CN108373976A - 一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，每次制备液体菌种的数量大大提高，比原来的摇床振荡法高出6～7倍；易于控制，液体菌种的制备成功率高；发酵罐的水循环降温及温度电控，可以很好的控制液体菌种的制备温度，从而确保液体菌种制备的效率和成功率；此方法制备的液体菌种具有密度大、菌球多、活力强等优点。
Description
技术领域
本发明属于食用菌液体制种技术领域，具体涉及一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法。
背景技术
传统的蛹虫草液体菌种制备一般都是摇床振荡法，其缺点有：一、制备量少，一台摇床只能放1000ml的三角瓶9～10个，每瓶盛装菌液500ml。总共只能制备液体菌种4500～5000ml。二、摇床转速不好控制，过快、过慢均对菌种的制备质量造成很大影响，直接影响菌种制备的成功率。三、受室内环境温度影响大，因三角瓶内液体量少，对室内温度的恒定有较高的要求。室温偏差大，也直接影响菌种制备的成功率。四、由于三角瓶内部空间有限，导致溶氧量不足，因此菌种制备时间长，效率低。摇床震荡法需7天时间才能完成液体菌种的制备。
经过专利文献检索：申请号201510882932.8《蛹虫草液体菌种吹氧发酵制备法》，种子液制备方法与本发明不同，其次，该发明未说明发酵终点的判断方法，只是以发酵时间作为发酵终点的唯一判定点，不够准确。申请号201310300068.7《一种液体深层发酵制备的蛹虫草保健饮料及制备方法》公开一种液体深层发酵制备的蛹虫草保健饮料及其制备方法，经母种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐发酵培养、发酵罐发酵培养等五步，与本发明的母种培养、一级摇瓶种子培养、发酵罐发酵培养三步不同，且在接种量、罐压、装液量等关键工艺要求上也不一致。
经专利文献检索，没有和本发明重叠的“一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法”，所以提出本发明方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，达到一次制备液体菌种量高、提高蛹虫草液体菌种的制备成功率、提高蛹虫草栽培行业的生产效率，实现工业化生产的目的。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
（1）母种活化
将蛹虫草菌种接种到试管母种培养基中，于23～25℃恒温培养箱中培养8～10天，获
得活化的蛹虫草菌；
所述的蛹虫草菌种是采用生长正常、健壮、无病虫害的新鲜野生蛹虫草作为分离材料，
经消毒后切取得到的小菌块；或是采用国内各名优食用菌研究所购进的蛹虫草菌种；
所述的母种培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水
煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖24克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1.0克、琼脂20克、维生素B11.0克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30 分钟，待温度降至25℃以下后使用；
（2）一级摇瓶种子培养
将从活化的蛹虫草菌菌体上切取得到的菌块转接至装有一级摇瓶培养基的三角瓶中，静置培养2天，然后置于摇床上，于19～20℃、100～120转/分钟震荡培养5～7天，得到一级摇瓶菌种液；
所述的一级摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖10克、蛋白胨2克、蚕蛹粉10g、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1.0克、维生素B11.0克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，将配好的培养基分装于三角瓶中，装料量为三角瓶容量的1/4～1/2，用棉塞和牛皮纸扎封瓶口，于121℃高压灭菌25～30分钟，待温度降至25℃以下后使用 ；
（3）发酵罐空消
往发酵罐内加入纯净水至观察镜上方即可，同时加热夹层注入纯净水至夹层观察镜镜面2/3处，将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，空消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
（4）发酵罐实消
根据发酵罐容积及装料系数称取所需培养料，完成后混匀并加水至指定液位；
将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，实消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，并进入保温程序，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，夹层通入自来水，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
