WO2019009130A1 - ガラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

ガラクトオリゴ糖の製造方法 Download PDF

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伊藤　雅彦
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    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing galactooligosaccharides using ⁇ -galactosidase, more specifically, by causing ⁇ -galactosidase to act on a substrate in the presence of a specific metal ion at a predetermined concentration to obtain trisaccharides or more.
  • the present invention relates to a method for improving the amount and reaction rate of galactooligosaccharides.
  • ⁇ -galactosidase catalyzes galactosyl transfer as well as hydrolysis of ⁇ -D-galactoside bonds such as lactose, and produces galactooligosaccharides to selectively grow bifidobacteria in the intestine. Is used for
  • Products obtained by galactosyl transfer reaction using ⁇ -galactosidase include trisaccharides such as ⁇ -D-galactopyranosyl (1-4) ⁇ -D-galactopyranosyl-D glucose (4'-GL)
  • trisaccharides such as ⁇ -D-galactopyranosyl (1-6) -D-glucose
  • trisaccharides are preferable from the viewpoint of improvement of the bifidobacteria growth promoting effect, etc.
  • a technique to further increase the amount of galactooligosaccharides produced above. Further, from the viewpoint of reduction of production cost and improvement of production efficiency, it is important to shorten the reaction time until the production amount of galactooligosaccharide having three or more sugars becomes maximum, and a method for improving the reaction rate is desired ing.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing galactooligosaccharides using ⁇ -galactosidase, in which the amount and reaction rate of galactooligosaccharides having three or more saccharides are improved.
  • the present inventors have found that by reacting ⁇ -galactosidase with a substrate in the presence of sodium and magnesium ions in a specific concentration range, trisaccharides or more can be obtained.
  • the inventors have found that the production amount of galactooligosaccharide can be increased and the reaction time until the production amount reaches the maximum can be shortened, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a method for producing galactooligosaccharides characterized in that ⁇ -galactosidase is reacted with a substrate in the presence of 5 to 60 mM sodium ion and 0.5 to 8 mM magnesium ion.
  • the production method of the present invention it is possible to increase the amount of production of galactooligosaccharides having three or more sugars, to improve the reaction rate, and to shorten the reaction time to reach the maximum amount of formation. . Therefore, galactooligosaccharides having three or more sugars can be efficiently produced at low cost.
  • the method for producing galactooligosaccharide of the present invention is characterized in that ⁇ -galactosidase is reacted with a substrate in the presence of 5 to 60 mM sodium ion and 0.5 to 8 mM magnesium ion.
  • the galactooligosaccharides include three or more galactooligosaccharides represented by the general formula Gal- (Gal) n-Glc (Gal is a galactose residue, Glc is glucose, and n is an integer of 1 to 6).
  • ⁇ -galactosidase is an enzyme that catalyzes a reaction of hydrolyzing ⁇ -galactoside bonds such as lactose and o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside, and a galactosyl transfer reaction.
  • the ⁇ -galactosidase used in the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of improvement in the amount of reaction and reaction rate of galactooligosaccharides having three or more sugars, genus Kluyveromyces, genus Streptococcus, and lactobacilli.
  • Those derived from microorganisms belonging to the genus Lactobacillus, Bifidobacterium or Bacillus are preferably used, and more preferably Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Streptococcus thermosis.
  • Filth Streptococcus thermophilus
  • Lacto Those derived from Lactobacillus bulgaricus and Bifidobacterium breve are preferred, and ⁇ -galactosidase derived from a microorganism belonging to the genus Kleberomyces is particularly preferred, and ⁇ -galactosidase derived from Kleberomyces is further preferred. .
  • ⁇ -galactosidase for example, GODO-YNL (made by Joint Shusei Co., Ltd.), maxilacto LG 5000 (made by DSM) from Kluyveromyces lactis, Lactozyme 3000 L from Kluyveromyces fragilis, etc. (Manufactured by Novozymes), Lactase Y-ST (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) derived from Streptococcus thermophilus, and the like can be mentioned.
  • GODO-YNL made by Joint Shusei Co., Ltd.
  • maxilacto LG 5000 made by DSM
  • Lactozyme 3000 L from Kluyveromyces fragilis
  • Lactase Y-ST manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the form of the microorganism having ⁇ -galactosidase activity or the form of ⁇ -galactosidase derived from the microorganism is not particularly limited.
  • a microorganism having ⁇ -galactosidase activity when using a microorganism having ⁇ -galactosidase activity, it is cultured according to a known culture method of a microorganism, and the obtained culture solution is used as it is or, if necessary, known centrifugation, membrane treatment, drying, crushing, etc.
