイオマスの加水
分解物、木材加水分解物、麦わら加水分解物、トウモロ
コシ茎の加水分解物、サトウモロコシ等として供給する
ことができる。 【００６２】モノサッカライド及びジサッカライド又は
これらの混合物の濃度は種々であり得る。グルコースの
み及びスラクトースのみが0.５ｗ／ｖ％〜７ｗ／ｖ％の
範囲、そして好ましくは約４ｗ／ｖ％の濃度で使用され
る。さらに、グルコースとシュークロースの混合物を、
その比率を１：10〜10：１とし、培地に対する合計濃度
を0.５ｗ／ｖ％〜７ｗ／ｖ％として使用することができ
る。フラスコ培養においては１ｗ／ｖ％グルコース及び
２ｗ／ｖ％シュークロースの濃度が好ましい。 【００６３】炭素源が発酵中に間欠的に又は連続的に供
給されるフィード回分発酵においては、添加される合計
炭素基質は４ｗ／ｖ％〜30ｗ／ｖ％の範囲で変化し得
る。炭素源は精製された又は部分精製されたフィードス
トックとして供給することができ、あるいはこれに代え
て、糖蜜のごとき複合混合物として供給することができ
る。これらの炭素源は、それらが汚染生物を含有しない
ように調製される。 【００６４】グルコース含有培地でのグルコースのＤ−
グルコン酸への転換は、回分培養において培地のpHの有
意な低下を導く。約4.０より低いpHを細胞の増殖を制限
するので、pHの調節が好ましい。この発明のグルコン酸
生産株の液体培地のpH調節は、クエン酸塩のごとき緩衝
剤の使用によって行うことができる。しかしながら、酸
を中和するために添加し得る緩衝剤の量は制限され、そ
してグルコン酸生産株の高密度への増殖は使用し得る緩
衝剤の量により制限される。 【００６５】さらに、緩衝剤としてのクエン酸塩又は他
の塩の使用は培地を高価なものとする。アセトバクター
はフラクトースを酸に代謝しないので、炭素源としてフ
ラクトースを使用することによってpH調節を行うことも
できる。しかしながら、フラストースは高価な基質であ
り、そしてセルロース繊維の製造コストを上昇せしめ
る。 【００６６】本発明者は、1306−３株を変異源で処理す
ることによって、1306−11株及び1306−21株により例示
される安定な変異株を開発した。これらの株は有意に低
下した量のグルコン酸を生産するが、親株1306−３に典
型的な安定な態様でセルロースを生産する。変異誘発処
理は、約１％の生存率を得るのに十分な濃度のメタンス
ルホン酸エチル(EMS) を使用して行った。1306−11株の
場合には、変異処理された生存細菌の内8,100 コロニー
をスクリーニングした。２個の単離株が低下した量のグ
ルコン酸を生産した。 【００６７】1306−11株は、Ｒ−20−CaCO3 培地のプレ
ート上での培養、及び親株1306−３に類似する形態を有
するがしかし培地中の炭酸カルシウムを透明にしないコ
ロニーについてスクリーニングすることにより選択し
た。1306−21株は、例５において後記するようにして選
択した。 【００６８】細菌培養物は、液体培地中に乱流を生じさ
せるために知られている任意の手段により、攪拌培養条
件下で増殖せしめることができる。このような手段は当
業者によく知られている。小規模の、一般に10ｌ未満の
培養容量の場合、培地に渦流動を付与する往復又は振と
う培養機により液体培地を攪拌することができる。 【００６９】大規模の、一般に10ｌ以上の培養容量の場
合には、培地を種々の手段により、例えばインペラー、
浮揚上昇発酵槽例えばエアーリフト発酵槽、発酵ブロス
のポンプ駆動循環、又はこれらの組み合わせにより攪拌
することができる。この発明のセルロース生成物の大規
模製造のために種々の反応器設計が適当である。例え
ば、Biochemical Engineering and Biotechnology Hand
book, Atkinson及びMavituna編、第１版、ザ・ネイチュ
アープレス、ニューヨーク（1983）の第７章を参照のこ
と。 【００７０】培地が攪拌される限り、長時間にわたり0.
１ｇ／ｌ／時以上であるセルロースの平均容積生産性に
おいてセルロース生産性微生物を増殖せしめるために種
々の発酵方法が適切である。適当な発酵法には回分発酵
法、フィード回分発酵法、反復回分発酵法、及び連続発
酵法が適当である。 【００７１】回分発酵においては、セルロース生産性微
生物が発酵槽に導入され、そして培地をさらに添加する
ことなく発酵が進行する。発酵の終点において、発酵槽
の内容物が集められ、そしてセルロースが採取される。
フィード回分発酵においては、発酵の終りまで処理のた
めの発酵液を取り出すことなく、発酵中に種々の栄養、
例えば窒素源又は炭素源が培地に添加される。 【００７２】栄養は連続的に、又は所定の間隔で、ある
いは培地中の栄養レベルが所望の値より低くなった場合
に添加される。反復回分発酵においては、一定容量の培
養液が処理のために取り出され、そして培養器中の残り
の培養液に一定容量の新鮮な培地が添加され、そして発
酵が回復される。反復回分発酵においては、フィード回
分発酵における場合と同様に、栄養を連続的に、又は所
定の間隔で、あるいは培地中の栄養レベルが所望の値よ
りも低下した時に添加することができる。 【００７３】連続発酵においては、一定速度で培養液が
発酵槽から取り出され、そして新鮮な培地で置き換えら
れる。連続発酵においては、容器への培地流及び容器か
らの培養液を調整することによってセルロース生産微生
物の増殖速度をおよそ一定の速度に維持することができ
る。 【００７４】回分発酵、フィード回分発酵、反復回分発
酵、及び連続発酵はいずれも、培地に対して接種物が１
ｖ／ｖ％以上である限り、0.１ｇ／ｌ／時以上の平均容
積生産性を達成するために適当である。0.１ｇ／ｌ／時
のセルロースの平均容積生産性を得るために培地に対し
て１〜10ｖ／ｖ％の接種物が効果的である。連続培養に
おいては、培地と同様にセルロース生産細胞及びセルロ
ースが取り出され、そして新鮮な培地が、0.１ｇ／ｌ／
時の平均容積生産性を維持するのに十分な速度で添加さ
れる。 【００７５】セルロース濃度及び容積生産性を決定する
ため、前記の発酵法のいずれかにより生産されたセルロ
ースが発酵液から採取される。一般に、セルロースを分
離するための任意の方法を使用することができるが、遠
心分離が好ましい。セルロース生産微生物、スペント培
地及びセルロースを含有する発酵液の各バッチを遠心す
る。上清液の容積を測定し、そしてこの上清を棄てる。 【００７６】微生物及びセルロースを含む固形物を含ん
で成るペレットが残る。このペレットを脱イオン水で２
〜３回洗浄して残留培地を除去する。第１図は、この段
階でのペレットのマクロ構造を示す。残留物をアルカリ
溶液、例えば0.１Ｍ NaOH 又はKOH により60〜65℃にて
少なくとも２時間処理する。溶液を混合してセルロース
の大きな塊を分散せしめることができる。 【００７７】アルカリ処理の間、混合物をゆっくり攪拌
し、そして60〜65℃に維持する。アルカリ処理された材
料を洗浄し、そして次にペレットを洗浄し、そして脱イ
オン水中で３〜４回遠心する。第１Ｂ図はこの段階での
マクロ構造を示す。次にセルロースを真空オーブン中で
乾燥し、そして秤量する。回分培養について接種から収
得までの発酵時間当り、使用された培地の容積当り、生
産されたセルロースの合計質量（ｇ／ｌ／時）として容
積生産性が定義される。 【００７８】次に、例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。 【００７９】例１．この例は、非振とう条件下で、主基
質としてのフラクトースに増殖するＡ．キシリヌム1306
−３によるセルロース生産を示す。Moshe Benziman博
士、ヘブレウ大学、イエルサレム、イスラエンから入手
した1499−１株を比較のために同じ条件下で増殖せしめ
た。 【００８０】50mlのエルレンマイヤーフラスコ中２％の
フラストースを含有するＹ３−３培地25mlを収容する種
母フラスコを用意し、そして寒天スラントから接種し
た。この培養物を30℃にて３日間静置培養として増殖せ
しめた。フラスコを手で激しく振って細胞を遊離せし
め、そしてこの培養物（セルロースペレットを含まな
い）0.５mlを、２ｗ／ｖ％のフラクトースを含有する同
じＹ３−３培地の数個のフラスコ（50mlフラスコ中25m
l）に接種した。 【００８１】670nm にて0.03ODの細胞懸濁液を使用しそ
して各フラスコに0.５mlを導入することにより、すべて
の株の同じ接種を行った。フラスコを振とうしないで30
℃にてインキュベートした。フラスコをインキュベーシ
ョンからはずし、そして全内容物をサンプリングのため
に収得した。各菌株につき各時点で２連のサンプリング
を行った。サンプリングは増殖が明らかになった時から
開始し、そして通常毎日２個のサンプルを採取した。 【００８２】セルロースの生産を測定するため、各サン
プルのフラスコ内容物を100ml ビーカーに移した。次に
懸濁液を、大Tekmerプローブを用いて全力の50％にて１
分間ほぐした。懸濁液を5,000rpmにて10分間遠心分離し
た。上清を棄て、そしてペレットを15mlの0.１Ｎ Nacl
液中に懸濁し、そして渦動せしめた。懸濁液を時々渦動
しながら15分間平衡化し、そして前記の洗浄段階を反復
した。 【００８３】第２洗浄からのペレットを15mlの0.５Ｎ K
OHに再懸濁し、そして60℃にて穏和な攪拌を行いながら
120 分間インキュベートした。懸濁液を遠心し、そして
KOH上清を棄てた。ペレットを15mlの脱イオン水に再懸
濁し、そして時おり渦動しながら室温にて15分間平衡化
した。サンプルを遠心分離し、そして前記の洗浄方法を
合計４回反応した。最後の遠心分離段階の後、湿セルロ
ースマットを秤量し、そして真空中55℃にて一夜乾燥し
た。 【００８４】 【表１】【００８５】２％のフラストースを含有するＹ３−３培
地上での1306−３株及び1499−１株によるセルロース生
産。 初期pH＝6.０、N.D.＝測定せず。 【００８６】例２．攪拌培養におけるセルロース生産安
定性研究 1306−３株及び1499−１株におけるセルロース合成の安
定性を、液体攪拌培養への菌株の一連の移行の間に、各
移行において均一な種接物を使用して試験した。セルロ
ース合成の安定性を評価するために、フラスコでのセル
ロース生産の観察及びプレート上でのサンプルからの大
形コロニー（Ｌ−コロニー）の出現を用いた。1499−１
におけるセルロース生産は、生産されるセルロースの量
の減少及びセルロース非生産株を代表する大拡散コロニ
ー数の増加により示されるように、好気攪拌フラスコ中
では、不安定であった。1306−３株におけるセルロース
生産は振とうされたフラスコ中で少なくとも30世代にわ
たり安定なようであった。 【００８７】種母培養物を、親培養物の寒天スラントか
ら、50mlのエルレンマイヤーフラスコ中２％のフラクト
ースを含有するＲ−20培地25ml中に接種した。種母培養
物を30℃にて４日間静置培養として増殖せしめた。フラ
スコを手で激しく振って細胞を遊離せしめ、そしてこの
培養物（セルロースペレットを含まない）0.５mlを、２
％のフラクトースを含有するＲ20培地の幾つかのフラス
コ（50mlフラスコ中25ml）に接種した。これらのフラス
コを振とうしないで30℃にてインキュベートした。 【００８８】静置フラスコでの数回の移行の後、36時間
ペレットを激しく振り、そして上清を接種物（１ｖ／ｖ
％）として使用し、２％フラクトースを含有するＲ20培
地（pH５）を収容するフラスコに接種した。フラスコ(1
25mlのフラスコ中25ml) を、ニュー・ブルンスウィック
・キラトリー振とう機中30℃にて200rpmでインキュベー
トした。24〜48時間後、培養物を無菌的に一緒にし、新
鮮な培地への第２移行のため、及びプレート上でのスト
リーキングのための接種物として使用した。各菌株を、
30世代とおよそ等しい４回の移行の間試験した。プレー
ト実験に使用した培地は２％のフラクトース及び1.５％
の寒天を含有するＲ20培地（pH5.0)であった。 【００８９】振とうフラスコで増殖する間、1499−１株
の培養物は見かけ上、細胞の均一な懸濁液及び異るサイ
ズの不規則な塊から成っていた。塊と細胞懸濁液との比
率は、第１移行から第３移行にかけて減少した。この観
察は、第１移行から第３移行にかけての生産されるセル
ロースの量の有意な減少、及びセルロース非生産株を代
表するＬ−コロニー比率の増加と相関した。増殖の関数
としての1499−１株のＬ−コロニーの頻度を表２に示
す。 【００９０】 【表２】 【００９１】非常に対照的に、1306−３株の培養物は、
振とうフラスコ中での増殖の間、見かけ上異るサイズの
不規則な塊とそれらの塊の間の透明な培地から成ってい
た。セルロース−ネガティブ細胞は培養液中に単一細胞
として現われ、そして塊の間の培地中に濁を生じさせ
る。４回の移行の後、培養物の外観及びセルロース生産
量の変化は観察されなかった。この間、プレート上のコ
ロニーは均一に現われ、大型の非生産性コロニーは観察
されなかった。 【００９２】例３．1306−３株の変異誘発 1306−３株を１％又は２％の化学変異剤メタンスルホン
酸エチル（EMS)により変異誘発処理し、そして生存細胞
をグルコン酸合成能力の喪失（glcA- ) についてスクリ
ーニングした。２個のglcA- 単離株が得られた。変異誘
発は次のようにして行った。 【００９３】Ｒ20−２培地上の1306−３株の２日間培養
物を変異処理のために使用した。約99％の死滅をもたら
すように条件を選択した。選択された条件は0.１Ｍリン
酸カルシウム緩衝液（pH6.0)0.２％ＥＭＳ、及び28℃に
て60分間のインキュベーションであった。細胞濃度は約
５×107 細胞／mlであった。この処理の後、培養物を−
80℃に凍結し、さらに使用した。 【００９４】例４．スクリーニング ＥＭＳ変異処理からの材料を用いて1306−３グルコン酸
ネガティブ変異株のスクリーニングを行った。スクリー
ニングは１％のCaCO3 を含有するＲ20−２プレート上で
行った。これらのプレートは、無菌Ｒ20−２中20％の無
菌CaCO3 を最終濃度が１％となるように加え、よく混合
し、そしてプレート当り10mlずつ分配することにより調
製した。プレート培地の最終pHは6.０であった。 【００９５】プレートを30℃にてインキュベートし、そ
して７〜10日後にスコアーした。透明化ゾーンを有しな
いコロニーを確認スクリーニングのために拾った。コロ
ニーを、２mlのＲ20−２培地を収容する無菌試験管に懸
濁し、そして３日間インキュベートして薄膜の形成及び
培養液のpHの低下をチェックした。スクリーニングした
8100個のコロニーの内、２％ＥＭＳ処理サンプルからの
２個の単離株がグルコン酸ネガティブであることが見出
された。これらの内良好な方を1306−11株と命名した。 【００９６】1306−11株及び1306−３株によるグルコン
酸生産を液体Ｒ20−グルコース培地及びＹ１−グルコー
ス培地で決定した。２％のグルコースを含有するＹ１の
初期pHは4.21であった。Ｒ20−２プレートからの１白金
耳の1306−11株又は1306−３株培養物を２mlの炭素源不
含有Ｙ１培地に懸濁した。これらの懸濁液の細胞数は約
1.６×108 細胞／mlであった。３mlの適切な培地を収容
する試験管（16×125mm)に 200μｌの細胞懸濁液を接種
し、そしてよく渦動混合した。試験管を振とうしないで
