JP6067800B2 - 微生物の死菌化方法 - Google Patents

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Description

本発明は、微生物の死菌化方法に関し、更に詳細には、酵素活性を有する微生物菌体液の酵素力価を維持したまま微生物を死菌化する方法に関する。
微生物には、有用な酵素活性を有するものが多く存在し、糖質、アミノ酸、リン脂質等の機能性食品素材の製造に広く利用されている。なかでも糖質素材、特にオリゴ糖の製造に利用できる微生物は多く知られており、例えば、スポロボロマイセス・シンギュラリス（Sporobolomyces singularis）に属する酵母菌の有するβ−ガラクトシダーゼ活性を利用し、ガラクトオリゴ糖を製造することが報告されている（特許文献１）。
ところで、微生物は一般に、加熱処理により死菌化され、保存等されることがあるが、上記のような酵素活性を有する微生物に加熱処理をする場合には、微生物は死菌化されるものの、酵素活性が著しく低下してしまい、事実上使用できなくなってしまうという問題があった。また、酵素活性を維持したまま死菌化させる技術として、形質転換した微生物を２５℃〜３５℃のアルコール等の薬品により酵素活性を維持したまま死菌化させる技術も報告（特許文献２）されているが、この技術では遺伝子組み換えをした微生物を利用したり、死菌化の処理に使用したアルコール等が残存したりするため、死菌化後の用途が限られてしまうという問題があった。
特公平５−５８７１４号公報 特開２００２−３５５０２８号公報
従って、本発明は酵素活性を有する微生物菌体液を、容易に保存・利用可能とする技術を提供することを課題とするものである。
本発明者らは、このような問題を解決すべく微生物の加熱処理による死菌化の条件について鋭意研究を行ったところ、酵素活性を有する微生物菌体液中の微生物を死菌化するための加熱処理の前にｐＨを調整することや、加熱処理の際に糖質を存在させることにより、酵素力価が維持されたまま死菌化できることを見出し、本発明を完成させた。また、前記のようにして死菌化された微生物菌体液は、死菌化前の微生物菌体液の酵素力価が維持されていることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は酵素活性を有する微生物菌体液のｐＨを調整し、次いでこれを加熱処理することを特徴とする菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化する方法である。
また、本発明は死菌化前の微生物菌体液の酵素力価が維持されていることを特徴とする死菌化微生物菌体液である。
更に、本発明は酵素活性を有する微生物菌体液に糖質を添加し、次いでこれを加熱処理することを特徴とする菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化する方法である。
また更に、本発明は糖質を含有し、死菌化前の微生物菌体液の酵素力価が維持されていることを特徴とする死菌化微生物菌体液である。
本発明の菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化する方法によれば、酵素活性を有する微生物菌体液の酵素力価を維持したまま微生物を死菌化することができる。また、この方法では、酵素の熱安定性を高めることができ、より広い温度条件で酵素力価が維持されたまま死菌化することができる。そのため、死菌化後の微生物菌体液は容易に保存・利用可能となる。即ち、微生物が生きている場合は、保存中に微生物から何らかの代謝物が生じ、微生物菌体液の品質が低下し、酵素力価の保存安定性にも影響を与える可能性があるが、死菌化されている場合はそのような問題は生じないため、死菌化微生物菌体液は酵素力価の保存安定性に優れている。
また、本発明の死菌化微生物菌体液は、酵素活性が維持された状態で死菌化されているので容易に保存・利用可能となる。
更に、上記死菌化微生物菌体液を乾燥させて死菌化微生物菌体乾燥粉末とすれば、より長期間安定に保存・利用可能となる。
実施例９において、乳糖濃度２質量／体積％でＳｓ濃縮液を４５℃または５０℃で５時間保持して加熱処理をした後の力価残存率を示す図面である。 実施例９において、乳糖濃度２質量／体積％でＳｓ濃縮液を４５℃または５０℃で１８時間保持して加熱処理をした後の力価残存率を示す図面である。 実施例９において、乳糖濃度５質量／体積％でＳｓ濃縮液を４５℃または５０℃で５時間保持して加熱処理をした後の力価残存率を示す図面である。 実施例９において、乳糖濃度５質量／体積％でＳｓ濃縮液を４５℃または５０℃で１８時間保持して加熱処理をした後の力価残存率を示す図面である。 実施例１１において、各種濃度の水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液を用いてＳｓ培養液のｐＨを調整した後の力価残存率を示す図面である。
本発明の菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化する方法（以下、「本発明方法」という）は、酵素活性を有する微生物菌体液のｐＨを調整し、次いでこれを加熱処理する方法（以下、「本発明方法１」という）または酵素活性を有する微生物菌体液に糖質を添加し、次いでこれを加熱処理する方法（以下、「本発明方法２」という）により実施することができる。
本発明方法により、死菌化される微生物としては、例えば、細菌、酵母、カビ等の微生物であって、酵素を細胞壁に結合しているか、あるいは菌体内および／または菌体外に産生するもの、即ち、酵素活性を有する微生物であれば特に限定されるものではない。これら酵素活性を有する微生物としては、例えば、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属等に属する細菌、スポロボロマイセス属、ブレラ属、クリベロマイセス属、リポマイセス属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、ステリグマトマイセス属、ベンシントニア属、バリストスポロマイセス属、フェロマイセス属、フィブロバシディウム属、シロバシディウム属、ティレショプシス属、イターソニリア属、ティレシア属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ハンセヌラ属、ロドトルラ属、デバリョマイセス属、ピキア属、トルロプシス属等に属する酵母が挙げられる。また、酵素としては、例えば、アミラーゼ、シュークラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−フラクトフラノシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、キシラナーゼ等の糖質分解酵素等の酵素が挙げられる。
上記酵素活性を有する微生物の中でもβ−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物が好ましい。このような微生物としては、スポロボロマイセス属、ブレラ属、クリベロマイセス属、リポマイセス属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、ステリグマトマイセス属、ベンシントニア属、バリストスポロマイセス属、フェロマイセス属、フィブロバシディウム属、シロバシディウム属、ティレショプシス属、イターソニリア属、ティレシア属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ハンセヌラ属、ロドトルラ属、デバリョマイセス属、ピキア属、トルロプシス属等に属する酵母、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。
また、上記β−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物の中でも酵母または細菌が好ましく、特に酵母がより好ましい。具体的なβ−ガラクトシダーゼ活性を有する酵母としては、特にスポロボロマイセス・シンギュラリス、ステリグマトマイセス・エリビアエ、クリプトコッカス・ローレンティ、ロドトルラ・ラクトーザ、シロバシディウム・マグナム、リポマイセス・リポファーが挙げられる。具体的なβ−ガラクトシダーゼ活性を有する細菌としては、特にストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ストレプトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ライヒマニー、ラクトバチルス・ヘルベティクス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスが挙げられる。