  • the solution is subjected to the treatment of (1) and used as a cell concentrate or pellet, a dried cell, a cell lysate or the like.
  • the cells may be viable cells, or may be treated with an organic solvent, freeze-dried or the like to make them dead.
  • ⁇ -galactosidase derived from a microorganism having ⁇ -galactosidase activity purification conditions and the degree of purification are not particularly limited, and general purification techniques can be used. After culturing the microorganism according to a known method, the cells are separated by separation means such as centrifugation and membrane treatment, and if the culture supernatant contains ⁇ -galactosidase, this is collected and the crude enzyme solution can do. When ⁇ -galactosidase is contained in the cells, the extract is obtained physically by disrupting the cells with a homogenizer or sonication, or enzymatically treating the cells with a cell wall lytic enzyme or the like.
  • Crude solutions may be combined as appropriate by combining ammonium sulfate precipitation treatment, dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography and the like to obtain a highly purified purified enzyme solution.
  • the substrate on which the above-mentioned ⁇ -galactosidase is caused to act there are cases where it is a single substrate acting as both an acceptor and a donor of galactosyl group, and when an acceptor and a donor of galactosyl group separately coexist. included.
  • a substrate serving as a donor of a galactosyl group include lactose, o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside and the like.
  • a substrate serving as a galactosyl group acceptor lactose, galactooligosaccharide, glucose, glycerol and the like can be mentioned.
  • the concentration of the substrate is appropriately set according to the type and the like, but when using lactose, for example, the concentration is 5 to 65% by mass from the viewpoint of the effect of improving the formation amount and formation rate of galactooligosaccharides of three or more sugars. It is preferably present, and more preferably 15 to 60% by mass.
  • the amount of ⁇ -galactosidase added can be appropriately adjusted according to the desired reaction time, but is preferably 10 to 1000 U, more preferably 30 to 800 U, per gram of lactose.
  • the reaction temperature and the like can be appropriately set in accordance with the optimum temperature and the like of ⁇ -galactosidase to be used. For example, when ⁇ -galactosidase derived from C.
  • the reaction temperature is preferably 30 to 50 ° C., and more preferably 40 to 50 ° C.
  • the measurement of the enzyme activity (U) is as follows. [Method for measuring ⁇ -galactosidase enzyme activity (U)] 0.5 mL of diluted enzyme sample was taken in a test tube, and 100 mM KH 2 PO 4 -NaOH buffer solution (pH 6.5, hereinafter referred to as “buffer”) to which manganese chloride was added to be 0.1 mM Is added and mixed, and then incubated at 37 ° C. for 3 minutes.
  • buffer 100 mM KH 2 PO 4 -NaOH buffer solution
  • the above-mentioned ⁇ -galactosidase is reacted with a substrate in the presence of sodium ion and magnesium ion.
  • concentration of sodium ion in the reaction system is 5 to 60 mM.
  • concentration of magnesium ion is 0.5 to 8 mM, more preferably 1.5 to 8 mM.
  • sodium ions and magnesium ions can be added to the reaction system in the form of a solid or buffer solution such as chlorides, carbonates, acetates, phosphates and the like, and from the point of little change in pH after addition, chloride Sodium and magnesium chloride are preferred.
  • the galactosyl transfer reaction by ⁇ -galactosidase is in competition with the substrate hydrolysis reaction. Therefore, when ⁇ -galactosidase is allowed to act on the substrate, the desired galactooligosaccharide is produced, and glucose and galactose are produced by the competing hydrolysis reaction. Such monosaccharides are produced, and once produced, galactooligosaccharides are also hydrolyzed.
  • the galactosyl transfer reaction between a specific donor and an acceptor It is difficult to control to produce the desired galactooligosaccharides.
  • the galactosyl transfer reaction between a specific donor and an acceptor It is difficult to control to produce the desired galactooligosaccharides.
  • the amount of galactooligosaccharides of, among others, galactooligosaccharides is increased. Further, since the reaction rate can be further increased to shorten the time to reach the maximum production amount, galactooligosaccharides having three or more sugars can be efficiently produced at low cost.
  • the method of the present invention is also applicable to secondary reactions in the preparation of galactooligosaccharides by sequential reactions in which two ⁇ -galactosidases are allowed to act. That is, after reacting a microorganism having ⁇ -galactosidase activity or ⁇ -galactosidase derived from the microorganism with a substrate as a primary reaction, 5 to 60 mM of ⁇ -galactosidase different from that used in the primary reaction is used as a secondary reaction.
  • the primary reaction solution in the presence of sodium ions of 0.5 to 8 mM and magnesium ions of 0.5 to 8 mM, the amount of unreacted substrate can be decreased and the amount of galactooligosaccharides can be increased.
