CN1978639A - 固定化菌体的制备方法及其应用 - Google Patents

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沈薇
宁长发
高力虎
孟广荣
李新柱
梁广
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Abstract

本发明公开了一种固定化菌体的制备方法。其步骤为：丝瓜海绵体的制备，即成熟丝瓜晒干后除去外皮得到丝瓜海绵体纤维，然后将其剪成圆盘，放入沸水中煮后，洗净、在蒸馏水中浸泡，将充分浸泡的海绵体圆盘干燥；孢子的制备，将木霉接种到斜面培养基上，在20～40℃培养3～5天，形成孢子备用；菌悬液的制备，将孢子用生理盐水配制成菌悬液；菌体的固定化，将菌悬液接种于装有利于菌丝体萌发的培养基和海绵体圆盘的锥形瓶中，20～30℃下100～200rpm培养2～3天得到固定化菌体。本发明的优点为：丝瓜海绵体孔隙率高，菌丝体固定其上不产生致密缠绕，能高效吸附废水中重金属；丝瓜海绵体是一种天然多孔状纤维，不含有害物质，不会对水体造成二次污染。

Description

固定化菌体的制备方法及其应用
一技术领域
本发明涉及重金属废水生物修复技术，特别是一种固定化菌体的制备方法及其应用。
二背景技术
传统的处理重金属的物理化学方法很多，如化学沉淀法、离子交换法、电解法、反渗透法、萃取法、活性炭吸附法、膜分离法等。它们各有优点，但不同程度地存在着投资大、能耗高、操作困难、易产生二次污染等缺点，特别是在处理低含量重金属污染时，其操作费用和原材料成本相对过高。随着生物技术的发展，20世纪80年代以来重金属废水的微生物去除研究受到越来越多的关注。由于生物吸附剂具有制作简单、可利用廉价的营养基质进行大量的生产、吸附量大、处理费用低、对环境友好、效率高等优点，越来越受到人们的广泛关注。其中选择高效的生物吸附剂是微生物修复重金属废水的关键。
然而吸附了大量金属的游离菌体很难从水溶液中分离出来，在实际应用中受到限制。而固定化菌体则将微生物固定在固体多孔状结构的材料上，使之具有适合在反应器中使用的一定直径、机械强度和必要的孔隙率，像离子交换树脂和活性炭一样可以重复使用。生物固定化材料在吸附和解吸的过程中重复使用可以极大的提高生物技术应用的经济价值。常用的固定化技术主要有吸附、包埋、交联等；固定剂有硅胶、戊二醛、明胶等。通常这类材料固定化后会使菌株的活性降低20～30％，且固定化成本高、工艺复杂。
三发明内容
本发明的目的在于提供一种能高效吸附废水中重金属的固定化菌体的制备方法。
实现本发明目的的技术解决方案：一种固定化菌体的制备方法，包括以下步骤：
1.1丝瓜海绵体的制备，即成熟丝瓜晒干后除去外皮得到丝瓜海绵体纤维，然后将丝瓜海绵体纤维剪成圆盘，放入沸水中煮后，洗净、在蒸馏水中浸泡，将充分浸泡的海绵体圆盘干燥，并保存在干燥器中；
1.2孢子的制备，将木霉接种到斜面培养基上，在20～40℃培养3～5天，形成孢子备用；
1.3菌悬液的制备，将孢子用尘理盐水配制成菌悬液；
1.4菌体的固定化，将菌悬液接种于锥形瓶中，锥形瓶中装有利于菌丝体萌发的培养基和1.1步骤制备的海绵体圆盘，20～30℃下100～200rpm培养2～3天得到固定化菌体。
本发明固定化菌体的制备方法中，将木霉接种到斜面培养基后，在28～30℃下培养。
本发明固定化菌体的制备方法中，木霉为绿色木霉。
本发明固定化菌体的制备方法中，斜面培养基为马铃薯培养基。
本发明固定化菌体的制备方法中，利于菌丝体萌发的培养基为：葡萄糖5～15g，Na2HPO40.5～5g，KaH2PO40.1～2g，MgSO4·7H2O0.1～0.5g，CaCl2·2H2O0.1～0.5g，加水至1000mL，pH自然，灭菌。
按上述方法制备的固定化菌体的应用，固定化菌体去除废水中的重金属。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：(1)丝瓜海绵体孔隙率高、表面积大，菌丝体固定其上不产生致密缠绕，因而体系不存在扩散的限制，不会造成固定化后菌体吸附重金属离子活性的大幅度下降，因此能高效吸附废水中的重金属；(2)丝瓜海绵体是一种天然多孔状纤维，不含有害物质，不会对水体造成二次污染；(3)选用丝瓜海绵体作为菌体固定化载体，原料来源丰富，容易加工，价格低廉，固定化工艺简单。
四附图说明
附图是本发明去除废水中重金属的固定化菌体的制备方法的流程图。
五具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
结合附图，本发明固定化菌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)丝瓜海绵体制备：将成熟丝瓜晒干后除去外皮部分，即可得到丝瓜海绵体。然后将海绵体纤维剪成直径大约为2.5cm的圆盘，2～3mm厚，在沸水中煮30min，自来水冲干净后，在蒸馏水中浸泡24h，换蒸馏水3～4次。将充分浸泡的海绵体圆盘于70℃烘干，并保存于干燥器中。
(2)斜面培养：将绿色木霉接种到斜面培养基上，在28～30℃培养3～5天，待孢子形成备用。其中，斜面培养基为马铃薯培养基，用常规方法制备马铃薯培养基，即马铃薯去皮，切成小块，煮沸30min，然后用纱布过滤，在上清液中加20g蔗糖，加15g琼脂，加水至1000mL，pH自然，121℃下灭菌30min。
(3)菌悬液的制备：将孢子用生理盐水(蒸馏水或去离子水)配成孢子浓度约为106个/mL的菌悬液；
(4)菌体的固定化：菌悬液(5mL)接种于250mL的锥形瓶，锥形瓶中装有100mL利于菌丝体萌发的培养基和(1)步骤制备的4个预称重的海绵体圆盘。其中海绵体圆盘作为固定化的载体。接种后30℃，150rpm培养72h得到固定化菌体。收获菌体或圆盘后用蒸馏水洗涤两次，4℃保藏。将菌丝体生长后的海绵体圆盘于70℃烘干8h后称重，减去丝瓜海绵体圆盘的重量，即为固定化的菌体干重。其中，利于菌丝体萌发的培养基的制备(单位：g/L)，即葡萄糖10，Na2HPO40.25，KaH2PO40.2，MgSO4·7H2O0.5，CaCl2·2H2O0.1，加水至1000mL，pH自然，115℃灭菌30min。
将制备的上述固定化菌体用于重金属吸附：取一个固定化圆盘接种于250mL的锥形瓶(含100mL生长培养基，培养基组成同上)中，添加重金属离子Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+使浓度达100mg/L，30℃、150rpm，振荡吸附6h，去除废水中的重金属；测定吸附后重金属离子浓度，得到吸附量分别为743、187、358、134mg/g。连续流反应器处理分别含100mg/L的Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+废水：反应器外径30mm，内径26mm，填料高度为60mm，有效容积31.83cm3，孔隙体积13.26cm3。其中，待处理废水为人工配制废水，水质特征如下(g/L)：KH2PO41.0，Na2HPO40.50，MgSO4·7H2O0.01，CaCl20.002，Na2SO40.01，NaNO30.01，pH5.5～6.0。进水方式为升流式，流速约为3.2ml/h，运行1天后采样。运行温度为25℃左右。反应器运行16天，每隔24h采水样5mL，测定Pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+浓度。