特に好ましく用いられるβ−ガラクトシダーゼ活性を有する酵母としては、スポロボロマイセス・シンギュラリスが挙げられ、その一つの例である、スポロボロマイセス・シンギュラリス ＪＣＭ ５３５６（ＡＴＣＣ ２４１９３）は理化学研究所バイオリソースセンター（〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）やＡＴＣＣ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）等から有償で入手することが可能である。
また、スポロボロマイセス・シンギュラリスの別の例としては、特開２００３−３２５１６６号公報に記載の作出方法により、β−ガラクトシダーゼ高産生変異微生物として得た酵母を挙げることができる。このうち、具体的に、親株として上記スポロボロマイセス・シンギュラリス ＪＣＭ ５３５６を用い、前記特許文献の工程（ａ）〜（ｃ）により得られた酵母の例としては、スポロボロマイセス・シンギュラリスＩＳＫ−＃４Ｄ４、同＃５Ａ５、同＃＃２Ｂ６が挙げられ、これは２００２年４月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８８１８、ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１９およびＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７として寄託されている。
上記した微生物を死菌化する本発明方法のうち、酵素活性を有する微生物菌体液のｐＨを調整し、次いでこれを加熱処理する方法（本発明方法１）について説明する。本発明方法１の実施にあたっては、まず、酵素活性を有する微生物を常法に従って培地等で培養して培養液を得る。この培養液をそのまま微生物菌体液として用いてもよく、更に、遠心分離装置や膜濃縮装置などを用いて、適宜、洗浄・濃縮を行なったものを微生物菌体液として用いてもよい。この微生物菌体液の固形分含量は特に限定されるものではなく、具体的には０.５〜１０％を例示することができる。なお、この明細書における「固形分含量」とは、微生物菌体液中の菌体の固形分含量を指し、例えば、微生物菌体液中に培地成分が含まれる場合は、その培地成分に由来する固形分は、この明細書における「固形分含量」には含まれない。
次いでこの微生物菌体液のｐＨを調整する。ｐＨの範囲は特に限定されないが、より広い温度範囲において酵素力価をより高く維持できるという点から、好ましくは３.５〜６.５、より好ましくは４.２〜６.３、更に好ましくは４.５〜５.７である。このｐＨの調整に用いられる物質は特に限定されず、酸、塩基、塩の何れも用いることができ、具体的には、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等の水溶液や、リン酸ナトリウム緩衝液等の各種緩衝液を適宜用いることができるが、ｐＨ調整後に力価が低下しないという点から、炭酸塩を用いることが好ましく、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選ばれる炭酸塩の１種または２種以上を用いることがより好ましい。
なお、ｐＨ調整前に微生物菌体液へ糖質を添加および／またはｐＨ調整後であって加熱処理前に微生物菌体液へ糖質を添加することが、酵素の熱安定性を更に向上させ、酵素力価をより高く維持できる点から好ましい。ここで用いられる糖質は特に制限されるものではなく、単糖、２糖、３糖以上のオリゴ糖、多糖の何れも用いることができる。単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース等が挙げられ、２糖としては乳糖、乳糖異性体、マルトース、スクロース、トレハロース等が挙げられ、３糖以上のオリゴ糖としてはガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖等が挙げられ、多糖としてはデキストリン、澱粉等を挙げることができる。これら糖質の中でも、酵素力価の維持効果やコストの点から、乳糖、グルコース、マルトース、ガラクトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、特に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上を用いることが好ましい。微生物菌体液に添加する糖質の量は特に制限されるものではないが、糖質の添加量の下限は、例えば、微生物菌体液に対し０.２質量／体積％（以下、単に「％」という）以上が好ましく、より好ましくは０.５％以上、更に好ましくは２％以上である。また、微生物菌体液に糖質を添加する時期や方法も特に限定されるものではなく、例えば、別途調製した糖質の濃厚溶液を添加する方法が挙げられるが、微生物菌体液に添加する糖質溶液の量が多すぎると微生物菌体液中の菌体濃度が希薄になり、微生物菌体液の単位重量あたりの酵素力価が低下してしまうという問題が生じる場合があるので、糖質の添加量の上限は３０％以下が好ましく、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下である。以上のことから、微生物菌体液に添加する糖質の量は０.２〜３０％が好ましく、より好ましくは０.５〜１５％、更に好ましくは０.５〜１０％、特に好ましくは２〜１０％である。
また、微生物菌体液に添加する糖質がその酵素の基質となりえる場合（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物の菌体液に乳糖を加える場合）には、糖質添加から加熱処理が終わるまでに糖質の一部または大部分が酵素反応を受ける場合もあるが、反応の程度（分解度や重合度）にかかわらず糖質を添加したことによる効果は発揮されるので、酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。例えば、糖質添加後、そのまま保持しても、または冷却処理や加熱処理しても、酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。また、上記の場合、微生物菌体液中に、添加した糖質が酵素反応を受けて生成した他の糖質が含まれる場合があるが、このような糖質が存在していても酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。微生物菌体液中に添加した糖質が酵素反応を受けて生成する糖質としては、単糖、２糖、３糖以上のオリゴ糖、多糖を挙げることができ、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース等が挙げられ、２糖としては乳糖、乳糖異性体、マルトース、スクロース、トレハロース等が挙げられ、３糖以上のオリゴ糖としてはガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などの各種オリゴ糖が挙げられ、多糖としてはデキストリン、澱粉等が挙げられる。具体的に、糖質分解酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）活性を有する微生物菌体液中に添加する糖質が乳糖の場合には、乳糖が酵素反応を受けるため、微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、ガラクトース、乳糖、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖を挙げることができ、添加する糖質がマルトースの場合には、微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖を挙げることができ、添加する糖質がデキストリンの場合には微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖、デキストリンを挙げることができる。なお、微生物菌体液中に添加する糖質として乳糖、グルコース、マルトース、ガラクトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上を用いることが好ましいことから、これらの糖質を添加した微生物菌体液中には、これらの糖質と、これらの糖質が酵素反応を受けて生成する糖質が含まれ、具体的には乳糖、グルコース、ガラクトース、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖、マルトース、マルトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上の糖質が含まれていることが好ましい。また、微生物菌体液中に添加する糖質として、乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上を用いることがより好ましいことから、微生物菌体液中には、乳糖、グルコース、ガラクトース、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖、マルトースおよびマルトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上の糖質が含まれていることがより好ましい。