  • microorganism having ⁇ -galactosidase activity used in the primary reaction for example, microorganisms belonging to Sporobolomyces (Sporobolomyces), Aspergillus (Aspergillus), and Bacillus (Bacillus) are preferable, and in particular, the genus belongs to Sporoboromyces. Microorganisms are preferred, and Sporobolomyces singularis is more preferred from the viewpoint of improvement in the amount and reaction rate of galactooligosaccharides having three or more sugars.
  • the form of the microorganism having ⁇ -galactosidase activity or the form of ⁇ -galactosidase derived from the microorganism used in the primary reaction is not particularly limited, and, for example, culture fluid, bacterial cells obtained by concentrating the culture fluid by centrifugation, membrane treatment, etc. Concentrates or pellets, dried cells, disrupted cells, crude enzyme solution, purified enzyme solution, enzyme powder and the like can be mentioned, and these are prepared according to known methods.
  • a microorganism having ⁇ -galactosidase activity when using a microorganism having ⁇ -galactosidase activity, it is cultured according to a known culture method of a microorganism, and the obtained culture solution is used as it is or, if necessary, known centrifugation, membrane treatment, drying, crushing, etc.
  • the solution is subjected to the treatment of (1) and used as a cell concentrate or pellet, a dried cell, a cell lysate or the like.
  • the cells may be viable cells, or may be treated with an organic solvent, freeze-dried or the like to make them dead.
  • ⁇ -galactosidase derived from a microorganism having ⁇ -galactosidase activity purification conditions and the degree of purification are not particularly limited, and general purification techniques can be used. After culturing the microorganism according to a known method, the cells are separated by separation means such as centrifugation and membrane treatment, and if the culture supernatant contains ⁇ -galactosidase, this is collected and the crude enzyme solution can do. When ⁇ -galactosidase is contained in the cells, the extract is obtained physically by disrupting the cells with a homogenizer or sonication, or enzymatically treating the cells with a cell wall lytic enzyme or the like.
  • Crude solutions may be combined as appropriate by combining ammonium sulfate precipitation treatment, dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography and the like to obtain a highly purified purified enzyme solution.
  • the microorganism having the above-mentioned ⁇ -galactosidase activity or ⁇ -galactosidase derived from the microorganism is reacted with a substrate such as lactose.
  • the reaction conditions can be appropriately set according to the properties of the microorganism having ⁇ -galactosidase activity to be used or the ⁇ -galactosidase derived from the microorganism. For example, when S.
  • the concentration of lactose is 10 to 60 mass in terms of the effect of improving the amount and rate of formation of galactooligosaccharides. % Is preferable, and 40 to 50% by mass is more preferable.
  • the amount of Sporobolomyces cyngularis added is preferably 0.03 to 0.3 U, and more preferably 0.2 to 0.3 U per 1 g of lactose.
  • the reaction temperature is about 30 to 70 ° C., and the reaction may be performed for about 24 to 96 hours.
  • the primary reaction solution obtained in the primary reaction is reacted with ⁇ -galactosidase different from that used in the primary reaction in the presence of sodium ions and magnesium ions in a specific concentration range.
  • the ⁇ -galactosidase used in the secondary reaction is not particularly limited, but from the viewpoint of improving the amount of reaction and the reaction rate of galactooligosaccharides having three or more sugars, the genus Kluyveromyces, Streptococcus, Those derived from a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, Bifidobacterium or Bacillus are preferably used, and more preferably Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Streptococcus Thermophilus (Streptococcus thermophilus), Those derived from Lactobacillus bulgaricus and Bifidobacterium breve are preferred, and ⁇ -galactosidase derived from a microorganism belonging to the genus Kleberomyces is particularly preferred, and ⁇ -galactosidase derived from Kleberomyces is further preferred. .
  • the concentration of sodium ion in the secondary reaction solution is 5 to 60 mM.
  • the concentration of magnesium ion is 0.5 to 8 mM, more preferably 1.5 to 8 mM.
  • the load for desalting and purifying galactooligosaccharides becomes large, which is not preferable.
  • the presence of sodium ions and magnesium ions in such a concentration range can improve the production amount and production efficiency of galactooligosaccharides.
  • Sodium ions and magnesium ions can be added to the reaction system in the form of solid or buffer solutions such as chlorides, carbonates, acetates, phosphates and the like, and from the point of little change in pH after addition, chloride Sodium and magnesium chloride are preferred.