30℃にて３日間インキュベートした。表３は、変異株13
06−11及び親株1306−３についての３日目のpH及びグル
コン酸レベルを示す。値は２本の試験管のそれぞれにつ
いて示す。 【００９７】 【表３】 【００９８】例５．1306−21株の調製及び同定 1306−２株を例３におけるようにして変異誘発処理し
た。次に微生物をＣＳＬプレート（２％グルコース、３
％コーンスティープリカー）にプレートして単一コロニ
ーを確立した。コロニーを拾い、そして0.25mlのＳＣＬ
培地（４％グルコース、１％コーンスティープリカー）
を収容するミクロタイタートレイウエルに入れた。これ
らのトレイを、pH試験紙（2.９〜5.２の範囲）により測
定した場合の培地pHの明瞭な低下が観察されるまで４〜
５日間インキュベートした。そのpHは約５（pH試験紙が
緑色〜緑味色）であるコロニーを第２スクリーニングに
通した。 【００９９】第２スクリーニングにおいては、前記のミ
クロタイタートレイウエル中で使用した高グルコース培
地２mlを収容する試験管に、選択されたコロニーを接種
した。試験管を30℃にてインキュベートした。コロニー
を薄膜形成及びpHについて試験した。1306−21株と命名
されたグルコン酸ネガティブ株を、こうして選択した。 【０１００】比較のため、1306−11株及び1306−21株の
サンプルを、種々の量のグルコース及びコーンスティー
プリカーを含有するＣＳＬ培地を収容する種母フラスコ
中で、例１に記載した一般的方法を用いて増殖せしめ
た。５日間のインキュベーションの後、セルロース生産
及び培地pHを決定した。これらの結果を表４に示す。 【０１０１】 【表４】 【０１０２】以上のごとく、これらの試験において、13
06−21株は1306−11株に比較して、低い酸生産（高いp
H）及び高いセルロース生産を示した。例６ ．網状セルロース生成物の製造 1306−14株はアセトバタター1306−11株の自然変異株で
ある。1306−11株のコロニーが特徴的に一様な凸状であ
りそして濃ベージュ色を有するのに対して、この自然変
異株はＲ20−２プレート上で大形の白色粘質コロニーと
して同定された。 【０１０３】凍結ストックからの1306−14株のサンプル
を 100mlのＲ20−２培地中に接種し、そして静置条件下
で30℃にて約３日間増殖せしめた。培養物の完全な内容
物を無菌ブレンダーに移した。小ブレンドヘッドを用い
て、培養物を短い４秒バーストによりブレンドした。破
砕された培養物の５ｖ／ｖ％接種物を2000mlのバッフル
付フラスコ中 400mlのＲ20−２培地に移し、そして125r
pmにて振とうしながら30℃にて約2.５日間培養した。フ
ラスコの内容物をブレンドし、そしてこれを用いて発酵
槽に接種した。 【０１０４】バッフル付フラスコからの破砕された培養
物の５ｖ／ｖ％接種物を、２％のグルコースを含有する
Ｒ20−２培地９ｌに移した。発酵槽（ブラウン）にはイ
ンペラーを装着し、そして内部加熱コイル及びバッフル
を取り外した。発酵条件は最初600rpmであり、そして44
時間後に 1000rpmに上げて、粘性を増した培地の混合を
増加した。温度を30℃（±１℃）に調節した。pHは5.０
±0.１に調節し、そして培地中の酸素濃度を約30％の空
気飽和に維持した。48時間目に発酵槽の内容物を集め
た。 【０１０５】セルロースを自然沈降せしめ、そして過剰
の液を注ぎ出した。残ったセルロースをブレンドし、洗
浄し、そして前記のようにして洗浄した。セルロースを
脱イオン水で洗浄し、そして0.５Ｎ NaOH 中60℃にて一
夜、３回抽出した。最終抽出の後、洗浄水のpHが6.０以
下に低下するまでセルロースを脱イオン水で洗浄した。
この調製物を、例８に記載する走査電子顕微鏡実験のた
めに使用した。 【０１０６】例７．1306−８株は、NRRLB42 のサンプル
から直接選択されたアセトバクターの単離株である。13
06−８株のコロニーは、Ｒ20−２プレート上での白色の
高くもり上がったコロニーにより特徴付けられる。1306
−８株はグルコン酸を生産した。凍結ストックからの13
06−８株のサンプル（2.５ml）を 100mlのＲ20−２培地
に接種し、そして 500mlの広口エルレンマイヤーフラス
コ中で静置条件下30℃にて培養した。種母培地をこれら
の条件下で約２〜４日間、見ることができる薄膜が形成
されるまでインキュベートした。次に、種母培養の全内
容物をブレンドし、そして次の培養物に接種するために
使用した。 【０１０７】ジメチルホルムアミド(DMF) 中ベンレート
(Benlate) 殺カビ剤（デュポン）の10ｇ／100 ml懸濁液
0.025mlを含むＲ20−２培地１ｌを収容する広口フェル
ンバッハフラスコを用いて発酵を行った。ＤＭＦ及びベ
ンレートのこの濃度はアセトバクター1306−８株の増殖
に有意な影響を与えることなくカビの汚染を防止するた
めに効果的であった。 【０１０８】約８〜10mlを用いて１ｌのＲ20−２培地に
接種した。培養物をフェルンバッハフラスコ中で10〜14
日間30℃にて、攪拌しないで（すなわち静置して）増殖
せしめた。収得の時点で、0.３〜1.２cmの厚さの薄膜が
形成されていた。 【０１０９】薄膜をフェルンバッハフラスコから取り出
し、次にブレンドし、脱イオン水で洗浄して培地及び細
胞の一部分を除去した。フィルターとして 286μｍの網
目開口を有するフィルタースクリーン（スペクトラメッ
シュ＃146382）を用いて大型ブフナー漏斗を通して洗浄
を行った。 【０１１０】ブレンドされそして洗浄された薄膜の抽出
を0.50Ｍ NaOH を用いて約60℃にて約14時間行った。所
望の時間混合及びインキュベーションを行った後、抽出
混合物を上記の条件下で濾過した。脱イオン水による洗
浄は、洗浄水のpHが6.０以下に低下するまで続けた。こ
の調製物を用いて走査電子顕微鏡実験に使用した。 【０１１１】例８．前記例６及び例７から得られたセル
ロース生成物を走査電子顕微鏡観察のために用意した。
検体を凍結乾燥し、そして次に６：40金：パラジウム導
電フィルムにより真空下で表面被覆(sputter) した。16
KVの加速電圧で運転されるナトメーター走査型電子顕微
鏡を用いて光学写真を撮った。 【０１１２】図２及び図４は、得られたセルロース生成
物の代表面な電子顕微鏡写真である。図２及び図４は、
例７に従って静置培養において製造されたセルロース製
造物を示す。これらの図が示すところによれば、生成物
は、相互にオーバーラップしそして交差するように見え
るが相互連結されているようには見えない延長されたセ
ルロースフィブリルの積み重ねから主として成る。静置
培養条件下で生産されたセルロースのフィラメントは約
0.05〜0.２ミクロンの幅にわたり、多くのストランドは
0.05〜0.１ミクロンの範囲にある。 【０１１３】これに対して、図３及び図５は、例６にお
いて攪拌培養で製造されたセルロース生成物が、静置培
養において成長したセルロースに比べて、断面が一般に
太い…0.１〜0.２ミクロンの範囲…フィブリルの網状体
から成ることを示している。さらに、このセルロースフ
ィブリルは、フィブリルがオーバラップするのではなく
むしろ主として相互連結されたネットワークを形成して
いるようである。 【０１１４】例９．この例は、この発明の網状セルロー
ス生成物の幾つかの特徴を示す。ハンドシートを、アセ
トバクターにより生産されたセルロースのサンプルか
ら、TAPPI 公認試験法T205om−81に記載されている方法
に従って約60ｇ／ｍ2 の基本重量に調製した。セルロー
スは、２％のグルコースを含有するＲ20−培地を用いて
フラスコ培養において静置増殖条件下で1306−３株から
製造された。 【０１１５】網状セルロース生成物は、同じ培地を使用
して、600rpmでのインペラーによる攪拌のもとで発酵槽
にて、1306−11株を用いて製造された。セルロースを含
有する培養液を冷貯蔵した後、セルロースを処理した。
セルロースを 150,000回転のブリティッシュ・ディスイ
ンテグレーター中で分散せしめた（２ｌの水中1.２
ｇ）。次に、この懸濁液を、 200メッシュのワイヤース
クリーンを含む自動シート型に注入し、そして２時間以
上排水した。 【０１１６】湿ったハンドシート（直径15cm）をシート
型から取り出し、そして最後に吸取紙の間で過剰の水を
おだやかに除去した。次に、シートを吸取紙に挟んでTA
PPIプレスに入れ、種々の時間にわたり50psi(345kPa)
の荷重のもとにおき、種々の密度のシートを製造した。
シートを、ノーブル・アンド・ウードの実験室用ドラム
ドライヤーを通すことによりシートの最終乾燥を行っ
た。シートの引張強さを、インストロン・ユニバーサル
試験装置を用いてTAPPI 法T494om−81に従って測定し
た。 【０１１７】この例の網状セルロース生成物は、これが
ハンドシートに形成された場合、圧縮(densification)
に対する実質的な耐性を付与することが見出された。異
る湿圧縮荷重を用いることにより、約 300〜約500kg ／
ｍ3 の密度を有する一連のシートを調製した。低い密度
にもかかわらず、これらの紙様シートは非常に高い引張
り強さを有していた。典型的には、上記の密度を有する
それらのシートの引張指数 100〜150 ニュートン−メー
ター／ｇの範囲である。約 500kg／ｍ3 より低い密度を
有する、クラフトパルプから形成された匹敵するシート
は引張強さを実質的に有していない。 【０１１８】静置培養条件下で製造されたセルロースか
ら形成されたハンドシートは圧縮(densification) に対
する上記の耐性を示さない。典型的には、非攪拌培養の
セルロースからのシートは、使用された湿圧縮荷重に依
存して約 500〜約750 kg／ｍ3 の密度を有する。 【０１１９】例10．この例は、アセトバクターの２つの
株を用いて、攪拌培養条件のもとで製造された網状セル
ロース生成物と静置条件のもとで製造された非網状セル
ロース生成物の圧縮(densification) に対する耐性を比
較する。網状セルロースは、例６に記載したような攪拌
増殖条件下で1306−14株を用いて得られた。非網状セル
ロースは、例７に記載したのと実質的に同じ静置条件下
で、２％のグルコースを含有するＲ20−２培地を用いて
静置フラスコ培養において1306−３株を用いて得られ
た。 【０１２０】ハンドシートを網状セルロース及び静置培
養で製造したセルロースから、例９に記載したようにし
て約60ｇ／ｍ2 の基本重量に調製した。但し、シートを
製造するために種々の圧縮荷重を使用した。網状セルロ
ース及び非網状セルロースからこの例において製造され
たシートの密度及びその他の特徴を次の表５に示す。 【０１２１】 【表５】 【０１２２】例11．６菌株を試験した。1306−３株及び
1306−11株は前記の通りである。アセトバクター・アセ
チ・サブスペシス・キシリヌム（Acetobacter aceti su
b sp. xylinum) ATCC No.23769の２つのサブカルチュア
ーをこの明細書において23769A及び23769Bと称する。さ
らに、ATCC 31174株、及びナショナルコレクション・オ
ブ・インドストリアル・バクテリア8132株(Aberdeen 、
英国）、並びに1499−１株も試験した。 【０１２３】前種母培養、種母培養及び製造段階のため
の培地は４ｗ／ｖ％のフラクトース及び５ｗ／ｖ％のＣ
ＳＬを含有するＣＳＬ培地であった。前種母は、 750ml
のファルコン＃3028組織培養フラスコ中 100mlの上記培
地中で、0.01％のダウコーニング消泡剤を用い、静置条
件下で、30℃にて24〜48時間増殖せしめた。前種母培養
物の全内容物を前記のようにしてブレンドし、そして種
母培養の５ｖ／ｖ％の接種物を調製するために使用し
た。前種母をＲ20−２プレート上にストリークして汚染
をチェックした。すべての菌株は均一なコロニー形態を
有していたが、1499株は約50％の大形コロニーを有して
いた。 【０１２４】種母培養は、バッフルを有する 125mlのフ
ラスコ中上記の培地25ml中で、往復振とう機中125rpmの
振とう条件下で30℃にて３日間増殖せしめた。ブレンド
された種母のそれぞれからのサンプルをＲ20−２プレー
ト上にストリークして汚染についてチェックした。約50
％の大形コロニーを有する1499−１株を除くすべての菌
株が均一なコロニー形態を有していた。種母培養物の残
りのすべての内容物を前記のようにしてブレンドし、そ
して製造段階のための５％接種物を調製するために使用
した。 【０１２５】各株につき２連の発酵培養物をバッフルを
有する 125mlのフラスコ中125rpmの往復振とう機上で30
℃にて培養した。各菌株の２連のフラスコを１日、２
日、３日、及び４日目に収得した。但しATCC 23769B に
ついては、増殖が不十分であったため７日目に収得し
た。1499−１株及びATCC 31174株の両者はこれらの条件
下で水溶性ポリサッカライド(WSP) を生産した。1306−
３株又は1306−11株によってはＷＳＰは生産されなかっ
た。各菌株についてセルロース生産を測定した。その結
果を表６に示す。セルロース生産の値はｇ／ｌで示す。 【０１２６】 【表６】 【０１２７】例12．発酵槽におけるセルロース製造 1306−11株の前種母及び種母培養物は、例10に記載した
ようにして２日間増殖せしめた。但し、４ｗ／ｖ％のグ
ルコース及び５ｗ／ｖ％のＣＳＬを含有する培地を使用
した。種母培養物は同じ培地中で２日間増殖せしめた。
但し、培養容積はバッフル付２ｌフラスコ中 400mlであ
った。 【０１２８】14ｌのケマップ(Chemap)発酵槽中で２回の
発酵槽試行を５ｖ／ｖ％の接種物及び12ｌの初発容量で
行った。72時間の発酵槽試行の間、培養物を30℃（±１
℃）に維持した。発酵槽＃１においては、最初のグルコ
ース濃度は32ｇ／ｌであった。発酵槽＃２においては、
グルコース及びシュークロース濃度はそれぞれ10ｇ／ｌ
及び20ｇ／ｌであった。発酵中に発酵槽＃１に、さらに
143ｇ／ｌのグルコースを間欠的に添加した。 【０１２９】発酵槽＃２には、50ｇ／ｌのグルコース及
び72ｇ／ｌのシュークロースを発酵中に間欠的に発酵槽
に加えた。最初の２ｖ／ｖ％のＳＣＬ濃度に、最初容量
に対して２容量％に相当する量のＣＳＬを32時間目及び
59時間目に追加した。 【０１３０】溶存酸素濃度は30％空気飽和に維持した。
発酵槽＃２中では、溶存酸素濃度は69時間目から約２時
間にわたり０に低下した。攪拌を最初600rpmに維持し
た。セルロース濃度の上昇と共に粘度が上昇したので、
インペラー速度を 1200rpmに増加した。発酵槽１につい
て、セルロース、グルコン酸及び２−ケト−グルコン酸
の濃度を第７表に示す。 【０１３１】発酵槽２について、セルロースの濃度を表
８に示す。グルコースのみの発酵槽＃１において達成さ
れる最大セルロース濃度は12.7ｇ／ｌであった。グルコ
ース／シュークロース発酵槽＃２において達成される最
大セルロース濃度は18.3ｇ／ｌであった。両最高値は発
酵開始後71.6時間目に達成された。この時点での容積生
産性は、発酵槽＃１及び＃２においてそれぞれ0.18及び
0.26ｇ／ｌ／時であった。 【０１３２】 【表７】【０１３３】 【表８】 【０１３４】例13．1306−11株の代りに1306−21株を用