上記のようにしてｐＨを調整した後、加熱処理が行われる。加熱処理の方法は、特に限定されるものではなく、連続的に行うプレート式熱交換装置による方法、バッチ処理で行う加熱蒸気や温水によって菌体液が入ったタンクを加熱する方法等が適用できるが、酵素の失活を極力防ぐよう温度制御するためにはバッチ処理で行う加熱蒸気や温水によって菌体液が入ったタンクを加熱する方法の方が好ましい。バッチ処理の際の加熱処理は酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化できる条件であれば特に限定されないが、４０〜５０℃が好ましく、より好ましくは４０〜４８℃、更に好ましくは４０〜４６℃である。また、バッチ処理で、ｐＨ調整前に微生物菌体液へ糖質を添加および／またはｐＨ調整後であって加熱処理前に微生物菌体液へ糖質を添加する場合は、４０〜６０℃が好ましく、より好ましくは４０〜５５℃、更に好ましくは４０〜５０℃である。また、加熱時間も特に限定されるものではないが、１時間以上が好ましく、より好ましくは６時間以上である。ただし、加熱時間が長すぎると酵素力価が低下することがあるため、２４時間以下が好ましく、より好ましくは２０時間以下であり、更に好ましくは１８時間以下である。以上のことにより、加熱時間は１〜２４時間が好ましく、より好ましくは１〜２０時間、更に好ましくは１〜１８時間、より好ましくは６〜２４時間、更に好ましくは６〜２０時間、より好ましくは６〜１８時間である。また、加熱処理の前に糖質が添加されている場合、加熱時間は１〜２４時間が好ましく、更に好ましくは４〜２０時間、より好ましくは５〜１８時間である。なお、本発明方法１において死菌化とは、微生物の生菌が、加熱処理により１０００ｃｆｕ／ｍＬ以下にまで低減することをいい、好ましくは１００ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下にまで低減することが望ましい。
また、上記のように加熱処理を行うことにより、微生物菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物菌体液中の微生物が死菌化される。ここで酵素力価が維持されているとは、加熱処理後（死菌化後）の酵素力価が加熱処理前（死菌化前）の酵素力価の８０％以上であることをいい、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
加熱処理後の微生物菌体液（死菌化微生物菌体液）は、２５℃以下、好ましくは０〜５℃の低温条件で長期間保存することができる。そして、これらの加熱処理後の微生物菌体液は、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
また、加熱処理後の微生物菌体液は、更に、噴霧乾燥、凍結乾燥等の公知の乾燥手段で乾燥させ死菌化微生物菌体乾燥粉末とすることができる。その際に、乾燥工程や乾燥後の保存による酵素力価の低下を防ぐために、加熱処理後の微生物菌体液に糖質を添加することもできる。用いられる糖質は特に制限されるものではなく、単糖、２糖、３糖以上のオリゴ糖、多糖の何れも用いることができる。単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース等が挙げられ、２糖としては乳糖、乳糖異性体、マルトース、スクロース、トレハロース等が挙げられ、３糖以上のオリゴ糖としてはガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖が挙げられ、多糖としてはデキストリン、澱粉等を挙げることができる。これら糖質の中でも、酵素力価の維持効果、乾燥のし易さやコストの点から、乳糖、マルトースおよびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上を用いることが好ましく、特に乳糖および／またはマルトースを用いることが好ましく、乳糖を用いることがさらに好ましい。添加する糖質の量は特に限定されるものではなく、糖質の添加量の下限は、例えば、微生物菌体液に対し０.１％以上が好ましく、より好ましくは０.５％以上、更に好ましくは１％以上である。また、微生物菌体液中に添加する糖質の量が多すぎると微生物菌体液を乾燥粉末とした場合に微生物菌体乾燥粉末の単位重量あたりの酵素力価が低下してしまうことがあるため、糖質の添加量の上限は３０％以下が好ましく、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、更により好ましくは３％以下である。以上のことから、微生物菌体液中に添加する糖質の量は、微生物菌体液に対し０.１〜３０％が好ましく、より好ましくは０.５〜１５％、更に好ましくは０.５％〜１０％、より好ましくは１％〜１０％、更により好ましくは１％〜５％、より好ましくは１％〜３％である。また、糖質の添加方法は特に限定されないが、例えば、別に調製した糖質の濃厚溶液を添加する方法が挙げられる。乾燥の程度は特に限定されないが、例えば、乾燥粉末中の水分量が、およそ１０％以下となるまで行う。この乾燥により、乾燥直後の酵素力価の８０％以上の酵素力価を維持したまま液体の場合よりもより長期間、例えば、１年間以上も保存することができる。また、これらの死菌化微生物菌体乾燥粉末は、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
なお、上記した噴霧乾燥の条件としては、乾燥室の入口・出口温度は酵素が著しく失活しない範囲ならよく、また、アトマイザー回転数、原液フィード量などはその条件次第で若干製品としての特性の異なる微生物菌体乾燥粉末が得られるが、最終的な酵素力価にはほとんど影響はないので、余り留意する必要はない。具体的には、乾燥室の入口温度は７０℃〜２００℃、好ましくは１１０℃〜１８０℃、出口温度は５０℃〜１２０℃、好ましくは７０℃〜９０℃を例示することができる。また、アトマイザー回転数は１０,０００〜３０,０００ｒｐｍ、原液フィード量は０.２〜２００ｋｇ／時間を例示することができる。これらの噴霧乾燥はアトマイザーの他にも二流体ノズル等の噴霧方式を用いて行うことができる。なお、工業的に連続生産できるという点から、噴霧乾燥法を用いることが好ましい。
上記で得られた、加熱処理後の微生物菌体液および死菌化微生物菌体乾燥粉末はそれぞれ単独でまたは組み合わせて含有させて酵素組成物とすることもできる。この酵素組成物には、酵素活性に影響を及ぼさない範囲で希釈剤、賦形剤、界面活性剤、防腐剤等を添加することもできる。また、この酵素組成物も、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
次に、上記した微生物を死菌化する本発明方法のうち、酵素活性を有する微生物菌体液に糖質を添加し、次いでこれを加熱処理する方法（本発明方法２）について説明する。本発明方法２の実施にあたっては、まず、酵素活性を有する微生物を常法に従って培地等で培養して培養液を得る。この培養液をそのまま微生物菌体液として用いてもよいが、更に、遠心分離装置や膜濃縮装置などを用いて、適宜、洗浄・濃縮を行ったものを、酵素活性を有する微生物菌体液として用いてもよい。この微生物菌体液の固形分含量は特に限定されるものではなく、具体的には０.５〜１０％を例示することができる。なお、前記したように、この明細書における「固形分含量」とは、微生物菌体液中の菌体の固形分含量を指し、例えば、微生物菌体液中に培地成分が含まれる場合は、その培地成分に由来する固形分は、この明細書における「固形分含量」には含まれない。
次いでこの微生物菌体液に、糖質を添加する。ここで用いられる糖質は特に制限されるものではなく、単糖、２糖、３糖以上のオリゴ糖、多糖の何れも用いることができる。単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース等が挙げられ、２糖としては乳糖、乳糖異性体、マルトース、スクロース、トレハロース等が挙げられ、３糖以上のオリゴ糖としてはガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖等が挙げられ、多糖としてはデキストリン、澱粉等を挙げることができる。これら糖質の中でも、酵素力価の維持効果やコストの点から、乳糖、グルコース、マルトース、ガラクトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、特に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上を用いることが好ましい。微生物菌体液に添加する糖質の量は特に制限されるものではないが、糖質の添加量の下限は、例えば、微生物菌体液に対し０.２％以上が好ましく、より好ましくは０.５％以上、更に好ましくは２％以上である。また、微生物菌体液に糖質を添加する時期や方法も特に限定されるものではなく、例えば、別途調製した糖質の濃厚溶液を添加する方法が挙げられるが、微生物菌体液に添加する糖質溶液の量が多すぎると微生物菌体液中の菌体濃度が希薄になり、微生物菌体液の単位重量あたりの酵素力価が低下してしまうという問題が生じる場合があるので、糖質の添加量の上限は３０％以下が好ましく、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下である。以上のことから、微生物菌体液に添加する糖質の量は０.２〜３０％が好ましく、より好ましくは０.５〜１５％、更に好ましくは０.５〜１０％、特に好ましくは２〜１０％である。