  • the concentration of residual lactose in the primary reaction solution is preferably 5 to 65% by mass, and more preferably 15 to 60% by mass, from the viewpoint of the improvement in the amount of galactooligosaccharides having three or more sugars and the reaction rate.
  • the amount of ⁇ -galactosidase added is preferably 10 to 1000 U, more preferably 30 to 800 U, per gram of remaining lactose.
  • the reaction temperature and the like can be appropriately set in accordance with the optimum temperature and the like of ⁇ -galactosidase to be used. For example, when .beta.-galactosidase derived from C. lactis is used, the reaction temperature is preferably 30 to 50.degree. C., and more preferably 40 to 50.degree. C., from the viewpoint of the improvement of the amount and rate of formation of galactooligosaccharides of three or more sugars. .
  • the reaction solution in which the galactooligosaccharide is produced as described above is used as it is or is appropriately decolorized with activated carbon, filtered with diatomaceous earth, desalted with ion exchange resin, concentrated with a concentrator, or as a liquid sugar, or a spray drier
  • it can be used as it is as table sugar, or it can be added to food and drink such as fermented milk, lactic acid bacteria drink, bread, jam and confectionery.
  • the addition concentration at that time and it may be appropriately determined in consideration of flavor, physical properties and the like.
  • it can be used for cosmetics, medicines and the like.
  • Example 1 15 g of local grade lactose was weighed into a 100 mL Erlenmeyer flask, and 85 g of Bis-Tris buffer solution (pH 6.8) prepared with deionized water (containing neither sodium ion nor magnesium ion) was added (lactose concentration 15%). After completely dissolving lactose in a boiling water bath, it was cooled in a 45 ° C. constant temperature water bath.
  • Bis-Tris buffer solution pH 6.8
  • deionized water containing neither sodium ion nor magnesium ion
  • Example 2 The ratio of the residual disaccharide and the galactooligosaccharide having three or more saccharides was measured in the same manner as in Example 1 except that 2.6 M sodium chloride was added so that the sodium ion concentration would be 30 mM. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 The experiment was conducted except that the lactose concentration in the reaction solution was 45%, 2.6 M sodium chloride was added so that the sodium ion concentration was 5 mM, and GODO-YNL was reacted at 45 ° C. by adding 250 U per 1 g of lactose.
  • the ratio of residual disaccharides to galactooligosaccharides having 3 or more saccharides was measured. The results are shown in Table 3.
  • Example 4 The experiment was conducted except that the lactose concentration in the reaction solution was 45%, 2.6 M sodium chloride was added so that the sodium ion concentration was 60 mM, and GODO-YNL was reacted at 45 ° C. by adding 250 U per 1 g of lactose.