いて例12の発酵を反復した。但し次の変更を行った。 １．前種母及び種母は、２％のグルコース及び２％のＣ
ＳＬを含有するＣＳＬ培地中で調製した。 ２．攪拌速度は900rpmを超えなかった。 ３．最初のグルコース濃度は20ｇ／ｌであり、そして発
酵中に 109ｇ／ｌをさらに添加した。 ４．最初のＣＳＬ濃度は２ｖ／ｖ％であり、発酵中27.8
時間後に２ｖ／ｖ％をさらに添加した。この試行におい
て観察されたセルロース、グルコン酸、２−ケト−グル
コン酸及び５−ケト−グルコン酸の濃度を表９に示す。 【０１３５】 【表９】【０１３６】表９の結果を表７のそれと比較して、1306
−21はセルロース生産については1306−11株と同等又は
それより良好であるが、酸の生産は非常に少ないようで
ある。低い酸生産性は、理論的には、1306−21株がより
少ない塩基の添加により匹敵する濃度に培養することを
可能にする。 【０１３７】例14. セルロースの性質に対する攪拌の効
果 下記の４種の性質に対する攪拌の効果を評価するために
一組の試験を行った。 １．ハンドシートの形成（例９のTAPPI 試験）：発酵か
らの精製され、処理されそして再懸濁されたセルロース
ファイバーの、 150メッシュスクリーン上に一体シート
を形成する能力。結果は、再懸濁されたファイバーに対
するスクリーン上に保持されたファイバーの％、及び形
成されたシートの粘着性(integrity) の定性的評価に従
って判定される。 【０１３８】２．沈降速度：発酵槽からの稀釈されたサ
ンプルが傾斜したシリンダー中で沈降する速度。セルロ
ースの沈降する懸濁液の沈降物／上清液界面の高さの下
降を時間に対してプロットする。所与の時点でのプロッ
トの傾斜から瞬間沈降速度を決定することができる。こ
の性質はセルロース粒子のサイズ及び密度に依存する。 【０１３９】３．懸濁粘度：グリセリン溶液により換算
された、トーマス−ストーマー(Thomas-Stormer)粘度計
により測定される懸濁されたセルロース発酵槽ブロスの
粘度。この性質はセルロース粒子の形態に依存する。 ４．粒子のサイズ及び形態：この性質は、発酵槽からの
セルロースの光学顕微鏡写真から決定される。 【０１４０】第１のセットの試験は1306−11株を用いる
４回の発酵槽試行から成り、この間に、異る最高攪拌速
度で運転される14ｌのケマップ発酵槽から時間の関数と
してサンプルを採取した。これらの４回の発酵槽試行は
増殖する培養物を用いる典型的な発酵であるが、長時間
の攪拌の効果を評価するため通常の発酵時間を超えて延
長した。これらの試行からのサンプルをハンドシート形
成能力について分析した。 【０１４１】第２のセットの試験は、 250ｌの発酵槽試
行から得られた古い非増殖セルロース培養物を、４個の
14ｌケマップ発酵槽中で攪拌することから成った。攪拌
速度は各発酵槽において一定であったが、発酵槽ごとに
異った。各発酵槽から経時的にサンプルを採取した。こ
のセットの実験におけるセルロース濃度はすべての発酵
槽について均一であったが、第１のセットの実験におけ
る最終濃度の約半分であった。 【０１４２】この第２のセットの実験においては、第１
のセットの実験の平均通気速度（空気及び酸素）とおよ
そ同じ速度で窒素を吹き込んだ。第２のセットの実験か
らのサンプルをハンドシート形成、沈降速度、粘度、並
びに粒子のサイズ及び形態について分析した。第１のセ
ットの実験及び第２のセットの実験からのハンドシート
の結果をそれぞれ表10及び表11に要約する。 【０１４３】 【表１０】【０１４４】 【表１１】 【０１４５】表10は、増加した攪拌速度及び延長された
攪拌時間がハンドシート形成に不都合な影響を与えるこ
とを示している。一層稀薄なそして増殖しないセルロー
ス培養物が使用された表11の結果は、ハンドシート形成
が表10に示されるほど攪拌及び時間に対して感受性でな
いことを示した。表11における一層良好な結果は、発酵
槽中の低いセルロース濃度又は高い目標シート重量に基
くであろう。 【０１４６】しかしながら、他の試験結果は、セルロー
スの性質が攪拌速度、及び第２のセットの実験の間の時
間により影響を受けることを示している。例えば、粘度
の分析は、800rpm及び 1000rpmにおける攪拌時間と共に
発酵槽中でのセルロース懸濁液の粘度が上昇することを
示す。粘度の上昇は、密度の高いペレットから密度の低
いパックされたファイバー様形状へのセルロースの形態
の変化を反映しているであろう。このような変化は、粒
子のサイズ及び形態を評価するために使用された光学顕
微鏡写真において観察された。 【０１４７】沈降速度の研究は、高速で又は長時間にわ
たって攪拌されたセルロースがよりゆっくりと沈降する
ことを示した。これらの結果は、攪拌速度及び時間の増
加と共にセルロース粒子が低密度にパックされた小さい
ファイバーになることを示す光学顕微鏡写真と一致し
た。沈降速度、粘度、粒子のサイズ及び形状、並びにハ
ンドシート形成の分析からの一般的結果は、すべて相互
に一致し、そしてある程度相関した。 【０１４８】攪拌の速度及び時間によるセルロースの性
質の変化の機構は現時点では完全には理解されていな
い。攪拌速度の増加がセルロース粒子に対する剪断応力
を増加せしめることが知られている。しかしながら、他
の力、例えば乱流渦応力(trubulent eddy stress) 及び
キャビテーション力、もまたセルロースの性質の変化に
寄与するであろう。さらに、上記の力及び応力並びに他
の因子も、セルロースの回収及び精製の間に働くであろ
う。従って、セルロース処理のすべての段階においてセ
ルロースに対する損傷を最小にするように注意を払わな
ければならない。 【０１４９】例15．セルロース生成物のＣ−13NMR 分析 攪拌条件下で生産された細菌性セルロース生成物の微細
構造（表12に示す）を試験しそして非攪拌条件下又は静
置培養条件下で生産された細菌性セルロースのそれと比
較した。ＮＭＲスペクトル分析はVanderhartら、Macrom
olecules 17 :1465−1472(1984)により記載されている
方法と実質的に同じ方法により行った。 【０１５０】すなわち、ＮＭＲスペクトル分析をＳ−10
0 NMR スペクトル計（General Electric Fremont(CA)
を用いて2.34Ｔにて行った。これは陽子について100.2M
Hz、そしてＣ−13について25.3MHz の周波数に対応す
る。クロス−ポラリゼーション時間は典型的には1.０〜
2.０msであった。 【０１５１】対応するラジオ周波数振幅は48kHz の回転
・フレームの正確な周波数においてHartmann Huhn マッ
チについてセットされ、そしてサンプルスピン周波数に
よりミスマッチでなかった。化学シフト参照に、ヘマチ
ルベンゼンのメチル炭素、共鳴が17.80ppmにおいて現わ
れるように両日運転周波数をセットすることにより達成
された。ローター材料は窒化硼素又は相安定化ジルコニ
アであった。 【０１５２】試薬されたサンプルについてのＮＭＲの結
果を表12及び表13に示す。これらは４種類の非攪拌アセ
トバクター培養物から、及び11種類のアセトバクター培
養物からのセルロース生成物から成る。表12及び表13中
のサンプル番号に対応する使用株及び培養条件を表14に
示す。 【０１５３】表12及び13は、静置培養又は攪拌培養され
た菌株からのサンプルのＮＭＲ分析により得られた形態
分布を示す。これらの結果が示すところによれば発酵槽
サンプル（攪拌）から製造されたセルロースと静置培養
からのそれとの比較において重要な差異が存在する。攪
拌されたサンプルの低い結晶化度（セルロースＩ）はＩ
α及びＩβスペクトルピーク並びに非晶質セルロースに
よるピークの量の実質的な変化により支持される。 【０１５４】特に注目すべきことは、すべての発酵槽サ
ンプルにセルロースIIが一貫して存在し、静置培養サン
プルには存在しないことである。さらに、長い発酵時間
及び高い剪断ストレスにかけられた２個の攪拌サンプル
（アセトバクター1306−11株に対応するサンプルＡ−07
0 及びＡ−071)において、セルロースの有動意な部分が
セルロースIIであり、セルロースIIの含量と培養中の攪
拌の量との間の関連性が示唆された。 【０１５５】さらに、攪拌培養と静置培養との比較にお
いて、Ｉα含量の一貫した差が存在した。さらに、攪拌
培養からのセルロースにおいて90ppm に高レベルの残留
シグナルが存在した。表12及び表13に示すように、この
方法は非品質セルロース含量の２つの測定値の間の非常
によい一致を与えた。 【０１５６】ＮＭＲ分析を用いてここで観察される相違
は個々のセルロース分子が一緒にパックされている状態
及び異る分子鎖間のコンホーメーションの相違を反映し
ているであろう。 【０１５７】 【表１２】 【０１５８】 【表１３】【０１５９】 【表１４】 【０１６０】 【結論及び寄託】細菌性セルロースが攪拌条件下で高い
効率で長時間にわたって生産される。従来、細菌性セル
ロースの長期生産は、困難と非常に低い生産性を伴って
いた。ここに開示される発明は、細菌性セルロースの発
酵生産における大きな利点を提供する。1306−３株、13
06−11株、及び1306−21株のサンプルは、特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約、及
びそれに基く規則の規定のもとにアメリカン・タイプ・
カルチュア・コレクション・12301 パークラウン・ドラ
イブ、ロックビル、メリーランド、米国20832 に寄託さ
れた。寄託日及び番号は次の通りである。 【０１６１】 【表１５】 【０１６２】これらの寄託は、ATCCとこの出願の出願人
であるシタス・コーポレーションとの間の契約により行
われた。ATCCとの契約は該菌株及びその子孫の永久的な
入手可能性を、該寄託を記載しそして特定している出願
に関する米国特許が発行された後又は米国もしくは外国
出願の公告もしくは公衆への公開の後、このいずれが早
く到来するにしても公衆に与え、そして、これらの菌株
又はその子孫の入手可能性を、35USC § 122及びこれに
基く長官規則(886 OG 638 への特別の言及を伴う37 CFR
§1.14を含む）に従って、米国特許・商標局長官により
権利を有すると決定された者に与える。この出願の出願
人は、寄託中の菌株が、適切な条件下で培養された場合
に失われ、死滅し又は破壊された場合には、通知の後速
やかに同じ株の生存培養物により置き換えることを承諾
した。 【０１６３】ブタペスト条件に基く寄託は、寄託された
その培養物が生存及び非汚染条件下で、寄託された微生
物のサンプルの分譲の最も新しい要求がATCCにより受理
された後少なくとも５年間、そしていかなる場合にも寄
託の日から少なくとも30年間、維持されるであろう。 【０１６４】寄託された微生物の入手可能性は、いずれ
かの政府の権威の下にその特許法により認められた権利
を侵害してこの発明を実施することの許諾であると解し
てはならない。 【０１６５】さらに、この発明の範囲は寄託された菌株
の範囲に限定されない。なぜなら、寄託された具体例は
単に、この発明の特定の観点の例示であると意図される
からである。寄託された株と機能的に同等なすべての微
生物株がこの発明の範囲に属する。さらに、この明細書
に示されそして記載された態様の他、これらの記載から
当業者にとって明らかな変法はこの発明の範囲に属す
る。この明細書に記載された情報に基いて、この発明の
範囲を逸脱することなく、種々の変法を行うことができ
よう。
にセルロースを生産することができるアセトバクター
（Acetobacter ) の菌株に関する。さらに詳しくは、こ
の発明のアセトバクターの株は、培養中のセルロース生
産の喪失をまねく不安定性を示すことなく攪拌培養にお
いて多量のセルロースを生産する能力を有することを特
徴とする。この発明のアセトバクターの株はさらに、グ
ルコン酸を生産する実質的に低下した能力によりさらに
特徴付けられる。人工培地中でこのようなグルコン酸ネ
ガティブ(glcＡ- ) 株を用いるセルロース生産は、これ
らの株が培地を実質的に酸性化しないために促進され
る。このようなグルコン酸ネガティブのアセトバクター
株は高細胞濃度培養において有用である。 【０００２】この発明はさらに、新規な性質を有する細
菌性セルロース生成物に関する。特に、この発明は網状
セルロース(reticulated cellulose) 生成物に関する。
この網状の細菌性セルロース生成物は、静置培養条件低
下でセルロース生産性微生物により生産される細菌性セ
ルロース生成物の微視的構造と異る微視的構造により特
徴付けられる。 【０００３】この発明はさらに、攪拌培養条件下で、一
般には４時間を超える持続される時間にわたってセルロ
ース生産微生物を培養することにより網状セルロース生
成物を製造する方法に関する。攪拌培養条件下での細菌
性セルロースの持続する効率的生産は予想外のことであ
った。 【０００４】 【従来の技術】アセトバクターによるセルロースの生産
は少なくとも1930年代以来熱のこもった研究対象であっ
た。1947年に、グルコース及び酸素の存在下でアセトバ
クターの非増殖細胞がセルロースを合成することが示さ
れた。 Hestrin, S.、Aschner,M. 及び Mager, J.、Nat
ure 159：64(1947)。Hestrin 等の観察以来、アセトバ
クターは種々の条件下でセルロースの生産を伴って培養
されてきた。 【０００５】例えば、約90〜 100サイクル／分の往復振
とうにより培養された場合、細胞は大きなゲル塊中に混
入される。培地が渦動を伴って攪拌される条件下で増殖
した場合、セルロースと細胞から成る星状のゲル体が形
成される。静置培養として増殖した場合、空気／培地界
面に薄膜(pellicle)が形成される。この薄膜は、培養物
を収容する容器の液面と同じ表面形状及び面積を一般に
有するパッドとして形成される。Hestrin 及びSchramm,
Biochem.Journal 58 : 345 −352 (1954)。 【０００６】Hestrin 及びSchramm は、10％未満の生存
細胞を含有するアセトバクターの凍結乾燥調製物による
迅速なセルロース生産を観察した。しかしながらこれら
の実験は、３〜４時間という比較的短時間にわたる前記
のような凍結乾燥調製物による振とう条件下でのセルロ
ース生産のみを測定しており、そしてグルコースの存在
下でアセトバクターにより生産されるグルコン酸により
惹起される実質的なpH変化を制御するためにクエン酸塩
緩衝条件下で行われた。 【０００７】アセトバクターによるポリサッカライドの
合成は、非増殖培養物を用いて幾つかのグループにより
行われた。これらの研究の幾かにおいては、Hestrin 及
びSchramm (1954)により記載されているように、アセト
バクターNRRLB 42株が培養され、セルロース薄膜が除去
され、0.01Ｍ Tris −EDTA中に再懸濁され、凍結され、
そして次に解凍された。これらの処理された細胞は、細
胞の増殖を維持しないがしかし調製された細胞によるセ
ルロースの合成を可能にする酵素活性を保存する条件下
での生化学的研究のために使用された。 【０００８】しかしながら、セルロース生産のためにア
セトバクターを培養するための条件の決定の進歩は、広
範な報告の対象ではなかった。そして、1982年12月16日
に出願された米国特許出願No.450,324の優先権を主張す