上記のようにして微生物菌体液に糖質を添加した後は、加熱処理が行われる。加熱処理の方法は、特に限定されるものではなく、連続的に行うプレート式熱交換装置による方法、バッチ処理で行う加熱蒸気や温水によって菌体液が入ったタンクを加熱する方法等が適用できるが、酵素の失活を極力防ぐよう温度制御するためにはバッチ処理で行う加熱蒸気や温水によって菌体液が入ったタンクを加熱する方法の方が好ましい。バッチ処理の際の加熱処理は酵素力価が維持されたまま微生物を死菌化できる条件であれば特に限定されないが、４０〜６０℃が好ましく、より好ましくは４０〜５５℃、更に好ましくは４０〜５０℃である。また、加熱時間も特に限定されるものではないが、１時間以上が好ましく、より好ましくは４時間以上、更に好ましくは５時間以上である。ただし、加熱時間が長すぎると酵素力価が低下することがあるため、２４時間以下が好ましく、より好ましくは２０時間以下であり、更に好ましくは１８時間以下である。以上のことより、加熱時間は１〜２４時間が好ましく、更に好ましくは４〜２０時間、より好ましくは５〜１８時間である。なお、本発明方法２において死菌化とは、微生物の生菌が、加熱処理により１０００ｃｆｕ／ｍＬ以下にまで低減することをいい、好ましくは１００ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下にまで低減することが望ましい。
また、上記のように加熱処理を行うことにより、微生物菌体液の酵素力価が維持されたまま微生物菌体液中の微生物が死菌化される。ここで酵素力価が維持されているとは、加熱処理後（死菌化後）の酵素力価が加熱処理前（死菌化前）の酵素力価の８０％以上であることをいい、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
なお、微生物菌体液に添加する糖質がその酵素の基質となりえる場合（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物の菌体液に乳糖を加える場合）には、糖質添加から加熱処理が終わるまでに糖質の一部または大部分が酵素反応を受ける場合もあるが、反応の程度（分解度や重合度）にかかわらず糖質を添加したことによる効果は発揮されるので、酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。例えば、糖質添加後、そのまま保持しても、または冷却処理や加熱処理しても、酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。また、上記の場合、微生物菌体液中に、添加した糖質が酵素反応を受けて生成した他の糖質が含まれる場合があるが、このような糖質が存在していても酵素力価の安定化という点からは全く問題がない。微生物菌体液中に含まれる糖質としては、単糖、２糖、３糖以上のオリゴ糖、多糖を挙げることができ、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース等が挙げられ、２糖としては乳糖、乳糖異性体、マルトース、スクロース、トレハロース等が挙げられ、３糖以上のオリゴ糖としてはガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などの各種オリゴ糖が挙げられ、多糖としてはデキストリン、澱粉等が挙げられる。具体的に、糖質分解酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）活性を有する微生物菌体液中に添加する糖質が乳糖の場合には、乳糖が酵素反応を受けるため、微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、ガラクトース、乳糖、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖を挙げることができ、添加する糖質がマルトースの場合には、微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖を挙げることができ、添加する糖質がデキストリンの場合には微生物菌体液中に含まれる糖質として、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖、デキストリンを挙げることができる。なお、微生物菌体液中に添加する糖質として乳糖、グルコース、マルトース、ガラクトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上を用いることが好ましいことから、これらの糖質を添加した微生物菌体液中には、これらの糖質と、これらの糖質が酵素反応を受けて生成する糖質が含まれ、具体的には乳糖、グルコース、ガラクトース、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖、マルトース、マルトオリゴ糖およびデキストリンからなる群から選ばれる１種以上の糖質が含まれていることが好ましい。また、微生物菌体液中に添加する糖質として、乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上を用いることがより好ましいことから、微生物菌体液中には、乳糖、グルコース、ガラクトース、乳糖異性体、ガラクトオリゴ糖、マルトースおよびマルトオリゴ糖からなる群から選ばれる１種以上の糖質が含まれていることがより好ましい。
加熱処理後の微生物菌体液（死菌化微生物菌体液）は、２５℃以下、好ましくは０〜５℃の低温条件で長期間保存することができる。そして、これらの加熱処理後の微生物菌体液は、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
また、加熱処理後の微生物菌体液は、更に、噴霧乾燥、凍結乾燥等の公知の乾燥手段で乾燥させ死菌化微生物菌体乾燥粉末とすることができる。乾燥の程度は特に限定されないが、例えば、乾燥粉末中の水分量が、およそ１０％以下となるまで行う。この乾燥により、乾燥直後の酵素力価の８０％以上の酵素力価を維持したまま液体の場合よりもより長期間、例えば、１年間以上も保存することができる。また、これらの死菌化微生物菌体乾燥粉末は、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
なお、上記した噴霧乾燥の条件としては、乾燥室の入口・出口温度は酵素が著しく失活しない範囲ならよく、また、アトマイザー回転数、原液フィード量などはその条件次第で若干製品としての特性の異なる微生物菌体乾燥粉末が得られるが、最終的な酵素力価にはほとんど影響はないので、余り留意する必要はない。具体的には、乾燥室の入口温度は７０℃〜２００℃、好ましくは１１０℃〜１８０℃、出口温度は５０℃〜１２０℃、好ましくは７０℃〜９０℃を例示することができる。また、アトマイザー回転数は１０,０００〜３０,０００ｒｐｍ、原液フィード量は０．２〜２００ｋｇ／時間を例示することができる。これらの噴霧乾燥はアトマイザーの他にも二流体ノズル等の噴霧方式を用いて行うことができる。なお、工業的に連続生産できるという点から、噴霧乾燥法を用いることが好ましい。
上記で得られた、加熱処理後の微生物菌体液および死菌化微生物菌体乾燥粉末はそれぞれ単独でまたは組み合わせて含有させて酵素組成物とすることもできる。この酵素組成物には、酵素活性に影響を及ぼさない範囲で希釈剤、賦形剤、界面活性剤、防腐剤等を添加することもできる。また、この酵素組成物も、酵素活性を利用する種々の用途に利用することができる。
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、β−ガラクトシダーゼ力価、固形分含量、微生物菌体乾燥粉末の残留水分、粒度分布、スポロボロマイセス・シンギュラリスの生菌数および糖組成は、次の方法で測定・分析した。
（１）β−ガラクトシダーゼ力価の測定法
（ａ）検液の調製