  • the ratio of residual disaccharides to galactooligosaccharides having 3 or more saccharides was measured. The results are shown in Table 4.
  • the amount of galactooligosaccharides having three or more sugars can be increased in a short reaction time, it is useful as an industrial method for producing galactooligosaccharides.

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Abstract

５～６０ｍＭのナトリウムイオン及び０．５～８ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で、β－ガラクトシダーゼを基質と反応させることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法により、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度を向上させる方法を提供する。

Description

ガラクトオリゴ糖の製造方法
　本発明は、β－ガラクトシダーゼを用いたガラクトオリゴ糖の製造方法に関し、より詳細には、β－ガラクトシダーゼを、所定の濃度における特定の金属イオンの共存下で基質に作用させることによって、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度を向上する方法に関する。
　β－ガラクトシダーゼは、乳糖などのβ－Ｄ－ガラクトシド結合を加水分解する反応とともに、ガラクトシル基転移反応も触媒することが知られており、腸内で選択的にビフィズス菌を増殖させるガラクトオリゴ糖の製造に使用されている。
　このようなβ－ガラクトシダーゼを用いた反応において、ガラクトシル基の転移率を向上させる方法が検討されている。例えば基質の乳糖濃度を高めてβ－ガラクトシダーゼを作用させることで転移率を高める方法が提案されている（特許文献１）。
　β－ガラクトシダーゼを用いたガラクトシル基転移反応による生成物には、β－Ｄ－ガラクトピラノシル（１－４）β－Ｄ－ガラクトピラノシル－Ｄグルコース（４´－ＧＬ）などの３糖以上のガラクトオリゴ糖の他、例えばβ－Ｄ－ガラクトピラノシル（１－６）－Ｄ－グルコースなどの転移２糖が含まれ得るが、ビフィズス菌増殖促進効果の向上等の点から、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量をより高める技術が求められている。また製造コストの低減及び生産効率の改善の観点からは、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が最大となるまでの反応時間を短縮することが重要であり、反応速度を向上させる方法が望まれている。
特公平５－２２５１７号公報
　本発明の課題は、β－ガラクトシダーゼを用いたガラクトオリゴ糖の製造方法において、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度を向上させる方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の濃度範囲のナトリウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下で、β－ガラクトシダーゼを基質と反応させることにより、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が増大し、かつ、生成量が最大に至るまでの反応時間を短縮できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、５～６０ｍＭのナトリウムイオン及び０．５～８ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で、β－ガラクトシダーゼを基質と反応させることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法である。
　本発明の製造方法によれば、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量を高めることができるとともに、反応速度も向上し、最大の生成量に到達するまでの反応時間を短縮することが可能である。そのため、３糖以上のガラクトオリゴ糖を効率良く低コストで生産することができる。
　本発明のガラクトオリゴ糖の製造方法は、５～６０ｍＭのナトリウムイオン及び０．５～８ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で、β－ガラクトシダーゼを基質と反応させることを特徴とする。ガラクトオリゴ糖には、一般式Ｇａｌ－（Ｇａｌ）ｎ－Ｇｌｃ（Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース、ｎは１～６の整数を示す）で表される３糖以上のガラクトオリゴ糖が含まれる。
　β－ガラクトシダーゼは、ラクトースやｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等のβ－ガラクトシド結合を加水分解する反応や、ガラクトシル基転移反応を触媒する酵素である。本発明で用いるβ－ガラクトシダーゼとしては特に制限されるものではないが、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度の向上の点から、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物由来のものが好ましく、さらに、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）由来のものが好ましく、特にクリベロマイセス属に属する微生物由来のβ－ガラクトシダーゼが好ましく、さらにクリベロマイセス・ラクチス由来のβ－ガラクトシダーゼが好ましい。
　上記β－ガラクトシダーゼの市販品として、例えば、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のＧＯＤＯ－ＹＮＬ（合同酒精株式会社製）、マキシラクトＬＧ５０００（ＤＳＭ社製）やクリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来のラクトザイム３０００Ｌ（ノボザイムズ社製）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のラクターゼＹ－ＳＴ（ヤクルト薬品工業株式会社製）等を挙げることができる。