る英国特許出願No.2,131,701A 中に記載されている、ア
セトバクターの培養のために使用される条件は、Hestri
n 及びSchramm (1951)において記載された条件すなわ
ち、約６の始発pH、15℃〜30℃、そして好ましくは20℃
〜28℃の範囲の温度である。 【０００９】Bergesy Manual of Systematic Bacteriol
ogy Kreig 及びHolt編、第１版、William & Wilkins 、
バルチモア及びロンドン（1984）中Deley 等、“Acetob
acteracea", 267 −272 頁、によれば、増殖のための最
も良好な炭素源は、記載の順序に、エタノール、グリセ
リン及び乳酸である。ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノー
ル及びＤ−グルコースからは酸が生成される。 【００１０】英国特許出願No.2,131,701A に記載されて
いる炭素源は、スラクトース、マンニトール、ソルビト
ール及びグルコース（これらのすべては急速なセルロー
ス生産をもたらす）、並びにグリセリン、ガラクトー
ス、ラクトース、マルトース及びシュークロース（これ
らのすべては一層緩慢な増殖をもたらす）を包含する。
ソルボース、マンノース、セロビオース、エリスリトー
ル、エタノール及び酢酸を用いる場合、増殖は観察され
なかった。 【００１１】英国特許出願No.2,131,701A においては、
培地を除去するために処理した後に創傷手当用品として
使用するための密着ゲル状材料を製造することが所望さ
れる。このマット状形態を得るため、数時間〜数日間又
は数週間にわたる細胞増殖、及びセルロース生産の間、
培養物は不動状態に保持される。 【００１２】不動又は静置培養条件下での密着マット又
は薄膜の形成は英国特許出願No.1,131,701A 中に記載さ
れている培養様式であるが、この特許はさらに、セルロ
ース合成アセトバクターを含有する培地の間欠的攪拌は
微生物により生産されるセルロースフィブリルの長さを
調節することができることを説明している。間欠的攪拌
は、微生物によるフィブリルの綿状延長速度及び細胞表
面からフィブリルを攪拌剪断する時間間隔により決定さ
れる有限の長さのフィブリルをもたらす。しかしなが
ら、セルロース生産に対する連続的攪拌の効果について
は検討されていない。 【００１３】連続攪拌培養におけるアセトバクターから
のセルロースの生産は多くの問題点を伴い、従来その最
も困難なものは培養の不安定性であった。この不安定性
はセルロース生産能力が喪失すること及び非生産型細胞
によりセルロース生産細胞が次第に駆逐されることによ
り現われる。菌株の不安定性は、セルロース非生産性微
生物の変異株又は変種の自然的出現の結果であろう。 【００１４】非生産株のこの出現は、攪拌培養物中での
増殖中に培養物の集団バランスをセルロース生産型から
セルロース非生産型に移行せしめるのに十分な頻度をも
って起こるようである。振とう培養におけるセルロース
生産性の喪失もまた、遺伝的変化に基くセルロース非生
産性型への変異ではなく常に生理的因子の結果であろ
う。Leisinger 等、Ueber cellulosefrie Mutanten Von
Acetobacter xylinum,Arch. Mikrobiol, 54 : 21−36
(1966)。原因は不明であるが、攪拌培地中での細菌性セ
ルロースの断続的生産は今まで報告されていない。 【００１５】アセトバクターのセルロース・ネガティブ
(Cel- ) 株は、メタンスルホン酸エチル (EMS)、亜硝酸
及びＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）を
用いる化学的変異誘発により作られた。静置培養におい
て増殖した場合、ＥＭＳ−変異株及び亜硝酸−変異株の
すべて、並びにＮＧ−変異株の90％がセルロース生産タ
イプに復帰した。Valla 等、Cellulose −Negative Mut
ants of Acetobacterxyllinum, J.Gen, Microbiol. , 1
28(7)：1401−1408(1982)。 【００１６】静置培養におけるセルロース生産性株と非
生産性株との混合培養物の増殖は、セルロース生産性株
に非常に有利であり、他方、振とうフラスコ中でのこの
ような混合培養物の増殖は非生産性株に有利である。Va
lla 等（1982）。この結果によれば、この微生物により
生産されたセルロースマット又は薄膜は、アセトバクタ
ー細胞が酵素の供給の豊富な液体静置培地の表面に達す
ることを可能にするという仮説が支持される。酸素の溶
解速度及び低い酸素溶解度が増殖を制限する振とう条件
下では、セルロース生産性細胞の選択的集合及びそれに
よりもたらされる酸素に関する物質移動の制限のため、
セルロース・ネガティブ株が有利である。 【００１７】従って、攪拌された培地中での安定なセル
ロース生産菌であるアセトバクターの株を同定しそして
単離することは、培地への十分な酸素供給のために攪拌
を必要とする程十分に濃厚な培養物中でアセトバクター
からセルロースを大規模生産するために非常に重要であ
ることは容易に明らかであろう。 【００１８】アセトバクターは特徴的にグラム陰性の、
0.６〜0.８μｍ×1.０〜４μｍの棒（桿）状細菌であ
る。この菌は厳格に好気性であり、代謝は呼吸的であ
り、決して発酵的ではない。これはさらに、セルロース
と化学的に同一である多数のポリβ−１，４−グルカン
鎖を生成する能力により区別される。多数セルロース鎖
又はミクロフィブリルは、細胞膜に対して外側の部位の
細菌表面において合成される。これらのミクロフィブリ
ルは約1.６nm×5.８nmの断面寸法を有する。静置又は放
置培養条件において、ミクロフィブリルは細菌表面で一
緒になって約3.２nm×133nm の断面寸法を有するフィブ
リルを形成する。 【００１９】これらの微生物によって生産されたセルロ
ースフィブリルは、木材パルプから製造されたセルロー
スと多くの点で類似しているが、幾つかの点で異なる。
特に、差異はこれらのフィブリルの断片幅である。アセ
トバクターにより生産されたセルロースフィブリルは、
パルプカバ又は松材から典型的に製造されるセルロース
ファイバーより、通常２オーダー狭い。これらのアセト
バクター生産フィブリルの小さい断面サイズは、それに
伴う常用の木材セルロースより大きい表面積及びセルロ
ースの本来的な親水性と相まって、水性溶液を吸収する
異常に大きな能力を有するセルロース生成物を導く。 【００２０】高い吸収性のこの能力は、熱傷の治療にお
いて使用される包帯の製造において、又は、長時間の外
科処置の間に暴露された器官の表面の乾燥を防止するた
めの外科用包帯として有用であることが証明されてい
る。このような用途、及びアセトバクターにより生産さ
れたそのままの薄膜の処理により作られる種々の医薬含
浸パッドが英国特許出願No.2,131,701A に記載されてい
る。この英国特許出願の薄膜は、不動状態に維持される
培地トレイ中で、増殖するアセトバクターにより生産さ
れる。 【００２１】アセトバクターは偏性好気性菌であるた
め、すなわちこのものは酸素の非存在下では増殖するこ
とができないため、アセトバクターによるセルロースの
生産は空気−液体培地表面において起こる。各細菌は空
気−液体界面において１本のフィブリルを連続的に生産
する。新しいセルロースが表面で形成されるに従って既
在のセルロースは増殖培地中に押し出される。その結
果、静置培養条件下で生産されたセルロース薄膜はセル
ロースファイバーの層から成る。 【００２２】このようにして生産されたセルロースの体
積は、空気と培地との界面によりかなり制限される。攪
拌条件下、上昇した溶存酸素濃度において培養された場
合、既知のアセトバクター株がセルロース非生産株に変
る傾向は、経済的に製造し得るセルロースの量を厳しく
制限する。従って、長期にわたる攪拌発酵における単位
容器容量当りの高いセルロース生産性は今まで報告され
ていない。 【００２３】攪拌又は静置による回分培養におけるアセ
トバクターによるセルロースの製造に伴う他の問題は、
グルコースをグルコン酸及びケトグルコン酸に転換する
アセトバクターの能力である。生物によるこのような酸
生産に伴うpHの低下もまた、特に回分培養において、生
産されるセルロースの量を制限する。さらに、グルコン
酸の生産は、セルロース生産の犠牲において培地からグ
ルコースを除去する。 【００２４】 【発明の概要】本発明者は新規な性質を有する細菌性セ
ルロース生成物を創製した。特に、本発明者は網状セル
ロース生成物を開発した。この網状細菌性セルロース生
成物は、静置培養条件下でセルロース生産性微生物によ
り生産された細菌性セルロースの微視的構造とは異る微
視的構造を有することを特徴とする。 【００２５】既知の静置培養条件下で生産された細菌性
セルロースは、重なりそしてからみ合った別々のセルロ
ースストランド又はフィブリルから成る組織化されてい
ない（disorganized) 層構造により特徴付けられる。こ
の組織化されていない層構造は、微生物アセトバクター
により代表されるセルロース生産性微生物の増殖パター
ンを反映する。 【００２６】静置培養において、アセトバクターは典型
的には液体培地の表面と酸素を含有する空気との界面で
増殖する。細菌が増殖するに従って、セルロースファイ
バーは連続的に形成され、そして蓄積し、培地中に深く
沈む。こうして形成されたセルロース薄膜は空気−培地
界面でアセトバクターの細胞の増殖する集団を支持する
連続層状セルロースファイバーの塊から成る。 【００２７】この発明の攪拌培養条件に従って生産され
るセルロースの巨視的及び微視的構造は、既知の静置培
養条件に従って生産されたそれとは異る。巨視的には、
この発明のセルロースは、空気−培地界面における連続
薄膜としてではなくペレットとして培養物中に形成され
る。微視的には、この発明のセルロース生成物は三次元
網状構造によって特徴付けられる。 【００２８】この構造は、相互に連結して三次元的に延
びる格子状パターンを形成するセルロースの頻繁に太く
なるストランドにより特徴付けられる。静置培養におい
て生産される細菌性セルロースは、平行であるがしかし
組織化されていない平面中、主としてストランドの長軸
にそって方向付けられたセルロースのオーバーラップす
る近接するストランドにより特徴付けられる。 【００２９】これに対して、この発明のセルロース生成
物の網状構造は、オーバーラップしているのではなく相
互に連結されているセルロースのストランドにより特徴
付けられる。これらの相互連結されたストランドはおよ
そ直角な方向付け及びおよそ平行な方向付けの両方を有
する。 【００３０】その結果、この発明の網状セルロース生成
物は走査電子顕微鏡写真においてさらに一般的に窓のあ
る形状を有し、他方、静置培養において生産されたセル
ロースは走査電子顕微鏡写真において、相互の上に十字
状に重ねられているがしかしある１つの層中では実質的
に平行しているストランドの形状を有する。 【００３１】この発明のセルロース生成物のストランド
は、攪拌を伴わない対応する培地中で生産されたそれよ
りも一般に太い。網状セルロースは、約0.１〜約0.２ミ
クロンの幅で配置された相互連結されたフィラメントか
ら成っていた。非攪拌条件下で生産されたセルロースの
フィラメント又はストランドは約0.05〜0.２ミクロンの
幅で配置されており、多くのストランドが0.05〜約0.10
ミクロンの幅で配置されていた。 【００３２】さらに、非網状セルロース生成物のフィブ
リルは、網状生成物のフィブリルに比べて、一層低頻度
で分岐しそして相互連結されているようである。非網状
セルロース生成物は相互に接触する多くのフィブリルを
有するようであるが、フィブリルは相互連結されている
のではなくむしろ相互に重層されている。これに対し
て、この発明の網状セルロースのフィブリルは相互に連
結して相互連結ファイバーの実質的に連続的なネットワ
ークを形成するファイバーの大きな比率を有する。 【００３３】この発明の網状セルロース生成物は、非攪
拌条件下で生産されたセルロースに対して幾つかの利点
を有する。網状セルロース生成物はアセトバクターのご
ときセルロース生産性微生物の攪拌培養において特徴的
に生産されるため、これは常用の大容量発酵法により製
造され得る。従って、従来技術の増殖の緩慢な不動培地
でのセルロース薄膜の製造と異り、この発明の網状セル
ロース生成物は、アセトバクターの急速増殖培養物中
で、高い容積生産性及び網状セルロース生成物の高濃度
を伴って製造され得る。 【００３４】この発明の網状セルロース生成物を非攪拌
条件下で生産された細菌性セルロース生成物から区別す
ることができる１つの方法は、紙様シートへの一体化に
対するその特徴である。網状セルロース生成物のバッチ
は、常用手段、例えば、ブリティッシュ・ディスペンサ
ーによる水中への分散、及びこれに続くシート型での形
成及び種々の倍数での圧縮によるハンドシート（hand s
heet) に成形される場合圧縮（densification)に対して
広範囲の耐性を与える。 【００３５】網状セルロース生成物の幾つかのバッチ
は、上記のような手段によりハンドシートに成形される
場合、圧縮（densification)に対する実質的な耐性を提
供することが見出された。異る湿圧縮負荷を用いること
により、約 300〜約 900kg／m3の範囲の密度を有する一
連のシートが製造され、圧縮（densification)に対して
実質的な耐性を示すものは約300 〜約 500kg／cm3 であ
った。 【００３６】低い密度にもかかわらず、これらの紙様シ
ートは、インストロン・ユニバーサル試験装置を用いる
Technical Association of the Pulp and Paper Indust
ry(TAPPI) 法に従って測定した場合、非常に高い引張り
強さ（tensile strength）を有する。典型的には、300
〜 500kg／m3の密度範囲のシートの引張り指数（tensil
e index)は 100〜150 ニュートン−メーター／ｇの間で
ある。約 500kg／m3以下の密度を有するクラフトパルプ
から形成された対応するシートは引張り強さを実質的に
有しない。 【００３７】静置培養条件下で製造されたセルロースか
ら形成されたハンドシートは圧縮（densification)に対
する上記の耐性を示さない。典型的には、非攪拌培養の
セルロースからのこのようなシートは、用いられた湿圧
縮負荷に依存して約 500〜約750kg／m3の密度を有す
る。 【００３８】この発明はさらに、攪拌培養条件下で長時
間にわたりセルロース生産性微生物を培養することによ
り網状セルロース生成物を製造する方法に関する。攪拌
培養条件下での細菌性セルロースの生産は、アセトバク
ターのセルロース非生産性株を選択する攪拌培養条件の
よく知られている傾向に照らして驚くべきことである。
Valla 等（1982) 。さらに、これらの条件下で生産され
るセルロースの網状構造は全く予想外のことである。 【００３９】この明細書において使用する場合、アセト
バクター（Acetobacter)なる語は、微生物の属、そして
特にセルロースを生産する属の構成員に関する。この記
載に該当する多くの微生物が知られているが、それらの
菌学的分類は議論すべき対象であった。例えば、アメリ