所述的发酵罐发酵培养培养基配制方法：葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、酵母粉0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸二氢钾0.05%、VB1 添加量为每1L培养基加入2片；
（5）发酵罐接种培养
将发酵罐出气阀关小，保证罐体有一定的压力，在接种圈上绑一圈脱脂棉，用酒精浸润脱脂棉，然后把接种圈套在接种口上方，用工具拧动接种阀至松动，用打火机将脱脂棉点燃，拧开接种阀，拿到火焰上方，迅速将一级摇瓶菌种在火焰上方打开并倒入发酵罐内，然后将接种阀迅速拧紧在接种口上，调整出气阀至合适的罐压；
（6）发酵液检查
发酵24h后，可以通过闻罐体排气阀排出的气味，如果有异味，则出现污染，立即停止发酵并进行空消，找出染菌原因；
发酵3天后可从观察镜口看菌球形成情况，并定时取样进行镜检和pH检查，检查是否染菌和pH值，待发酵液pH值到指定范围时终止发酵。
所述的发酵罐为气升式发酵罐。
所述发酵终止指标为发酵液pH达到4.0～5.0。
所述发酵罐的装料系数为60～65%。
所述一级摇瓶菌种需革兰氏染色后镜检合格才能用于接种。
所述发酵罐接种所需一级摇瓶菌种量为发酵罐装液量的8～10%。
所述发酵罐培养蛹虫草菌种的罐压为0.02-0.04Mpa。
本发明的有益效果在于：本发明公开的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，每次制备液体菌种的数量大大提高，比原来的摇床振荡法高出6～7倍；易于控制，液体菌种的制备成功率高；发酵罐的水循环降温及温度电控，可以很好的控制液体菌种的制备温度，从而确保液体菌种制备的效率和成功率；此方法制备的液体菌种密度大、菌球多、活力强等优点。
具体实施方式
实施例1：
本实施例一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法如下实施步骤：
（1）母种活化
将蛹虫草菌种接种到试管母种培养基中，于23～25℃恒温培养箱中培养8～10天，获
得活化的蛹虫草菌；
所述的蛹虫草菌种是采用生长正常、健壮、无病虫害的新鲜野生蛹虫草作为分离材料，
经消毒后切取得到的小菌块；或是采用国内各名优食用菌研究所购进的蛹虫草菌种；
所述的母种培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水
煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖24克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1.0克、琼脂20克、维生素B11.0克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌30 分钟，待温度降至25℃以下后使用；
（2）一级摇瓶种子培养
将从活化的蛹虫草菌菌体上切取得到的菌块转接至装有一级摇瓶培养基的三角瓶中，静置培养2天，然后置于摇床上，于19℃、120转/分钟震荡培养5天，得到一级摇瓶菌种液，取样经革兰氏染色后镜检无杂菌才能用于发酵罐接种；
一级摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯600克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨6克、蚕蛹粉30g、磷酸二氢钾1.5克、硫酸镁3.0克、维生素B13.0克，加蒸馏水定容至3000毫升，pH自然，将配好的培养基分装于三角瓶中，装料量为三角瓶容量的1/2，共6瓶，用棉塞和牛皮纸扎封瓶口，于121℃高压灭菌30分钟，待温度降至25℃以下后使用 ；
（3）发酵罐空消
发酵罐为50L气升式发酵罐，加热原理是在夹层里装一圈电加热丝，电加热产生蒸汽。
往发酵罐内加入纯净水至观察镜上方即可，同时加热夹层注入纯净水至夹层观察镜镜面2/3处，将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，空消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
（4）发酵罐实消
发酵罐装料60%，即为30L；
发酵罐发酵培养培养基配制方法：葡萄糖0.6kg、蛋白胨0.09kg、酵母粉0.15、硫酸镁0.03 kg、磷酸二氢钾0.015kg、VB160片，将培养料混匀并加水至指定液位；
将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，实消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，并进入保温程序，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，夹层通入自来水，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
（5）发酵罐接种培养
将发酵罐出气阀关小，保证罐体有一定的压力，在接种圈上绑一圈脱脂棉，用酒精浸润脱脂棉，然后把接种圈套在接种口上方，用工具拧动接种阀至松动，用打火机将脱脂棉点燃，拧开接种阀，拿到火焰上方，迅速将6瓶镜检合格一级摇瓶菌种在火焰上方打开并倒入发酵罐内，然后将接种阀迅速拧紧在接种口上，调整出气阀罐压至0.02Mpa；
（6）发酵液检查