　β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物または当該微生物由来のβ－ガラクトシダーゼの形態としては特に限定されるものではなく、例えば、培養液、培養液を遠心分離や膜処理等により濃縮した菌体濃縮液またはペレット、乾燥菌体、菌体破砕物、粗酵素溶液、精製酵素溶液、酵素粉末等が挙げられ、これらは公知の方法に従って調製される。
　例えば、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物を使用する場合、公知の微生物の培養方法に従って培養し、得られた培養液をそのまま用いるか、必要に応じて公知の遠心分離、膜処理、乾燥、破砕等の処理を施して、菌体濃縮液またはペレット、乾燥菌体、菌体破砕物液等として用いる。菌体は生菌体のままでもよいし、有機溶剤処理、凍結乾燥処理等を施して死菌体としたものでもよい。
　また、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物由来のβ－ガラクトシダーゼを使用する場合、精製条件、精製度に特に制約はなく、一般的な精製手法を用いることができる。当該微生物を公知の方法に従って培養した後、遠心分離、膜処理等の分離手段で菌体を分離し、培養上清中にβ－ガラクトシダーゼが含まれる場合にはこれを回収し、粗酵素溶液とすることができる。また菌体内にβ－ガラクトシダーゼが含まれる場合は、菌体をホモジナイザーや超音波処理により物理的に破砕するか、細胞壁溶解酵素等を用いて酵素的に処理することにより、菌体内抽出液を得て、粗酵素溶液とすることができる。これらの粗酵素溶液を硫安塩析処理、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製度の高い精製酵素溶液としてもよい。
　上記β－ガラクトシダーゼを作用させる基質としては、ガラクトシル基の受容体及び供与体のいずれとしても作用する単独の基質である場合と、ガラクトシル基の受容体と供与体が別途共存している場合とが含まれる。ガラクトシル基の供与体となる基質としては、乳糖、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドなどが挙げられる。またガラクトシル基の受容体となる基質としては、乳糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、グリセロールなどが挙げられる。
　基質の濃度はその種類等に応じて適宜設定されるが、例えば乳糖を用いる場合、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び生成速度の向上効果の点から、その濃度は５～６５質量％であることが好ましく、１５～６０質量％がより好ましい。またβ－ガラクトシダーゼの添加量は、所望の反応時間に合わせて適宜調整することができるが、乳糖１ｇあたり１０～１０００Ｕが好ましく、３０～８００Ｕがより好ましい。反応温度等は使用するβ－ガラクトシダーゼの至適温度等に応じて適宜設定することができる。例えば、クリベロマイセス・ラクチス由来のβ－ガラクトシダーゼを用いる場合、反応温度は３０～５０℃が好ましく、４０～５０℃がより好ましい。なお、酵素活性（Ｕ）の測定は次のとおりである。
［β－ガラクトシダーゼ酵素活性（Ｕ）の測定法］
希釈酵素試料０．５ｍＬを試験管に取り、０．１ｍＭとなるように塩化マンガンを加えた１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５、以下、「緩衝液」という）０．５ｍＬを加えて混合した後、３７℃で３分間保温する。あらかじめ３７℃で保温しておいた０．１％のｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（以下、「ＯＮＰＧ」という）溶液１．０ｍＬを加えてすばやく混合し、正確に３７℃で１分間保温する。０．２Ｍの炭酸ナトリウム溶液２．０ｍＬを加えてすばやく混合し、反応を停止する（試験系）。別に、希釈酵素試料０．５ｍＬを試験管に取り、緩衝液０．５ｍＬを加えて混合した後、０．２Ｍの炭酸ナトリウム溶液２．０ｍＬを加え、３７℃で３分間保温し、あらかじめ３７℃で保温しておいたＯＮＰＧ溶液０．１ｍＬを加えて混合し、正確に３７℃で１分間保温する（盲検系）。蒸留水を対照として試験系および盲検系の４２０ｎｍの吸光度を測定し、次式により酵素活性（Ｕ）を算出した。
［数式１］
　酵素活性＊＝（Ａ１－Ａ２）×１０×Ｂ
　　Ａ１：試験系の吸光度
　　Ａ２：盲検系の吸光度
　　Ｂ　：希釈倍率
　　＊　Ｕ／ｍｌ
　本発明では、上記β－ガラクトシダーゼをナトリウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下で基質に反応させる。反応系におけるナトリウムイオンの濃度は５～６０ｍＭである。一方、マグネシウムイオンの濃度は０．５～８ｍＭであり、より好ましくは１．５～８ｍＭである。ナトリウムイオン濃度が６０ｍＭより大きい場合やマグネシウムイオン濃度が８ｍＭより大きい場合は、得られたガラクトオリゴ糖を脱塩して精製する際の負荷が大きくなり好ましくない。ナトリウムイオン及びマグネシウムイオンをこのような範囲で共存させることにより、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度を向上することができる。ナトリウムイオン及びマグネシウムイオンは、塩化物、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩等の塩を固体または緩衝液の形態で反応系に添加することができ、添加後のｐＨ変化が少ない点から、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムが好ましい。
　一般にβ－ガラクトシダーゼによるガラクトシル基転移反応は、基質の加水分解反応と競合するため、基質にβ－ガラクトシダーゼを作用させると、所望のガラクトオリゴ糖が産生されると共に、競合する加水分解反応によってグルコースやガラクトースなどの単糖が生成し、また一旦生成したガラクトオリゴ糖も加水分解を受ける。このようにガラクトシル基転移反応と加水分解反応が競合するうえ、それに伴ってガラクトシル基の供与体と受容体としても多様な組み合わせが生じ得るため、特定の供与体と受容体間のガラクトシル基転移反応を優先させ、所望のガラクトオリゴ糖が生成されるよう制御することは困難とされる。これに対し、本発明では、特定の濃度範囲のナトリウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下でβ－ガラクトシダーゼを基質に作用させることにより、ガラクトオリゴ糖の中でも特に３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量を増加させることができ、さらにその反応速度を高めて生成量が最大となるまでの到達時間を短縮できるため、３糖以上のガラクトオリゴ糖を効率よく、低コストで生産することが可能となる。