微生物菌体液の約２.５ｇ〜約６.０ｇを５０ｍＬ容メスフラスコに正確に秤量し、５０ｍＭリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０）（以下、「緩衝液」という）で定容して、十分に溶解ないし懸濁させて検液とした。また、微生物菌体液が糖質（乳糖）を含む場合には、その約２.５ｇを５０ｍＬ容の遠沈管に正確に秤量し、緩衝液に懸濁した後に、遠心分離（２０,０００Ｇ、１５分間）して洗浄し、糖質を除いた。この洗浄操作を３回行なった後に、５０ｍＬ容メスフラスコに移し、緩衝液で定容して十分に懸濁させて検液とした。更に、被検試料が微生物菌体乾燥粉末(以下、「乾燥品」という)の場合は、その約１５０〜３５０ｍｇについて、同様の操作で洗浄した後に検液を調製した。
（ｂ）測 定
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside；ＯＮＰＧ）０.３７６６ｇを１００ｍＬ容メスフラスコに秤量し、緩衝液に溶解・定容して１２.５ｍＭの溶液を調製した。試験管に、このＯＮＰＧ溶液を０.８ｍＬ入れ、３０℃の恒温水槽中で５分間保持した。これに検液を０.２ｍＬ添加してよく混合し、３０℃で１０分間反応させた後に０.２５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を４ｍＬ加えて反応を停止した（試験系）。別に、試験管にＯＮＰＧ溶液０.８ｍＬと０.２５Ｍ炭酸ナトリウム溶液４ｍＬを入れ、更に検液を０.２ｍＬ加えてよく混合した（盲検系）。試験系および盲検系のそれぞれを、遠心分離（２,０００Ｇ、１０分間、１５〜２０℃）にかけ、得られた上清について、波長４２０ｎｍで吸光度を測定し、次式により単位数を算出した。なお、上記の反応条件で、１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノール（o-nitrophenol；ＯＮＰ）を遊離するのに要する酵素量を１Ｕとした。
Figure 0006067800
（２）固形分含量
死菌化処理前後の微生物菌体液の５〜１０ｇ、または５〜１０ｍLをアルミ皿に正確に秤量し、１０５℃で１６時間乾燥した。この操作における乾燥前後の重量から、固形分含量（質量％）を算出した。また、噴霧乾燥において、固形分あたりのβ−ガラクトシダーゼ力価を算出する際に用いる乾燥原液と乾燥品の固形分含量も同様の条件で求めた。なお、微生物菌体液が培養液のときは（培地成分を含むときは）、遠沈管に正確に秤量し、遠心洗浄して培地成分を除いた後に、洗浄菌体の全量をアルミ皿に移し、上記と同様の操作で乾燥し、固形分含量を算出した。
（３）残留水分量
噴霧乾燥における乾燥品の残留水分量は、（株）ケット科学研究所製の赤外線水分計を用いて１０５℃、１５分間の条件で測定した。
（４）粒度分布
乾燥品の粒度分布は、シンパテック社製のレーザー回折式粒度分布測定装置（ＨＥＬＯＳ＆ＲＯＤＯＳシステム）を用いて乾式で測定した。
（５）スポロボロマイセス・シンギュラリスの生菌数
ラクトース２.５％、酵母エキス０.５％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、寒天１.５％になるように溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨ５.０に調整した後に、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１０分間）し、平板プレート（φ９０ｍｍ）を作成した。これに、生理食塩水で溶解・希釈したサンプルを１００μＬ塗抹し、２５℃で約１週間培養した後に、生じたコロニーを計測し、スポロボロマイセス・シンギュラリスの生菌数とした。
（６）糖組成分析
糖組成はＨＰＬＣを用いて以下の条件で分析した。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０２（昭和電工(株)）
溶媒：純水
流速：０.５ｍＬ／分
温度：８０℃
検出器：示差屈折計
実 施 例 １
微生物の死菌化：
（１）培養
スポロボロマイセス・シンギュラリス（Sporobolomyces singularis） ＹＩＴ １００４７（ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６、以下、「Ｓｓ」と表記）を、グルコース５％、酵母エキス１.０％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離（１００００Ｇ、３０分間）して得られた湿菌体に、滅菌した市水を加えて十分に懸濁した。これを同条件で遠心分離し、固形分含量が５％程度となるように湿菌体を少量の市水に懸濁したものをＳｓ濃縮液とした。
（２）死菌化＜ｐＨと加熱温度の検討＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.０％）のｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で、３.５〜６.３に段階的に調整した。これらとｐＨ未調整（ｐＨ３.１）のＳｓ濃縮液を３５℃、４０℃、４５℃、５０℃または５５℃で１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１に示した。
Figure 0006067800
ｐＨを３.５、４.０に調整した後に加熱処理した場合には、４０〜４５℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４５℃では８０％以上、４０℃では９０％以上であった。また、ｐＨ３.５の場合は３５℃でも死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。ｐＨ４.２、４.７、５.０、５.８または６.３に調整して加熱処理した場合には、４０〜４５℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。一方、ｐＨの調整を行わず、加熱処理を行った場合（ｐＨ３.１）では、４０℃の加熱温度でＳｓが死菌化され、かつ、力価残存率が９０％以上となるものの、その値は９２.２％であり、ｐＨを調整した場合に比べて力価残存率は低かった。更に、４５℃では力価残存率が８０％を下回り、他のｐＨ条件より、死菌化可能で酵素力価が維持できる温度条件が５℃以上狭いと推測された。
（３）死菌化＜加熱温度の詳細な検討＞
上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.６％）のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で４.０、４.５、４.９、５.７または６.５に調整した。これらを４４℃、４６℃、４８℃、５０℃または５２℃で５時間または１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のＳｓの生菌数および力価残存率の結果を表２（加熱処理５時間）、表３（加熱処理１８時間）に示した。
Figure 0006067800
Figure 0006067800
加熱処理５時間において、ｐＨ４.０に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜４８℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４８℃では８０％以上、４４〜４６℃では９０％以上であった。ｐＨ４.５に調整した後、加熱処理した場合には、４６〜５０℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は５０℃では８０％以上、４６〜４８℃では９０％以上であった。ｐＨ４.９または５.７に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜５０℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。特に４６〜５０℃の加熱温度ではＳｓは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。ｐＨ６.５に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜４８℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４８℃では８０％以上、４４〜４６℃では９０％以上であった。特に４６〜４８℃ではＳｓは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。
また、加熱処理１８時間において、ｐＨ４.０に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜４６℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４６℃では８０％以上、４４℃では９０％以上であった。ｐＨ４.５、４.９または５.７に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜４８℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４８℃では８０％以上、４４〜４６℃では９０％以上であった。ｐＨ６.５に調整した後、加熱処理した場合には、４４〜４６℃の加熱温度で、Ｓｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。