发酵24h后，通过闻罐体排气阀排出的气味，未发现有异味；
发酵3天后可从观察镜口看到大量菌球生成，并取样进行镜检后合格，说明发酵未染菌，pH检查后pH值为5.5，可以继续发酵；
发酵4天后进行pH检查，pH值为4.5，发酵终止，可以作为生产种进行生产。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）母种活化
将蛹虫草菌种接种到试管母种培养基中，于23～25℃恒温培养箱中培养8～10天，获
得活化的蛹虫草菌；
所述的蛹虫草菌种是采用生长正常、健壮、无病虫害的新鲜野生蛹虫草作为分离材料；
经消毒后切取得到的小菌块；或是采用国内各名优食用菌研究所购进的蛹虫草菌种；
所述的母种培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水
煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖24克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1.0克、琼脂20克、维生素B11.0克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30 分钟，待温度降至25℃以下后使用；
（2）一级摇瓶种子培养
将从活化的蛹虫草菌菌体上切取得到的菌块转接至装有一级摇瓶培养基的三角瓶中，静置培养2天，然后置于摇床上，于19～20℃、100～120转/分钟震荡培养5～7天，得到一级摇瓶菌种液；
所述的一级摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖10克、蛋白胨2克、蚕蛹粉10g、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1.0克、维生素B11.0克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，将配好的培养基分装于三角瓶中，装料量为三角瓶容量的1/4～1/2，用棉塞和牛皮纸扎封瓶口，于121℃高压灭菌25～30分钟，待温度降至25℃以下后使用；
（3）发酵罐空消
往发酵罐内加入纯净水至观察镜上方即可，同时加热夹层注入纯净水至夹层观察镜镜面2/3处，将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，空消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
（4）发酵罐实消
根据发酵罐容积及装料系数称取所需培养料，完成后混匀并加水至指定液位；
将发酵罐温度控制器设定加热温度121℃，通电开始加热；
温度达到121℃时开始计时，并从夹层通蒸汽给管道、蒸汽过滤器、空气过滤器灭菌，30min即可，30min到后，关闭夹层出蒸汽阀，开启空气进气阀，将管路及滤芯吹干，时间30min，吹滤芯时间到点后，实消的1h时间也到点了，设定温度控制器至19℃，电加热器自动关闭，并进入保温程序，通过开大罐体出气阀及夹层排气阀，待夹层没有压力及温度降至100℃以下时，夹层通入自来水，通入无菌空气开启搅拌冷却至19℃即可；
所述的发酵罐发酵培养培养基配制方法：葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、酵母粉0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸二氢钾0.05%、VB1 添加量为每1L培养基加入2片；
（5）发酵罐接种培养
将发酵罐出气阀关小，保证罐体有一定的压力，在接种圈上绑一圈脱脂棉，用酒精浸润脱脂棉，然后把接种圈套在接种口上方，用工具拧动接种阀至松动，用打火机将脱脂棉点燃，拧开接种阀，拿到火焰上方，迅速将一级摇瓶菌种在火焰上方打开并倒入发酵罐内，然后将接种阀迅速拧紧在接种口上，调整出气阀至合适的罐压；
（6）发酵液检查
发酵24h后，可以通过闻罐体排气阀排出的气味，如果有异味，则出现污染，立即停止发酵并进行空消，找出染菌原因；
发酵3天后可从观察镜口看菌球形成情况，并定时取样进行镜检和pH检查，检查是否染菌和pH值，待发酵液pH值到指定范围时终止发酵。
2.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述的发酵罐为气升式发酵罐。
3.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述发酵终止指标为发酵液pH达到4.0～5.0。
4.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述发酵罐的装料系数为60～65%。
5.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述一级摇瓶菌种需革兰氏染色后镜检合格才能用于接种。
6.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述发酵罐接种所需一级摇瓶菌种量为发酵罐装液量的8～10%。
7.根据权利要求1所述的一种深层发酵制备蛹虫草菌种的生产方法，其特征在于：所述发酵罐培养蛹虫草菌种的罐压为0.02-0.04Mpa。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20180807 |