　また本発明の方法は、２種のβ－ガラクトシダーゼを作用させる逐次反応によるガラクトオリゴ糖の製造における二次反応にも適用できる。すなわち、一次反応として、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物または当該微生物由来のβ－ガラクトシダーゼを基質に反応させた後、二次反応として、一次反応に用いたものと異なるβ－ガラクトシダーゼを、５～６０ｍＭのナトリウムイオン及び０．５～８ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で一次反応液に作用させることにより、未反応の基質を減少させるとともに、ガラクトオリゴ糖の生成量を増大させることができる。
　一次反応に用いるβ－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物としては、例えば、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が好ましく、特にスポロボロマイセス属に属する微生物が好ましく、さらにスポロボロマイセス・シンギュラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）が３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度の向上の点から好ましい。
　一次反応において用いるβ－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物または当該微生物由来のβ－ガラクトシダーゼの形態としては特に限定されるものではなく、例えば、培養液、培養液を遠心分離や膜処理等により濃縮した菌体濃縮液またはペレット、乾燥菌体、菌体破砕物、粗酵素溶液、精製酵素溶液、酵素粉末等が挙げられ、これらは公知の方法に従って調製される。
　例えば、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物を使用する場合、公知の微生物の培養方法に従って培養し、得られた培養液をそのまま用いるか、必要に応じて公知の遠心分離、膜処理、乾燥、破砕等の処理を施して、菌体濃縮液またはペレット、乾燥菌体、菌体破砕物液等として用いる。菌体は生菌体のままでもよいし、有機溶剤処理、凍結乾燥処理等を施して死菌体としたものでもよい。
　また、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物由来のβ－ガラクトシダーゼを使用する場合、精製条件、精製度に特に制約はなく、一般的な精製手法を用いることができる。当該微生物を公知の方法に従って培養した後、遠心分離、膜処理等の分離手段で菌体を分離し、培養上清中にβ－ガラクトシダーゼが含まれる場合にはこれを回収し、粗酵素溶液とすることができる。また菌体内にβ－ガラクトシダーゼが含まれる場合は、菌体をホモジナイザーや超音波処理により物理的に破砕するか、細胞壁溶解酵素等を用いて酵素的に処理することにより、菌体内抽出液を得て、粗酵素溶液とすることができる。これらの粗酵素溶液を硫安塩析処理、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製度の高い精製酵素溶液としてもよい。
　一次反応において、上記β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物または当該微生物由来のβ－ガラクトシダーゼを、乳糖等の基質に反応させる。反応条件は、使用するβ－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物または当該微生物由来のβ－ガラクトシダーゼの特性に応じて適宜設定することができる。例えば、β－ガラクトシダーゼ活性を有する微生物としてスポロボロマイセス・シンギュラリスを使用し、基質として乳糖を用いる場合、ガラクトオリゴ糖の生成量及び生成速度の向上効果の点から、乳糖の濃度は１０～６０質量％が好ましく、４０～５０質量％がより好ましい。またスポロボロマイセス・シンギュラリスの添加量は、乳糖１ｇあたり０．０３～０．３Ｕが好ましく、０．２～０．３Ｕがより好ましい。また反応温度は３０～７０℃程度であり、２４～９６時間程度反応させればよい。
　二次反応では、一次反応で得られた一次反応液に、特定の濃度範囲のナトリウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下で、一次反応に用いたものとは異なるβ－ガラクトシダーゼを作用させる。
　二次反応において使用されるβ－ガラクトシダーゼは特に制限されるものではないが、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度の向上の点から、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物由来のものが好ましく、更に、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）由来のものが好ましく、特にクリベロマイセス属に属する微生物由来のβ－ガラクトシダーゼが好ましく、さらにクリベロマイセス・ラクチス由来のβ－ガラクトシダーゼが好ましい。
　上記β－ガラクトシダーゼを特定の濃度範囲のナトリウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下で一次反応液に作用させることにより、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が増加する。さらに、その反応速度も向上し、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が最大となるまでの反応時間が短縮される。二次反応液におけるナトリウムイオンの濃度は５～６０ｍＭである。一方、マグネシウムイオンの濃度は０．５～８ｍＭであり、より好ましくは１．５～８ｍＭである。ナトリウムイオン濃度が６０ｍＭより大きい場合やマグネシウムイオン濃度が８ｍＭより大きい場合は、ガラクトオリゴ糖を脱塩して精製する際の負荷が大きくなり好ましくない。ナトリウムイオン及びマグネシウムイオンをこのような濃度範囲で存在させることにより、ガラクトオリゴ糖の生成量及び生産効率を向上することができる。ナトリウムイオン及びマグネシウムイオンは、塩化物、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩等の塩を固形または緩衝液の形態で反応系に添加することができ、添加後のｐＨ変化が少ない点から、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムが好ましい。