（４）死菌化＜加熱時間の検討＞
上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.０％）のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で４.５に調整し、４０℃または４５℃で保持して加熱処理をした。加熱処理中のＳｓの生菌数を経時的に測定した結果を表４に示した。
Figure 0006067800
Ｓｓ生菌数は、４０℃、４５℃の加熱温度とも経時的に減少し、４０℃の加熱処理では、６時間で１０００ｃｆｕ／ｍＬ以下、９時間で１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。また、４５℃の加熱処理では、１時間で１０００ｃｆｕ／ｍＬ以下、２時間で１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。
（５）死菌化＜乳糖との組み合わせ＞
上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.６％）について、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４.５に調整したもの、乳糖を１％になるように添加したもの（ｐＨ未調整）、乳糖を１％になるように添加した後にｐＨを４.５に調整したものの３種を調製し、５０℃で１８時間保持して加熱処理をした（試験Ｉ）。同様の操作で、乳糖を２％添加した場合も実施した（試験II）。各Ｓｓ懸濁液の力価残存率を表５に示した。なお、加熱処理後のＳｓ生菌数は、すべて１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であった。
Figure 0006067800
試験Ｉ、IIとも、ｐＨ調整または乳糖添加の単独処理のときの力価残存率よりも、ｐＨ調整と乳糖添加を組み合わせたときの力価残存率のほうが高かった。ｐＨ調整による力価安定効果は、乳糖存在下でも変わらずに発揮され、更に、力価残存率が高くなることが分かった。
実 施 例 ２
乾燥品の調製：
実施例１と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.３％）のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で４.５に調整し、４０℃で１８時間保持して、加熱処理をした。この死菌化Ｓｓ濃縮液７.８Ｌに、８、２０、４０％乳糖溶液を２.６Ｌ加えて十分に混合し、固形分含量がＳｓ：約４％、乳糖：２、５、１０％の乾燥原液を調製した。これらと、乳糖を添加していない死菌化Ｓｓ濃縮液をそれぞれ、噴霧乾燥のパイロット装置（プロダクションマイナ、ＧＥＡプロセスエンジニアリング(株)）を用いて、入口温度：１２０℃、出口温度：約８０℃、アトマイザー回転数：１２,５００ｒｐｍ、原液処理量：４Ｋｇ／時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの力価残存率（乾燥原液の固形分あたり力価に対する乾燥品の固形分あたり力価の割合）、平均粒径、残留水分を測定した結果を表６に示す。
Figure 0006067800
乾燥原液中の乳糖濃度０〜１０％において、乾燥後の力価残存率が９０％以上である乾燥品を得ることができた。なお、これらの乾燥品のＳｓ生菌数はいずれも１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であり、加熱処理前後の力価残存率はいずれも９０％以上であった。
実 施 例 ３
オリゴ糖生成試験：
（１）乾燥品の懸濁液の調製
上記実施例２で得られた乾燥品のうち、製品１と製品２をそれぞれ４５Ｕ相当量を秤量し、これらをそれぞれ１０ｍｌのイオン交換水に加え、懸濁した。
（２）オリゴ糖生成反応
上記（１）で調製した乾燥品の懸濁液の全量または実施例１と同様の方法で得られたＳｓ濃縮液４５Ｕ相当量を、それぞれ６０％乳糖溶液８００ｍＬに添加して混合し、６５℃、ｐＨ６で２２時間反応させた。このときの糖組成を調べた結果を表７に示した。
Figure 0006067800
乾燥品の懸濁液とＳｓ濃縮液（生菌懸濁液）とでは、生成する糖組成や反応速度に大きな違いはなく、乾燥品がオリゴ糖の製造に利用できることがわかった。
実 施 例 ４
微生物の死菌化：
（１）培養
実施例１の（１）と同様にしてＳｓ濃縮液（固形分含量５.８％）を得た。
（２）死菌化＜乳糖の濃度と加熱温度の検討＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液と乳糖溶液を３：１で混合し、乳糖を０.２〜１５％含むＳｓ濃縮液を調製した。これらと乳糖無添加のＳｓ濃縮液を３５℃、４０℃、４５℃、５０℃または５５℃で１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のＳｓの生菌数の測定および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表８に示した。
Figure 0006067800
乳糖を０.２％添加して加熱処理した場合には、４０〜４５℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は４５℃では８０％以上、４０℃では９０％以上であった。乳糖を０.５〜１％添加して加熱処理した場合には、４０〜４５℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。乳糖を２〜５％添加して加熱処理した場合には、４０〜５０℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。乳糖を１０〜１５％添加して加熱処理した場合には、４０〜５５℃の加熱温度でＳｓは死菌化され、かつ、力価残存率は９０％以上であった。一方、乳糖を無添加で加熱処理した場合には、４０℃の加熱温度でＳｓが死菌化され、かつ力価残存率が９０％以上となるものの、４５℃では力価残存率が８０％を下回り、死菌化可能で酵素力価が維持できる温度条件が、乳糖を添加した場合よりも５℃以上狭いと推測された。
（３）死菌化＜糖質の種類の検討＞
デキストリン（ＮＳＤ＃３００、サンエイ糖化（株））、ガラクトオリゴ糖３糖以上画分、乳糖、マルトースおよびグルコースについて、死菌化時の酵素活性の安定化効果を比較した。上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液(固形分含量５.６％)と、８、２０％の糖質溶液を３：１で混合し、糖質を２％または５％含むＳｓ濃縮液を調製した。これらを４５℃または５０℃で１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後の力価の割合（力価残存率）の結果を表９に示した。なお、加熱処理前のＳｓ生菌数は１０８ｃｆｕ／ｍＬであったが、加熱処理後には何れの糖質、何れの濃度も１０ｃｆｕ／ｍＬ以下に低減し、死菌化されていた。
Figure 0006067800
糖質無添加のときの力価残存率は、４５℃の加熱温度では７２.７％、５０℃の加熱温度では２９.５％であった。これに対し、何れの糖質も共存させた方が力価残存率は高く、５０℃の加熱温度でデキストリンを共存させた場合以外は、力価残存率は８０％以上にまで向上した。
（４）死菌化＜加熱時間の検討＞
上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.０％）と２０％乳糖溶液を３：１で混合し、乳糖を５％含むＳｓ濃縮液を調製し、４０℃、４５℃で保持して加熱処理をした。加熱処理中のＳｓの生菌数を経時的に測定した結果を表１０に示した。
Figure 0006067800
Ｓｓ生菌数は、４０℃、４５℃の加熱温度とも経時的に減少し、４０℃の加熱処理では、４時間で１０００ｃｆｕ／ｍＬ以下、５時間で１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。また、４５℃の加熱処理では、１時間で１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となった。
（５）死菌化＜糖組成の検討＞
上記（１）と同様にして得られたＳｓ濃縮液(固形分含量５.３％)と８、２０、４０％乳糖溶液を３：１で混合し、乳糖を２％、５％、１０％含むＳｓ濃縮液を調製した。これらを４０℃で１８時間保持して加熱処理した。以下のＨＰＬＣ条件で、加熱処理後の糖組成を分析した。その結果を表１１に示した。また、加熱処理前の力価を測定し、残存力価を算出した結果もあわせて表１１に示した。なお、加熱処理前のＳｓ生菌数は１０８ｃｆｕ／ｍＬであったが、加熱処理後には何れも１０ｃｆｕ／ｍＬ以下に低減し、死菌化されていた。