カン・タイプ・カルチュアー・コレクションのカタログ
の第15版にNo.10245、No.10821、及びNo.23769として挙
げられているセルロース生産性微生物は、アセトバクタ
ー・アセチ・サブスペシス・キシリヌム（Acetobacter
aciti subsp.xylinum)、及びアセトバクター・パストリ
アヌス(Acetoba cter pasteurianus)の両者として分類さ
れている。 【００４０】従って、後でさらに説明するような攪拌培
養条件下での安定性の特徴を有するアセトバクターのす
べてのセルロース生産性株は、それがアセトバクター・
アセチ・サブスペシス・キシリヌムとして、アセトバク
ター・パストリアヌスとして、又は他の名称で分類され
ていても、この発明の範囲に属すると考えられる。本発
明者は、発酵槽工程条件を含む攪拌培養条件及び非攪拌
培養条件の両者において長時間培養において安定なアセ
トバクターの多くの株を発見しそして開発した。 【００４１】菌株の安定性は攪拌条件下において証明さ
れる。すなわち、攪拌条件下液体培地中で増殖したアセ
トバクターのサブカルチュアーを固体培地上に置いた場
合のコロニー形態により決定する場合、この発明の菌株
は42〜45世代の発酵過程の終りにおいて0.５％未満のオ
ーダーの非常に低い頻度でセルロース非生産性型に変化
するようである。 【００４２】この発明のアセトバクターの株を変異処理
し、そして多数の誘導体株を選択した。選択された株の
１つ及びその子孫は、グルコース含有培地で増殖した場
合の非常に低下したグルコン酸生成能力により特徴付け
られる。低下したグルコン酸生成能力を有するこのよう
な株は安定である。発酵槽ブロスからのサンプルのサブ
カルチュアーがグルコース含有培地上で炭酸カルシウム
を透明にするコロニーを形成する能力を有しないことに
より決定した場合、42〜45世代の発酵過程の終点におい
て、0.５％未満のグルコン酸生産型が検出される。これ
らの株は、セルロース非生産型への変化及びグルコン酸
生産型への変化に関して安定である。 【００４３】セルロース生産性微生物の増殖及び網状セ
ルロース生成物のための炭素源として、汚染微生物を含
有しない種々の原料を使用することができる。適当な炭
素源には、純粋な形態もしくは部分精製された形態で
の、又はモノサッカライド−もしくはジサッカライド−
含有原料としての、モノサッカライド類及びジサッカラ
イド類、例えばトウモロコシ澱粉及び糖蜜由来のグルコ
ースが含まれる。 【００４４】この発明の株によるセルロースの製造は、
静置条件下で可能であるのよりも高い溶存酸素濃度を可
能にする条件下で行われよう。攪拌されながらセルロー
ス生産を維持する菌株の能力は、使用される培地中の溶
存酸素を増加せしめるための種々の手段を許容する。す
なわち、生産されたセルロースのインペラーへの付着は
不利であろうが、培地中に浸漬されたインペラーによる
培地の直接攪拌が好結果をもって使用された。溶存酸素
を増加せしめるために培養物を攪拌する手段は、微生物
発酵分野における当業者によく知られている。培養液中
の酸素は0.01〜0.４気圧酸素の間で異ることができる。 【００４５】ブロスを攪拌するためにインペラーを使用
する発酵槽（14ｌ）において、ブロスの特性（粘度）及
び生ずるセルロースの特性（粒子のサイズ及び形態、沈
降速度、並びにハンドシートの形成）の両者が高いイン
ペラー速度（行われた試行において約600rpm以上）によ
り影響を受けることが見出された。これらの結果がすべ
ての発酵槽容積及び構成及び／又は攪拌の方法に妥当す
るか否かは不明である。 【００４６】しかしながら、行われた試験においてはよ
り高いインペラー速度／より長い攪拌時間が、より長い
粒子沈降時間、より高い懸濁液粘度、ハンドシート試験
におけるより少ないセルロース保持、及びより小さい粒
子をもたらした。従って、セルロースの意図される最終
用途に依存して、微生物をこのような攪拌条件下で培養
することを回避するのが好ましい。従って、十分に低い
攪拌速度及び短い攪拌時間で発酵を行うことによりセル
ロース生成物の性質の実質的な低下を回避するのが好ま
しい。 【００４７】この発明のセルロース生産性微生物を培養
するための効果的なpH範囲は４〜６であり、そして好ま
しくは4.５〜5.５である。pHは、クエン酸塩のごとき緩
衝剤を培地に加えることにより、あるいは所望の範囲に
pHを維持するのに十分な量の塩基又は酸を培地に加える
ことにより、調節することができる。 【００４８】 【発明の具体的な記載】以下のこの発明の具体的な記載
において、多くの培地を記載する。これらの培地は特に
ことわらない限り下記の組成を有する。Ｒ20−２培地は
次の組成を有する。Ｒ20−２ バクトペプトン ５ｇ／ｌ 酵母エキス ５ｇ／ｌ Na2HPO4 2.７ｇ／ｌ クエン酸 1.15ｇ／ｌ 炭素源 特に示される通り（特に示されない場合は ２％グルコース） 最終pH 5.０±0.２ Ｒ20は上記と同じであるが、最終pHは6.０である。 【００４９】Ｒ20−３は上記と同じであるがクエン酸が
省略されている。Ｙ−１培地は、最小培地とも称し、次
の組成を有する。化合物 最終濃度（mM) (NH4)2SO4 25 KH2PO4 7.３ MgSO4 1.０ FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.0011 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 pH＝5.０ グルコース 特にことわらない限り２ｗ／ｖ％ 【００５０】Ｙ−１培地を用いるすべての研究のため、
上記最小培地に下記のビタミン混合物を 100倍希釈で加
えた。ビタミン混合物 化合物 mg／Ｌ イノシトール 200 ナイアシン 40 ピリドキシンHCl 40 チアミンHCl 40 パントテン酸カルシウム 20 リボフラビン 20 ｐ−アミノ安息香酸 20 葉 酸 0.２ ビオチン 0.２ 【００５１】コーンスティープリカー培地は次の組成を
有する。成 分 最終濃度（mM) (NH4)2SO4 25 KH2PO4 7.3 MgSO4 1.0 FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.001 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 ビタミン混合物（前記） 10ml／ｌ 炭素源 特に示される通り（特に示されな い場合はグルコース２ｗ／ｖ％又 は４ｗ／ｖ％） コーンスティープリカー 特に示される通り（通常 （遠心後の上清画分） ２ｖ／ｖ％又は５ｖ／ｖ％） 消泡剤 0.01ｖ／ｖ％ 最終pH＝5.０±0.２ 【００５２】コーンスティープリカーの組成は供給者及
び処理の態様により異る。コーンプロダクツユニット
（Corn Products Unit) 、ＣＰＣ北米、ストックトン、
カリホルニアから得られる典型的なコーンスティープリ
カーサンプルLot E804は下記の組成を有する。 【００５３】主たる成分 ％ 固形分 43.8 粗蛋白質 18.4 脂 肪 0.5 粗繊維 0.1 灰 分 6.9 カルシウム 0.02 リ ン 1.3 無窒素抽出物 17.8 非蛋白性窒素 1.4 NaCl 0.5 カリウム 1.8 還元糖（デキストロースとして） 2.9 澱 粉 1.6 pH 4.5 【００５４】Ｙ３−３培地は次の組成を有する。成 分 濃 度 酵母エキス 10ｇ／ｌ ペプトン 10ｇ／ｌ KH2PO4 4mM K2HPO4 6mM グルコース 20ｇ／ｌ pH 6.0 【００５５】この発明の１つの観点は、アセトバクター
（Acetobacter)の幾つかのセルロース生産性株に関す
る。この発明のアセトバクターの株の安定性は、セルロ
ースを生産しない表現型への非常に低い転換頻度により
示される。攪拌条件下で増殖したアセトバクターのサブ
カルチュアーを42〜45世代の発酵サイクルの終点で固体
培地上にプレートした場合のコロニー形態により決定す
る場合、セルロースを生産しない表現型への転換頻度は
５×10-3である。 【００５６】セルロース生産株のコロニーは一般にベー
ジュ色又は白色であり、そして小形であり、もり上って
おり又は凸形であり、そしてサイズがコンパクトであ
る。これに対して、セルロース非生産株は固体培地上に
大形の、通常平らなコロニーを形成する。 【００５７】この発明の安定なアセトバクターの株はナ
サン・レジョナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern
Regional Research Laboratory)、ペオリア、イリノ
イ、米国、から入手したＡ．キシリヌム（A.xylinum)N
o.NRRL B42 の最初の単離株から誘導された。Ｒ−20−
２培地の寒天プレート上でのNRRL株の増殖は２種類のコ
ロニー形態を示し、一方が白色であり、他方がベージュ
色であった。顕微鏡的には、ベージュ色のコロニーはア
セトバクターの株に典型的な長い棒（桿）形の細胞を有
する。この株を1306−３と命名する。 【００５８】親NRRL B42株と異り、1306−３株は、 Cou
so, R.O.等、Biosynthesisof Polysrccharides in Acet
o bacter xylinum；Sequential Synthesis of a Heptas
accharide Diphosphete Prenol；Eur. J．Biochem. 123
: 617−627(1982) により報告されたような水溶性ポリ
サッカライドを生産しない。1306−３株の培養物は、種
々の炭素源を含有する異る培地上で培養した場合、微視
的形態及び巨視的コロニー形態のいずれにおいても安定
である。さらに、この発明の株のコロニー及び細胞形態
は、種々の培地で静置培養又は振とう液体培養された場
合に安定なままである。 【００５９】1306−３株及びその子孫は、種々の炭素源
及び窒素源を含有する種々の液体培地中でセルロースを
生産することができる。カゼイン加水分解物、酵母エキ
ス、マルトエキス、アンモニウム塩、コーンスティープ
リカー及び他の窒素リッチ物質を、アミノ酸、窒素、ミ
ネラル及びビタミン類の一般源として使用することがで
きる。コーンスティープリカーは0.１ｖ／ｖ％〜10ｖ／
ｖ％の範囲において好ましい。 【００６０】振とうフラスコ培養においては５ｖ／ｖ％
のコーンスティープリカーが好ましい。発酵槽において
は、初期濃度２ｖ／ｖ％のコーンスティープリカーに、
発酵の過程で追加の２ｖ／ｖ％のコーンスティープリカ
ーが補充される。種々の炭素源を使用することができ、
これにはマンニトール、ソルビトール、シュークロー
ス、フラクトース、及びグルコースが包含される。但
し、後者の炭素源を用いて、Ｄ−グルコン酸及びケトグ
ルコン酸、例えば２−ケト−Ｄ−グルコン酸又は５−ケ
ト−グルコン酸が1306−３株により生産される。 【００６１】有意に少ない量のＤ−グルコン酸を生産す
るこの発明のアセトバクターの株も本発明者等により開
発された。これを後にさらに記載する。網状セルロース
生成物の生産において有用な炭素源は、モノサッカライ
ドもしくはその混合物、例えばグルコース及びフラクト
ース、ジサッカライド、例えばシュークロース、及びモ
ノサッカライドとジサッカライドとの混合物により特徴
付けられる。さらに、炭素源は糖の複合混合物（comple
x mixture)、例えば糖蜜、又は植物性バイオマスの加水
分解物、木材加水分解物、麦わら加水分解物、トウモロ
コシ茎の加水分解物、サトウモロコシ等として供給する
ことができる。 【００６２】モノサッカライド及びジサッカライド又は
これらの混合物の濃度は種々であり得る。グルコースの
み及びスラクトースのみが0.５ｗ／ｖ％〜７ｗ／ｖ％の
範囲、そして好ましくは約４ｗ／ｖ％の濃度で使用され
る。さらに、グルコースとシュークロースの混合物を、
その比率を１：10〜10：１とし、培地に対する合計濃度
を0.５ｗ／ｖ％〜７ｗ／ｖ％として使用することができ
る。フラスコ培養においては１ｗ／ｖ％グルコース及び
２ｗ／ｖ％シュークロースの濃度が好ましい。 【００６３】炭素源が発酵中に間欠的に又は連続的に供
給されるフィード回分発酵においては、添加される合計
炭素基質は４ｗ／ｖ％〜30ｗ／ｖ％の範囲で変化し得
る。炭素源は精製された又は部分精製されたフィードス
トックとして供給することができ、あるいはこれに代え
て、糖蜜のごとき複合混合物として供給することができ
る。これらの炭素源は、それらが汚染生物を含有しない
ように調製される。 【００６４】グルコース含有培地でのグルコースのＤ−
グルコン酸への転換は、回分培養において培地のpHの有
意な低下を導く。約4.０より低いpHを細胞の増殖を制限
するので、pHの調節が好ましい。この発明のグルコン酸
生産株の液体培地のpH調節は、クエン酸塩のごとき緩衝
剤の使用によって行うことができる。しかしながら、酸
を中和するために添加し得る緩衝剤の量は制限され、そ
してグルコン酸生産株の高密度への増殖は使用し得る緩
衝剤の量により制限される。 【００６５】さらに、緩衝剤としてのクエン酸塩又は他
の塩の使用は培地を高価なものとする。アセトバクター
はフラクトースを酸に代謝しないので、炭素源としてフ
ラクトースを使用することによってpH調節を行うことも
できる。しかしながら、フラストースは高価な基質であ
り、そしてセルロース繊維の製造コストを上昇せしめ
る。 【００６６】本発明者は、1306−３株を変異源で処理す
ることによって、1306−11株及び1306−21株により例示
される安定な変異株を開発した。これらの株は有意に低
下した量のグルコン酸を生産するが、親株1306−３に典
型的な安定な態様でセルロースを生産する。変異誘発処
理は、約１％の生存率を得るのに十分な濃度のメタンス
ルホン酸エチル(EMS) を使用して行った。1306−11株の
場合には、変異処理された生存細菌の内8,100 コロニー
をスクリーニングした。２個の単離株が低下した量のグ
ルコン酸を生産した。 【００６７】1306−11株は、Ｒ−20−CaCO3 培地のプレ
ート上での培養、及び親株1306−３に類似する形態を有
するがしかし培地中の炭酸カルシウムを透明にしないコ
ロニーについてスクリーニングすることにより選択し
た。1306−21株は、例５において後記するようにして選
択した。 【００６８】細菌培養物は、液体培地中に乱流を生じさ
せるために知られている任意の手段により、攪拌培養条
件下で増殖せしめることができる。このような手段は当
業者によく知られている。小規模の、一般に10ｌ未満の
培養容量の場合、培地に渦流動を付与する往復又は振と
う培養機により液体培地を攪拌することができる。 【００６９】大規模の、一般に10ｌ以上の培養容量の場
合には、培地を種々の手段により、例えばインペラー、
浮揚上昇発酵槽例えばエアーリフト発酵槽、発酵ブロス
のポンプ駆動循環、又はこれらの組み合わせにより攪拌
することができる。この発明のセルロース生成物の大規
模製造のために種々の反応器設計が適当である。例え
ば、Biochemical Engineering and Biotechnology Hand
book, Atkinson及びMavituna編、第１版、ザ・ネイチュ
アープレス、ニューヨーク（1983）の第７章を参照のこ
と。 【００７０】培地が攪拌される限り、長時間にわたり0.