　一次反応液における残存乳糖の濃度は、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び反応速度の向上効果の点から、５～６５質量％が好ましく、１５～６０質量％がより好ましい。またβ－ガラクトシダーゼの添加量は、残存乳糖１ｇあたり１０～１０００Ｕが好ましく、３０～８００Ｕがより好ましい。反応温度等は使用するβ－ガラクトシダーゼの至適温度等に応じて適宜設定することができる。例えば、クリベロマイセス・ラクチス由来のβ－ガラクトシダーゼを用いる場合、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量及び生成速度の向上効果の点から、反応温度は３０～５０℃が好ましく、４０～５０℃がより好ましい。
　以上のようにしてガラクトオリゴ糖が生成した反応液は、そのまま、あるいは適宜活性炭による脱色やケイソウ土による濾過、イオン交換樹脂による脱塩、濃縮機による濃縮を行い、液糖として、または噴霧乾燥機などによって粉末化して食品素材として利用できる。例えば、そのままテーブルシュガーとして利用したり、発酵乳、乳酸菌飲料、パン、ジャムや菓子類等の飲食品に添加することも可能である。その際の添加濃度には特に限定されず、風味や物性等を鑑みて適宜決定すればよい。このような食品以外にも、化粧品、医薬品等にも利用できる。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
実施例１
　１００ｍＬ容三角フラスコに局方グレードの乳糖を１５ｇ秤量し、脱イオン水で調製した（ナトリウムイオンとマグネシウムイオンが含まれていない）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）を８５ｇ加えた（乳糖濃度１５％）。沸騰水浴中で乳糖を完全に溶解した後に、４５℃の恒温水槽中で冷却した。これに２．６Ｍの塩化ナトリウムをナトリウムイオン濃度が１５ｍＭとなるように加え、また０．７５Ｍの塩化マグネシウムをマグネシウムイオン濃度が下記表１に記載された濃度になるように加え、これらにＧＯＤＯ－ＹＮＬ（クリベロマイセス・ラクチス由来のβ―ガラクトシダーゼ、合同酒精株式会社製）を乳糖１ｇ当たり６００Ｕ添加して４０℃で反応させた。これら反応液を経時的に７時間目までサンプリングし、沸騰水浴中で９０℃まで昇温して酵素を失活させた後、残２糖と３糖以上のガラクトオリゴ糖の割合を下記条件に基づくＨＰＬＣ分析により測定した。各マグネシウムイオン濃度における３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が最大となったときの測定結果を表１に示す。なお、残２糖には未反応の乳糖及び転移２糖が含まれる。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ－８０２
移動層：精製水
流　速：０．５ｍＬ/ｍｉｎ
検　出：示差屈折計
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２
　２．６Ｍの塩化ナトリウムをナトリウムイオン濃度が３０ｍＭとなるように添加した以外は実施例１と同様にして残２糖と３糖以上のガラクトオリゴ糖の割合を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３
　反応液中の乳糖濃度を４５％とし、２．６Ｍの塩化ナトリウムをナトリウムイオン濃度が５ｍＭとなるように添加し、ＧＯＤＯ－ＹＮＬを乳糖１ｇ当たり２５０Ｕ添加して４５℃で反応させた以外は実施例１と同様にして残２糖と３糖以上のガラクトオリゴ糖の割合を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例４
　反応液中の乳糖濃度を４５％とし、２．６Ｍの塩化ナトリウムをナトリウムイオン濃度が６０ｍＭとなるように添加し、ＧＯＤＯ－ＹＮＬを乳糖１ｇ当たり２５０Ｕ添加して４５℃で反応させた以外は実施例１と同様にして残２糖と３糖以上のガラクトオリゴ糖の割合を測定した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１及び表２より、ナトリウムイオン濃度が１５ｍＭ及び３０ｍＭで、マグネシウムイオンを０．５ｍＭ以上となるように添加することで、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が最大となるまでの反応時間が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭ及び０．１ｍＭの場合と比較して半分以下に短縮されることが明らかとなった。また、マグネシウムイオン濃度の増加に伴って、３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が増加することが示された。さらに、ナトリウムイオン濃度が１５ｍＭの場合、マグネシウムイオンを１．５ｍＭ以上となるように添加することで、３糖以上ガラクトオリゴ糖の生成量が最大となるまでの反応時間がより短縮されることが明らかとなった。また、表３及び表４より、ナトリウムイオン濃度が５ｍＭ、６０ｍＭの場合、マグネシウムイオンを０．５ｍＭ以上となるように添加することで３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が最大となるまでの反応時間が、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭ及び０．１ｍＭの場合と比較して短縮されることが明らかとなり、マグネシウムイオン濃度の増加に伴って、特にマグネシウムイオン濃度が１．５ｍＭ以上で３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量が増加することが示された。
　本発明によれば、短い反応時間で３糖以上のガラクトオリゴ糖の生成量を高めることができるため、工業的なガラクトオリゴ糖の製造方法として有用である。

 

Claims (3)

  1. 　５～６０ｍＭのナトリウムイオン及び０．５～８ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で、β－ガラクトシダーゼを基質と反応させることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
  2. 　マグネシウムイオンの濃度が１．５～８ｍＭである請求項１記載の製造方法。
  3. 　β－ガラクトシダーゼが、クリベロマイセス属に属する微生物由来のものである請求項１又は２記載の製造方法。

     
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