Figure 0006067800
乳糖を含むＳｓ濃縮液（生菌懸濁液）は加熱処理中に乳糖がβ−ガラクトシダーゼの作用を受けるが、その反応の度合にかかわらず、力価安定効果は維持されていることが分かった。また、Ｓｓ濃縮液中には、添加した乳糖が酵素反応を受けて生成した単糖（グルコース、ガラクトース）やガラクトオリゴ糖が存在していても酵素力価の安定化には問題がないことも確認され、糖質として単糖やガラクトオリゴ糖が利用できることも確認された。
実 施 例 ５
乾燥品の調製：
実施例１と同様にして得られたＳｓ濃縮液（固形分含量５.３％）と８、２０、４０％乳糖溶液を３：１で混合し、固形分含量がＳｓ：４％、乳糖：２、５、１０％の乾燥原液を調製した。これらを４０℃で１８時間保持して、加熱処理をした。この死菌化Ｓｓ濃縮液を噴霧乾燥のパイロット装置（プロダクションマイナ、ＧＥＡプロセスエンジニアリング(株)）を用いて、入口温度：１２０℃、出口温度：約８０℃、アトマイザー回転数：１２５００ｒｐｍ、原液処理量：４Ｋｇ／時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの力価残存率（乾燥原液の固形分あたり力価に対する乾燥品の固形分あたり力価の割合）、平均粒径、残留水分を測定した。その結果を表１２に示した。
Figure 0006067800
乾燥原液中の乳糖濃度２〜１０％において、乾燥後の力価残存率が９０％以上である微生物菌体乾燥品を得ることができた。なお、これらの乾燥品のＳｓ生菌数は何れも１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であり、加熱処理前後の力価残存率は何れも９０％以上であった。
実 施 例 ６
オリゴ糖生成試験：
（１）乾燥品の懸濁液の調製
上記実施例５で得られた乾燥品のうち、製品５と製品６をそれぞれ４５Ｕ相当量を秤量し、これらをそれぞれ１０ｍｌのイオン交換水に加え、懸濁した。
（２）オリゴ糖生成反応
上記（１）で調製した乾燥品の懸濁液の全量または実施例１と同様の方法で得られたＳｓ濃縮液４５Ｕ相当量を、それぞれ６０％乳糖溶液８００ｍＬに添加して混合し、６５℃、ｐＨ６で２２時間反応させた。このときの糖組成を調べた結果を表１３に示した。
Figure 0006067800
乾燥品の懸濁液とＳｓ濃縮液（生菌懸濁液）とでは、生成する糖組成に大きな違いはなく、乾燥品がオリゴ糖の製造に利用できることがわかった。
実 施 例 ７
微生物の死菌化：
（１）培養
実施例１の（１）と同様にしてＳｓ濃縮液（固形分含量５.２％）を得た。
（２）死菌化＜乳糖の濃度と加熱温度の検討＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液と乳糖溶液を３：１で混合し、乳糖を２〜５％含むＳｓ濃縮液を調製した。これらと乳糖無添加のＳｓ濃縮液を５０℃で１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１４に示した。なお、加熱処理後のＳｓ生菌数はいずれも１０ｃｆｕ／ｍｌ以下であった。
Figure 0006067800
乳糖濃度２〜５％で力価残存率が８０％を上回った。そして、乳糖濃度３％以上で力価残存率が９０％を上回ることがわかった。
実 施 例 ８
微生物の死菌化：
（１）培養
実施例１の（１）と同様にしてＳｓ濃縮液（固形分含量５.４％）を得た。
（２）死菌化＜乳糖との組み合わせ＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液について、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４.５に調整したもの、乳糖を１％になるように添加したもの（ｐＨ未調整）、乳糖を１％になるように添加した後にｐＨを４.５に調整したものの３種を調製し、４５℃で１８時間保持して加熱処理をした（試験III）。同様の操作で、乳糖を２％添加した場合も実施した（試験IV）。各Ｓｓ懸濁液の力価残存率を表１５に示した。なお、加熱処理後のＳｓ生菌数は、すべて１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であった。
Figure 0006067800
試験III、IVとも、ｐＨ調整または乳糖添加の単独処理のときの力価残存率よりも、ｐＨ調整と乳糖添加を組み合わせたときの力価残存率のほうが高かった。ｐＨ調整による力価安定効果は、乳糖存在下でも変わらずに発揮され、更に、力価残存率が高くなることがわかった。
（３）死菌化＜乳糖との組み合わせ＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液について、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４.５、５.０、５.５に調整したもの、乳糖を２％になるように添加したもの（ｐＨ未調整）、乳糖を２％になるように添加した後にｐＨを４.５、５.０、５.５に調整したものの３種を調製し、５０℃で５時間または１８時間保持して加熱処理をした。各Ｓｓ懸濁液の力価残存率を表１６に示した。なお、加熱処理後のＳｓ生菌数は、すべて１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であった。
Figure 0006067800
いずれの場合も、ｐＨ調整または乳糖添加の単独処理のときの力価残存率よりも、ｐＨ調整と乳糖添加を組み合わせたときの力価残存率のほうが高かった。また、加熱保持時間１８時間の場合、ｐＨ４.５〜５.５に調整することにより、乳糖２％でも力価残存率が９０％以上となった。
実 施 例 ９
微生物の死菌化：
（１）培養
Ｓｓを、グルコース２％、酵母エキス０.４％、リン酸一カリウム０.０５％、硫酸マグネシウム０.０２５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離（１００００Ｇ、３０分間）して得られた湿菌体に、滅菌した市水を加えて十分に懸濁した。これを同条件で遠心分離し、得られた湿菌体に乳糖溶液および滅菌水を加え、乳糖を２％または５％含み、かつ菌体濃度が２.５％、４.５％および６.５％（ｗ／ｖ）となるＳｓ濃縮液を調製した。
（２）死菌化＜乳糖の濃度と加熱温度の検討＞
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液を４５℃または５０℃で５時間または１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のＳｓの生菌数の測定および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）を図１〜４に示した。
いずれの菌体濃度でも、死菌化後の力価残存率は８０％以上であり、力価残存率に差は認められなかった。特に、乳糖濃度が５％の場合には、いずれの菌体濃度でも、死菌化後の力価残存率は９０％以上であった。
実 施 例 １０
微生物の死菌化：
（１）培養
Ｓｓを、グルコース４％、酵母エキス０.８％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養し、Ｓｓ培養液（固形分含量２.５％）を得た。
（２）死菌化
上記（１）で得られたＳｓ培養液のｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウム溶液で、３.５〜５.０に段階的に調整した。これらと、ｐＨ未調整のＳｓ培養液を４０℃または４５℃で、５時間または１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１７に示した。
Figure 0006067800
いずれの培養液でも死菌化処理時のｐＨが高いほど力価残存率が向上した。また、いずれの培養液でも力価残存率８０％以上、Ｓｓ生菌数１０ｃｆｕ／ｍｌ以下を満たすのは、ｐＨを４.０以上に調整し、４５℃で５時間加熱処理した場合であった。また、ｐＨ５.０に調整し、４５℃で１８時間加熱処理した場合も、上記力価残存率の条件を満たした。
実 施 例 １１
ｐＨ調整剤の検討：
（１）培養
Ｓｓを、グルコース４％、酵母エキス０.８％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養し、Ｓｓ培養液（固形分含量２.８％）を得た。
（２）ｐＨ調整
上記（１）で得られたＳｓ培養液に０.５Ｎ、２Ｎまたは５Ｎ水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液、１０％または２０％炭酸ナトリウム溶液を滴下してｐＨを５.０に調整した。ｐＨ調整前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対するｐＨ調整後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）を図５に示した。