１ｇ／ｌ／時以上であるセルロースの平均容積生産性に
おいてセルロース生産性微生物を増殖せしめるために種
々の発酵方法が適切である。適当な発酵法には回分発酵
法、フィード回分発酵法、反復回分発酵法、及び連続発
酵法が適当である。 【００７１】回分発酵においては、セルロース生産性微
生物が発酵槽に導入され、そして培地をさらに添加する
ことなく発酵が進行する。発酵の終点において、発酵槽
の内容物が集められ、そしてセルロースが採取される。
フィード回分発酵においては、発酵の終りまで処理のた
めの発酵液を取り出すことなく、発酵中に種々の栄養、
例えば窒素源又は炭素源が培地に添加される。 【００７２】栄養は連続的に、又は所定の間隔で、ある
いは培地中の栄養レベルが所望の値より低くなった場合
に添加される。反復回分発酵においては、一定容量の培
養液が処理のために取り出され、そして培養器中の残り
の培養液に一定容量の新鮮な培地が添加され、そして発
酵が回復される。反復回分発酵においては、フィード回
分発酵における場合と同様に、栄養を連続的に、又は所
定の間隔で、あるいは培地中の栄養レベルが所望の値よ
りも低下した時に添加することができる。 【００７３】連続発酵においては、一定速度で培養液が
発酵槽から取り出され、そして新鮮な培地で置き換えら
れる。連続発酵においては、容器への培地流及び容器か
らの培養液を調整することによってセルロース生産微生
物の増殖速度をおよそ一定の速度に維持することができ
る。 【００７４】回分発酵、フィード回分発酵、反復回分発
酵、及び連続発酵はいずれも、培地に対して接種物が１
ｖ／ｖ％以上である限り、0.１ｇ／ｌ／時以上の平均容
積生産性を達成するために適当である。0.１ｇ／ｌ／時
のセルロースの平均容積生産性を得るために培地に対し
て１〜10ｖ／ｖ％の接種物が効果的である。連続培養に
おいては、培地と同様にセルロース生産細胞及びセルロ
ースが取り出され、そして新鮮な培地が、0.１ｇ／ｌ／
時の平均容積生産性を維持するのに十分な速度で添加さ
れる。 【００７５】セルロース濃度及び容積生産性を決定する
ため、前記の発酵法のいずれかにより生産されたセルロ
ースが発酵液から採取される。一般に、セルロースを分
離するための任意の方法を使用することができるが、遠
心分離が好ましい。セルロース生産微生物、スペント培
地及びセルロースを含有する発酵液の各バッチを遠心す
る。上清液の容積を測定し、そしてこの上清を棄てる。 【００７６】微生物及びセルロースを含む固形物を含ん
で成るペレットが残る。このペレットを脱イオン水で２
〜３回洗浄して残留培地を除去する。第１図は、この段
階でのペレットのマクロ構造を示す。残留物をアルカリ
溶液、例えば0.１Ｍ NaOH 又はKOH により60〜65℃にて
少なくとも２時間処理する。溶液を混合してセルロース
の大きな塊を分散せしめることができる。 【００７７】アルカリ処理の間、混合物をゆっくり攪拌
し、そして60〜65℃に維持する。アルカリ処理された材
料を洗浄し、そして次にペレットを洗浄し、そして脱イ
オン水中で３〜４回遠心する。第１Ｂ図はこの段階での
マクロ構造を示す。次にセルロースを真空オーブン中で
乾燥し、そして秤量する。回分培養について接種から収
得までの発酵時間当り、使用された培地の容積当り、生
産されたセルロースの合計質量（ｇ／ｌ／時）として容
積生産性が定義される。 【００７８】次に、例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。 【００７９】例１．この例は、非振とう条件下で、主基
質としてのフラクトースに増殖するＡ．キシリヌム1306
−３によるセルロース生産を示す。Moshe Benziman博
士、ヘブレウ大学、イエルサレム、イスラエンから入手
した1499−１株を比較のために同じ条件下で増殖せしめ
た。 【００８０】50mlのエルレンマイヤーフラスコ中２％の
フラストースを含有するＹ３−３培地25mlを収容する種
母フラスコを用意し、そして寒天スラントから接種し
た。この培養物を30℃にて３日間静置培養として増殖せ
しめた。フラスコを手で激しく振って細胞を遊離せし
め、そしてこの培養物（セルロースペレットを含まな
い）0.５mlを、２ｗ／ｖ％のフラクトースを含有する同
じＹ３−３培地の数個のフラスコ（50mlフラスコ中25m
l）に接種した。 【００８１】670nm にて0.03ODの細胞懸濁液を使用しそ
して各フラスコに0.５mlを導入することにより、すべて
の株の同じ接種を行った。フラスコを振とうしないで30
℃にてインキュベートした。フラスコをインキュベーシ
ョンからはずし、そして全内容物をサンプリングのため
に収得した。各菌株につき各時点で２連のサンプリング
を行った。サンプリングは増殖が明らかになった時から
開始し、そして通常毎日２個のサンプルを採取した。 【００８２】セルロースの生産を測定するため、各サン
プルのフラスコ内容物を100ml ビーカーに移した。次に
懸濁液を、大Tekmerプローブを用いて全力の50％にて１
分間ほぐした。懸濁液を5,000rpmにて10分間遠心分離し
た。上清を棄て、そしてペレットを15mlの0.１Ｎ Nacl
液中に懸濁し、そして渦動せしめた。懸濁液を時々渦動
しながら15分間平衡化し、そして前記の洗浄段階を反復
した。 【００８３】第２洗浄からのペレットを15mlの0.５Ｎ K
OHに再懸濁し、そして60℃にて穏和な攪拌を行いながら
120 分間インキュベートした。懸濁液を遠心し、そして
KOH上清を棄てた。ペレットを15mlの脱イオン水に再懸
濁し、そして時おり渦動しながら室温にて15分間平衡化
した。サンプルを遠心分離し、そして前記の洗浄方法を
合計４回反応した。最後の遠心分離段階の後、湿セルロ
ースマットを秤量し、そして真空中55℃にて一夜乾燥し
た。 【００８４】 【表１】【００８５】２％のフラストースを含有するＹ３−３培
地上での1306−３株及び1499−１株によるセルロース生
産。 初期pH＝6.０、N.D.＝測定せず。 【００８６】例２．攪拌培養におけるセルロース生産安
定性研究 1306−３株及び1499−１株におけるセルロース合成の安
定性を、液体攪拌培養への菌株の一連の移行の間に、各
移行において均一な種接物を使用して試験した。セルロ
ース合成の安定性を評価するために、フラスコでのセル
ロース生産の観察及びプレート上でのサンプルからの大
形コロニー（Ｌ−コロニー）の出現を用いた。1499−１
におけるセルロース生産は、生産されるセルロースの量
の減少及びセルロース非生産株を代表する大拡散コロニ
ー数の増加により示されるように、好気攪拌フラスコ中
では、不安定であった。1306−３株におけるセルロース
生産は振とうされたフラスコ中で少なくとも30世代にわ
たり安定なようであった。 【００８７】種母培養物を、親培養物の寒天スラントか
ら、50mlのエルレンマイヤーフラスコ中２％のフラクト
ースを含有するＲ−20培地25ml中に接種した。種母培養
物を30℃にて４日間静置培養として増殖せしめた。フラ
スコを手で激しく振って細胞を遊離せしめ、そしてこの
培養物（セルロースペレットを含まない）0.５mlを、２
％のフラクトースを含有するＲ20培地の幾つかのフラス
コ（50mlフラスコ中25ml）に接種した。これらのフラス
コを振とうしないで30℃にてインキュベートした。 【００８８】静置フラスコでの数回の移行の後、36時間
ペレットを激しく振り、そして上清を接種物（１ｖ／ｖ
％）として使用し、２％フラクトースを含有するＲ20培
地（pH５）を収容するフラスコに接種した。フラスコ(1
25mlのフラスコ中25ml) を、ニュー・ブルンスウィック
・キラトリー振とう機中30℃にて200rpmでインキュベー
トした。24〜48時間後、培養物を無菌的に一緒にし、新
鮮な培地への第２移行のため、及びプレート上でのスト
リーキングのための接種物として使用した。各菌株を、
30世代とおよそ等しい４回の移行の間試験した。プレー
ト実験に使用した培地は２％のフラクトース及び1.５％
の寒天を含有するＲ20培地（pH5.0)であった。 【００８９】振とうフラスコで増殖する間、1499−１株
の培養物は見かけ上、細胞の均一な懸濁液及び異るサイ
ズの不規則な塊から成っていた。塊と細胞懸濁液との比
率は、第１移行から第３移行にかけて減少した。この観
察は、第１移行から第３移行にかけての生産されるセル
ロースの量の有意な減少、及びセルロース非生産株を代
表するＬ−コロニー比率の増加と相関した。増殖の関数
としての1499−１株のＬ−コロニーの頻度を表２に示
す。 【００９０】 【表２】 【００９１】非常に対照的に、1306−３株の培養物は、
振とうフラスコ中での増殖の間、見かけ上異るサイズの
不規則な塊とそれらの塊の間の透明な培地から成ってい
た。セルロース−ネガティブ細胞は培養液中に単一細胞
として現われ、そして塊の間の培地中に濁を生じさせ
る。４回の移行の後、培養物の外観及びセルロース生産
量の変化は観察されなかった。この間、プレート上のコ
ロニーは均一に現われ、大型の非生産性コロニーは観察
されなかった。 【００９２】例３．1306−３株の変異誘発 1306−３株を１％又は２％の化学変異剤メタンスルホン
酸エチル（EMS)により変異誘発処理し、そして生存細胞
をグルコン酸合成能力の喪失（glcA- ) についてスクリ
ーニングした。２個のglcA- 単離株が得られた。変異誘
発は次のようにして行った。 【００９３】Ｒ20−２培地上の1306−３株の２日間培養
物を変異処理のために使用した。約99％の死滅をもたら
すように条件を選択した。選択された条件は0.１Ｍリン
酸カルシウム緩衝液（pH6.0)0.２％ＥＭＳ、及び28℃に
て60分間のインキュベーションであった。細胞濃度は約
５×107 細胞／mlであった。この処理の後、培養物を−
80℃に凍結し、さらに使用した。 【００９４】例４．スクリーニング ＥＭＳ変異処理からの材料を用いて1306−３グルコン酸
ネガティブ変異株のスクリーニングを行った。スクリー
ニングは１％のCaCO3 を含有するＲ20−２プレート上で
行った。これらのプレートは、無菌Ｒ20−２中20％の無
菌CaCO3 を最終濃度が１％となるように加え、よく混合
し、そしてプレート当り10mlずつ分配することにより調
製した。プレート培地の最終pHは6.０であった。 【００９５】プレートを30℃にてインキュベートし、そ
して７〜10日後にスコアーした。透明化ゾーンを有しな
いコロニーを確認スクリーニングのために拾った。コロ
ニーを、２mlのＲ20−２培地を収容する無菌試験管に懸
濁し、そして３日間インキュベートして薄膜の形成及び
培養液のpHの低下をチェックした。スクリーニングした
8100個のコロニーの内、２％ＥＭＳ処理サンプルからの
２個の単離株がグルコン酸ネガティブであることが見出
された。これらの内良好な方を1306−11株と命名した。 【００９６】1306−11株及び1306−３株によるグルコン
酸生産を液体Ｒ20−グルコース培地及びＹ１−グルコー
ス培地で決定した。２％のグルコースを含有するＹ１の
初期pHは4.21であった。Ｒ20−２プレートからの１白金
耳の1306−11株又は1306−３株培養物を２mlの炭素源不
含有Ｙ１培地に懸濁した。これらの懸濁液の細胞数は約
1.６×108 細胞／mlであった。３mlの適切な培地を収容
する試験管（16×125mm)に 200μｌの細胞懸濁液を接種
し、そしてよく渦動混合した。試験管を振とうしないで
30℃にて３日間インキュベートした。表３は、変異株13
06−11及び親株1306−３についての３日目のpH及びグル
コン酸レベルを示す。値は２本の試験管のそれぞれにつ
いて示す。 【００９７】 【表３】 【００９８】例５．1306−21株の調製及び同定 1306−２株を例３におけるようにして変異誘発処理し
た。次に微生物をＣＳＬプレート（２％グルコース、３
％コーンスティープリカー）にプレートして単一コロニ
ーを確立した。コロニーを拾い、そして0.25mlのＳＣＬ
培地（４％グルコース、１％コーンスティープリカー）
を収容するミクロタイタートレイウエルに入れた。これ
らのトレイを、pH試験紙（2.９〜5.２の範囲）により測
定した場合の培地pHの明瞭な低下が観察されるまで４〜
５日間インキュベートした。そのpHは約５（pH試験紙が
緑色〜緑味色）であるコロニーを第２スクリーニングに
通した。 【００９９】第２スクリーニングにおいては、前記のミ
クロタイタートレイウエル中で使用した高グルコース培
地２mlを収容する試験管に、選択されたコロニーを接種
した。試験管を30℃にてインキュベートした。コロニー
を薄膜形成及びpHについて試験した。1306−21株と命名
されたグルコン酸ネガティブ株を、こうして選択した。 【０１００】比較のため、1306−11株及び1306−21株の
サンプルを、種々の量のグルコース及びコーンスティー
プリカーを含有するＣＳＬ培地を収容する種母フラスコ
中で、例１に記載した一般的方法を用いて増殖せしめ
た。５日間のインキュベーションの後、セルロース生産
及び培地pHを決定した。これらの結果を表４に示す。 【０１０１】 【表４】 【０１０２】以上のごとく、これらの試験において、13
06−21株は1306−11株に比較して、低い酸生産（高いp
H）及び高いセルロース生産を示した。例６ ．網状セルロース生成物の製造 1306−14株はアセトバタター1306−11株の自然変異株で
ある。1306−11株のコロニーが特徴的に一様な凸状であ
りそして濃ベージュ色を有するのに対して、この自然変
異株はＲ20−２プレート上で大形の白色粘質コロニーと
して同定された。 【０１０３】凍結ストックからの1306−14株のサンプル
を 100mlのＲ20−２培地中に接種し、そして静置条件下
で30℃にて約３日間増殖せしめた。培養物の完全な内容
物を無菌ブレンダーに移した。小ブレンドヘッドを用い
て、培養物を短い４秒バーストによりブレンドした。破
砕された培養物の５ｖ／ｖ％接種物を2000mlのバッフル
付フラスコ中 400mlのＲ20−２培地に移し、そして125r
pmにて振とうしながら30℃にて約2.５日間培養した。フ
ラスコの内容物をブレンドし、そしてこれを用いて発酵
槽に接種した。 【０１０４】バッフル付フラスコからの破砕された培養
物の５ｖ／ｖ％接種物を、２％のグルコースを含有する
Ｒ20−２培地９ｌに移した。発酵槽（ブラウン）にはイ
ンペラーを装着し、そして内部加熱コイル及びバッフル
を取り外した。発酵条件は最初600rpmであり、そして44
時間後に 1000rpmに上げて、粘性を増した培地の混合を
増加した。温度を30℃（±１℃）に調節した。pHは5.０
±0.１に調節し、そして培地中の酸素濃度を約30％の空
気飽和に維持した。48時間目に発酵槽の内容物を集め
た。 【０１０５】セルロースを自然沈降せしめ、そして過剰
の液を注ぎ出した。残ったセルロースをブレンドし、洗
浄し、そして前記のようにして洗浄した。セルロースを
脱イオン水で洗浄し、そして0.５Ｎ NaOH 中60℃にて一
夜、３回抽出した。最終抽出の後、洗浄水のpHが6.０以
下に低下するまでセルロースを脱イオン水で洗浄した。
この調製物を、例８に記載する走査電子顕微鏡実験のた
めに使用した。 【０１０６】例７．1306−８株は、NRRLB42 のサンプル
から直接選択されたアセトバクターの単離株である。13
06−８株のコロニーは、Ｒ20−２プレート上での白色の