Claims (7)

1、一种固定化菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1.1丝瓜海绵体的制备，即成熟丝瓜晒干后除去外皮得到丝瓜海绵体纤维，然后将丝瓜海绵体纤维剪成圆盘，放入沸水中煮后，洗净、在蒸馏水中浸泡，将充分浸泡的海绵体圆盘干燥，并保存在干燥器中；
1.2孢子的制备，将木霉接种到斜面培养基上，在20～40℃培养3～5天，形成孢子备用；
1.3菌悬液的制备，将孢子用生理盐水配制成菌悬液；
1.4菌体的固定化，将菌悬液接种于锥形瓶中，锥形瓶中装有利于菌丝体萌发的培养基和1.1步骤制备的海绵体圆盘，20～30℃下100～200rpm培养2～3天得到固定化菌体。
2、根据权利要求1所述的固定化菌体的制备方法，其特征在于将木霉接种到斜面培养基后，在28～30℃下培养。
3、根据权利要求1或2所述的固定化菌体的制备方法，其特征在于木霉为绿色木霉。
4、根据权利要求1所述的固定化菌体的制备方法，其特征在于斜面培养基为马铃薯培养基。
5、根据权利要求1所述的固定化菌体的制备方法，其特征在于利于菌丝体萌发的培养基为：葡萄糖5～15g，Na2HPO40.5～5g，KaH2PO40.1～2g，MgSO4·7H2O0.1～0.5g，CaCl2·2H2O0.1～0.5g，加水至1000mL，pH自然，灭菌。
6、一种固定化菌体的应用，其特征在于固定化菌体去除废水中的重金属。
7、根据权利要求6所述的固定化菌体的应用，其特征在于固定化菌体吸附废水中的重金属离子pb2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+。
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