ｐＨ調整剤として水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使用した場合、ｐＨ調整直後に力価が７〜８％低下した。一方、ｐＨ調整剤として炭酸ナトリウムを使用した場合、力価低下はほとんど生じなかった。
実 施 例 １２
ｐＨ調整剤の検討：
（１）培養
Ｓｓを、グルコース５％、酵母エキス１％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養し、Ｓｓ培養液（固形分含量２.５％）を得た。
（２）死菌化
上記（１）で得られたＳｓ培養液のｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウムまたは２０％炭酸ナトリウム溶液で、４.０〜５.０に段階的に調整した。これらを４０℃または４５℃で、５時間または１８時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）を表１８に示した。
Figure 0006067800
死菌化処理前後における力価残存率およびＳｓ生菌数について、ｐＨ調整剤による差は認められなかった。
実 施 例 １３
乾燥品の調製：
（１）Ｓｓ濃縮液の調製
Ｓｓを、グルコース４％、酵母エキス０.８％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離（１００００Ｇ、３０分間）して菌体濃縮液を回収した。これに滅菌した市水を加えて十分に懸濁して洗浄した後に同条件で遠心分離し、固形分が５％程度になるように調整したものをＳｓ濃縮液（固形分含量５.１％）とした。
（２）Ｓｓ培養液の調製
Ｓｓを、グルコース４％、酵母エキス０.８％、リン酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％を含む培地(ｐＨ５)で、２７℃、４日間好気的に培養し、Ｓｓ培養液を得た。
（３）Ｓｓ濃縮液の死菌化（ｐＨ調整）
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液のｐＨを２０％炭酸ナトリウム溶液で、４.８±０.２に調整した。このＳｓ濃縮液を４５℃で７時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１９に示した。また、乾燥直前に、死菌化後のＳｓ濃縮液に２４％乳糖溶液を５：１で混合し、乳糖を４％含む乾燥原液を調製した。
（４）Ｓｓ濃縮液の死菌化（乳糖共存）
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液と２４％乳糖溶液を５：１で混合し、乳糖を４％含むＳｓ濃縮液を調製した。このＳｓ濃縮液を５０℃で７時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１９に示した。死菌化後のＳｓ濃縮液をそのまま乾燥原液とした。
（５）Ｓｓ濃縮液の死菌化（ｐＨ調整・乳糖共存の併用）
上記（１）で得られたＳｓ濃縮液と２４％乳糖溶液を１０：１で混合し、乳糖を２.２％含むＳｓ濃縮液を調製した。さらに、当該Ｓｓ濃縮液のｐＨを２０％炭酸ナトリウム溶液で、４.８±０.２に調整した。このＳｓ濃縮液を５０℃で７時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１９に示した。また、乾燥直前に、死菌化後のＳｓ濃縮液に２４％乳糖溶液を１１：１で混合し、乳糖を４％含む乾燥原液を調製した。
（６）Ｓｓ培養液の死菌化（ｐＨ調整）
上記（２）で得られたＳｓ培養液のｐＨを２０％炭酸ナトリウム溶液で、４.８±０.２に調整した。このＳｓ培養液を４５℃で７時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のＳｓの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）の結果を表１９に示した。また、死菌化後のＳｓ培養液を遠心分離（１６０００Ｇ）して湿菌体を回収した。これに滅菌した市水を加えて十分に懸濁して、固形分が５％程度になるように調整し、死菌化されたＳｓ濃縮液（固形分含量５.２％）を得た。乾燥直前に、この死菌化されたＳｓ濃縮液に２４％乳糖溶液を５：１で混合し、乳糖を４％含む乾燥原液を調製した。
（７）噴霧乾燥
上記（３）〜（６）で得られた乾燥原液を噴霧乾燥のパイロット装置（プロダクションマイナ、ＧＥＡプロセスエンジニアリング（株））を用いて、入口温度：１２０℃、出口温度：８０℃、アトマイザー回転数：１５０００ｒｐｍ、原液処理量：約４.５ｋｇ／時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの乾燥品の力価残存率、平均粒径、残留水分を測定した。その結果を表１９に示した。
Figure 0006067800
すべての死菌化条件で、力価残存率９０％以上、かつ、Ｓｓ生菌数１０ｃｆｕ／ｍｌ未満の良好な乾燥品が得られた。
実 施 例 １４
保存試験：
実施例２で調製した乾燥品（製品１〜３）および実施例５で調製した乾燥品（製品５〜７）をそれぞれ５℃または２５℃で３６０日保存した。保存前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する保存後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合（力価残存率）を測定した。その結果を表２０に示した。
Figure 0006067800
５℃または２５℃で３６０日保存しても力価残存率は８０％以上であることが分かった。
実 施 例 １５
微生物の死菌化：
Ｓｓに代えてスポロボロマイセス・シンギュラリス ＪＣＭ ５３５６（ＡＴＣＣ ２４１９３）を用いる以外は実施例１と同様にして微生物の死菌化を行ったところ、力価残存率等についてほぼ同様の結果が得られた。例えば、ｐＨ５.０、４５℃で加熱処理した時に力価残存率が８０％以上であった。
実 施 例 １６
死菌化＜糖組成の検討＞：
Ｓｓに代えてスポロボロマイセス・シンギュラリス ＪＣＭ ５３５６（ＡＴＣＣ ２４１９３）を用いる以外は実施例４と同様にして微生物の死菌化を行ったところ、力価残存率等についてほぼ同様の結果が得られた。例えば、乳糖濃度５％、４５℃で加熱処理した時に力価残存率が８０％以上であった。
本発明方法によれば、酵素活性を有する微生物菌体液の酵素力価を維持したまま微生物を死菌化することができる。そのため、本発明方法で処理された微生物菌体液は、取り扱いが簡単であり、また保存可能であるため、酵素活性を利用した産業において有利に利用しうるものである。

Claims (6)

  1. β−ガラクトシダーゼ活性を有するスポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる糖質の１種以上を添加し、次いでこれを４０〜５０℃で４〜２０時間加熱処理することを特徴とする菌体液の、加熱処理後のβ―ガラクトシダーゼ力価が加熱処理前のβ―ガラクトシダーゼ力価の８０％以上である、スポロボロマイセス・シンギュラリスを死菌化する方法。
  2. 糖質を、０.２〜３０質量／体積％で添加する請求項１に記載のスポロボロマイセス・シンギュラリスを死菌化する方法。
  3. β−ガラクトシダーゼ活性を有するスポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる糖質の１種以上を添加し、次いでこれを４０〜５０℃で４〜２０時間加熱処理することにより得られる、加熱処理後のβ―ガラクトシダーゼ力価が加熱処理前のβ―ガラクトシダーゼ力価の８０％以上であることを特徴とする死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液。
  4. 糖質を、０.２〜３０質量／体積％で添加する請求項３に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液。
  5. 請求項３または４に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液を乾燥することにより得られる死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体乾燥粉末。
  6. 請求項３または４に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液および／または請求項５記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体乾燥粉末を含有する酵素組成物。
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