高くもり上がったコロニーにより特徴付けられる。1306
−８株はグルコン酸を生産した。凍結ストックからの13
06−８株のサンプル（2.５ml）を 100mlのＲ20−２培地
に接種し、そして 500mlの広口エルレンマイヤーフラス
コ中で静置条件下30℃にて培養した。種母培地をこれら
の条件下で約２〜４日間、見ることができる薄膜が形成
されるまでインキュベートした。次に、種母培養の全内
容物をブレンドし、そして次の培養物に接種するために
使用した。 【０１０７】ジメチルホルムアミド(DMF) 中ベンレート
(Benlate) 殺カビ剤（デュポン）の10ｇ／100 ml懸濁液
0.025mlを含むＲ20−２培地１ｌを収容する広口フェル
ンバッハフラスコを用いて発酵を行った。ＤＭＦ及びベ
ンレートのこの濃度はアセトバクター1306−８株の増殖
に有意な影響を与えることなくカビの汚染を防止するた
めに効果的であった。 【０１０８】約８〜10mlを用いて１ｌのＲ20−２培地に
接種した。培養物をフェルンバッハフラスコ中で10〜14
日間30℃にて、攪拌しないで（すなわち静置して）増殖
せしめた。収得の時点で、0.３〜1.２cmの厚さの薄膜が
形成されていた。 【０１０９】薄膜をフェルンバッハフラスコから取り出
し、次にブレンドし、脱イオン水で洗浄して培地及び細
胞の一部分を除去した。フィルターとして 286μｍの網
目開口を有するフィルタースクリーン（スペクトラメッ
シュ＃146382）を用いて大型ブフナー漏斗を通して洗浄
を行った。 【０１１０】ブレンドされそして洗浄された薄膜の抽出
を0.50Ｍ NaOH を用いて約60℃にて約14時間行った。所
望の時間混合及びインキュベーションを行った後、抽出
混合物を上記の条件下で濾過した。脱イオン水による洗
浄は、洗浄水のpHが6.０以下に低下するまで続けた。こ
の調製物を用いて走査電子顕微鏡実験に使用した。 【０１１１】例８．前記例６及び例７から得られたセル
ロース生成物を走査電子顕微鏡観察のために用意した。
検体を凍結乾燥し、そして次に６：40金：パラジウム導
電フィルムにより真空下で表面被覆(sputter) した。16
KVの加速電圧で運転されるナトメーター走査型電子顕微
鏡を用いて光学写真を撮った。 【０１１２】図２及び図４は、得られたセルロース生成
物の代表面な電子顕微鏡写真である。図２及び図４は、
例７に従って静置培養において製造されたセルロース製
造物を示す。これらの図が示すところによれば、生成物
は、相互にオーバーラップしそして交差するように見え
るが相互連結されているようには見えない延長されたセ
ルロースフィブリルの積み重ねから主として成る。静置
培養条件下で生産されたセルロースのフィラメントは約
0.05〜0.２ミクロンの幅にわたり、多くのストランドは
0.05〜0.１ミクロンの範囲にある。 【０１１３】これに対して、図３及び図５は、例６にお
いて攪拌培養で製造されたセルロース生成物が、静置培
養において成長したセルロースに比べて、断面が一般に
太い…0.１〜0.２ミクロンの範囲…フィブリルの網状体
から成ることを示している。さらに、このセルロースフ
ィブリルは、フィブリルがオーバラップするのではなく
むしろ主として相互連結されたネットワークを形成して
いるようである。 【０１１４】例９．この例は、この発明の網状セルロー
ス生成物の幾つかの特徴を示す。ハンドシートを、アセ
トバクターにより生産されたセルロースのサンプルか
ら、TAPPI 公認試験法T205om−81に記載されている方法
に従って約60ｇ／ｍ2 の基本重量に調製した。セルロー
スは、２％のグルコースを含有するＲ20−培地を用いて
フラスコ培養において静置増殖条件下で1306−３株から
製造された。 【０１１５】網状セルロース生成物は、同じ培地を使用
して、600rpmでのインペラーによる攪拌のもとで発酵槽
にて、1306−11株を用いて製造された。セルロースを含
有する培養液を冷貯蔵した後、セルロースを処理した。
セルロースを 150,000回転のブリティッシュ・ディスイ
ンテグレーター中で分散せしめた（２ｌの水中1.２
ｇ）。次に、この懸濁液を、 200メッシュのワイヤース
クリーンを含む自動シート型に注入し、そして２時間以
上排水した。 【０１１６】湿ったハンドシート（直径15cm）をシート
型から取り出し、そして最後に吸取紙の間で過剰の水を
おだやかに除去した。次に、シートを吸取紙に挟んでTA
PPIプレスに入れ、種々の時間にわたり50psi(345kPa)
の荷重のもとにおき、種々の密度のシートを製造した。
シートを、ノーブル・アンド・ウードの実験室用ドラム
ドライヤーを通すことによりシートの最終乾燥を行っ
た。シートの引張強さを、インストロン・ユニバーサル
試験装置を用いてTAPPI 法T494om−81に従って測定し
た。 【０１１７】この例の網状セルロース生成物は、これが
ハンドシートに形成された場合、圧縮(densification)
に対する実質的な耐性を付与することが見出された。異
る湿圧縮荷重を用いることにより、約 300〜約500kg ／
ｍ3 の密度を有する一連のシートを調製した。低い密度
にもかかわらず、これらの紙様シートは非常に高い引張
り強さを有していた。典型的には、上記の密度を有する
それらのシートの引張指数 100〜150 ニュートン−メー
ター／ｇの範囲である。約 500kg／ｍ3 より低い密度を
有する、クラフトパルプから形成された匹敵するシート
は引張強さを実質的に有していない。 【０１１８】静置培養条件下で製造されたセルロースか
ら形成されたハンドシートは圧縮(densification) に対
する上記の耐性を示さない。典型的には、非攪拌培養の
セルロースからのシートは、使用された湿圧縮荷重に依
存して約 500〜約750 kg／ｍ3 の密度を有する。 【０１１９】例10．この例は、アセトバクターの２つの
株を用いて、攪拌培養条件のもとで製造された網状セル
ロース生成物と静置条件のもとで製造された非網状セル
ロース生成物の圧縮(densification) に対する耐性を比
較する。網状セルロースは、例６に記載したような攪拌
増殖条件下で1306−14株を用いて得られた。非網状セル
ロースは、例７に記載したのと実質的に同じ静置条件下
で、２％のグルコースを含有するＲ20−２培地を用いて
静置フラスコ培養において1306−３株を用いて得られ
た。 【０１２０】ハンドシートを網状セルロース及び静置培
養で製造したセルロースから、例９に記載したようにし
て約60ｇ／ｍ2 の基本重量に調製した。但し、シートを
製造するために種々の圧縮荷重を使用した。網状セルロ
ース及び非網状セルロースからこの例において製造され
たシートの密度及びその他の特徴を次の表５に示す。 【０１２１】 【表５】 【０１２２】例11．６菌株を試験した。1306−３株及び
1306−11株は前記の通りである。アセトバクター・アセ
チ・サブスペシス・キシリヌム（Acetobacter aceti su
b sp. xylinum) ATCC No.23769の２つのサブカルチュア
ーをこの明細書において23769A及び23769Bと称する。さ
らに、ATCC 31174株、及びナショナルコレクション・オ
ブ・インドストリアル・バクテリア8132株(Aberdeen 、
英国）、並びに1499−１株も試験した。 【０１２３】前種母培養、種母培養及び製造段階のため
の培地は４ｗ／ｖ％のフラクトース及び５ｗ／ｖ％のＣ
ＳＬを含有するＣＳＬ培地であった。前種母は、 750ml
のファルコン＃3028組織培養フラスコ中 100mlの上記培
地中で、0.01％のダウコーニング消泡剤を用い、静置条
件下で、30℃にて24〜48時間増殖せしめた。前種母培養
物の全内容物を前記のようにしてブレンドし、そして種
母培養の５ｖ／ｖ％の接種物を調製するために使用し
た。前種母をＲ20−２プレート上にストリークして汚染
をチェックした。すべての菌株は均一なコロニー形態を
有していたが、1499株は約50％の大形コロニーを有して
いた。 【０１２４】種母培養は、バッフルを有する 125mlのフ
ラスコ中上記の培地25ml中で、往復振とう機中125rpmの
振とう条件下で30℃にて３日間増殖せしめた。ブレンド
された種母のそれぞれからのサンプルをＲ20−２プレー
ト上にストリークして汚染についてチェックした。約50
％の大形コロニーを有する1499−１株を除くすべての菌
株が均一なコロニー形態を有していた。種母培養物の残
りのすべての内容物を前記のようにしてブレンドし、そ
して製造段階のための５％接種物を調製するために使用
した。 【０１２５】各株につき２連の発酵培養物をバッフルを
有する 125mlのフラスコ中125rpmの往復振とう機上で30
℃にて培養した。各菌株の２連のフラスコを１日、２
日、３日、及び４日目に収得した。但しATCC 23769B に
ついては、増殖が不十分であったため７日目に収得し
た。1499−１株及びATCC 31174株の両者はこれらの条件
下で水溶性ポリサッカライド(WSP) を生産した。1306−
３株又は1306−11株によってはＷＳＰは生産されなかっ
た。各菌株についてセルロース生産を測定した。その結
果を表６に示す。セルロース生産の値はｇ／ｌで示す。 【０１２６】 【表６】 【０１２７】例12．発酵槽におけるセルロース製造 1306−11株の前種母及び種母培養物は、例10に記載した
ようにして２日間増殖せしめた。但し、４ｗ／ｖ％のグ
ルコース及び５ｗ／ｖ％のＣＳＬを含有する培地を使用
した。種母培養物は同じ培地中で２日間増殖せしめた。
但し、培養容積はバッフル付２ｌフラスコ中 400mlであ
った。 【０１２８】14ｌのケマップ(Chemap)発酵槽中で２回の
発酵槽試行を５ｖ／ｖ％の接種物及び12ｌの初発容量で
行った。72時間の発酵槽試行の間、培養物を30℃（±１
℃）に維持した。発酵槽＃１においては、最初のグルコ
ース濃度は32ｇ／ｌであった。発酵槽＃２においては、
グルコース及びシュークロース濃度はそれぞれ10ｇ／ｌ
及び20ｇ／ｌであった。発酵中に発酵槽＃１に、さらに
143ｇ／ｌのグルコースを間欠的に添加した。 【０１２９】発酵槽＃２には、50ｇ／ｌのグルコース及
び72ｇ／ｌのシュークロースを発酵中に間欠的に発酵槽
に加えた。最初の２ｖ／ｖ％のＳＣＬ濃度に、最初容量
に対して２容量％に相当する量のＣＳＬを32時間目及び
59時間目に追加した。 【０１３０】溶存酸素濃度は30％空気飽和に維持した。
発酵槽＃２中では、溶存酸素濃度は69時間目から約２時
間にわたり０に低下した。攪拌を最初600rpmに維持し
た。セルロース濃度の上昇と共に粘度が上昇したので、
インペラー速度を 1200rpmに増加した。発酵槽１につい
て、セルロース、グルコン酸及び２−ケト−グルコン酸
の濃度を第７表に示す。 【０１３１】発酵槽２について、セルロースの濃度を表
８に示す。グルコースのみの発酵槽＃１において達成さ
れる最大セルロース濃度は12.7ｇ／ｌであった。グルコ
ース／シュークロース発酵槽＃２において達成される最
大セルロース濃度は18.3ｇ／ｌであった。両最高値は発
酵開始後71.6時間目に達成された。この時点での容積生
産性は、発酵槽＃１及び＃２においてそれぞれ0.18及び
0.26ｇ／ｌ／時であった。 【０１３２】 【表７】【０１３３】 【表８】 【０１３４】例13．1306−11株の代りに1306−21株を用
いて例12の発酵を反復した。但し次の変更を行った。 １．前種母及び種母は、２％のグルコース及び２％のＣ
ＳＬを含有するＣＳＬ培地中で調製した。 ２．攪拌速度は900rpmを超えなかった。 ３．最初のグルコース濃度は20ｇ／ｌであり、そして発
酵中に 109ｇ／ｌをさらに添加した。 ４．最初のＣＳＬ濃度は２ｖ／ｖ％であり、発酵中27.8
時間後に２ｖ／ｖ％をさらに添加した。この試行におい
て観察されたセルロース、グルコン酸、２−ケト−グル
コン酸及び５−ケト−グルコン酸の濃度を表９に示す。 【０１３５】 【表９】【０１３６】表９の結果を表７のそれと比較して、1306
−21はセルロース生産については1306−11株と同等又は
それより良好であるが、酸の生産は非常に少ないようで
ある。低い酸生産性は、理論的には、1306−21株がより
少ない塩基の添加により匹敵する濃度に培養することを
可能にする。 【０１３７】例14. セルロースの性質に対する攪拌の効
果 下記の４種の性質に対する攪拌の効果を評価するために
一組の試験を行った。 １．ハンドシートの形成（例９のTAPPI 試験）：発酵か
らの精製され、処理されそして再懸濁されたセルロース
ファイバーの、 150メッシュスクリーン上に一体シート
を形成する能力。結果は、再懸濁されたファイバーに対
するスクリーン上に保持されたファイバーの％、及び形
成されたシートの粘着性(integrity) の定性的評価に従
って判定される。 【０１３８】２．沈降速度：発酵槽からの稀釈されたサ
ンプルが傾斜したシリンダー中で沈降する速度。セルロ
ースの沈降する懸濁液の沈降物／上清液界面の高さの下
降を時間に対してプロットする。所与の時点でのプロッ
トの傾斜から瞬間沈降速度を決定することができる。こ
の性質はセルロース粒子のサイズ及び密度に依存する。 【０１３９】３．懸濁粘度：グリセリン溶液により換算
された、トーマス−ストーマー(Thomas-Stormer)粘度計
により測定される懸濁されたセルロース発酵槽ブロスの
粘度。この性質はセルロース粒子の形態に依存する。 ４．粒子のサイズ及び形態：この性質は、発酵槽からの
セルロースの光学顕微鏡写真から決定される。 【０１４０】第１のセットの試験は1306−11株を用いる
４回の発酵槽試行から成り、この間に、異る最高攪拌速
度で運転される14ｌのケマップ発酵槽から時間の関数と
してサンプルを採取した。これらの４回の発酵槽試行は
増殖する培養物を用いる典型的な発酵であるが、長時間
の攪拌の効果を評価するため通常の発酵時間を超えて延
長した。これらの試行からのサンプルをハンドシート形
成能力について分析した。 【０１４１】第２のセットの試験は、 250ｌの発酵槽試
行から得られた古い非増殖セルロース培養物を、４個の
14ｌケマップ発酵槽中で攪拌することから成った。攪拌
速度は各発酵槽において一定であったが、発酵槽ごとに
異った。各発酵槽から経時的にサンプルを採取した。こ
のセットの実験におけるセルロース濃度はすべての発酵
槽について均一であったが、第１のセットの実験におけ
る最終濃度の約半分であった。 【０１４２】この第２のセットの実験においては、第１
のセットの実験の平均通気速度（空気及び酸素）とおよ
そ同じ速度で窒素を吹き込んだ。第２のセットの実験か
らのサンプルをハンドシート形成、沈降速度、粘度、並
びに粒子のサイズ及び形態について分析した。第１のセ
ットの実験及び第２のセットの実験からのハンドシート
の結果をそれぞれ表10及び表11に要約する。 【０１４３】 【表１０】【０１４４】 【表１１】 【０１４５】表10は、増加した攪拌速度及び延長された
攪拌時間がハンドシート形成に不都合な影響を与えるこ
とを示している。一層稀薄なそして増殖しないセルロー
ス培養物が使用された表11の結果は、ハンドシート形成
が表10に示されるほど攪拌及び時間に対して感受性でな
いことを示した。表11における一層良好な結果は、発酵
槽中の低いセルロース濃度又は高い目標シート重量に基
くであろう。 【０１４６】しかしながら、他の試験結果は、セルロー
スの性質が攪拌速度、及び第２のセットの実験の間の時
間により影響を受けることを示している。例えば、粘度
の分析は、800rpm及び 1000rpmにおける攪拌時間と共に
発酵槽中でのセルロース懸濁液の粘度が上昇することを
示す。粘度の上昇は、密度の高いペレットから密度の低
いパックされたファイバー様形状へのセルロースの形態
の変化を反映しているであろう。このような変化は、粒
子のサイズ及び形態を評価するために使用された光学顕
微鏡写真において観察された。 【０１４７】沈降速度の研究は、高速で又は長時間にわ
たって攪拌されたセルロースがよりゆっくりと沈降する
ことを示した。これらの結果は、攪拌速度及び時間の増
加と共にセルロース粒子が低密度にパックされた小さい
ファイバーになることを示す光学顕微鏡写真と一致し
た。沈降速度、粘度、粒子のサイズ及び形状、並びにハ
ンドシート形成の分析からの一般的結果は、すべて相互
に一致し、そしてある程度相関した。 【０１４８】攪拌の速度及び時間によるセルロースの性
質の変化の機構は現時点では完全には理解されていな
い。攪拌速度の増加がセルロース粒子に対する剪断応力
を増加せしめることが知られている。しかしながら、他
の力、例えば乱流渦応力(trubulent eddy stress) 及び
キャビテーション力、もまたセルロースの性質の変化に
寄与するであろう。さらに、上記の力及び応力並びに他
の因子も、セルロースの回収及び精製の間に働くであろ
う。従って、セルロース処理のすべての段階においてセ
ルロースに対する損傷を最小にするように注意を払わな
ければならない。 【０１４９】例15．セルロース生成物のＣ−13NMR 分析 攪拌条件下で生産された細菌性セルロース生成物の微細
構造（表12に示す）を試験しそして非攪拌条件下又は静
置培養条件下で生産された細菌性セルロースのそれと比
較した。ＮＭＲスペクトル分析はVanderhartら、Macrom
olecules 17 :1465−1472(1984)により記載されている
方法と実質的に同じ方法により行った。 【０１５０】すなわち、ＮＭＲスペクトル分析をＳ−10
0 NMR スペクトル計（General Electric Fremont(CA)
を用いて2.34Ｔにて行った。これは陽子について100.2M
Hz、そしてＣ−13について25.3MHz の周波数に対応す
る。クロス−ポラリゼーション時間は典型的には1.０〜
2.０msであった。 【０１５１】対応するラジオ周波数振幅は48kHz の回転
・フレームの正確な周波数においてHartmann Huhn マッ
チについてセットされ、そしてサンプルスピン周波数に
よりミスマッチでなかった。化学シフト参照に、ヘマチ
ルベンゼンのメチル炭素、共鳴が17.80ppmにおいて現わ
れるように両日運転周波数をセットすることにより達成
された。ローター材料は窒化硼素又は相安定化ジルコニ
アであった。 【０１５２】試薬されたサンプルについてのＮＭＲの結
果を表12及び表13に示す。これらは４種類の非攪拌アセ
トバクター培養物から、及び11種類のアセトバクター培
養物からのセルロース生成物から成る。表12及び表13中
のサンプル番号に対応する使用株及び培養条件を表14に
示す。 【０１５３】表12及び13は、静置培養又は攪拌培養され
た菌株からのサンプルのＮＭＲ分析により得られた形態
分布を示す。これらの結果が示すところによれば発酵槽
サンプル（攪拌）から製造されたセルロースと静置培養
からのそれとの比較において重要な差異が存在する。攪
拌されたサンプルの低い結晶化度（セルロースＩ）はＩ
α及びＩβスペクトルピーク並びに非晶質セルロースに
よるピークの量の実質的な変化により支持される。 【０１５４】特に注目すべきことは、すべての発酵槽サ
ンプルにセルロースIIが一貫して存在し、静置培養サン
プルには存在しないことである。さらに、長い発酵時間
及び高い剪断ストレスにかけられた２個の攪拌サンプル
（アセトバクター1306−11株に対応するサンプルＡ−07
0 及びＡ−071)において、セルロースの有動意な部分が
セルロースIIであり、セルロースIIの含量と培養中の攪
拌の量との間の関連性が示唆された。 【０１５５】さらに、攪拌培養と静置培養との比較にお
いて、Ｉα含量の一貫した差が存在した。さらに、攪拌
培養からのセルロースにおいて90ppm に高レベルの残留
シグナルが存在した。表12及び表13に示すように、この
方法は非品質セルロース含量の２つの測定値の間の非常
によい一致を与えた。 【０１５６】ＮＭＲ分析を用いてここで観察される相違
は個々のセルロース分子が一緒にパックされている状態
及び異る分子鎖間のコンホーメーションの相違を反映し
ているであろう。 【０１５７】 【表１２】 【０１５８】 【表１３】【０１５９】 【表１４】 【０１６０】 【結論及び寄託】細菌性セルロースが攪拌条件下で高い
効率で長時間にわたって生産される。従来、細菌性セル
ロースの長期生産は、困難と非常に低い生産性を伴って
いた。ここに開示される発明は、細菌性セルロースの発
酵生産における大きな利点を提供する。1306−３株、13
06−11株、及び1306−21株のサンプルは、特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約、及
びそれに基く規則の規定のもとにアメリカン・タイプ・
カルチュア・コレクション・12301 パークラウン・ドラ
イブ、ロックビル、メリーランド、米国20832 に寄託さ
れた。寄託日及び番号は次の通りである。 【０１６１】 【表１５】 【０１６２】これらの寄託は、ATCCとこの出願の出願人
であるシタス・コーポレーションとの間の契約により行
われた。ATCCとの契約は該菌株及びその子孫の永久的な
入手可能性を、該寄託を記載しそして特定している出願
に関する米国特許が発行された後又は米国もしくは外国
出願の公告もしくは公衆への公開の後、このいずれが早
く到来するにしても公衆に与え、そして、これらの菌株
又はその子孫の入手可能性を、35USC § 122及びこれに
基く長官規則(886 OG 638 への特別の言及を伴う37 CFR
§1.14を含む）に従って、米国特許・商標局長官により
権利を有すると決定された者に与える。この出願の出願
人は、寄託中の菌株が、適切な条件下で培養された場合
に失われ、死滅し又は破壊された場合には、通知の後速
やかに同じ株の生存培養物により置き換えることを承諾
した。 【０１６３】ブタペスト条件に基く寄託は、寄託された
その培養物が生存及び非汚染条件下で、寄託された微生
物のサンプルの分譲の最も新しい要求がATCCにより受理
された後少なくとも５年間、そしていかなる場合にも寄
託の日から少なくとも30年間、維持されるであろう。 【０１６４】寄託された微生物の入手可能性は、いずれ
かの政府の権威の下にその特許法により認められた権利
を侵害してこの発明を実施することの許諾であると解し
てはならない。 【０１６５】さらに、この発明の範囲は寄託された菌株
の範囲に限定されない。なぜなら、寄託された具体例は
単に、この発明の特定の観点の例示であると意図される
からである。寄託された株と機能的に同等なすべての微
生物株がこの発明の範囲に属する。さらに、この明細書
に示されそして記載された態様の他、これらの記載から
当業者にとって明らかな変法はこの発明の範囲に属す
る。この明細書に記載された情報に基いて、この発明の
範囲を逸脱することなく、種々の変法を行うことができ
よう。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ及びＢは、この発明の網状セルロース生成物
の巨視的構造を示す写真であり、繊維の構造を示す図面
に代る写真である。Ａは塩基抽出の前の生成物を示し、
そしてＢは塩基抽出及び精製の後のそれを示す。分割線
は約１mm間隔である。 【図２】非攪拌条件下で生産された非網状セルロース生
成物の5000倍の走査電子顕微鏡写真であって繊維の構造
を示す図面に代る写真である。 【図３】この発明の網状セルロースの5000倍の走査電子
顕微鏡写真であって繊維の構造を示す図面に代る写真で
ある。 【図４】非攪拌条件下で生産された非網状セルロース生
成物の10,150倍の走査電子顕微鏡写真であり繊維の構造
を示す図面に代る写真である。 【図５】網状セルロースの10,330倍の走査電子顕微鏡写
真であって繊維の構造を示す図面に代る写真である。
の巨視的構造を示す写真であり、繊維の構造を示す図面
に代る写真である。Ａは塩基抽出の前の生成物を示し、
そしてＢは塩基抽出及び精製の後のそれを示す。分割線
は約１mm間隔である。 【図２】非攪拌条件下で生産された非網状セルロース生
成物の5000倍の走査電子顕微鏡写真であって繊維の構造
を示す図面に代る写真である。 【図３】この発明の網状セルロースの5000倍の走査電子
顕微鏡写真であって繊維の構造を示す図面に代る写真で
ある。 【図４】非攪拌条件下で生産された非網状セルロース生
成物の10,150倍の走査電子顕微鏡写真であり繊維の構造
を示す図面に代る写真である。 【図５】網状セルロースの10,330倍の走査電子顕微鏡写
真であって繊維の構造を示す図面に代る写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３２６３
(72)発明者 ロバート ブルナー
アメリカ合衆国，カリフォルニア
94530，エル セルリト，ピー．オー.
ボックス 392
(72)発明者 ドナルド カーチス ジョンソン
アメリカ合衆国，ワシントン 98002,
オーバーン，サウス イースト，ワンハ
ンドレッドサーティフォース アベニュ
33936
(72)発明者 シャロン ペイン シューメイカー
アメリカ合衆国，カリフォルニア
94533，フェアフィールド，バーバンク
ドライブ 3173
(72)発明者 アマル ナス ナオギ
アメリカ合衆国，ワシントン 98125,
シアトル，ノースイースト，セブンティ
ーンス アベニュ 12531
(72)発明者 エホシュア アロニ
イスラエル国，クファル−サバ，ストリ
ート ナンバー ８
(56)参考文献 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．,
Ｖｏｌ．22，（1960）ｐ．25−39
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C08B 15/00
C12P 19/00 - 19/64
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．分岐する相互連結された三次元的に伸びるセルロー
スストランドの実質的に連続的な網状構造を形成するセ
ルロースストランドを特徴とする微生物的に生産された
網状セルロースであって、次の手段、すなわち： （ａ）攪拌培養条件下でセルロース生成物を生産するAT
CC 53264, ATCC 53263又はATCC 53524から得られる微生
物の能力を有するアセトバクター(Acetobacter) 属に属
する微生物を、１０リットル以上の培養容量でのインペ
ラー法、浮揚上昇法、エアー注入法もしくはポンプ駆動
循環法又はこれらの組合わせによる攪拌条件下で、セル
ロースの生産のために適当な液体培地中で、70時間以上
にわたって維持される 0.1ｇ／Ｌ／時以上の平均容積生
産性にて培養し、ここで前記微生物は固体培地でのセル
ロース非生産性コロニーの出現により決定した場合に攪
拌培養条件下でセルロース生産形からセルロース非生産
形に変化する頻度が42〜45世代にわたって 0.5％未満で
あり、そして （ｂ）得られた網状セルロース生成物を採取する、こと
により製造されたものである網状セルロース。 ２．シート形成手段によりシートに形成された場合、ア
セトバクター(Acetobacter) の静置増殖培養物中に生産
されるセルロースに比べて圧縮(densification) に対す
る耐性を有することを特徴とする、特許請求の範囲第１
項に記載のセルロース。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78899485A | 1985-10-18 | 1985-10-18 | |
| US78891585A | 1985-10-18 | 1985-10-18 | |
| US788994 | 1985-10-18 | ||
| US788915 | 1985-10-18 | ||
| US90008686A | 1986-08-28 | 1986-08-28 | |
| US900086 | 1986-08-28 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61246505A Division JPH0643443B2 (ja) | 1985-10-18 | 1986-10-18 | 網状セルロ−ス生成物及び微生物によるその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10310601A JPH10310601A (ja) | 1998-11-24 |
| JP3089269B2 true JP3089269B2 (ja) | 2000-09-18 |
Family
ID=27419862
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61246505A Expired - Lifetime JPH0643443B2 (ja) | 1985-10-18 | 1986-10-18 | 網状セルロ−ス生成物及び微生物によるその製造方法 |
| JP3091779A Expired - Lifetime JPH0732703B2 (ja) | 1985-10-18 | 1991-01-29 | セルロース生産性微生物 |
| JP10095213A Expired - Lifetime JP3089269B2 (ja) | 1985-10-18 | 1998-03-25 | 網状セルロース |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61246505A Expired - Lifetime JPH0643443B2 (ja) | 1985-10-18 | 1986-10-18 | 網状セルロ−ス生成物及び微生物によるその製造方法 |
| JP3091779A Expired - Lifetime JPH0732703B2 (ja) | 1985-10-18 | 1991-01-29 | セルロース生産性微生物 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0228779B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0643443B2 (ja) |
| AT (1) | ATE78059T1 (ja) |
| AU (1) | AU596812B2 (ja) |
| CA (1) | CA1335266C (ja) |
| DE (1) | DE3685952T2 (ja) |
| DK (1) | DK499186A (ja) |
| ES (1) | ES2041643T3 (ja) |
| FI (1) | FI90992C (ja) |
| IE (1) | IE59032B1 (ja) |
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